ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ NGUYỄN THỊ THÙY DUNG NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VÀ CỐ ĐỊNH ADN ĐẦU DÒ ỨNG DỤNG TRONG CẢM BIẾN ADN ĐỊNH HƯỚNG PHÁT HIỆN VI KHUẨN STREPTOCOCCUS SUIS GÂY BỆNH VIÊM MÀNG NÃO LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ NANO SINH HỌC HÀ NỘI - 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ NGUYỄN THỊ THÙY DUNG NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VÀ CỐ ĐỊNH ADN ĐẦU DÒ ỨNG DỤNG TRONG CẢM BIẾN ADN ĐỊNH HƯỚNG PHÁT HIỆN VI KHUẨN STREPTOCOCCUS SUIS GÂY BỆNH VIÊM MÀNG NÃO Chuyên ngành: Công nghệ Nano Sinh học Mã số: Chuyên ngành đào tạo thí điểm LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ NANO SINH HỌC Cán hướng dẫn: TS Lê Thị Hiên ‘HÀ NỘI - 2017 LỜI CẢM ƠN Luận văn tốt nghiệp không đời thiếu tận tình hướng dẫn TS Lê Thị Hiên Em xin thể lòng biết ơn sâu sắc nhận xét sửa chữa quý lời động viên cô em gặp khó khăn bước hoàn thiện luận văn Đồng thời, em xin gửi lời cảm ơn đến thầy, cô khoa Vật lý Kỹ thuật Công nghệ Nano, trường Đại học Công nghệ - Đại học Quốc gia Hà Nội, đặc biệt thầy cô môn Công nghệ nano sinh học, kiến thực quý báu tận tình truyền dạy cho em góp phần giúp em hoàn thành tốt luận văn suốt năm học vừa qua Bên cạnh đó, em xin bày tỏ lòng biết ơn đến ThS.Vũ Thị Huyền em sinh viên học tập, nghiên cứu phòng thí nghiệm trọng điểm micro – nano giúp đỡ em trình thực luận văn Cuối em xin cảm ơn tới gia đình bạn bè Những người bên cạnh ủng hộ em, cho em lời khuyên, động viên tạo điều kiện tốt để em hoàn thành luận văn Một lần em xin chân thành cảm ơn tất người Luận văn hoàn thành với hỗ trợ kinh phí từ Đề tài mã số QGTĐ.13.24 đề tài mã số QG.15.28 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu – học viên Nguyễn Thị Thùy Dung, chuyên ngành Công nghệ Nano Sinh học hoàn thành với hướng dẫn TS Lê Thị Hiên Kết luận văn trung thực không chép tài liệu Những nội dung luận văn có tham khảo sử dụng tài liệu, thông tin đăng tải tác phẩm, tạp chí liệt kê danh mục tài liệu tham khảo luận văn Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Học viên Nguyễn Thị Thùy Dung MỤC LỤC GIỚI THIỆU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Cảm biến sinh học xu 1.1.1 Tổng quan cảm biến sinh học 1.1.2 Cảm biến ADN 1.1.3 Cảm biến ADN dựa chuyển đổi quang 1.1.4 Cảm biến ADN dựa chuyển đổi điện hóa 1.1.5 Cảm biển ADN dựa chuyển đổi từ 10 1.1.6 Cảm biến sử dụng lần 11 1.2 Các phương pháp cố định đầu dò ADN 13 1.2.1 Phương pháp vật lý 14 1.2.2 Phương pháp hóa học 14 1.2.3 Phương pháp sinh học 17 1.3 Giới thiệu vi khuẩn Streptococcus suis 18 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Vật liệu, hóa chất, thiết bị 20 2.1.1 Vật liệu 20 2.1.2 Hóa chất dung dịch 20 2.1.3 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm 22 2.2 Phương pháp chế tạo 23 2.2.1 Phương pháp thiết kế đầu dò 23 2.2.2 Phương pháp thiết kế mồi cho phản ứng PCR 24 2.2.3 Chế tạo thẻ SPA sử dụng lần 25 2.2.4 Lai ADN với đầu dò thẻ SPA 29 2.2.5 Đánh dấu ADN