VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - LÊ THỊ LÝ NGHIÊN CỨU BIẾN NẠP GEN DOF1 VÀO MÔ SẸO PHÔI HÓA GIỐNG SẮN TMS 60444 THÔNG QUA VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Cán hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Văn Đồng Hà Nội, 2015 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - LÊ THỊ LÝ NGHIÊN CỨU BIẾN NẠP GEN DOF1 VÀO MÔ SẸO PHÔI HÓA GIỐNG SẮN TMS 60444 THÔNG QUA VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Cán hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Văn Đồng Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Hà Nội, 2015 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin trân trọng cảm ơn thầy, cô giáo tham gia giảng dạy Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật tận tình giảng dạy, dìu dắt thời gian học tập Viện Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Văn Đồng người thầy tận tình bảo, hướng dẫn suốt trình học tập, nghiên cứu khoa học thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể cán học viên làm việc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp hết lòng giúp đỡ thực thành công luận văn Cuối cùng, vô biết ơn gia đình bạn bè khích lệ, động viên, giúp đỡ chỗ dựa vững cho quãng thời gian qua Luận văn thực với hỗ trợ kinh phí từ Bộ Khoa học Công nghệ thông qua Hợp đồng Thực nhiệm vụ hợp tác quốc tế khoa học công nghệ theo nghị định thư số: 08/2013/HĐ-NĐT Tôi xin chân thành biết ơn hỗ trợ Hà Nội, tháng 12 năm 2015 Học viên Lê Thị Lý Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn MỤC LỤC MỞ ĐẦU 11 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .13 1.1 Giới thiệu chung sắn .13 1.1.1 Nguồn gốc phân loại sắn 13 1.1.2 Vai trò sắn 14 1.1.2.1 Vai trò sắn giới 14 1.1.2.2 Vai trò sắn Việt Nam .19 1.1.3 Giống sắn TMS 60444 21 1.2 Yếu tố phiên mã 21 1.2.1 Ứng dụng yếu tố phiên mã chọn giống phân tử 21 1.2.2 Yếu tố phiên mã Dof1 23 1.3 Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn A tumefaciens 26 1.3.1 Cơ sở khoa học phương pháp .26 1.3.2 Đặc điểm cấu trúc vi khuẩn Agrobacterium 27 1.4 Tình hình nghiên cứu chuyển gen sắn 33 1.4.1 Tình hình nghiên cứu chuyển gen sắn giới 33 1.4.2 Tình hình chuyển gen sắn Việt Nam .36 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.1 Vật liệu nghiên cứu 39 2.1.1 Mẫu thực vật .39 2.1.2 Vi khuẩn vector 39 2.1.3 Môi trường nghiên cứu .41 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 2.2 Phương pháp nghiên cứu 42 2.2.1 Nghiên cứu khả tạo mô sẹo phôi hóa 42 2.2.2 Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào mô sẹo phôi hóa 44 2.2.2.1 Chuẩn bị dung dịch khuẩn biến nạp .44 2.2.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ cefotaxime đến khả loại khuẩn thừa tái sinh từ mô sẹo phôi hóa sau biến nạp 45 2.2.2.3 Nghiên cứu nồng độ chất chọn lọc thực vật hygromycin thích hợp để chọn lọc mô chuyển gen .45 2.2.2.4 Nghiên cứu khả tái sinh thành hoàn chỉnh từ mô sẹo phôi hóa sau biến nạp chọn lọc chuyển gen 46 2.2.2.5 Phương pháp xác định có mặt gen Dof1 sau chuyển gen 46 2.2.3 Đánh giá đặc tính nông sinh học chuyển gen Dof1 điều kiện nhà lưới 48 2.2.3.1 Phương pháp đưa đất chăm sóc nhà lưới 48 2.2.3.2 Phương pháp đánh giá số đặc tính nông sinh học sắn trồng đồng ruộng 48 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 49 3.1 Kết tạo mô sẹo phôi hóa giống sắn TMS 60444 49 3.2 Kết chuyển gen Dof1 vào FEC giống sắn TMS 60444 52 3.2.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng mật độ khuẩn đến hiệu biến nạp gen Dof1 vào FEC giống sắn TMS 60444 53 3.2.