BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN HOÀNG CHUNG XỬ LÝ SƠ BỘ KEO TAI TƯỢNG PHẾ LIỆU NGÀNH GIẤY TRONG MÔI TRƯỜNG TRUNG TÍNH VÀ THUỶ PHÂN BẰNG ENZYM CHO SẢN XUẤT ETANOL SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : PGS.TS DOÃN THÁI HOÀ HÀ NỘI – 2010 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .1 DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ .3 MỞ ĐẦU .4 CHƢƠNG – TỔNG QUAN VỀ SẢN XUẤT ETANOL SINH HỌC TỪ VẬT LIỆU LIGNOXENLULOZA 1.1 Vật liệu lignoxenluloza 1.2 Phƣơng pháp chế biến vật liệu lignoxenluloza cho sản xuất etanol sinh học 10 1.3 Công nghệ tiền xử lý vật liệu lignoxenluloza 15 1.3.1 Phƣơng pháp học .18 1.3.2 Phƣơng pháp hóa học 19 1.4 Công nghệ thủy phân hydratcacbon enzym 21 1.4.1 Hệ enzym thủy phân hydratcacbon .21 1.4.2 Các yếu tố ảnh hƣởng đến trình thủy phân enzym 23 1.5 Lên men dịch thủy phân thu etanol 25 CHƢƠNG – NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .27 2.1 Nguyên, vật liệu 27 2.1.1 Nguyên liệu 27 2.1.2 Vật tƣ hóa chất 27 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu .27 2.2.1 Chuẩn bị nguyên liệu .27 2.2.2 Xác định thành phần hóa học nguyên liệu 27 2.2.3 Tiền xử lý nguyên liệu 28 i 2.2.4 Thủy phân enzym 28 2.2.5 Xác định hàm lƣợng đƣờng khử 30 2.2.6 Xác định độ cồn dịch sau lên men 31 2.2.7 Phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm 32 CHƢƠNG – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Thành phần hóa học gỗ keo tai tƣợng phế liệu 36 3.2 Nghiên cứu tiền xử lý nguyên liệu số tác nhân trung tính 37 3.2.1 Tiền xử lý theo phƣơng pháp Alcell 37 3.2.2 Tiền xử lý nƣớc nóng có kiểm soát pH 38 3.3 Nghiên cứu ảnh hƣởng trình tiền xử lý lignoxenluloza đến hiệu thủy phân enzym 40 3.3.1 Tối ƣu hóa điều kiện tiền xử lý phế liệu keo tai tƣợng nƣớc nóng .40 3.3.2 Nghiên cứu thủy phân enzym mẫu tiền xử lý 48 3.4 Nghiên cứu nâng cao hiệu thủy phân xenluloza thành glucoza 50 3.4.1 Phƣơng pháp chắt dịch định kỳ .50 3.4.2 Phƣơng pháp nghiền bi 51 3.5 Đánh giá khả lên men dịch thủy phân để thu etanol 53 3.5.1 Một số chủng vi sinh vật sử dụng cho nghiên cứu lên men dịch thủy phân .53 3.5.2 Đặc điểm sinh học chủng vi sinh vật lên men đƣợc dịch thủy phân enzym .53 3.5.3 Khả lên men dịch thủy phân 56 KẾT LUẬN .58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu có đƣợc luận văn hoàn toàn trung thực Tất thí nghiệm trực tiếp tiến hành cách nghiêm túc, tuyệt đối không chép từ nguồn Hà Nội, tháng10 năm 2010 Học viên Nguyễn Hoàng Chung DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Thành phần hóa học số loại phế thải nông nghiệp Bảng 1.2: Các phƣơng pháp tiền xử lý vật liệu lignoxenluloza 16 Bảng 1.3 Đặc điểm số phƣơng pháp tiền xử lý vật liệu lignoxenluloza 17 Bảng 2.1 Enzym Cellic CTec, HTec đặc điểm 30 Bảng 3.1 Thành phần hóa học gỗ keo tai tƣợng phế liệu 36 Bảng 3.2 Hiệu suất đƣờng khử giai đoạn Alcell thủy phân xenluloza 38 Bảng 3.3 Hiệu suất đƣờng khử giai đoạn tiền xử lý nƣớc nóng có kiểm soát pH thủy phân xenluloza 40 Bảng 3.4 Các mức tiến hành thí nghiệm 41 Bảng 3.5 Ma trận thí nghiệm khảo sát điều kiện tối ƣu 42 Bảng 3.6 Bảng thống kê hệ số bi δi 47 Bảng 3.7 Kết thí nghiệm tiến tới điều kiện tối ƣu .48 Bảng 3.8 Kết thủy phân enzym mẫu nguyên liệu tiền xử