hạt từ-streptavidin 30 2.2.6 Tách ADN từ khuẩn lạc 30 2.2.7 Phương pháp PCR 31 2.3 Phương pháp nghiên cứu mẫu 33 2.3.1 Điện di ADN 33 2.3.2 Khảo sát góc thấm ướt đế qua bước biến đổi bề mặt 35 2.3.3 Quang phổ hồng ngoại chuyển đổi chuỗi Fourier 36 2.3.4 Xác định nồng độ ADN quang phổ kế 36 2.3.5 Phương pháp kính vị quang học 37 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Chế tạo thẻ sử dụng lần 38 3.1.1 Chế tạo đế thẻ 38 3.1.2 Thiết kế ADN đầu dò đặc hiệu cho vi khuẩn S.suis 39 3.1.3 Cố định đầu dò SPA lên bề mặt đế thẻ sử dụng lần 43 3.1.3.1 Lựa chọn phương pháp cố định đầu dò SPA 43 3.1.3.2 Khảo sát thời gian cố định đầu dò SPA 47 3.1.3.3 Khảo sát lượng đầu dò SPA cố định đế thẻ 47 3.2 Khảo sát thẻ SPA với ADN 49 3.2.1 Lai đầu dò SPA với ADN đích 50 3.2.2 Lai đầu dò SPA với ADN đối chứng 51 3.3 Đánh dấu ADN hạt từ đánh giá kết cảm biến AMR 52 3.3.1 Đánh dấu ADN hạt từ 52 3.3.2 Đánh giá kết đánh dấu ADN hạt từ cảm biến AMR 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 DANH MỤC VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU Từ viết tắt Viết đầy đủ ADN Axit Deoxiribonucleic APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane bp base pair AMR Từ điện trở dị hướng (Anisotropic magnetoresistance) EDC 1–Ethyl–3–(3–dimethylaminipropyl) carbodiimide ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay FTIR Fourier transform infrared spectroscopy (Quang phổ hồng ngoại chuyển đổi chuỗi Fourier) MES 2–(N–morpholino) ethanesulfonic acid NCBI National Center for Biotechnology Information PBS Phosphate buffered saline PCR Polymerase chain reaction PDMS Poly dimethyl siloxane SAA Succinic acid anhydride S.suis Streptococcus suis UVO Ultraviolet Ozone 16S rARN Axit Ribonucleic 16S ribosome DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các chất nối sử dụng để cố định ADN với đế 16 Bảng 2.1 Trình tự đoạn ADN 20 Bảng 2.2 Các hóa chất 21 Bảng 2.3 Các dung dịch 22 Bảng 2.4 Các thiết bị, dụng cụ 22 Bảng 2.5 Bảng tổng hợp đặc tính riêng cặp mồi 25 Bảng 2.6 Tên mẫu 26 Bảng 2.7 Nồng độ ADN toàn phần tách từ khuẩn lạc S.suis liên cầu khuẩn khác 31 Bảng 2.8 Thành phần mẫu PCR 32 Bảng 2.9 Thành phần mẫu PCR 33 Bảng 2.10 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR PCR 33 Bảng 2.11 Thành phần gel acrylamide (đệm TBE) 15% (gel cô gel tách) 34 Bảng 2.12 Các mẫu phân tích phương pháp FTIR 36 Bảng 3.1 Trình tự ADN đặc trưng cho gen 16S rARN đầu dò SPA 41 Bảng 3.2 Cặp mồi cho phản ứng PCR 42 Bảng 3.3 Cặp mồi cho PCR 43 Bảng 3.4 Lượng đầu dò SPA ban đầu, lại cố định theo phương pháp vật lý hóa học 44 Bảng 3.5 Bảng so sánh kết cố định đầu dò ADN 49 Bảng 3.6 Trình tự đầu dò SPA, ADN đích ADN đối chứng 49 Bảng 3.7 Tỉ lệ phản ứng, lượng lai hiệu suất lai ADN đích tương ứng với lượng ADN đem lai 51 DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cấu tạo cảm biến sinh học Hình 1.2 Biểu đồ nhu cầu sử dụng cảm biến sinh học từ năm 1996 tới 2018 Hình 1.3 a Cấu trúc đoạn phân tử ADN b Liên kết hydro bazơ mạch ADN sợi đơn