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đồng nuôi cấy đến khả tiếp nhận gen Dof1 FEC giống sắn TMS 60444 55 3.2.3 Kết nghiên cứu hiệu diệt khuẩn cefotaxime ảnh hưởng đến khả sống sót tái sinh chồi từ FEC sau chuyển gen 57 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 3.2.4 Kết khảo sát hiệu gây chết chất chọn lọc hygromycin 60 3.2.5 Kết chọn lọc tái sinh chuyển gen sau biến nạp 62 3.2.6 Kết sàng lọc phân tích PCR kiểm tra có mặt gen Dof1 sau chuyển gen .65 3.3 Kết đưa vườn ươm đánh giá đặc tính nông sinh học chuyển gen Dof1 .70 3.3.1 Kết đưa vườn ươm 70 3.3.2 Kết đánh giá đặc tính nông sinh học chuyển gen Dof1 hệ T0 sau tháng trồng vườn ươm 72 3.3.3 Kết đánh giá đặc tính nông sinh học chuyển gen Dof1 hệ T0 sau tháng trồng nhà lưới 74 KẾT LUẬN .78 KIẾN NGHỊ 78 TÀI LIỆU THAM KHẢO 80 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Thành phần hóa học sắn sản phẩm sơ chế từ sắn so với loại lương thực khác [12] 17 Bảng 2: Năng lượng cung cấp trực tiếp cho người vùng nhiệt đới [12] 18 Bảng 3: Khái quát bước tạo mô sẹo phôi hóa sắn 43 Bảng 4: Thành phần điều kiện phản ứng PCR sử dụng mồi Dof1 F3/ Dof1 R3 47 Bảng 5: Kết tạo FEC từ chồi nách thùy non sắn TMS 60444 in vitro 49 Bảng 6: Hiệu diệt khuẩn cefotaxime ảnh hưởng đến tỉ lệ sống sót khả tái sinh FEC giống sắn TMS 60444 (sau tuần) 58 Bảng 7: Kết chọn lọc tái sinh FEC môi trường chứa hygromycin 63 Bảng 8: Kết đưa TMS 60444 chuyển gen Dof1 nhà lưới sau tháng 71 Bảng 9: Bảng đánh giá đặc tính nông sinh học chuyển gen Dof1 sau tháng trồng nhà lưới 72 Bảng 10: Bảng đánh giá đặc tính nông sinh học chuyển gen Dof1 sau tháng so với đối chứng điều kiện nhà lưới 75 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1: Hình thái sắn [58] .14 Hình 2: Hoạt động yếu tố phiên mã (TF) 22 Hình 3: Biểu Dof1 tăng biểu gen PEPC, PK, CS ICDH Arabidopsis chuyển gen Dof1 .24 Hình 4: Cấu tạo vi khuẩn A tumefaciens [4] 27 Hình 5: Cấu trúc biểu Ti-plasmid kiểu octopine kiểu nopaline 28 Hình 6: Sơ đồ cấu trúc Ti-plasmid [90] 30 Hình 7: Cơ chế biến nạp Agrobacterium vào tế bào thực vật [95] 32 Hình 8: Sơ đồ khái quát hệ thống sử dụng để tạo sắn chuyển gen [68] 35 Hình 9: Cây sắn TMS 60444 in vitro tháng tuổi 39 Hình 10: Sơ đồ vector pCAMBIA 1303 [75] 40 Hình 11: Sơ đồ vector pCAMBIA Dof1 [75] 40 Hình 12: Cụm mô sẹo phôi hóa giống sắn TMS 60444 44 Hình 13: Cụm mô sẹo giống sắn TMS 60444 hình thành phát triển môi trường từ nguồn vật liệu khác .51 Hình 14: Các khối FEC TMS 60444 hình thành phát triển môi trường MMS 52 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Hình 15: Ảnh hưởng mật độ dịch khuẩn khác đến khả tiếp nhận gen Dof1 FEC giống sắn TMS 60444 54 Hình 16: Ảnh hưởng nhiệt độ đồng nuôi cấy đến khả tiếp nhận gen Dof1 FEC giống sắn TMS 60444 56 Hình 17: Hiệu gây chết hygromycin lên FEC giống sắn TMS 60444 sau tuần 60 Hình 18: Các cụm FEC môi trường MMS bổ sung hygromycin nồng độ khác sau tuần chọn lọc 62 Hình 19: Kết chọn lọc tái sinh FEC môi trường tái sinh (MSN) chứa hygromycin qua giai đoạn khác 64 Hình 20: Kết kiểm tra rễ chuyển gen Dof1 môi trường chứa kháng sinh hygromycin .66 Hình 21: Kết điện di DNA tổng số kiểm tra chuyển gen Dof1 67 Hình 22: Kết điện di sản phẩm PCR kiểm tra có mặt gen HPT chuyển gen 68 Hình 23: Kết điện di sản phẩm PCR kiểm tra có mặt gen Dof1 chuyển gen .69 Hình 24: Kết đưa chuyển gen Dof1 đối chứng đất sau tháng 71 Hình 25: Cây TMS 60444 chuyển gen Dof1 đối chứng sau tháng trồng nhà lưới 73 Hình 26: Các TMS 60444 chuyển gen Dof1 đối chứng sau tháng trồng nhà lưới .77 Hình 27: Một số hình ảnh phân chạc đối chứng 77 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Bảng 10: Bảng đánh giá đặc tính nông sinh học chuyển gen Dof1 sau tháng so với đối chứng điều kiện nhà lưới Chỉ tiêu theo dõi Dof1 ĐC Độ bền Kém Trung bình Dạng thùy Ngọn giáo Mác elip Màu cuống Xanh Xanh phớt đỏ Màu Xanh đậm Xanh nhạt Số thùy Viền Mượt Mượt Màu gân Xanh Xanh phớt đỏ Hướng cuống Không Không Cao (cm) 123,7 ± 11,2 192,5 ± 8,9 Sự phân chạc Không phân chạc Phân chạc Kiểu