lý 49 Bảng 3.9 Sự thay đổi hiệu thủy phân xenluloza 52 theo phƣơng pháp nghiền bi 52 Bảng 3.10 Đặc điểm sinh học chủng nấm men 17 so sánh với chủng Saccharomyces cerevisae 54 Bảng 3.11 Đặc điểm sinh học chủng Pichia sp.09 so sánh với chủng Pichia stipytis 56 Bảng 3.9: Khả lên men dịch thủy phân 57 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1 Sơ đồ trình thủy phân axit 11 Hình 1.2 Sơ đồ trình thủy phân enzym 13 Hình 1.3 Tiền xử lý chuyển hóa sinh khối thành nhiên liệu 15 Hình 1.4 Ba phản ứng đƣợc xúc tác xenlulaza 22 Hình 1.5 Thủy phân xenluloza thành glucoza enzym xenlulaza .23 Hình 3.1 Ảnh hƣởng điều kiện xử lý nƣớc nóng tới hiệu suất đƣờng khử 42 Hình 3.2 Hiệu suất đƣờng khử giai đoạn thủy phân enzym (so với xenluloza nguyên liệu đầu) 50 Hình 3.3 Sự thay đổi hiệu thủy phân xenluloza theo phƣơng pháp chắt dịch 51 Hình 3.4 Hình thái tế bào khuẩn lạc chủng nấm men 17 54 Hình 3.5 Hình thái tế bào khuẩn lạc chủng Pichia sp 09 55 MỞ ĐẦU Việc sử dụng sinh khối thực vật, nguồn vật liệu tái tạo có chứa cacbohydrat, nhƣ tinh bột, hemixenluloza xenluloza, để sản xuất nhiên liệu cho vận tải vấn đề đƣợc quan tâm hàng đầu Etanol sản phẩm quan trọng thị trƣờng nhiên liệu Nó đƣợc xem nhƣ nhiên liệu “sạch” nguồn gốc tự nhiên tính thân thiện với môi trƣờng Mỹ số quốc gia đầu việc phát triển nhiên liệu etanol Thị trƣờng etanol mở rộng nhanh chóng từ tỷ lít năm 1975 đến 39 tỷ lít năm 2006 đƣợc dự đoán đạt 100 tỷ lít vào năm 2015 Việc sử dụng 10,6 tỷ gallon etanol năm 2009 làm giảm 16,5 triệu khí nhà kính từ phƣơng tiện vận tải, tƣơng đƣơng việc giảm 2,7 triệu phƣơng tiện giao thông đƣờng [13] Sản lƣợng etanol nhiên liệu năm 2007 Mỹ khoảng 6,5 tỷ gallon, chiếm 35% tổng sản lƣợng giới Việc sản xuất sử dụng gần tỷ gallon etanol năm 2006 giúp Mỹ giảm lệ thuộc vào lƣợng dầu nhập (khoảng 170 triệu thùng dầu) Dự kiến tới cuối năm 2010, sản lƣợng etanol nhiên liệu Mỹ tăng lên tới 10 tỷ gallon [20] Nƣớc Mỹ tiêu thụ 140 tỷ gallon xăng cho ô tô Năm 2007, việc sử dụng 100% ngô để sản xuất etanol cung cấp đƣợc 35 tỷ gallon nhiên liệu, đáp ứng 16% nhu cầu Việc chuyển hóa sinh khối chứa xenluloza nhƣ phế thải nông nghiệp thành nhiên liệu hóa chất mang lại nhiều lợi ích mặt kinh tế, môi trƣờng, lợi ích mang tính chiến lƣợc Quá trình sinh học sử dụng enzym xenlulaza cho hiệu suất đƣờng cao đồng thời mang lại hiệu kinh tế DOE (Department of Energy) USDA (United State of Department of Agriculture) công bố nguồn sinh khối mà Mỹ cung cấp cho sản xuất nhiên liệu sinh học khoảng 1,3 tỷ nguyên liệu khô, chiếm khoảng 40% nhu cầu nhiên liệu hàng năm cho ngành vận tải nƣớc [16] Các số liệu thống kê cho thấy, có khoảng 4% etanol đƣợc tổng hợp từ dầu, phần lớn đƣợc sản xuất từ trình lên men nguyên liệu sinh học Hiện etanol đƣợc sản xuất từ hai nhóm nguyên liệu sinh học là: nguyên liệu chứa đƣờng nguyên liệu chứa tinh bột Hai loại nguyên liệu có tính cạnh tranh việc sản xuất etanol Nếu nhƣ đầu năm 2000, 60% etanol nhiên liệu đƣợc sản xuất từ nguyên liệu chứa đƣờng tới năm 2006 tỷ lệ giảm xuống 47%, từ nguyên liệu ngũ cốc chiếm 53% Cũng nhƣ dầu, etanol có thị trƣờng tiềm lớn Nó thay cho toàn thị trƣờng nhiên liệu Hơn nữa, loại nhựa nhƣ polyetylen đƣợc sản xuất từ etanol (qua etylen) Tuy