ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ THỊ KIM NGỌC SỬ DỤNG KỸ THUẬT CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN PHÂN TÍCH NƢỚC TIỂU HỖ TRỢ CHẨN ĐOÁN UNG THƢ ĐẠI-TRỰC TRÀNG Chuyên ngành: HÓA LÝ THUYẾT VÀ HÓA LÝ Mã số chuyên ngành: 62 44 31 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HĨA HỌC Tp Hồ Chí Minh – Năm 2017 Cơng trình hồn thành tại: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - HCM Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Phạm Ngọc Sơn PGS.TS Trần Lê Quan Phản biện 1: GS.TS Nguyễn Sào Trung Phản biện 2: PGS.TS Nguyễn Tiến Tài Phản biện 3: TS Trần thị Như Trang Phản biện độc lập 1: PGS.TS Nguyễn Tiến Tài Phản biện độc lập 2: PGS.TS Hà Thúc Huy Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp nhà nước, họp trường Đại học Khoa học Tự Nhiên – HCM vào lúc ngày tháng năm - Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM Thư viện Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên-HCM MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Ung thư đại-trực tràng trở thành ba loại ung thư hàng đầu nam giới nữ giới [4] Chẩn đoán phát bệnh giai đoạn sớm yếu tố quan trọng Phương pháp chẩn đoán ung thư đại-trực tràng phổ biến nội soi đại tràng sigma nội soi với sinh thiết khối u Đây cách thức chẩn đoán xâm lấn phức tạp chi phí cao Trong nghiên cứu ung thư phương pháp nghiên cứu phân tích phổ đồ, kết hợp với xử lý thống kê liệu phổ theo ngun tắc Phân tích tổng thể chất chuyển hóa (metabolomics) Một số cơng trình nghiên cứu gần sử dụng kỹ thuật NMR nhiên mẫu nghiên cứu mơ hình động vật (chuột) số lượng mẫu hạn chế không phù hợp với kỹ thuật thống kê Mục tiêu đề tài Luận án thực với số lượng mẫu lớn mẫu nước tiểu người Mục tiêu cụ thể nghiên cứu là: a/ Dựa phổ NMR, so sánh tranh tổng thể chất chuyển hóa mẫu nước tiểu nhóm bệnh nhân ung thư đại-trực tràng nhóm người không bệnh b/ Xác định thay đổi chất chuyển hóa nước tiểu bệnh nhân ung thư đại-trực tràng So sánh kết với cơng trình nghiên cứu tương tự giới c/ Thiết lập mơ hình phân biệt nước tiểu bệnh nhân ung thư đại-trực tràng so với người khơng bệnh Mơ hình đề xuất cơng cụ hỗ trợ chẩn đốn phát sớm ung thư đại-trực tràng theo cách không xâm lấn Ý nghĩa thực tiễn đề tài Kết thu được, việc cung cấp thêm kiện khoa học rối loạn chuyển hóa chất q trình tiến triển bệnh ung thư đại-trực tràng cịn hy vọng đưa đến kỹ thuật chẩn đoán khơng xâm lấn nhẹ nhàng cho bệnh nhân nhanh chóng dễ dàng kỹ thuật áp dụng Về mặt kinh tế kết hợp chẩn đoán đồng thời nhiều loại bệnh với chẩn đoán ung thư đại tràng lần phân tích mẫu nước tiểu giúp tiết kiệm chi phí xét nghiệm Về mặt xã hội phương pháp chẩn đoán giúp tầng lớp bệnh nhân có hội tầm soát phát sớm bệnh ung thư đại tràng giảm gánh nặng cho gia đình xã hội khoản chi phí lớn để điều trị bệnh ung thư Tính đề tài Đề tài thực theo phương pháp nghiên cứu tổng thể chất chuyển hóa chưa có nghiên cứu tương tự Việt nam Đề tài cho thấy khả phát triển kỹ thuật NMR kỹ thuật chẩn đoán sàng lọc Mặc khác kết luận án đóng góp vào thành tựu nghiên cứu phân tích tổng thể chất chuyển hóa, đem đến thay đổi lớn cách tiếp cận y tế chăm sóc sức khỏe Chƣơng 1.1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Ung thƣ đại-trực tràng: Các phương pháp chẩn đoán ung thư đại trực tràng là: Thử máu; Xét nghiệm chức gan; Sinh thiết; Siêu âm; CT Scan; MRI; X quang phổi; PET Scan [4] Ung thư đại-trực tràng xếp thành giai đoạn theo tiêu chí: mức độ khối u nguyên phát tình trạng hạch vùng tình trạng di xa (theo