chạc Mọc thẳng đứng 2-4 Hoa Chưa có Chưa có Kết theo dõi sau tháng trồng nhà lưới thể bảng 10, hình 26 hình 27 cho thấy chuyển gen Dof1 đối chứng phát triển tốt, chưa có hoa, viền mượt, hướng cuống không Tất chuyển gen Dof1 phát triển đồng hình thái phát triển có khác biệt đáng kể so với đối chứng nhiều đặc điểm như: màu sắc, hình dạng, chiều cao, số lượng thùy phân chạc Đa số mang gen Dof1 có thân, ngọn, gân cuống có màu xanh nhạt, trưởng thành có màu xanh đậm, có dạng hình giáo Trong tất đối chứng có thân trưởng thành màu xanh nhạt 75 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn cuống có màu xanh phớt đỏ, có dạng hình mác elip Tuy nhiên khả giữ chuyển gen Dof1 đối chứng Ở giai đoạn này, chuyển gen Dof1 đối chứng có chênh lệch đáng kể chiều cao trung bình so với giai đoạn tháng tuổi, chuyển gen Dof1 có chiều cao trung bình (123,7 cm) thấp so với đối chứng (192,5 cm), đồng thời chuyển gen Dof1 có kiểu hình mọc thẳng không phân chạc đối chứng hầu hết có phân chạc từ 2-4 chạc, tán xòe rộng dẫn đến tốn nhiều diện tích trồng sắn chuyển gen Dof1 Có thể thấy, tính trạng có lợi chuyển gen Dof1 giúp tiết kiệm diện tích, tăng mật độ trồng sắn, có tiềm mang lại suất tốt đơn vị diện tích canh tác so với đối chứng Như vậy, sau tháng trồng nhà lưới, chuyển gen Dof1 thích ứng với điều kiện khí hậu vùng phát triển tốt, thể nhiều đặc điểm khác biệt có lợi so với đối chứng Các theo dõi đánh giá tiếp giai đoạn tháng thu hoạch để phát thêm đặc điểm có lợi chuyển gen Dof1 so với đối chứng 76 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Hình 26: Các TMS 60444 chuyển gen Dof1 đối chứng sau tháng trồng nhà lưới Hình 27: Một số hình ảnh phân chạc đối chứng (vòng tròn đỏ biểu thị vị trí phân chạc) 77 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn KẾT LUẬN Tạo thành công FEC giống sắn TMS 60444, chồi nách giống sắn TMS 60444 cho hiệu tạo FEC cao hết thời gian thùy non Mật độ khuẩn OD600 = 0,5 thích hợp cho chuyển gen Dof1 vào FEC giống sắn TMS 60444; nồng độ 400 mg/l cefotaxime thích hợp cho loại khuẩn thừa sau biến nạp; nồng độ 20 mg/l hygromycine ngưỡng gây chết 100% FEC giống sắn TMS 60444 dùng để chọn lọc chuyển gen Dof1 Qua nghiên cứu chuyển gen tạo thành công 18 dòng sắn chuyển gen Dof1 đưa dòng sắn chuyển gen Dof1 hệ T0 trồng nhà lưới Cây chuyển gen Dof1 có đặc tính nông sinh học khác với đối chứng: màu xanh nhạt, màu xanh đậm, xẻ 5-7 thùy, thùy trung tâm có dạng hình giáo, gân cuống màu xanh khác với đối chứng có màu xanh tía, màu xanh nhạt, xẻ 7-9 thùy, thùy trung tâm có dạng hình mác elip, gân cuống có màu xanh phớt đỏ KIẾN NGHỊ - Tiến hành thí nghiệm phân tích sinh học phân tử (southern blot, northern blot…) để kiểm tra chuyển gen - Tiếp tục theo dõi đánh giá đặc tính nông sinh học chuyển gen Dof1 hệ T0 hệ 78 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn - Tiến hành thí nghiệm hóa sinh phân tích hàm lượng protein, axit amin chuyển gen Dof1 so với đối chứng không chuyển gen 79 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bùi Lan Anh, Nguyễn Phan Cẩm Tú, Trần Nguyên Vũ, Bùi Văn Lệ (2008), “Xây dựng quy trình biến nạp gen bar- gen kháng thuốc diệt cỏ vào khoai mì (Manihot esculenta Crantz) phương pháp bắn gen”, Tạp chí phát triển KH&CN, 11(1), tr 90-95 Hoàng Kim Anh, Ngô Kế Sương, Nguyễn Xích Liên (2005), Tinh bột sắn sản phẩm từ tinh bột sắn, Nhà xuất Khoa học Kĩ thuật Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nghị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng-Giáo trình cao học nông nghiệp, NXB Nông nghiệp Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2005), Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp, Trường ĐH Nông Nghiệp I Nguyễn Thị Hòa Vân (2009), Bước đầu nghiên cứu chuyển gen kháng sâu cryIAc vào hoa đồng tiền, Luận văn