nhiên, trữ lƣợng vật liệu chứa đƣờng ngũ cốc có giới hạn Chúng nguyên liệu đắt tiền để sản xuất etanol, bên cạnh đó, nguồn cung cấp thực phẩm cho ngƣời Sự cạnh tranh dẫn tới giá loại ngũ cốc đƣờng tăng cao tƣơng lai Hơn nữa, tính kinh tế trình sản xuất etanol từ ngũ cốc phụ thuộc vào thị trƣờng cho sản phẩm phụ nó, chẳng hạn nhƣ bột ngũ cốc qua chế biến sử dụng làm thức ăn chăn nuôi gia súc, phân bón nông nghiệp… Các vật liệu lignoxenluloza nguồn nguyên liệu dồi cho sản xuất etanol nhiên liệu nhƣng đƣợc sử dụng Lignoxenluloza đƣợc thu mua với giá thấp từ nhiều nguồn khác nhau, chẳng hạn nhƣ từ phế liệu gỗ, chất thải rắn, giấy loại, sản phẩm thừa mùa vụ Những vật liệu chứa đƣờng đƣợc polyme hóa dạng xenluloza hemixenluloza, chất đƣợc giải phóng nhờ trình thủy phân sau lên men vi sinh vật thành etanol Ở nƣớc ta vấn đề tận dụng phế liệu, phế thải sinh khối chứa xenluloza nói chung cho sản xuất etanol sản phẩm khác chƣa đƣợc quan tâm mức, mà dạng phế liệu không đƣợc sử dụng làm chất đốt sinh hoạt nhiều nhƣ trƣớc Đây lãng phí lớn gây không vấn đề bảo vệ môi trƣờng Theo thống kê [22], năm 1999 nƣớc có 669.505 rừng keo bạch đàn, chủ yếu Keo tai tƣợng Bạch đàn urophyla, tập trung vùng Tây Bắc, Đông Bắc, Đồng sông Hồng, Bắc Trung Bộ, Duyên hải Nam Trung Bộ, Tây Nguyên, Đông Nam Bộ, Đồng sông Cửu Long Tốc độ tăng trƣởng trung bình hàng năm đạt 5% Riêng gỗ nguyên liệu, nƣớc ta có khoảng 300.000 rừng nguyên liệu giấy, năm trồng khoảng 7.000 Với suất bình quân 10  12 m3/ha, sản lƣợng gỗ nguyên liệu giấy đạt triệu m3/năm, tức 1,5 triệu Hiện nay, năm ngành giấy tiêu thụ khoảng 250.000 nguyên liệu gỗ, chủ yếu gỗ keo tai tƣợng bạch đàn Phế liệu gỗ (gỗ nhỏ, cành nhánh, mảnh vụn) chiếm khoảng 10  15%, năm riêng phế liệu gỗ ngành giấy vào khoảng 25  30 ngàn Qua thấy không phế liệu ngành giấy, chủ yếu gỗ keo bạch đàn, mà nguyên liệu gỗ tính loại không phù hợp cho sản xuất đồ mộc làm nguyên liệu giấy lớn Vì vậy, không nghi ngờ nữa, gỗ phế liệu gỗ nƣớc ta nguồn nguyên liệu tiềm cho sản xuất etanol Việc lựa chọn phƣơng pháp tiền xử lý vật liệu lignoxenluloza có ảnh hƣởng lớn tới chi phí giai đoạn thủy phân enzym Mục đích giai đoạn tiền xử lý làm biến đổi loại bỏ thành phần gây ức chế trình thâm nhập enzym vào chất Việc sử dụng tác nhân hóa học rẻ tiền nhƣ axit, bazo, dung môi hữu để tách loại hemixenluloza lignin khỏi vật liệu lignoxenluloza cho kết tốt để lên men enzym [5,6] Tuy nhiên, sử dụng hóa chất này, có nhiều vấn đề đặt nhƣ thiết bị phải chịu ăn mòn, ảnh hƣởng tiêu cực tới môi trƣờng, nhƣ tới giai đoạn (chẳng hạn nhƣ giai đoạn lên men) Sử dụng tác nhân trung tính nhƣ nƣớc, hay phƣơng pháp học xu hƣớng nhằm hạn chế tối thiểu việc xử lý thải môi trƣờng Ở khoảng nhiệt độ 200oC, nƣớc nhóm axetyl đóng vai trò nhƣ axit, chúng hòa tan đƣợc hemixenluloza lignin khỏi vật liệu lignoxenluloza Việc sử dụng thêm phƣơng pháp học nhƣ nghiền bi nguyên liệu sau đƣợc xử lý nƣớc, giúp cho trình xử lý sau dễ dàng Hơn nữa, việc giảm độ tinh thể xenluloza nhờ nghiền bi đƣợc biết có tác dụng làm tăng hiệu xử lý enzym Xuất phát từ thực tế trên, thực luận văn với đề tài: “Xử lý sơ gỗ keo tai tượng phế liệu ngành giấy môi trường trung tính thủy phân enzym cho sản xuất etanol sinh học.” Mục tiêu đề tài: Thiết lập điều kiện tối ƣu trình xử lý sơ thủy phân enzym gỗ keo tai tƣợng phế liệu để thu etanol Đối tượng nghiên cứu: gỗ keo tai tƣợng phế liệu nhà máy Giấy Bãi Bằng, thuộc Tổng Công ty Giấy Việt Nam, Phù Ninh, Phú Thọ Nội dung nghiên cứu: - Xác định thành phần hóa học nguyên liệu; - Nghiên cứu điều kiện tiền xử lý tối ƣu nguyên liệu nƣớc nhiệt độ cao; - Nghiên cứu ảnh hƣởng thời gian nghiền bi tới hiệu suất đƣờng khử mẫu bột gỗ qua xử lý nƣớc nhiệt độ cao; - Thiết lập quy trình xử lý khả thi gỗ keo tai tƣợng phế liệu thủy phân enzym cho sản xuất etanol Ý nghĩa khoa học tính thực tiễn đề tài: Các kết thu đƣợc sở cho việc xây dựng hoàn thiện quy trình công nghệ khả thi đƣờng hóa nguyên liệu gỗ keo tai tƣợng enzym * Tối ưu hóa điều kiện tiền xử lý Sử dụng phƣơng pháp leo dốc (phƣơng pháp Box – Wilson) để tối ƣu hóa trình tiền xử lý phế liệu keo tai tƣợng nƣớc nóng Chọn bƣớc nhảy yếu tố Z1 δ1 = 5, dựa vào δ1 tính δ3 Z3 theo công thức:  i  1 bi  i b1 1 Trong δi bƣớc nhảy yếu tố thứ i; bi hệ số hồi quy yếu tố tƣơng quan; Δi khoảng biến thiên yếu tố tƣơng ứng Các giá trị tính toán thể bảng 3.6 Bảng 3.6 Bảng thống kê hệ số bi δi Ký hiệu X1 (oC) X3 (phút) ∆j 20 10 bj 2,93 -0,73 bj∆j 58,51 -7,26 δj -1,62 Làm tròn δj -2 Theo đó, hiệu suất đƣờng khử tăng nhiệt độ tăng 5oC thời gian xử lý giảm phút, tỷ dịch có ảnh hƣởng tới hiệu suất đƣờng khử nên thí nghiệm tiếp theo, tỷ dịch đƣợc sử dụng 1/15 Xuất phát từ thí nghiệm tâm tiến hành số thí nghiệm tiến lên nhằm xác định điều kiện xử lý tối ƣu Điều kiện kết thí nghiệm tiến lên đƣợc tập hợp bảng 3.7 47 Bảng 3.7 Kết thí nghiệm tiến tới điều kiện tối ưu Các yếu tố ảnh hƣởng Hiệu suất đƣờng khử so với gỗ KTĐ, % Lƣợng chất hòa tan, % TN Nhiệt độ, o C Thời gian, phút Tỷ dịch 180oC 20 1/15 9,33 25,43 10 185oC 17 1/15 10,81 27,25 11 190oC 14 1/15 12,20 29,49 12 195oC 12 1/15 12,50 30,43 13 200oC 10 1/15 10,85 30,87 Kết cho thấy, mẫu nguyên liệu đƣợc xử lý nƣớc nhiệt độ 195oC, thời gian 12 phút có hiệu suất đƣờng cao Trong khoảng nhiệt độ từ 180 đến 195oC, hiệu suất đƣờng khử tăng Tuy nhiên nhiệt độ xử lý lên tới 200oC, hiệu suất có xu hƣớng giảm Điều giải thích nhiệt độ cao, axit có mặt dịch thủy phân phân hủy monosaccarit sinh làm giảm hiệu suất đƣờng khử 3.3.2 Nghiên cứu thủy phân enzym mẫu tiền xử lý Để đánh giá hiệu giai đoạn tiền xử lý, mẫu xơ sợi đƣợc tiến hành thủy phân hệ enzym nhƣ đề cập 2.2.4 Hệ enzym NS50013, NS50010, NS50014 sử dụng điều kiện mức dùng (cho 1g nguyên liệu KTĐ) nhƣ sau:  Đệm xitrat có pH = 4,8, mức dùng 1/30  NS50010: mL; NS50013: mL; NS50014: mL Hệ enzym Cellic CTec HTec sử dụng điều kiện mức dùng (cho 1g nguyên liệu KTĐ) nhƣ sau:  Đệm xitrat có pH = 5,0; mức dùng 1/30 48  CTec: mL; HTec: 0,2 mL Mức dùng loại enzym đƣợc sử dụng dựa kết nghiên cứu số cán môn CN Xenluloza & Giấy Quá trình thủy phân enzym đƣợc thực 50oC, vòng ngày Sau thời gian trên, dịch thủy phân đƣợc tách khỏi phần xơ sợi đƣa xác định hàm lƣợng đƣờng khử, kết thu đƣợc nhƣ bảng 3.8 Bảng 3.8 Kết thủy phân enzym mẫu nguyên liệu tiền xử lý Nhiệt độ, oC Hiệu suất đƣờng so với nguyên liệu ban đầu, % Hệ Hệ enzym enzym Hệ enzym Hệ enzym 180oC 17,31 16,82 25,54 27,07 35,73 34,71 185oC 17,99 18,92 27,37 28,56 35,74 38,45 190oC 23,48 22,45 