xoắn kép AND Hình 1.4 Sự bắt cặp ADN đích ADN đầu dò cảm biến ADN Hình 1.5 Cấu trúc kẹp tóc (hair pin) Hình 1.6.a Cơ chế hoạt động cảm biến ADN sử dụng cặp đầu dò bắt đầu dò phát kết hợp Cy5 với chấm lượng tử để đánh dấu b Ảnh chồng huỳnh quang cho thấy việc vị trí QD Cy5 Hình 1.7.a Cấu trúc cảm biến SPR b Đồ thị phụ thuộc cường độ ánh sáng phản xạ vào góc tới trước sau có phân tử ADN đích lai với đầu dò bề mặt cảm biến c ADN đầu dò ADN đích bề mặt cảm biến SPR Hình 1.8 Cảm biến ADN dựa chuyển đổi điện hóa sử dụng chất thị oxi hóa – khử 10 Hình 1.9 Cảm biến ADN dựa chuyển đổi điện hóa sử dụng hạt nano 10 Hình 1.10 Cảm biến ADN dựa chuyển đổi từ 11 Hình 1.11.a Máy đo đường huyết On-Call EZ II b Cấu trúc que thử 12 Hình 1.12 a Hệ thống sử dụng chip lần Biacore T200 b Chip lần c Cấu tạo bề mặt chip 12 Hình 1.13.a Phương pháp vật lý b Phương pháp hóa học c Phương pháp sinh học.13 Hình 1.14.a Cấu trúc nhóm thiol b Cố định ADN có nhóm thiol lên đế vàng 14 Hình 1.15 Sơ đồ chức hóa đế cố định ADN 15 Hình 1.16 Cấu trúc số chất nối thường dùng 16 Hình 1.17 Cố định đầu dò ADN EDC NHS 17 Hình 1.18.a Cố định streptavidin lên đế b Cố định ADN đầu dò có gắn biotin lên đế phủ streptavidin 17 Hình 1.19 Sơ đồ cố định ARN có nhóm biotin lên bề mặt đế chức hóa streptavidin 18 Hình 1.20 Vi khuẩn liên cầu lợn qua kính hiển vi điện tử 18 Hình 2.1 Sơ đồ chế tạo thẻ sử dụng lần SPA 26 Tên sản phẩm tạo thành qua bước liệt kê bảng 3.1 26 Hình 2.2 Thẻ SPA diện tích tiến hành cố định đầu dò SPA 29 Hình 2.3 Mẫu bệnh phẩm cấy môi trường thạch máu 30 Hình 2.4 Minh họa góc thấm ướt 35 Hình 2.5 Sơ đồ hệ chụp ảnh góc thấm ướt 35 Hình 3.1 Phổ FTIR màng PDMS qua bước chức hóa 38 Hình 3.2 Góc thấm ướt bề mặt thẻ sau bước biến đổi 39 Hình 3.3 Kết chạy chương trình ClustalX 2.0.11 chọn đoạn ADN đặc trưng cho gen 16S rARN loài S.suis 40 Hình 3.4 Sơ đồ vị trí cặp mồi sản phẩm PCR 41 Hình 3.5 Điện di sản phẩm PCR 198 bp cặp mồi SF-SR gel agarose 1.5% L: Thang ADN 100 bp (ThermoFisherTM SM0242) Ss01-Ss05, Ss07, Ss08, Ss10, Ss11: chủng S.suis Các đối chướng LM: Listeria monocytogenes Sa01, Sm01,Sv01, Spn02: loài thuộc giống Streptococcus 42 Hình 3.6 Điện di sản phẩm PCR gen 16S rARN sử dụng cặp mồi SF2-SRB gel polyacrylamide 15% L: Thang ADN 50 bp (ThermoFisherTM SM0371) Ss07, Ss08, Ss09, Ss10 Ss11 thuộc loài S.suis Sm01, Sa01, Spn02 đối chứng 43 Hình 3.7 Các phương pháp cố định đầu dò ADN lên bề mặt đế thẻ sử dụng lần 44 Hình 3.8 Phổ hấp thụ đầu dò SPA dung dịch trước sau cố định lên bề mặt đế thẻ PDMS carboxyl phương pháp 45 Hình 3.9 Phổ FTIR thẻ PDMS carboxyl thẻ SPA 46 Hình 3.10 Phóng to vị trí đỉnh đặc biệt từ hình 3.9 46 Hình 3.11 Ảnh FESEM bề mặt màng mỏng PDMS (a) thẻ SPA (b), (c) 47 Hình 3.12 Đồ thị tối ưu thời gian cố định 47 Hình 3.13 Đồ thị tối ưu lượng đầu dò SPA cố định lên đến PDMS carboxyl 48 Hình 3.14 Sơ đồ lai ADN đích với đầu dò SPA thẻ SPA 50 Hình 3.15 Đồ thị biểu diễn lượng ADN đích phản ứng ứng với nồng độ đầu vào 50 Hình 3.16 Sơ đồ lai ADN đối chứng với đầu dò SPA