Thạc sĩ, Đại học Nông nghiệp Nguyễn Thị Hồng Hạnh Nguyễn Hưng Quang (2011), Hiện trạng sử dụng sắn phụ phẩm từ sắn chăn nuôi gia súc nhai lại Việt Nam, Tạp chí Khoa học công nghệ, 82(06): 59 – 63 Nguyễn Văn Đồng Lê Thị Thủy (2013), Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào việc nhân nhanh số giống sắn bệnh, Tạp chí Nông nghiệp phát triển Nông thôn, kỳ 1, tháng 5/2013 Nguyễn Văn Đồng, Nguyễn Anh Vũ, Lê Tiến Dũng, Tống Thị Hường, Lê Thị Ngọc Quỳnh, Lê Thị Lý, Vũ Anh Thu, Vũ Hoàng Nam, Vũ Thế Hà, Lê Huy Hàm, Chikako Utsumi, Yoshinori Utsumi, Motoaki Seki (2014), Kết tạo mô sẹo phôi hóa phục vụ cho chuyển gien vào sắn, Tạp chí Nông nghiệp Phát triển nông thôn, 8(1):29-35, 2014; Đính chính: Tạp chí Nông nghiệp Phát triển nông thôn, 9(2):147–148, 2015 80 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Phạm Văn Biên Hoàng Kim (1995), Cây sắn, NXB Nông nghiệp TP Hồ Chí Minh 10 Quách Vũ Quỳnh Hương, Nguyễn Đức Doanh, Nhữ Viết Cường, Hoàng Thị Ngát, Lê Thị Ánh Hồng (2006), Một số kết chuyển gen kháng nấm Chitinase gluconase vào sắn thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, Tạp chí Nông nghiệp phát triển nông thôn, 20, 41-44 11 Tổng cục thống kê (2014), Niên giám thống kê, NXB Thống kê 12 Trần Ngọc Ngoạn (2007), Giáo trình sắn, NXB Nông nghiệp Hà Nội 13 Trần Quốc Dung, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ (2006), Công nghệ chuyển gen (động vật, thực vật), Đại học Huế 14 Trần Thị Lệ, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Quốc Dung (2006), Giáo trình Công nghệ gen Nông nghiệp, Đại học Huế 15 Trần Văn Minh (2003), Công nghệ sinh học thực vật, Giáo trình cao học – nghiên cứu sinh, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh 16 Trịnh Đình Đạt (2006), Công nghệ sinh học tập – Công nghệ sinh học di truyền, Nxb Giáo Dục Tài liệu tiếng Anh 17 Abrahamian P and Kantharajah A (2011), "Effect of Vitamins on In Vitro Organogenesis of Plant", American Journal of Plant Sciences, 2, pp 669-674 18 Allem, A.C (2002), "The Origins and Taxonomy of Cassava", in Cassava: Biology, Production and Utilization, (Eds) R.J Hillocks, J.M Thresh, and A.C Bellotti CABI Publishing: New York, USA, pp 1-16 19 Baba A I., Nogueira F C S., Pinheiro C B., Brasil J N., Jereissati E S., Jucá T L., Soares A A., Santos M F., Domont G B And Campos F A P (2008), Proteome analysis of secondary somatic embryogenesis in cassava (Manihot esculenta), Plant Sci., 175, 717–723 doi: 10.1016/j.plantsci.2008.07.014 81 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 20 Bull S E., Owiti J A., Niklaus M., Beeching J R., Gruissem W and Vanderschuren H (2009) Agrobacterium-mediated transformation of friable embryogenic calli and regeneration of transgenic cassava, Nat Protoc., 4, 1845–1854 doi: 10.1038/nprot.2009.208 21 Ceballos H., Iglesias C A., Perez J C and Dixon A G O (2004), Cassava breeding: opportunities and challenges, Plant Mol Biol., 56: 503-16; PMID: 15630615; http:// dx.doi.org/10.1007/ s11103-004-5010-5 22 Ceballos H and G de la Cruz (2012), "Cassava Taxonomy and Morphology", in Ospina B and Ceballos H (Eds), Cassava in the Third Millenium: Modern Production, Processing, Use and Market System, CIAT Vol 377, CIAT Publication: Colombia, pp 15-28 23 Cheng M., Brenda A L., Spencer T M., Xudong Ye and Charles L Armstrong (2004), Invited transformation of review: Factors influencing monocotyledonous species Agrobacterium-mediated In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant, 40: 31–45 24 Cock J H (1982), Cassava: a basic energy source in the tropics, Science, 218, 755–762 25 Coruzzi G M & Zhou L (2001), Carbon and nitrogen sensing and signaling in plants: emerging ‘matrix effects’, Curr Opin Plant Biol , 247-253 26 Dai D., Hu Z., Pu G., Li H., Wang C (2006), Energy