UICC) [2] Ở giai đoạn sớm cần phẫu thuật cắt bỏ khối u đủ Ở giai đoạn muộn cần điều trị đa mô thức gồm hóa trị xạ trị Một số xét nghiệm tầm soát là: FOBT; FIT; Nội soi đại tràng sigma; X quang [4] 1.2 Sinh hóa nƣớc tiểu Các tính chất hóa lý như: số lượng, màu, mùi, tỷ trọng pH… thay đổi theo điều kiện sinh lý bệnh lý [1] Thành phần vô nước tiểu gồm ion như: Na+, Cl-, Ca+2, NH4+, Mg+2, PO4-3, SO4-2…ít có giá trị xét nghiệm lâm Thành phần hữu chứa chủ yếu urea; acid uric, hormon, vitamin, enzym đặc biệt hàng trăm loại chất chuyển hóa xuất nước tiểu Khoảng 20-30 chất chuyển hóa thơng thường nghiên cứu định lượng [32] 1.3 Phân tích tổng thể chất chuyển hóa (metabolomics) Mục đích nghiên cứu nhằm so sánh tranh tổng quát chất chuyển hóa cá thể với cá thể khác hay tập hợp với tập hợp khác Từ nhận đặc trưng khác biệt kiểu so sánh dấu vân tay (giai đoạn fingerprinting) Sau xác định chất chuyển hóa số đóng vai trò chất đánh dấu sinh học gây nên khác biệt (giai đoạn profiling) Biến số Phân tích tổng thể chất chuyển hóa thường khoảng vài trăm biến Số lượng mẫu (cỡ mẫu) nghiên cứu phải lớn tương ứng [62] Ứng dụng quan trọng phương pháp phân tích tổng thể chất chuyển hóa nghiên cứu chất đánh dấu sinh học ung thư [59, 64, 72] thuốc điều trị ung thư [14, 30, 68, 72, 83] 1.4 Kỹ thuật cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) Các tín hiệu phổ NMR thể xác thành phần cấu trúc phân tử chất chuyển hóa thơng qua độ dịch chuyển hóa học hình dạng tín hiệu (mũi đơn hay mũi đa) Phần lớn nghiên cứu dùng phổ proton 1H-NMR-NOESY [10, 46, 75] Sau ghi phổ việc nhận danh phổ dựa phổ chuẩn nước tiểu phổ chuẩn hàng trăm chất chuyển hóa có sẳn thư viện phổ như: BioMagResBank [71], Human Metabolome Database (http://www.hmdb.ca) [3] Cường độ tín hiệu proton H2O lớn nên cần dùng kỹ thuật Xóa ghép mũi H2O Các phổ NMR khác như: phổ 13C-NMR có độ phân tán phổ rộng nhiều so với phổ 1H-NMR, nhiên độ nhạy thời gian ghi phổ kéo dài [8] Phổ 2D-NMR (NMR hai chiều) không bị chồng lấp tín hiệu cộng hưởng nên phát nhận danh nhiều chất chuyển hóa so với phổ 1D-NMR (NMR chiều) thời gian thâu phổ kéo dài [37, 57, 67], phổ biến phổ : HSQC; TOCSY ; COSY; HMBC 1.5 Phân tích liệu đa biến (MVA) Tùy theo mục đích nghiên cứu, dùng nhiều kỹ thuật khác nhau: 1- Kỹ thuật Phân tích cấu tử (Principal Component Analysis – PCA) nhằm đánh giá khái quát tập hợp mẫu Kỹ thuật khơng áp đặt tính chất cho tập hợp mẫu (unsupervised modelling), cho phép nhận biết chất tập hợp mẫu (các mẫu tương tự hay khác biệt), phát xu hướng phân bố tự nhiên tập hợp mẫu (sự phân nhóm điểm lệch…); 2- Kỹ thuật Bình phƣơng cực tiểu riêng phần (Partial Least Square - PLS) nhằm dự đốn tính chất mẫu Một tập hợp mẫu phân nhóm cách có định hướng theo tính chất đặc trưng biết trước (supervised modelling) Sự phân nhóm tạo thành mơ hình PLS Khi có mơ hình PLS đưa vào mẫu mới, xem mẫu phân bố vào nhóm mơ hình Từ dự đốn tính chất đặc trưng mẫu [17] Dữ liệu đầu vào cần dạng bảng số - gọi Bảng X Với bảng X gồm N dòng (N mẫu/phổ) K cột (K khoảng chia phổ), biểu diễn dạng N điểm phổ không gian K chiều Nguyên lý kỹ thuật PCA làm giảm đáng kể số chiều liệu mà mô tả gần phân bố mẫu PCA lập không gian mới, chiều ứng với biến ảo mới, gọi Cấu Tử Chính (PC) Mỗi PC hàm số tuyến tính biến số K ban đầu Sự phân bố tập hợp mẫu không gian PC gọi mơ hình PCA Trong khơng gian chiều mới, ví dụ PC1-PC2-PC3, chiếu tất điểm phổ lên mặt phẳng tọa độ tạo PC1-PC2 hình Hình 1.2: (a) PC1 PC2 không gian; (b) Mặt phẳng PC1-PC2 Các mẫu có thành phần