ADN đích với bề mặt đế thẻ PDMS carboxyl đầu dò SPA 51 Hình 3.17 Các lượng ADN lai tương đương với lượng ADN đem lai ADN đích, ADN đối chứng ADN đích đế đầu dò SPA 52 Hình 3.18 Sơ đồ biểu diễn trình đánh dấu ADN hạt từ 53 Hình 3.19 a Ảnh FESEM hạt từ b Cấu trúc streptavidin biotin 53 Hình 3.20 Sơ đồ mô tả thí nghiệm lai ADN đánh dấu từ thẻ SPA với mẫu ADN đích ba mẫu đối chứng 53 Hình 3.21 Hình ảnh quan sát bề mặt thẻ SPA kính hiển vi quang học với độ phóng đại vật kính 50x 54 Hình 3.22 Sơ đồ cấu tạo cách sử dụng cảm biến AMR 55 Hình 3.23 a Tín hiệu cảm biến thẻ SPA với lượng ADN đích khác đối chứng b Đồ thị phụ thuộc tín cảm biến vào lượng ADN đích thẻ SPA 55 53 Hình 3.18 Sơ đồ biểu diễn trình đánh dấu ADN hạt từ (a) (b) Hình 3.19 a Ảnh FESEM hạt từ b Cấu trúc streptavidin biotin Bên cạnh đó, thực đánh dấu từ với đối chứng sau: đối chứng a: thẻ SPA ADN đích, đối chứng b: thẻ SPA với ADN đối chứng (có trình tự không bổ sung với đầu dò biotin đầu 5’ (xem bảng 3.5), đối chứng c: thẻ đầu dò SPA với ADN đích (hình 3.20) Hình 3.20 Sơ đồ mô tả thí nghiệm lai ADN đánh dấu từ thẻ SPA với mẫu ADN đích ba mẫu đối chứng 54 Sau ủ thẻ với hạt từ rửa thẻ đệm để loại bỏ hạt từ không liên kết, thẻ quan sát kính hiển vi quang học với độ phóng đại vật kính 50x (độ phóng đại kính hiển vi độ phóng đại thị kính nhân với độ phóng đại vật kính) (hình 3.21) Có thể thấy khác biệt tương đối mẫu ADN đích mẫu đối chứng Nếu hình ảnh hạt từ mẫu ADN đích thể số lượng nhiều dày đặc, hình ảnh chụp hạt từ mẫu đối chứng a, b, c thể số lượng hẳn Mẫu ADN đích 18 pmol Đối chứng a Đối chứng b Đối chứng c Hình 3.21 Hình ảnh quan sát bề mặt thẻ SPA kính hiển vi quang học với độ phóng đại vật kính 50x 3.3.2 Đánh giá kết đánh dấu ADN hạt từ cảm biến AMR Đoạn ADN đích sau đánh dấu từ thẻ SPA, phát thiết bị cảm biến phát hạt từ Cảm biến sử dụng để phát hạt từ cảm biến từ điện trở dị hướng (anisotropic magnetoresistance) nhóm tác giả Lê Khắc Quynh chế tạo phòng thí nghiệm trọng điểm micro-nano (Đại học Quốc gia Hà Nội) [14] Hình 3.22 sơ đồ mô tả cấu tạo hệ đo sử dụng cảm biến thẻ dùng lần SPA với ADN 55 đánh dấu từ Thẻ dùng lần với sợi ADN đích đánh dấu từ đưa trực tiếp lên bề mặt cảm biến để tiến hành đo tín hiệu Hình 3.22 Sơ đồ cấu tạo cách sử dụng cảm biến AMR Kết đo tín hiệu cảm biến từ cho thấy trường hợp thẻ SPA ủ với ADN đích sau đánh dấu từ cho tín hiệu lớn nhiễu (hình 3.23.a) Tín hiệu tăng gần tuyến tính với lượng ADN đích (hình 3.23.b) Giới hạn phạt cảm biến khoảng 4.5 pmol sợi đơn ADN đích Các đối chứng a,b,c mô tả mục 3.3.1 cho tín hiệu tương đương với nhiễu (hình 3.23.a) a) b) Hình 3.23 a Tín hiệu cảm biến thẻ SPA với lượng ADN đích khác đối chứng b Đồ thị phụ thuộc tín cảm biến vào lượng ADN đích thẻ SPA Kết cho thấy giới hạn phát cảm biến AMR nồng độ 4.5 pmol ADN đích, nồng độ dung dịch ADN đích đầu vào 0.3 µM So với phương pháp cảm biến sợi quang phát ADN với độ nhạy nồng độ 0.5 µM [33] phương pháp dùng cảm biến AMR có tính khả quan độ nhạy tốt giá thành 56 phương pháp