efficiency and potentials of cassava fuel ethanol in Guangxi region of China, Energy Convers Manage 47: 1686–1699 27 Dillen W., De Clercq J., Kapila J., Zambre M., Van Montagu M., Angenon G (1997), The effect of temperature on Agrobacterium tumefaciens-mediated gene transfer to plants, Plant J., 12:1459–1463 28 EE S F., Khairunnisa M B., Zeti-Azura M H., Noor Azmi S and Zamri Z (2014), Effective hygromycin concentration for selection of Agrobacteriummediated transgenic Arabidopsis thaliana, Malaysian Applied Biology, 43 (1) pp 119-123, ISSN 0126-8643 82 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 29 Fauquet C M (2008), Cassava: A Gift to the World and a Challenge for Scientists Paper presented at “Cassava meeting the challenges of the new millennium” hosted by IPBO- Ghent University, Belgium, 21-25 30 Foyer, C H & Ferrario, S (1994), Modulation of carbon and nitrogen metabolism in transgenic plants with a view to improved biomass production, Biochem Soc Trans., 22 , 909-915 31 Fukuda W M G., Guevara C L., Kawuki R and Ferguson M E (2010), Selected morphological and agronomic descriptors for the characterization of cassava, International Institute of Tropical Agriculture (IITA), Ibadan, Nigeria, 19pp 32 Gallardo F., Fu J., Canton F R., Garcia-Gutierrez A., Canovas F M & Kirby E G (1999), Expression of a conifer glutamine synthetase gene in transgenic poplar, Planta, 210 , 19-26 33 Gelvin S B (2003) Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the ‘‘gene-jockeying’’ tool, Microbiol Mol Biol Rev, 67:16–37 34 Gilberston R L.; Rojas M.R.; Russell D.; Maxwell D P (1991), The use of the asymmetric polymerase chain reaction and DNA sequencing to determinate genetic variability among isolates of bean golden mosaic geminivirus in the Dominican Republic, J Gen Virol., 72: 2843-2848 35 González A E., Schöpke C., Beachy N R N., MIFauquet C (1998), Regeneration of transgenic plants (Manihot esculenta Crantz) through Agrobacterium mediated transformation of embryogenic suspension cultures, Plant Cell Rep, 17: 827–831 36 Hoang Kim, Le Huy Ham, Manabu Ishitani, Hernan Ceballos, Nguyen Van Bo, Tran Ngoc Ngoan, Kazuo Kawano, Reinhardt Howeler, Rod Lefroy, Nguyen Phuong, Hoang Long, Nguyen Thi Le Dung, Tran Cong Khanh, Vo Van Quang, Dao Trong Tuan, Nguyen Minh Cuong, Nguyen Van Vu and Nguyen Van Dong (2013) Vietnam cassava breeding overview: the broad perspective Presentation to Kickoff Meeting of a Cooperative Research Project under the East Asia Joint Research Program (e-ASIA JRP) at AGI, Hanoi on Jan.8 and 9, 2013 83 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 37 Hoshi Y., Kondo M., Mori S., Adachi Y., Nakano M and Kobayashi H (2004), "Production of transgenic lily plants by Agrobacterium-mediated transformation", Plant Cell Rep, 22 (6), pp 359-364 38 Howeler R Aye T M (2015), Sustainable management of cassava in Asia – From research to practice, Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), 396, 148p 39 Ihemere U., Arias-Garzon D., Lawrence S and Sayre R (2006), Genetic modification of cassava for enhanced starch production, Plant Biotechnology Journal, 4, pp 453–465 40 Jaglo-Ottosen K R., Gilmour S J., Zarka D G., Schabenberger O & Thomashow M F (1998), Arabidopsis CBF1 overexpression inducees COR genes and enhances freezing tolerance, Science, 280, 104-106 41 Jin S X., Zhang X L., Liang S G., Nie Y C., Guo X P., Huang C (2005), Factors affecting transformation efficiency of embryogenic callus of Upland cotton (Gossypium hirsutum) with Agrobacterium tumefaciens, Plant Cell Tissue Organ Cult, 81:229-237 42 Joseph R., Yeoh H.-H and C.