29,81 31,14 45,72 43,72 195oC 26,34 24,10 31,42 31,34 57,43 54,98 200oC 32,59 32,16 33,69 33,38 56,44 52,75 % Chất tan Hiệu suất đƣờng so với xenluloza, % Hệ Hệ enzym enzym Kết cho thấy:  Mẫu bã nguyên liệu đƣợc thủy phân điều kiện 195oC, thời gian 12 phút tiến hành thủy phân enzym cho hiệu suất đƣờng khử cao  Hệ enzym NS50010, NS50013, NS50014 cho hiệu thủy phân cao hệ enzym Cellic CTec Cellic HTec Đánh giá hàm lƣợng đƣờng khử so với lƣợng xenluloza nguyên liệu cho thấy hiệu xử lý enzym xenluloza tƣơng đối cao Kết cho 49 thấy mẫu đƣợc tiền xử lý 195oC cho hiệu suất đƣờng khử so với xenluloza cao Kết tƣơng đồng với kết tiền xử lý nƣớc nóng giai đoạn trƣớc Hiệu suất đường khử, % 70 60 50 Hệ enzym NS50010,13,14 40 30 Hệ enzym (Cellic CTec&HTec) 20 10 Nhiệt độ, oC Hình 3.2 Hiệu suất đường khử giai đoạn thủy phân enzym (so với xenluloza nguyên liệu đầu) 3.4 Nghiên cứu nâng cao hiệu thủy phân xenluloza thành glucoza Nguyên liệu sau tiền xử lý nƣớc nóng, phần lớn hemixenluloza đƣợc tách khỏi xenluloza Tuy nhiên phần xenluloza tinh thể trở ngại lớn hoạt động enzym Để tăng hiệu thủy phân enzym cần tiến hành thêm số phƣơng pháp xử lý để nhằm làm giảm vùng tinh thể xenluloza, tạo điều kiện cho enzym xâm nhập vào chất Trong số nhiều phƣơng pháp, phƣơng pháp chắt dịch – thay enzym nghiền bi hành tinh nguyên liệu qua xử lý đƣợc lựa chọn để nghiên cứu luận văn 3.4.1 Phương pháp chắt dịch định kỳ Hoạt tính enzym có ảnh hƣởng lớn tới hiệu thủy phân xenluloza Theo lý thuyết động học tăng hiệu suất phản ứng cách tăng nồng độ chất 50 Xuất phát từ lý thuyết đó, tiến hành chắt dịch thay enzym sau ngày hai mẫu đƣợc đƣợc tiền xử lý 195oC 200oC 45 38.33 40 36.47 Hiệu suất đường, % 35 30 26.34 24.10 25 Giữ qua ngày Định kì chắt dịch 20 15 10 Hệ enzym NS50010,13,14 Hệ enzym Ctec & Htec Hình 3.3 Sự thay đổi hiệu thủy phân xenluloza theo phương pháp chắt dịch (nguyên liệu đƣợc tiền xử lý 195oC, chắt dịch thay sau ngày) Kết qua lần khẳng định khả cải thiện hiệu thủy phân enzym đƣợc chắt dịch thay định kỳ 3.4.2 Phương pháp nghiền bi Mục đích giai đoạn tiền xử lý làm biến đổi cấu trúc tế bào gỗ, giải phóng bề mặt xenluloza, tạo điều kiện cho trình thâm nhập enzym vào chất Nhiều nghiên cứu cho thấy việc sử dụng axit, bazơ dung môi hữu để tách loại hemixenluloza lignin khỏi vật liệu lignoxenluloza có ảnh hƣởng đáng kể tới giai đoạn thủy phân enzym Tuy nhiên, hóa chất lại yêu cầu thiết bị chống ăn mòn phải đƣợc trung hòa thu hồi để giảm ảnh hƣởng tiêu cực tới môi trƣờng nhƣ tới trình (chẳng hạn, lên men) 51 Sử dụng phƣơng pháp thủy phân nƣớc nhiệt độ cao kết hợp với phƣơng pháp học để xử lý vật liệu lignoxenluloza đƣợc xem phƣơng pháp thân thiện với môi trƣờng trình không sử dụng hóa chất Ở nhiệt độ cao, khoảng 200oC, nƣớc nhóm axetyl hemixenluloza đóng vai trò nhƣ axit, chúng hòa tan hemixenluloza lignin khỏi lignoxenluloza Các trình học đƣợc sử dụng sau xử lý nƣớc nhiệt độ cao nhằm giúp cho việc xử lý vật liệu trình dễ dàng Hơn nữa, tác động học góp phần làm giảm độ tinh thể xenluloza, tăng cƣờng khả thâm nhập enzym vào chất [2] Nguyên liệu sau đƣợc tiền xử lý nƣớc 195oC tiếp tục đƣợc nghiền thiết bị nghiền bị hiệu FRISCHT, tốc độ quay 200 vòng/ phút, khảo sát khoảng thời gian nghiền: 