tương tự có điểm phổ nằm gần mặt phẳng PC1- PC2 Tọa độ mẫu trục PC phương sai mẫu theo phương tương ứng gọi điểm số (Score) Mặt phẳng tạo PC1 - PC2 hình chiếu điểm phổ gọi Biểu đồ điểm số PC1-PC2 Các điểm lệch (outlier) điểm nằm tách biệt biểu đồ gây ảnh hưởng lớn đến phân bố mơ hình làm cho mơ hình bị lệch phía chúng Biểu đồ tải trọng chiều trông phổ 1H-NMR Cường độ tín hiệu thể mức độ đóng góp biến số tương ứng cấu tử gọi tải trọng (loading) Tín hiệu có cường độ mạnh tín hiệu chủ yếu gây phân nhóm điểm phổ Quan sát Biểu đồ chiều xác định chất chuyển hóa (tương ứng với tín hiệu có cường độ mạnh) góp phần quan trọng vào phân nhóm mẫu Biểu đồ tải trọng hai chiều biễu diễn tải trọng biến số cấu tử hình 1.4 Hình1.4: Biểu đồ tải trọng chiều hai chiều Nguyên lý kỹ thuật PLS: PLS bắt đầu với bảng liệu X Ngoài ra, cần bảng thơng tin thứ cấp, gọi bảng Y Mỗi dịng bảng Y mẫu tương tự bảng X Nhưng cột bảng Y nhóm thơng tin thứ cấp Thơng tin thứ cấp loại liệu Giá trị biến Y đại lượng vật lý đo lường mà số Thông thường giá trị biến Y số Kỹ thuật PLS tìm mối tương quan tốt bảng X Y, theo điều kiện áp đặt thông tin bảng Y Vậy sử dụng mơ hình PLS để dự đốn thơng tin bị thiếu mẫu khác Các mơ hình PLS PCA gồm Biểu đồ điểm số Biểu đồ tải trọng Chƣơng ĐỐI TƢỢNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vấn đề y đức nghiên cứu Nghiên cứu tuân thủ y đức vì: Bệnh nhân giải thích rõ mục tiêu đồng ý tham gia nghiên cứu; việc lấy mẫu nước tiểu không gây nguy hiểm; Tên địa bệnh nhân giữ bí mật; Bệnh nhân khơng trả thêm phí… 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu Mẫu thu thập Trung tâm Chẩn đoán Y khoa MEDIC từ tháng 3/2013 đến tháng 10/2014 (18 tháng) Sau mẫu phân tích mẫu Phịng thí nghiệm phân tích trung tâm-ĐHKHTN-ĐH QG TPHCM, Trung tâm Dịch vụ Phân tích Thí nghiệm-Sở KHCN TPHCM 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu cắt ngang Mẫu lấy trọn thời điểm Dân số nghiên cứu tất bệnh nhân đến khám bệnh lý đại-trực tràng làm nội soi chẩn đoán Tiêu chuẩn loại trừ bệnh lý rối loạn chuyển hóa gồm đái tháo đường suy thận mãn Tiêu chuẩn vàng nội soi đại-trực tràng kết hợp sinh thiết sang thương Cỡ mẫu trung bình cho nghiên cứu cắt ngang tính tốn 73 mẫu 2.4 Chuẩn hóa quy trình Hình 2.1: Sơ đồ bước tiến hành nghiên cứu Bác sĩ vấn bệnh nhân để ghi nhận Bảng khảo sát thông in (Phụ lục 1) lập Danh sách bệnh nhân (Phụ lục 2); thu thập kết nội soi đại tràng kết xét nghiệm giải phẫu bệnh; thu thập mẫu nước tiểu theo Phương pháp lấy mẫu nước tiểu dịng, bảo quản -80o C khơng q tháng đến đem phân tích Mẫu chuyển từ bệnh viện sang xử lý theo bước: Rã đơng mẫu nước tiểu đến nhiệt độ phịng 20 ÷ 30 phút; Ly tâm 6.000 vòng /phút ÷ 10 phút để tách cặn rắn; Chuyển 540 µl lớp dung dịch vào ống nghiệm 1.500 µl; Bổ sung 60 µl dung dịch đệm (pH 4); Làm mẫu cách ngâm bồn siêu âm phút rút mẫu cho vào ống đo NMR 5mm [43 57] Thiết bị phân tích hệ NMR Bruker AVANCE III 500 Ultrashield Plus Cryo Chu trình xung 1D-NOESY- PRESAT có xóa ghép tín hiệu H2O Số lần quét NS = 32 Tổng thời gian – phút/mẫu Phổ 1H-NMR xử lý phần mềm Topspin version 3.1 – Bruker Sau bước xử lý phổ NMR chuẩn hóa hay cịn gọi đồng hóa trước đưa vào phân tích thống kê đa biến: PCA PLS phần mềm AMIX version 3.9.12 - Bruker BioSpin Đồng hóa gồm bước : chia khoảng phổ 1H-NMR theo hình chữ nhật; cắt vùng phổ cần quan sát 9.50 ppm - 0.50 ppm; chia nhỏ phổ thành khoảng có độ rộng 0.05 ppm; chọn kiểu tích phân: cường độ (tích phân) khoảng phổ chia nhỏ lấy theo tỷ lệ giá trị tổng cường độ phổ; xác định tỷ xích phổ (scaling) theo cường độ tổng (scale to total intensity) ; gán cho tổng cường độ phổ giá trị ; loại bỏ vùng phổ khơng phân tích từ 6.5 ppm - 4.5 ppm Phân tích thống kê đa biến: PCA PLS tính phần mềm AMIX theo nguyên lý mục 1.5 Đánh giá phương pháp NMR Độ Nhạy (Sensivity) Độ Đặc Hiệu (Specificity) đồng thời xác định giá trị tiên đoán dương giá trị tiên đoán âm phương pháp Đánh giá phù hợp phương pháp NMR so với phương pháp tiêu chuẩn vàng số Jacob Cohen’s Kappa Chƣơng 3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Ghi phổ NMR Để tăng giá trị nghiên cứu mẫu thu thập nhiều cỡ mẫu quy định Tổng số mẫu thu thập 229 mẫu gồm 77 mẫu bệnh 152 mẫu lành Ghi phổ 77 phổ bệnh 152 phổ lành tương ứng 10 phân bố trái Biểu đồ tải trọng hai chiều (hình 3.8-B), khiến mẫu lành (dấu màu xanh) phân bố trái Biểu đồ điểm số (hình 3.8-A)  Hình 3.9-B thể rõ tín hiệu cộng hưởng 7.63 ppm 7.53 ppm 7.43 ppm 7.38 ppm 7.33 ppm 2.53 ppm 2.28 ppm 2.23 ppm 2.18 ppm 2.13 ppm…(± 0.025 ppm) phân bố phải - Biểu đồ tải trọng hai chiều (hình 3.8-B), khiến mẫu bệnh (dấu màu đỏ) phân bố phải - Biểu đồ điểm số (hình 3.8-A)  Hình 3.9-C thể rõ tín hiệu cộng hưởng 3.83 ppm 3.73 ppm 3.53 ppm, 3.48 ppm, 3.43 ppm…(± 0.025 ppm) phân tán phải – Biểu đồ tải trọng hai chiều (hình 3.8-B) gây phân tán mẫu bệnh (dấu màu đỏ) Biểu đồ điểm số (hình 3.8-A)  Nhận xét Biểu đồ tải trọng chiều (hình 3.8-C): Có mối tương quan Biểu đồ tải trọng hai chiều Biểu đồ tải trọng chiều Biểu đồ điểm số theo PC1-PC2 hình 3.8-A, 3.8-B, 3.8-C :  Các tín hiệu cộng hưởng 4.08 ppm 3.28 ppm 3.18 ppm 3.08 ppm 2.58 ppm, 1.23 ppm 1.18 ppm…phân bố phần tọa độ âm (-) trục PC1 Biểu đồ tải trọng hai chiều (hình 3.8-B) tương ứng với tín hiệu âm (-) Biểu đồ tải trọng chiều (hình 3.8-C) Tọa độ PC1 âm (-) điểm hình 3.8-B tương ứng với mức cường độ tín hiệu âm (-) hình 3.8-C Vậy xu hướng giảm hàm lượng chất chuyển hóa tương ứng nguyên nhân gây khác biệt nhóm mẫu bệnh nhóm mẫu lành, khiến mẫu phân bố tách nhóm Biểu đồ điểm số theo PC1-PC2 (hình 3.8-A)  Tương tự, tất tín hiệu cộng hưởng phân bố phần tọa độ dương (+) trục PC1 Biểu đồ tải trọng hai chiều (hình 3.8-B) tương ứng với tín hiệu dương (+) Biểu đồ tải trọng chiều (hình 3.8C) Tọa độ PC1 dương (+) điểm hình 3.8-B tương ứng với cường độ tín hiệu dương (+) hình 3.8-C Vậy xu hướng 18 tăng hàm lượng chất chuyển hóa tương ứng nguyên nhân gây khác biệt nhóm mẫu bệnh nhóm mẫu lành, khiến mẫu phân bố tách nhóm Biểu đồ điểm số theo PC1-PC2 (Hình 3.8-A) Biểu đồ tải trọng chiều (C) có hình dạng tương tự phổ 1HNMR nên việc nhận danh tín hiệu Biểu đồ tải trọng chiều (C) thực tương tự nhận danh phổ 1H-NMR cách xếp chồng phổ Từ xác định chất chuyển hóa có ý nghĩa quan trọng với hàm lượng tăng mạnh giảm mạnh creatinine/creatine (giảm) hippurate (tăng) phenylacetate (tăng) phenylacetylglutamine (tăng) p-cresol (tăng) tyrosine (tăng) có vai trị chất đánh dấu sinh học ung thư đại-trực tràng (ký hiệu chữ màu đỏ bảng 3.5) Bảng 3.5: Xu hướng biến đổi chất chuyển hóa ung thư đại-trực tràng stt Chất chuyển hóa Xu hướng biến đổi: (+) Tăng / (-) Giảm Creatinine / Creatine -/+ 10 11 12 13 14 15 Hippurate Glycine Citrate Trimethylamine N-Oxide Lactate Alanine Dimethylamine Taurine Methyl Succinate Leucine / Isoleucine Valine Phenylacetate Acetic Acid Phenylacetylglutamine + + + + 19 stt Chất chuyển hóa Xu hướng biến đổi: 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Threonine P.Cresol Acetoacetate Succinate Pyruvate Isocitrate Aspartate Trimethylamine Tyrosine