-S (2004), Loh Induced mutations in cassava using somatic embryos and the identification of mutant plants with altered starch yield and composition Plant Cell Reports 23(1-2): 91-98 43 Kasuga M., Liu Q., Miura S., Yamaguchi-Shinozaki K & Shinozaki K (1998), Improving plant drought, salt and freezing tolerance by gene transfer of a single stress-inducible transcription factor Nat Biotechnol 17, 287-291 44 Katagiri F., and Chua N H (1992), Plant transcription factors: Present knowledge and future challenges, Trends Genet, 8, 22–27 45 Koehorst-van Putten H J J., Sudarmonowati E., Herman M., Pereira-Bertram I J., Wolters A M A., Meima H., Vetten N., Raemakers C J J M., and Visser R G F (2012), "Field testing and exploitation of genetically modified cassava with low-amylose or amylose-free starch in Indonesia", Transgenic Research, 21(1), pp 39-50 46 Ladino J J., Echeverry M., Mancilla L I., Lopez D., Chavarriaga P., Tohme J and Roca W (2002), Genetic transformation of cassava: confirmation of 84 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn transgenesis in clone 60444 and analysis of CRY1Ab protein in transgenic lines Preliminary data on transformation of farmer-preferred cultivars SM1219-9 and CM3306-4 Annual Report, CIAT, Cali, Colombia 47 Lam H.-M., Coschigano K T., Oliveira I C., Melo-Oliveira R & Coruzzi G M (1996), The molecular-genetics of nitrogen assimilation into amino acids in higher plants, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol., 47, 569-593 48 Li H.-Q., Sautter C., Potrykus I and Puonti-Kaerlas J (1996), "Genetic transformation of cassava (Manihot esculenta Crantz)", Nat Biotech, 14(6), pp 736-740 49 Liu J., Zheng Q., Ma Q., Gadidasu K K and Zhang P (2011) Cassava genetic transformation and its application in breeding J Integr Plant Biol 53, 552–569 doi: 10.1111/j.1744-7909.2011.01048.x 50 Ma Q., Zhou W and Zhang P (2015), Transition from somatic embryo to friable embryogenic callus in cassava: Dynamic changes in cellular structure, physiological status, and gene expression profiles, Front Plant Sci., 6:824 doi:10.3389/fpls.2015.00824 51 Manyong V M., Dixon A G O., Makinde K O., Bokanga M and Whyte J (2000), The contribution of IITA-improved cassava to food security in subSaharan Africa: an impact study IITA Report, IITA, Ibadan, Nigeria 52 Maria A B., Shinichiro S., Kurt F and Jamie H D C (2008), Structural basis for hygromycin B inhibition of protein biosynthesis, Published by Cold Spring Harbor Laboratory Press, RNA, 14:1590–1599 53 Mena M., Vicente-Carbajosa J., Schmidt R.J., Carbonero P (1998), An endosperm-specific DOF protein from barley, highly conserved in wheat, binds to and activates transcription from the prolamin-box of a native β-hordein promoter in barley endosperm, Plant J., 16, 5362 54 Menkens A E., Schindler U and Cashmore A R (1995), The G-box: A ubiquitous regulatory DNA element in plants bound by the GBF family of bZIP proteins, Trends Biochem, Sci, 13, 506–510 55 Nosengo N (2003), Fertilized to death Nature 425, 894-895 85 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 56 Nyaboga E., Njiru J., Nguu E., Gruissem W., Vanderschuren H., and Tripathi L (2013) Unlocking the potential of tropical root crop biotechnology in east Africa by establishing a genetic transformation platform for local farmer preferred cassava cultivars Front Plant Sci 4:526 doi: 10.3389/fpls.2013 00526 57 Oliveira I C., Brears T., Knight T J., Clark A & Coruzzi G M (2002), Overexpression of Cytosolic Glutamine Synthetase Relation to Nitrogen, Light, and Photorespiration, Plant Physiol., 129, 1170-1180 58 Raemakers C J J M., Sofiari E., Jacobsen E., and Visser R G F (1997), "Regeneration and transformation of cassava", Euphytica, 96(1), pp 153-161 59 Raemakers K., Schreuder M., Pereira I., Munyikwa T., Jacobsen E., and Visser R (2001), "Progress made in FEC transformation of cassava", Euphytica, 