thực Bên cạnh có vài phương pháp đại có giá thành cao có giới hạn phát thấp phương pháp đánh dấu huỳnh quang ADN chip có giới hạn phát 1nM [11] phương pháp graphene hiệu ứng trường cách đưa ADN vào môi trường nước có chứa chất hóa học nhằm phát ADN qua tín hiệu điện thông qua màng graphene có giới hạn phát thấp pM [6] 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Đã thiết kế ADN đầu dò SPA (độ dài 43 Nucleotide), với trình tự 5’Amin-(T)20 CAGTATTTACCGCATGGTAGATA-3’, đặc hiệu cho gen 16S rARN liên cầu khuẩn S.suis Đã chế tạo thẻ dùng lần cách phủ polyme PDMS lên đế silic, sau chức hóa đế để cố định đầu dò SPA phương pháp hóa học (dùng chất nối EDC) Mật độ đầu dò đạt 2.4 x 1013 sợi/cm2 Khi lai đầu dò SPA thẻ dùng lần với ADN đích cho thấy với ADN đích đem lai tăng lượng ADN lai tăng Tại lượng ADN đích đem lai pmol, có phân biệt ADN đích ADN đối chứng 8.7 lần Sử dụng cảm biến từ đo lượng ADN đánh dấu từ thẻ cho thấy tín hiệu cảm biến tăng tuyến tính với lượng ADN đích đem lai, giới hạn phát 4.5 pmol sợi đơn ADN đích 58 DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Lê Thị Hiên, Vũ Thị Huyền, Nguyễn Thị Thùy Dung, Trần Thị Ngọc, Lương Hồng Nhung, Bùi Đình Tú (2015), Cố định protein albumin huyết bò lên Polydimethylsiloxane chức hóa APTES, SAA ứng dụng chế tạo cảm biến sinh học, Kỷ yếu Hội nghị Vật lý chất rắn Khoa học vật liệu toàn quốc lần thứ – SPMS2015, 08-10/11/2015, Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam, tr 514 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Lê Thị Hiên, Vũ Thị Huyền, Nguyễn Thị Thùy Dung, Trần Thị Ngọc, Lương Hồng Nhung, Bùi Đình Tú (2015), ”Cố định protein albumin huyết bò lên Polydimethylsiloxane chức hóa APTES, SAA ứng dụng chế tạo cảm biến sinh học”, Kỷ yếu Hội nghị Vật lý chất rắn Khoa học vật liệu toàn quốc lần thứ – SPMS2015, 08-10/11/2015, Tp Hồ Chí Minh, Việt Nam, tr.514 Lê Thị Hiên, Hà Thị Quyến (2014), Các phương pháp thực nghiệm nano sinh học, Trường Đại học Công nghệ, Đại học Quốc Gia Hà Nội Tiếng anh Ashaari N.S, Ramarad S., Khairuddin D., Akhir N.A.M, Hara Y., Mahadi N.M., Mohamed R., Nathan S (2015), “Development of repeatable arrays of proteins using immobilized DNA microplate (RAPID-M) technology”, BMC Res Notes 8, pp 669-677 Bhalla N., Jolly P., Formisano N., Estrela P (2016), “Introduction to biosensors”, Essays in Biochemistry 60 (1), pp.1-8 Cattaruzza F., Cricenti A., Flamini A., Girasole M., Longo G., Prosperi T., ADNreano G., Cellai L., Chirivino E (2006), “Controlled loading of oligodeoxyribonucleotide monolayers onto unoxidized crystalline silicon; fluorescence-based determination of the surface coverage ADN of the hybridization efficiency; parallel imaging of the process by Atomic Force Microscopy”, Nucleic Acids Res 34 (4), pp.1-13 Chen T.Y., Loan P.T.K., Hsu C.L., Lee Y.H., Wang J.T.W., Wei K.H., Lin C.T., Li L.J (2013), “Label-free detection of DNA hybridization using transistors based on CVD grown grapheme”, Biosens Bioelectron 41, pp.103109 Chowdhury