30 phút, 60 phút 90 phút (với chu kỳ 10 phút nghiền 10 phút dừng) Kết thu đƣợc bảng 3.9 Bảng 3.9 Sự thay đổi hiệu thủy phân xenluloza theo phương pháp nghiền bi Mẫu Thời gian nghiền, phút 30 Nồng độ đƣờng, g/l Hệ Hệ enzym enzym 6,086 5,054 Hiệu suất so với Hiệu suất so với nguyên liệu ban đầu xenluloza Hệ Hệ Hệ Hệ enzym enzym enzym enzym 45,06 38,96 93,74 81,06 60 6,551 6,035 46,26 43,03 96,24 89,51 90 6,373 5,612 47,57 41,13 98,96 85,57 So với lƣợng xenluloza nguyên liệu, trình nghiền sau tiền xử lý nƣớc giúp nâng cao hiệu suất đƣờng khử trình thủy phân enzym rõ rệt Kết cho thấy hiệu suất thủy phân enzym tăng thời gian nghiền tăng Tuy nhiên, việc lựa chọn thời gian nghiền để xử lý cần xem xét tới lƣợng tiêu tốn nghiền yếu tố liên quan trực tiếp tới chi phí toàn trình 52 3.5 Đánh giá khả lên men dịch thủy phân để thu etanol Lên men công đoạn cuối trình sản xuất etanol sinh học từ lignoxenluloza Nguyên liệu sau đƣợc tiền xử lý nƣớc nóng, thủy phân enzym, đƣợc đƣa lên men Quá trình lên men đƣợc thực số chủng nấm men vi khuẩn Dƣới số chủng nấm men đƣợc dùng trình lên men dịch thủy phân 3.5.1 Một số chủng vi sinh vật sử dụng cho nghiên cứu lên men dịch thủy phân Quá trình lên men dịch thủy phân enzym sử dụng số chủng vi sinh vật sau: - Chủng nấm men: 17, 22, 24 đƣợc phân lập từ bánh men cổ truyền - Chủng vi khuẩn: D3, D5, Pichia stipitis Bộ sƣu tập giống Phòng Công nghệ Vật liệu sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam 3.5.2 Đặc điểm sinh học chủng vi sinh vật lên men dịch thủy phân enzym 3.5.2.1 Đặc điểm sinh học chủng nấm men 17  Đặc điểm hình thái tế bào, khuẩn lạc Chủng nấm men 17 đƣợc nuôi môi trƣờng Hansen dịch thể Hình dạng, kích thƣớc, xếp tế bào đƣợc xác định kính hiển vi định tử Kết đƣợc trình bày hình 3.4 53 Hình 3.4 Hình thái tế bào khuẩn lạc chủng nấm men 17  Đặc điểm sinh lý, sinh hóa Chủng vi khuẩn 17 đƣợc xác định đặc điểm sinh lý, sinh hóa nhƣ: ảnh hƣởng nhiệt độ, ảnh hƣởng pH môi trƣờng đến khả sinh trƣởng Kết tổng hợp đƣợc trình bày bảng 3.10 Bảng 3.10 Đặc điểm sinh học chủng nấm men 17 so sánh với chủng Saccharomyces cerevisae Đặc điểm Chủng 17 Saccharomyces cerevisiae Hình dạng tế bào Elíp, cầu, ovan, trứng Elíp, cầu, ovan, trứng Nảy chồi Nhiều phía Nhiều phía Sinh bào tử Có Có Khuẩn ty thật - - Khuẩn ty giả - - Tạo váng - - Hình dáng Tròn to Tròn to Bề mặt Nhẵn bóng Nhẵn bóng Màu Trắng đục Trắng đục Khuẩn lạc: 54 Mép Không có cƣa Không có cƣa Cặn Rắn Rắn Đồng hóa nitrrat - - 3.5.2.2 Đặc điểm sinh học chủng Pichia  Đặc điểm hình thái tế bào khuẩn lạc Chủng nấm men Pichia sp.09 đƣợc nuôi môi trƣờng Hansen dịch thể Hình dạng, kích thƣớc, xếp tế bào đƣợc xác định kính hiển vi điện tử Kết đƣợc trình bày hình 3.5 Hình 3.5 Hình thái tế bào khuẩn lạc chủng Pichia sp 09  Đặc điểm sinh lý, sinh hóa Chủng Pichia sp.09 đƣợc xác định đặc điểm sinh lý, sinh hóa nhƣ: ảnh hƣởng nhiệt độ, ảnh hƣởng pH môi trƣờng đến khả sinh trƣởng Kết tổng hợp đƣợc trình bày bảng 3.11 55 Bảng 3.11 Đặc điểm sinh học chủng Pichia sp.09 so sánh với chủng Pichia stipytis Đặc điểm Chủng Pichia stipytis Hình dạng tế bào Elíp, cầu, ovan, trứng Nảy chồi Nhiều phía Sinh bào tử Có Khuẩn ty thật - Khuẩn ty giả - Tạo váng - Khuẩn lạc: Hình dáng Bề mặt Màu Mép Cặn