Histidine Glutamate Betaine Serine Guanidoacetate Methionine (+) Tăng / (-) Giảm + + + + + + + + 3.6 Xác nhận giá trị phƣơng pháp NMR chẩn đoán ung thƣ đại-trực tràng Tính tốn số đặc trưng phương pháp : Độ nhạy = 89.6% ; Độ đặc hiệu = 90.3% ; Giá trị dự đoán dương tính = 84.1% ; Giá trị dự đốn âm tính = 94.6% Đánh giá phù hợp phương pháp : số Kappa = 0.80 Kết luận : Phương pháp NMR cho kết chẩn đoán sàng lọc phù hợp tốt với kết phương pháp nội soi sinh thiết giải phẫu bệnh 3.7 Kiểm chứng lâm sàng mơ hình chẩn đốn NMR Chọn số trường hợp bệnh án có vấn đề cơng tác chẩn đốn bệnh Đó trường hợp bác sĩ phải chẩn đoán lại nhiều lần số trường hợp có kết chẩn đốn sơ nội soi khác biệt so với kết giải phẫu bệnh 20 Trường hợp : Mẫu nước tiểu mã số 339  Kết nội soi: Ung thư đại tràng Sigma Bệnh nhân sinh thiết mô khối u để tiếp tục làm giải phẫu bệnh  Kết giải phẫu bệnh lần 1: Viêm ruột mạn tính khơng đặc hiệu Kết khác biệt so với kết chẩn đoán sơ Bệnh nhân làm lại nội soi sinh thiết giải phẫu bệnh  Kết giải phẫu bệnh lần 2: Carcinom tuyến, biệt hóa vừa đại tràng Đây kết luận sau Mẫu dùng kiểm chứng sau: Mẫu giả định “mẫu mù” đưa vào mơ hình PLS mà khơng kèm theo thông tin từ bệnh án Kế : mẫu phần mềm AMIX phân bố vào vùng mẫu bệnh Vậy kết chẩn đoán phương pháp NMR bệnh nhân bị ung thư đại-trực tràng phù hợp kết luận sau giải phẫu bệnh Trường hợp : Các mẫu nước tiểu mã số 101 175 184 296 có kết chẩn đốn sơ phương pháp nội soi khơng xác so với kết giải phẫu bệnh cụ thể sau: STT Mã số Kết nội soi 101 Ung thư đại tràng lên 175 184 296 Ung thư ống hậu môn-trực tràng Theo dõi ung thư trực tràng Ung thư trực tràng Kết giải phẫu bệnh Viêm ruột mạn tính khơng đặc hiệu Viêm ruột mạn tính khơng đặc hiệu Viêm ruột mạn tính khơng đặc hiệu Viêm ruột mạn tính khơng đặc hiệu Mơ hình PLS cho thấy mẫu 101 175 184 296 phần mềm AMIX phân bố vùng mẫu lành mơ hình Vậy kết chẩn đốn sàng lọc phương pháp NMR phù hợp kết giải phẫu bệnh 21 Chƣơng a BÀN LUẬN Kiểm soát q trình Kiểm sốt q trình thu thập bảo quản mẫu  Phải ghi nhận đầy đủ thông tin mẫu để giảm thiểu loại trừ khác biệt mẫu  Mẫu nước tiểu phải thu thập theo Phương pháp lấy mẫu nước tiểu dòng để tránh nhiễm khuẩn tế bào  Nước tiểu thu thập vào thời điểm cố định ngày tốt vào buổi sáng sớm bụng đói  Lưu mẫu -80oC không tháng để ổn định chất chuyển hóa  Độ dịch chuyển hóa học phổ NMR nhạy với pH Phải sử dụng dung dịch đệm Kiểm sốt q trình xử lý mẫu:  Chuẩn xác rút thể tích dung dịch chuyển vào ống NMR sai khác thể tích mẫu chứa ống NMR dẫn đến sai khác cường độ phổ thâu nhận  Chất bảo quản NaN3 thiết phải bổ sung, ngăn vi khuẩn tăng trưởng  Ly tâm lọc nước tiểu nhằm ngăn chặn tăng trưởng vi khuẩn gây sai lệch phổ NMR Kiểm soát kỹ thuật ghi phổ NMR  Một lượng chất nội chuẩn 3- (trimetylsilyl) propionic axit-2,2,3,3-d4 (TMSP-d4) thường thêm vào mẫu nước tiểu để lấy làm tọa độ tham chiếu 0.00 ppm  Nhiệt độ tối ưu 300oK (27oC) ±0.01oK  Thiết bị ổn định nhiệt BCU cần thiết hệ NMR sử dụng cho mục đích nghiên cứu hóa sinh Kiểm sốt q trình phân tích liệu đa biến  Kết phân tích đa biến phổ đồ phụ thuộc nhiều vào việc chuyển phổ đồ thành bảng số liệu ban đầu 22  Tiến hành lập bảng số liệu kỹ thuật phù hợp như: chọn kích thước khoảng chia chọn vùng phổ loại trừ… Xử lý kết hợp số liệu thống kê kiến thức phổ cần thiết để kết thí nghiệm có ý nghĩa đắn Kiểm sốt an tồn phịng thí nghiệm:  Cần lưu trữ mẫu nước tiểu quy định tuyệt đối tn thủ ngun tắc an tồn phịng thí nghiệm sinh học 4.2 Mơ hình chẩn đốn sàng lọc PLS  Các