A.D., Gangopadhyay R., De A (2014), “Highly sensitive electrochemical biosensor for glucose, DNA ADN protein using goldpolyaniline nanocomposites as a common matrix”, Sensor Actuat B: Chem 190, pp.348-356 Damborsky P., Svitel J., KatrlíK J (2016), “Optical biosensors”, Essays in Biochemistry 60 (1), pp.91-100 60 Ding L., Bond A.M., Zhai J., Zhang J (2013), “Utilization of nanoparticle labels for signal amplification in ultrasensitive electrochemical affinity biosensors”, Anal Chim Acta 797, pp.1-12 10 Efimenko K., Wallace W.E., Genzer J (2002), “Surface modification of Sylgard-184 poly(dimethyl siloxane) networks by ultraviolet ultraviolet/ozone treatment”, J Colloid Interface Sci 254 (2), pp.306 ADN 11 Fredonnet J., Foncy J., Cau J., Sesverac C., Francois J.M., Tresvisiol E (2016), “Automated ADN Multiplexed Soft Lithography for the Production of LowDensity DNA Microarrays”, Microarrays (4), pp.25 12 Gottschalk M., Higgins R., Jacques M., Mittal K.R., Henrichsen J (1989), “Description of 14 new capsular types of Streptococcus suis”, J Clin Microbiol 27 (12), pp.2633–2636 13 Gupta P., Dillon A.C., Bracker A.S., George S.M (1991), “FTIR studies of H2O ADN D2O decomposition on porous silicon surfaces”, Surf Sci Lett 245 (3), pp.145 14 Hien L T., Quynh L K., Huyen V T., Tu B D., Hien N T., Phuong D M., Nhung P H., Giang D T H., Duc N H (2016), “DNA-magnetic bead detection using disposable cards ADN the anisotropic magnetoresistive sensor”, Adv Nat Sci: Nanosci Nanotechnol (4), pp 045006 15 Higgins R., Gottschalk M., Boudreau M., Lebrun A., Henrichsen J (1995), “Description of six new capsular types (29-34) of Streptococcus suis”, J Vet Diagn Invest 7, pp.405-406 16 Kanungo M., Mettu S., Law K.Y., Daniel S (2014), “Effect of roughness geometry on wetting ADN dewetting of rough PDMS surface”, Langmuir 30 (25), pp.7358 17 King S.J., Allen A.G, Maskell D.J., Dowson C.G., Whatmore A.M (2004), “Distribution, Genetic Diversity, ADN Variable Expression of the Gene Encoding Hyaluronate Lyase within the Population Streptococcus suis”, J Bacteriol 186 (14), pp.4740 18 Lamour G., Hamraoui A., Buvailo A., Xing Y., Keuleyan S., Prakash V., Eftekhari-Bafrooei A., Borguet E (2010), “Contact Angle Measurements Using a Simplified Experimental Setup”, J Chem Educ 87, pp.1403–1407 61 19 Lipiec E., Kowalska J., Lekki J., Wiechec A., Kwiatek W.M (2012), “FTIR Microspectroscopy in Studies of DNA Damage Induced by Proton Microbeam in Single PC-3 Cells”, Acta Phys Pol A 121, pp.506-509 20 Marois C., Bougeard S., Gottschalk M., Kobisch M (2004), “Multiplex PCR Assay for Detection of Streptococcus suis Species ADN Serotypes ADN 1/2 in Tonsils of Live ADN Dead Pigs”, J Clin Microbiol 42 (7), pp.3169–3175 21 Mazokopakis E.E., Kofteridis D.P., Papadakis J.A., Gikas A.H., Samonis G.J (2005), “Frist case report of Streptococcus suis septicaemia ADN meningitis from Greece”, Eur J Neurol 12 (6), pp.487–489 22 Michel W., Mai T., Naiser T., Ott A (2007), “Optical Study of DNA Surface