120(1), pp 15-24 60 Rao R N., Allen N E., Hobbs J N., Alborn W E., Kirst H A., Paschal J W (1983), "Genetic and enzymatic basis of hygromycin B resistance in Escherichia coli", Antimicrobial Agents and Chemotherapy 24 (5): 689–95 61 Saini R., Singh R P., Jaiwal P K (2007) Agrobacterium tumefaciens-mediated transfer of Phaseolus vulgaris α-amylase inhibitor-1 gene into mungbean Vigna radiata (L.) Wilcaek using bar as selectable marker Plant Cell Rep 26:187–19 62 Sarria R., Torres E., Angel F., and Chavarriga P (2000), "Transgenic plants of cassava (Manihot esculenta) with resistance to basta obtained by Agrobacerium - mediated transformation", Plant Cell Rep., 19, pp 339-344 63 Schöpke C., Franche C., Bogusz D., Chavarriaga P., Fauquet C., Beachy N R (1993), "Transformation in Cassava (Manihot esculenta Crantz)", Plant Protoplast and Genetics Engineering IV, Biotechnology in Agriculture and Forestry, Springer-Verlag Berlin, Vol 23, pp 273-289 64 Siritunga D and Sayre R (2004), "Engineering cyanogen synthesis and turnover in cassava (Manihot esculenta)", Plant Molecular Biology, 56, pp 661–669 65 Sunilkumar G Rathore K S (2001), Transgenic cotton: factors influencing Agrobacterium-mediated transformation and regeneration, Mol Breed, 8:37–52 86 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 66 Taylor N J., Edwards M., Kiernan R J., Davey C D M., Blakesley D and Henshaw G G (1996), Development of friable embryogenic callus and embryogenic suspension culture systems in cassava (Manihot esculenta Crantz), Nat Biotechnol 14, 726–730 67 Taylor N J., Masona M V., Carcano R., Ho T., Schopke C., Fauquet C M (2001), Production of embryogenic tissues and regeneration of transgenic plants in cassava (Manihot esculenta Crantz) Euphytica 120:25-34 68 Taylor N., Chavarriaga P., Raemakers K., Siritunga D and Zhang P (2004), Development and application of transgenic technologies in cassava Plant Molecular Biology, 56: 671–688 69 Taylor T., Gaitán-Solís E., Moll T., Trauterman B., Jones T., Pranjal A., Trembley C., Abernathy V., Corbin D and Fauquet C M (2012), A Highthroughput platform for the production and analysis of transgenic cassava (Manihot esculenta) plants, Trop Plant Biol 5, 127–139, doi: 10.1007/s12042012-9099-4 70 Tripathi J N., Muwonge A., and Tripathi L (2012) Efficient regeneration and transformation protocol for plantain cultivar ‘Gonja Manjaya’ (Musa spp AAB) using embryogenic cell suspension In vitro Cell Dev Biol Plant 48, 216–224 doi: 10.1007/s11627-011-9422-z 71 Ubalua A O and Mbanaso ENA (2013), A Novelgene Transformation Technique for Farmer’s Preferred Cassava Cultivar (Nwibibi) from Nigeria, World Journal of Agricultural Sciences, (3): 284-289 72 Vicente-Carbajosa J., Moose S P., Parsons R., Schmidt R J (1997), A maize zinc-finger protein binds the prolamin box in zein gene promoters and interacts with the basic leucine zipper transcriptional activator Opaque2, Proc Natl Acad Sci USA , 94, 7685 7690 73 Vincent R., Fraisier V., Chaillou S., Limami M A., Deleens E., Phillipson B., Douat C., Boutin J.-P & Hirel B (1997), Overexpression of a soybean gene encoding cytosolic glutamine synthetase in shoots of transgenic Lotus corniculatus L plants triggers changes in ammonium assimilation and plant development, Planta, 201 , 424-433 87 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 74 Welsch R., Arango J., Bar C., Salazar B., Al-Babili S., Beltrán J., Chavarriaga P., Ceballos H., Tohme J and Beyer P (2010), Provitamin A Accumulation in Cassava (Manihot esculenta) Roots Driven by a Single Nucleotide Polymorphism in a Phytoene Synthase Gene, The Plant Cell, Vol 22: 3348– 3356 75 Xu W R., Wang Y J., Wang X P., Hao W., Sun M (2005), Construction of the plant expression