điểm phổ mẫu lành phân bố tập trung Nguyên nhân số mẫu lành thu thập nhiều  Đa số trường hợp dương tính giả (69%) bệnh nhân có bệnh lý khác tiêu hóa Đây nguyên nhân gây tượng dương tính giả  Các trường hợp âm tính giả đa số khơng có tiền sử bệnh bị bệnh thông thường Các ung thư khác chưa phát nguyên nhân gây tượng âm tính giả  Có thể tổng hợp kết nghiên cứu phân tích tổng thể chất chuyển hóa giới để xây dựng thành thư viện liệu biến đổi chất chuyển hóa nhiều loại bệnh  Biểu đồ điểm số PCA theo PC1 PC2 (hình 3.6) chia làm vùng rõ rệt phù hợp chất tự nhiên tập hợp mẫu: vùng mẫu bệnh vùng mẫu lành chứng tỏ quy luật biến đổi chất chuyển hóa xác định đặc trưng cho tình trạng bệnh hay khỏe mạnh  Mơ hình chẩn đốn kiểm chứng trường hợp lâm sàng, tất phù hợp với kết giải phẫu bệnh 4.3 So sánh độ nhạy, độ đặc hiệu phƣơng pháp NMR với nghiên cứu giới Độ nhạy độ đặc hiệu kỹ thuật NMR nghiên cứu 89.6% 90.3% Các nghiên cứu khác công bố độ nhạy độ đặc hiệu cao tương đương 23 4.4 So sánh kết xác định chất đánh dấu sinh học với nghiên cứu giới  Có 80% chất chuyển hóa biến đổi trùng với kết nghiên cứu Yunping Qiu cộng (2010) Trong chất đánh dấu sinh học ung thư đại-trực tràng hippurate, phenylacetate, phenylacetylglutamine, pcresol, succinate, tyrosine chất chuyển hóa có mạch vịng  Có 67% chất chuyển hóa biến đổi trùng với kết nghiên cứu Young Kee Chae cộng (2010) Creatinine chất chuyển hóa có hàm lượng giảm mạnh rõ rệt  Có 10% chất chuyển hóa pyruvate guanidoacetate dimethylamine chưa ghi nhận nghiên cứu khác Và 23% chất chuyển hóa serine, betaine, lactate, threonine, leucine/isoleucine, trimethylamine, glutamate - có xu hướng biến đổi khác biệt với nghiên cứu giới 4.5 Sự biến đổi chất chuyển hóa chế sinh ung thƣ Sự tăng nồng độ chất đánh dấu sinh học ung thư người bệnh làm tăng số nhóm cho proton (-OH, -NH) nhóm nhận proton (>C=O, >N- ) làm tăng khả tồn mối liên kết tạo thành chất chuyển hóa với nucleotide phân tử ADN thơng qua nhóm cho nhận proton, gây biến loạn mã di truyền ADN 4.6 Giới hạn nghiên cứu  Nhiều biến thực (khoảng 3000 tín hiệu) phân bố vào vùng phổ H-NMR rộng khoảng 10 ppm Khi chia khoảng phổ để phân tích liệu đa biến lại khơng thể chia q nhỏ để tăng độ xác bị giới hạn độ phân giải ổn định tín hiệu Sử dụng kỹ thuật tách mẫu LCMS để giảm bớt tín hiệu  Cần tăng số lượng mẫu nghiên cứu Tính tốn cỡ mẫu theo cơng thức tương quan độ nhạy độ đặc hiệu phương pháp NMR tỷ lệ lưu hành (prevalence) ung thư đại-trực tràng lên đến hàng ngàn mẫu 24  Đối tượng tham gia nghiên cứu người tìm đến khám bệnh viện nên kết chưa thật đại diện cho quần thể lớn  Kết nghiên cứu dừng dạng Nghiên cứu cắt ngang (crosssectional) chưa ứng dụng vào thực tế lâm sàng  Kết dương tính cần xác nhận phương pháp khác xét nghiệm nội soi siêu âm sinh thiết KẾT LUẬN  Luận án nghiên cứu “ Sử dụng kỹ thuật NMR để phân tích nước tiểu hỗ trợ chẩn đốn ung thư đại-trực tràng” đem lại đóng góp cho lĩnh vực khoa học chuyên ngành - Y học Luận án cơng trình nghiên cứu tiên phong giới thiệu xây dựng thử nghiệm phương pháp hỗ trợ chẩn đoán ung thư cịn giới chưa có Việt nam dựa kết hợp công cụ phân tích đại - Cộng hưởng từ hạt nhân - phương pháp thống kê đa biến  Khác với nghiên cứu tương tự giới luận án “ Sử dụng kỹ thuật NMR để phân tích nước tiểu hỗ trợ chẩn đoán ung thư đại-trực tràng” nghiên cứu mẫu nước tiểu bệnh nhân Việt Nam Ngoài đặc trưng riêng cá thể ảnh hưởng lên thành phần chất chuyển hóa tình trạng bệnh lý tình trạng sử dụng thuốc… thành phần chất chuyển hóa mẫu nước