Hybridization Reveals DNA Surface Density as a Key Parameter for Microarray Hybridization Kinetics”, Biophys J 92 (3), pp.999–1004 23 Mongra A.C., Kaur A (2012), “Overview of biosensors development around the world”, InteARNtional JouARNl of Biomedical ADN Advance Research 03 (07), pp 519-530 24 Nguyen H.H., Park J., Kang S., Kim M (2015), “Surface Plasmon Resonance: A Versatile Technique for Biosensor Applications”, Sensors 15, pp.1048110510 25 Nimse S.B., Song K., Sonawane M.D., Sayyed D.R., Kim T (2014), “Immobilization Techniques for Microarray: Chanllenges ADN Applications”, Sensors 14, pp.22208-22229 26 Okura M., Osaki M., Nomoto R., Arai S., Osawa R., Sekizaki T., Takamatsu D (2016), “Current Taxonomical Situation of Streptococcus suis”, Pathogens 5, pp.45-59 27 Özçam A.E., Efimenko K., Genzer J (2014), “Effect of ultraviolet/ozone treatment on the surface ADN bulk properties of poly(dimethyl silaxane) ADN poly(vinylmethyl siloxane) networks”, Polymer 55 (14), pp.3107-3119 28 Perch B., Kristjansen P., Skadhauge K (1968), “Group R streptococci pathogenic for man Two cases of meningitis ADN one fatal case of sepsis”, Acta Pathol Microbiol ScADN 74 (1), pp.69-76 29 Radu G.L., Truică G.I., Penu R., Moroeanu V., Litescu S.C (2012), “Use of the fourier transform infrared spectroscopy in characterization of specific samples”, U.P.B Sci Bull – B 74 (4), pp 137-148 62 30 Samanta A., Medintz I.L (2016), “Nanoparticles ADN DNA – a powerful ADN growing functional combination in bionanotechnology”, Nanoscale 8, pp.9037-9095 31 StackebrADNt E., Goebel B.M (1994), “Taxonomic note: A place for DNADNA reassociation ADN 16S rARN sequence analysis in the present species definition in bacteriology”, Int J Syst Bacteriol 44, pp.846-849 32 Stuart B.H (2004), Infrared Spectroscopy: Fundamentals ADN Applications, Wiley, New York, pp.152 33 Sun D., Guo T., Ran Y., Huang Y., Guan B (2014), “In-situ DNA hybridization detection with a reflective microfiber grating biosensor”, Biosens Bioelectron 61, pp.541-546 34 Turner A.P.F (2013), “Biosensors: sense ADN sensibility”, Chem Soc Rev 42 (8), pp.3184-3196 35 Vigneshvar S., Sudhakumari C.C., Senthikumaran B., Prakash H (2016), “Recent advances in biosensor technology for potential applications-An overview”, Front Bioeng Biotechnol (11) 36 Vincent H.A., Phillips J.O., Henderson C.A., Roberts A.J., Stone C.M., Mardle, C.E., Callaghan A.J (2013), “An Improved Method for Surface Immobilisation of ARN: Application to Small Non-Coding ARN - mARN Pairing”, PLoS ONE (11), pp.79142 37 Wang Z., Li R.X (2007), “Fabrication of DNA micropatterns on the polycarbonate surface of compact discs”, Nanoscale Res Lett 2, pp.69–74 38 Wertheim H.F.L., Nghia H.D.T., Taylor W., Schultsz C (2009), “Streptococcus suis: An Emerging Human Pathogen”, Clin Infect Dis 48 (5), pp.617-625 39 Wu H., Huang B., Zare R.N (2005), “Construction of microfluidic chips using polydimethylsiloxane for adhesive bonding”, The Royal Society of Chemistry 