vectors carrying resistant genes to powdery mildew and adversities in wild species of Vitis in China, Acta Botanic Boreali-Occidentalia Sinica 25:851–857 (in Chinese, with English abstract) 76 Xu J., Duan X G., Yang J., Beeching J R and Zhang P (2013), Enhanced reactive oxygen species scavenging by overproduction of superoxide dismutase and catalase delays post-harvest physiological deterioration of cassava storage roots, Plant Physiol., 161, 1517–1528 doi: 10.1104/pp.112.212803 77 Yanagisawa S., and Izui K (1993), Molecular cloning of two DNA binding proteins of maize that are structurally different but interact with the same sequence motif, J Biol Chem, 268, 16028–16036 78 Yanagisawa S (1995), A novel DNA binding domain that may form a single zinc finger motif, Nucleic Acids Res, 23, 3403–3410 79 Yanagisawa S (1996), Dof DNA binding proteins contain a novel zinc finger motif, Trends Plant Sci, 1, 213–214 80 Yanagisawa S and Sheen J (1998), Involvement of Maize Dof Zinc Finger Proteins in Tissue-Specific and Light-Regulated Gene Expression, The Plant Cell, Vol 10, 75–89 81 Yanagisawa S (2000), Dof1 and Dof2 transcription factors are associated with expression of multiple genes involved in carbon metabolism in maize, Plant J., 21, 281-288 82 Yanagisawa S (2002), The Dof family of plant transcription factors, Trends Plant Sci., , 555-560 83 Yanagisawa S., Akiyama A., Kisaka H., Uchimiya H & Miwa T (2004), Metabolic engineering with Dof1 transcription factor in plants: Improved 88 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn nitrogen assimilation and growth under low nitrogen conditions, Proc Natl Acad Sci USA 101, 7833-7838 84 Yanagisawa S (2004), Improved nitrogen assimilation using transcription factors, 85 Zainuddin I M., Schlegel K., Gruissem W and Vanderschuren H (2012), “Robust transformation procedure for the production of transgenic farmerpreferred cassava landraces”, Plant Methods, 8:24 86 Zhang P., Legris G., Coulin P & Puonti-Kaerlas J (2000), Production of stably transformed cassava plants via particle bombardment Plant Cell Rep., 19, 939–945 87 Zhang P., Phansiri S., Puonti-Kaerlas J (2001), Improvement of cassava shoot organogenesis by the use of silver nitrate in vitro, Plant Cell 88 Zhang P., Bohl-Zenger S., Puonti-Kaerlas J., Potrykus I., Gruissem W (2003), Two cassava promoters related to vascular expression and storage root formation, Planta, 218:192-203 Tài liệu World Wide Web 89 http://www.asiacreative.vn/en/tinh-hinh-san-xuat-va-tieu-thu-ethanol-tren-thegioi/ 90 https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Ti_plasmid.svg 91 http://hiephoisanvietnam.org.vn/chi-tiet-tin/xuat-khau-nong-san-9-thang-caphe-tut-sau-san-tang-vut 92 http://isa.ciat.cgiar.org/urg/csearchacc.do 93 http://orientbiofuels.com.vn/index.php/vi/cay-san/tong-quan-ve-cay-san 94 http://petrotimes.vn/san-trong-lo-trinh-san-xuat-ethanol-160145.html 95 www.science.leidenuniv.nl/index.php/ibl/van_heusden/research 96 http://www.vaas.org.vn/cay-sa-n-vie-t-nam-nghien-cu-u-pha-t-trie-na15192.html 89 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ... chọn giống sắn TMS 60444 giống sắn Vi n nghiên cứu Thụy Sĩ Hoa Kỳ đánh giá giống sắn dễ tạo mô sẹo phôi hóa chuyển gen thành công [69], [87] để thực đề tài: Nghiên cứu biến nạp gen Dof1 vào mô sẹo. .. vào mô sẹo phôi hóa giống sắn TMS 60444 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens , với mục đích tạo giống sắn TMS 60444 mang gen Dof1 kỹ thuật chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens. . .VI N HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VI T NAM VI N SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - LÊ THỊ LÝ NGHIÊN CỨU BIẾN NẠP GEN DOF1 VÀO MÔ SẸO PHÔI HÓA GIỐNG SẮN TMS 60444 THÔNG QUA VI KHUẨN