Tròn nhỏ Nhẵn bóng Trắng đục Không cƣa Rắn Đồng hóa nitrrat - 3.5.3 Khả lên men dịch thủy phân Tiến hành thử nghiệm khả lên men dịch thu đƣợc tiền xử lý mẫu phế liệu gỗ keo tai tƣợng nƣớc nóng 195oC có nồng độ đƣờng khử 6,5 g/L Trong trình thủy phân đƣờng đƣợc tạo mà có chất ức chế nhƣ fufural, hydrometyl fufural (HMF), axit cacboxylic hợp chất phenol Trong số đó, fufural HMF hai chất ức chế quan trọng Sự có mặt chất ức chế có ảnh hƣởng xấu tới hoạt động vi sinh vật đƣợc sử dụng trình lên men dịch thủy phân thƣờng đƣợc khử độc để làm giảm nồng độ chất ức chế Tiến hành khử độc theo sơ đồ sau [2]: Ca(H2PO4)2 Ca(OH)2 Dịch thủy phân pH=10 Lọc pH=7 56 Lọc Lên men Sau đƣợc khử độc, dịch thủy phân đƣợc lên men số chủng nấm men vi khuẩn Kết thu đƣợc bảng 3.9 Bảng 3.9: Khả lên men dịch thủy phân Ký hiệu chủng Thời gian lên men, h D3 Dịch thủy phân nƣớc nóng 195oC Không xử lý Có xử lý Dịch thủy phân enzym mẫu tiền xử lý nƣớc nóng 195oC, 12 phút 72 ± + +++ D5 72 + + +++ Y17 72 ± + +++ Y22 72 ± + +++ Y24 72 + + +++ Pychia 72 ± + +++ ±: yếu, +: trung bình, +++: tốt Kết cho thấy khả lên men dịch tiền xử lý nƣớc nóng cải thiện rõ rệt đƣợc khử độc Với dịch thủy phân enzym, hiệu lên men tốt 57 KẾT LUẬN Từ kết thí nghiệm đây, đƣa điều kiện xử lý tối ƣu trình xử lý mẫu nguyên liệu gỗ keo tai tƣợng phế liệu nƣớc nóng nhƣ sau:  Giai đoạn tiền xử lý nước nóng: − Nhiệt độ xử lý: 195oC − Thời gian xử lý: 12 phút − Tỷ dịch: 1/15  Giai đoạn nghiền bi hành tinh − Thời gian nghiền: 60 phút (nghiền liên tục 10 phút, sau dừng 10 phút) − Thiết bị nghiền FRISCHT loại cối nghiền, cối bi ϕ40mm  Giai đoạn thủy phân enzym: − Sử dụng hệ enzym NS50010, NS50013, NS50014 với mức dùng 1ml loại, 30ml đệm xitric có pH = 4,8 hệ enzym Cellic CTec&HTec hãng Novozymes với mức dùng lần lƣợt 1mL 0,2 mL (cho 1g KTĐ bột gỗ xử lý) − Định kỳ chắt dịch sau hai ngày, sau bổ sung đệm enzym vào, tiếp tục để thêm hai ngày − Dịch sau thủy phân đƣợc tách phần xác định đƣờng khử phƣơng pháp DNS, phần lại đƣa lên men  Giai đoạn lên men: Sử dụng chủng nấm men Y17 vi khuẩn Pichia sp.09 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO Anneil Nilson, Control of fermentation of lignocellulosic hydrolysates, Department of Chemical Engineering II, Lund University, Sweden Ashok Pandey (2009), Handbook of Plant-based Biofuels, CRP Press, Taylor & Francis Group Deisy Y Corredor, Kansas State University, (2008), Pretreatment and Enzymatic Hydrolysis of Lignocellulosic Biomass Eva Palmqvist, barbell Hahn-Hagerdal, Fermentation of lignocellulosic hydrolysates I: inhibition and detoxification, Bioresource Technology 74, 1999 Harmsen P.F.H, Huijgen W J J, Bermudez Lopez L M, Bakker R R C, Literature Review of Physical and Chemical Pretreatment Processes for Lignocellulosic Biomass, pp 22-23 Hiroyuki Inoue, Shinichi Yano, Takashi Endo, Tsuyoshi Sakaki, Shigeki Sawayama, “Combining hot-compressed water and ball milling pretreatments to improve the efficiency of the enzymatic hydrolysis of eucalyptus”, Biotechnology for Biofuels 2008 Johan Gullichsen and Hannu Paulapuro, Papermaking Science and Technology, Book 6: Chemical Pulping, 1997 Joseph Weil, Mark Brewer, Richard Hendrickson, Ayda Sarikaya, and Michael R Ladisch, Continous