5, pp.1393–1398 40 Wu Y., Lai R.Y (2013), “Development of a “signal – on” electrochemical DNA sensor with an oligo-thymine spacer for point mutation detection”, Chem Commun 49 (33), pp.3422 – 3424 41 Wu Y., Yang X., Yi X., Liu Y., Chen Y., Liu G., Li R.W (2015), “Magnetic Nanoparticle for Biomedicine Applications”, J Nanotechnol Nanomed Nanobiotechnol (1), pp.3-9 63 42 Xia N., Deng D., Zhang L., Yuan B., Jing M., Du J., Liu L (2013), “SADNwich-type electrochemical biosensor for glycoproteins detection based on dual-amplification of boronic acid-gold nanoparticles ADN dopamine-gold nanoparticles”, Biosens Bioelectron 43, pp.155-159 43 Yin J., Han X., Cao Y., Lu C (2014), “Surface Wrinkling on Polydimethylsiloxane Microspheres via Wet Surface Chemical Oxidation”, Sci Rep 4, pp.5710 64 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Bảng mã tên thứ tự chủng loài S.suis loài giống Streptococcus cho gen 16S rARN Phân loại Các loài giống Streptococcus STT Tên loài Mã Streptococcus thermophilus NR_042778.1 strain ATCC 19258 Streptococcus vestibularis NR_042777.1 strain ATCC 49124 Streptococcus salivarius NR_102816.1 CCHSS3 strain CCHSS3 Streptococcus equinus strain NR_114642.1 NCDO 1037 Streptococcus constellatus NR_121747.1 subsp pharyngis Streptococcus intermedius NR_118938.1 strain NCTC 11324 Streptococcus anginosus NR_118937.1 strain NCTC 10713 Streptococcus sobrinus strain NR_114727.1 NCTC 12279 Streptococcus sobrinus strain AY188349.1 ATCC 33478 10 Streptococcus downei strain NR_042774.1 MFe 28 11 Streptococcus macacae strain NR_042775.1 ATCC 35911 12 Streptococcus ATCC 35037 oralis strain NR_114413.1 65 Các chủng loài S.suis 13 Streptococcus oralis 14 Streptococcus NCTC 12261 15 Streptococcus parasanguis AF003933.1 16 Streptococcus sanguis AF003928.1 17 Streptococcus cristatus strain NR_042771.1 ATCC 51100 18 Streptococcus suis strain L010 FJ434463.1 19 Streptococcus suis CSCDC 119-176 20 Streptococcus suis strain S735 NR_036918.1 21 Streptococcus ATCC 43765 suis strain AB002525.1 22 Streptococcus YS121 suis isolate KM972312.1 23 Streptococcus suis AF009502.1 24 Streptococcus suis AF009500.1 25 Streptococcus suis AF009504.1 26 Streptococcus suis AF009505.1 27 Streptococcus suis strain L008 FJ434461.1 mitis AF003932.1 strain NR_115560.1 strain JX207111.1 66 Phụ lục 2: Phổ FTIR thẻ PDMS carboxyl 67 Phụ lục 3: Phổ FTIR thẻ SPA ... NGHỆ NGUYỄN THỊ THÙY DUNG NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VÀ CỐ ĐỊNH ADN ĐẦU DÒ ỨNG DỤNG TRONG CẢM BIẾN ADN ĐỊNH HƯỚNG PHÁT HIỆN VI KHUẨN STREPTOCOCCUS SUIS GÂY BỆNH VI M MÀNG NÃO Chuyên ngành: Công nghệ... cảm biến ADN định hướng phát vi khuẩn Streptococcus suis gây bệnh vi m màng não Luận văn gồm nội dung sau: Thiết kế ADN đầu dò đặc trưng cho vi khuẩn S .suis Chế tạo thẻ sử dụng lần mang ADN đầu. .. cho vi c xây dựng cảm biến phát liên cầu khuẩn S .suis gây bệnh Theo định hướng nghiên cứu gắn với xu phát triển trên, thực luận văn với đề tài Nghiên cứu thiết kế cố định ADN đầu dò ứng dụng cảm