pH Monitoring During Pretreatment of Yellow Poplar Wood Sawdust by Pressure Cooking in Water, Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol 70 – 72, 1998 Knauf, M and Moniruzzaman, M., (2004), Lignocellulosic biomass processing: a perspective Int Sugar J 106 147 – 150 59 10 Mohammad J Taherzadeh and Keikhosro Karimi (2007), Acid-based Hydrolysis Process for Ethanol from Lignocellulosis Materials: A Review; BioResources 2(3), pp.472-499 11 Mohammad J Taherzadeh and Keikhosro Karimi, Enzym – based Hydrolysis Processes for Ethanol from Lignocellulosic Materials: A Review, BioResources 2(4), pp.707-738 12 Mosier, N., Wyman, C., Dale, B., Elander, R., Lee, Y.Y., Holtzapple, M and Ladisch, M., (2005), Features of promising technologies for pre-treatment of lignocellulosic biomass Bioresource Technology 96 673 – 686 13 Parveen Kumar, Diane M Barrett, Michael J Delwiche, and Pieter Stroever, Methods for Pretreatment of Lignocellulosic Biomass for Efficient Hydrolysis and Biofuel Production 14 Perlack, R.D., Wright, L.L., Turhollow, A.F., Graham, R.L., Stokes, B.J and Erback, D.C (2005), Biomass as feedstock for bioenergy and byproducts industry: Technical feasibility of a billion – ton annual supply www.feedstockreview.ornl.gov Accessed Jannuary 2008 15 Peter G Markov, Saint Joseph College, Determinating the Alcohol Content of Beer and Wine, Modular Laboratory Program in Chemistry 16 Teherzadeh, M.J and Niklasson, C., (2004), Ethanol from lignocellulosic materials: Pretreatment, acid and enzymatic hydrolysis, and fermentation ACS Symp Ser 889 49 – 68 17 Wyman, C.E., 1995a, Ethanol from lignocellulosic biomass: technology, economics, and opportunities, Bioresource Technology 50, – 15 18 Wyman, C.E., 1996, Ethanol production from lignocellulosic biomass: overview In: Wyman, C.E (Ed), Handbook on Bioethanol , Production and Utilization Taylor & Francis, Washington DC (Chapter 1) 60 19 Renewable Fuels Association (2007), http://www.ethanolrfa.org Accessed February 2008 20 Renewable Fuels Association (2010), http://www.ethanolrfa.org 21 PGS TS Lê Thanh Mai, GS TS Nguyễn Thị Hiền, PGS TS Phạm Thu Thủy, TS Nguyễn Thanh Hằng, ThS Lê Thị Lan Chi (2007), Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men, NXB KH&KT, Hà Nội 22 Nguyễn Huy Sơn, Đặng Thịnh Triều (2004); Đánh giá thực trạng rừng trồng keo bạch đàn nước ta năm qua; TT Khoa học kỹ thuật kinh tế lâm nghiệp, Số 23 Hồ Sĩ Tráng (2004), Cơ sở hóa học gỗ xenluloza Tập 1&2, NXB KH&KT, Hà Nội 24 GS.TSKH Nguyễn Minh Tuyển, Quy hoạch thực nghiệm, NXB KH&KT 25 TS Nguyễn Doãn Ý, Giáo trình Quy hoạch thực nghiệm, NXB KH&KT 61 ... tăng hiệu xử lý enzym Xuất phát từ thực tế trên, thực luận văn với đề tài: Xử lý sơ gỗ keo tai tượng phế liệu ngành giấy môi trường trung tính thủy phân enzym cho sản xuất etanol sinh học. ” Mục... kiện tối ƣu trình xử lý sơ thủy phân enzym gỗ keo tai tƣợng phế liệu để thu etanol Đối tượng nghiên cứu: gỗ keo tai tƣợng phế liệu nhà máy Giấy Bãi Bằng, thuộc Tổng Công ty Giấy Việt Nam, Phù... thấy không phế liệu ngành giấy, chủ yếu gỗ keo bạch đàn, mà nguyên liệu gỗ tính loại không phù hợp cho sản xuất đồ mộc làm nguyên liệu giấy lớn Vì vậy, không nghi ngờ nữa, gỗ phế liệu gỗ nƣớc ta