tiểu nghiên cứu mang tính chất đặc trưng chung người Việt Nam chủng tộc địa lý ẩm thực… Đây nguồn sở liệu phù hợp chuẩn xác tối ưu cho mơ hình chẩn đốn phát sớm ung thư đại-trực tràng áp dụng cho người Việt Nam  Luận án nghiên cứu “ Sử dụng kỹ thuật NMR để phân tích nước tiểu hỗ trợ chẩn đoán ung thư đại-trực tràng” khảo sát chuẩn hóa quy trình điều kiện thơng số cho nghiên cứu thc loại phân tích chất chuyển hóa loại mẫu sinh học tiêu biểu mẫu nước tiểu Đây 25 tảng cho nghiên cứu khác xa diện rộng dân số cho bệnh lý khác cho loại mẫu khác huyết nước bọt…  Luận án thực đầy đủ mục tiêu cụ thể đề ra: Xác lập mơ hình phân bố tổng thể mẫu bệnh mẫu lành Trên cho thấy xu hướng phân bố theo chất tự nhiên tập hợp mẫu, phân tách rõ rệt thành nhóm: nhóm mẫu bệnh nhóm mẫu lành Xác định chất chuyển hóa thay đổi đáng kể nước tiểu bệnh nhân ung thư đại-trực tràng so với người bình thường Những chất chuyển hóa tăng gồm hợp chất có mạch vịng hippurate, phenylacetate, phenylacetylglutamine, p-cresol, succinate, tyrosine Chất chuyển hóa giảm creatinine Có tương đồng chất chuyển hóa phát từ đề tài nghiên cứu kết khác công bố giới Thiết lập mơ hình phân biệt nước tiểu bệnh nhân ung thư đại-trực tràng so với nước tiểu người không mắc bệnh Mơ hình cơng cụ sàng lọc, hỗ trợ chẩn đoán bệnh ung thư đại-trực tràng đạt độ nhạy 89.6% độ đặc hiệu 90.3% Mơ hình có số Kappa 0.80 đánh giá phù hợp so với phương pháp chẩn đoán tiêu chuẩn vàng áp dụng  Kết nghiên cứu cho thấy khả mối liên quan số chất chuyển hóa có nồng độ tăng với nucleotide ADN chế gây ung thư Nếu tiến hành nghiên cứu tập hợp mẫu lớn kết luận hẳn củng cố từ cung cấp hiểu biết xác nguyên nhân trình tiến triển ung thư  Tóm lại, phương pháp nghiên cứu tổng thể chất chuyển hóa cho thấy khả phát triển kỹ thuật NMR kỹ thuật chẩn đoán sàng lọc Bên cạnh thành tựu nghiên cứu phân tích tổng thể chất chuyển hóa hứa hẹn đem đến thay đổi lớn cách tiếp cận bác sỹ chăm sóc sức khỏe người 26 PHƢƠNG HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO  Để hiệu lực hóa phương pháp nghiên cứu cần tiến hành tập hợp mẫu lớn  Mở rộng nguồn mẫu từ nhiều bệnh viện có chun khoa ung thư thay lấy từ nguồn  Có thể tiến hành nghiên cứu 03 thiết bị NMR từ trường đủ mạnh (11.7 Tesla - 500 MHz) có Việt nam  Cần tiến hành biện pháp: tăng số lượng mẫu nghiên cứu tăng số lượng mẫu “mù” để kiểm chứng lâm sàng sử dụng kỹ thuật thống kê khác để kiểm tra chéo mơ hình thống kê so sánh liên phịng thí nghiệm với tập hợp mẫu số phương pháp chuẩn hóa ngành y tế  Phân tích xác mức độ tăng / giảm nồng độ chất đánh dấu sinh học ung thư đại-trực tràng người bệnh phương pháp phân tích định lượng GC-MS, LC/MS/MS  Có thể tiếp cận việc chẩn đốn ung thư đại trực tràng theo hướng khảo sát mẫu nước tiểu bệnh nhân thuộc giai đoạn khác (từ giai đoạn I đến giai đoạn IV) so sánh với mẫu người không mắc bệnh Với cách tiếp cận chẩn đoán giai đoạn sớm có tính hiệu giúp can thiệp chữa bệnh kịp thời [23]  Mở rộng nghiên cứu bệnh lý đường tiêu hóa gan mật thận… có biểu rõ nét biến đổi chất chuyển hóa xuất nước tiểu 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nƣớc [1] Đỗ Quý Hai (2007) Giáo trình hóa sinh Đại học Huế http://hueuni.edu.vn/csdlkhoahoc/index.php/sachgiaotrinh/index/us er:20 [2] Giáo trình Giải phẫu bệnh: Ung thư Đại tràng – Đại học Y Dược Huế http://medicare.health.vn/cong-dong/tai-lieu/giai-phau-benh-ungthu-dai-trang [3] http://bachmai.gov.vn/index.php?option=com_content&task= view&id=1252 [4] http://www.benhvienk.vn/index.php/154-vn-root-category/tin-tuc/tintuc-chung/2118-hoi-thao-phong-chong-ung-thu-tphcm-lan-thu-15 [5] Lê Quang Nghĩa Phát sớm điều trị phòng ngừa ung thư đại tràng - trực tràng http://daitrang.vn/phat-hien-som-dieu-tri-vaphong-ngua-ung-thu-dai-trang-truc-trang-124/ Tài liệu nƣớc [8] Abdul-Hamid M Emwas et al (2013) “NMR-based metabolomics in human disease diagnosis: applications, limitations and recommendations” Metabolomics 9, pp.1048–1072 [10] Amathieu R et al (2011) “Metabolomic approach by1H NMR spectroscopy of serum for the assessment of chronic liver failure in patients with cirrhosis” Journal of Proteome Research 10 (7), pp 3239-3245 [14] Bertini Ivano et al (2011), “Metabolomic NMR fingerprinting to identify and predict survival of patients with metastatic colorectal cancer” http://cancerres.aacrjournals.org [17] Bruker BioSpin (2006) ”AMIX-Viewer & AMIX Software” [18] Carolyn M Slupsky et al (2010) “Urine Metabolite Analysis Offers Potential Early Diagnosis of Ovarian and Breast Cancers” Clinical Cancer Research 16, pp 5835-5841 [20] Cheng Y et al (2012) “Distinct urinary metabolic profile of human colorectal cancer” Journal of Proteome Research (11), p 1354 28 [30] Elion G.B et al (1954) “Antagonists of nucleic acid derivatives: Viii Synergism in combinations of biochemically related antichất chuyển hóa” Journal of Biological Chemistry 208, pp 47–488 [31] Engelke UFH, Oostendorp M, Wevers RA (2007) “ NMR spectroscopy of body fluids as a metabolomics approach to inborn errors of metabolism” The Handbook of Metabonomics and Metabolomics, pp 375–412 [32] Erik J.Saude et al (2012) “Variation of metabolites in normal human urine” Metabolomics Springer Science+Business Media, LLC 2007 [37] He Wen et al (2010) “A new NMR-based metabolomics approach for the diagnosis of biliary tract cancer” Journal of Hepatology 52, pp 228–233 [44] J Carrola et al (2011) “ Metabolic signatures of lung cancer in biofluids: NMR-based metabonomics of urine” Proteome Res J 10, pp 221–230 [46] Jukarainen N M et al (2008) “Quantification of 1H NMR spectra of human cerebrospinal fluid: a protocol based on constrained totalline- shape analysis” Metabolomics 4(2), pp 150-160 [53] Li H et al (2012) “Resolving structural isomers of monosaccharide methyl glycosides using drift tube and traveling wave ion mobility mass spectrometry”, Anal Chem 84(7), pp 3231–3239 [57] Olaf Beckonert et al (2007) “Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma serum and tissue extracts” Nature Protocons 11 Vol [59] Qian Bu et al (2012) “ Metabolomics: A Revolution for Novel Cancer Marker Identification” Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening 15, pp 266–275 [61] R M Salek et al (2007) “A metabolomic comparison of urinary changes in type diabetes in mouse rat and human” Physiol Genomics 29, pp.99-108 [64] Seyfried T Shelton L (2010) “Cancer as a metabolic disease” Nutr Metab 7, pp 29 [66] Souhaila Bouatra et al (2013) “The Human Urine Metabolome” Plos One 8(9), www.plosone.org [67] Tang H et al (2004) “Use of relaxation-edited one-dimensional and two-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy to improve detection of small chất chuyển hóa in blood plasma” Anal Biochem 325, pp 260–272 [68] Tennant D A et al (2010) “Targeting metabolic transformation for cancer therapy” Nat Rev Cancer 10, pp 26 –277 [71] Ulrich E L et al (2008), BioMagResBank Nucleic Acids Res 36, pp 402-408 [72] Vander Heiden M G (2011) “Targeting cancer metabolism: A therapeutic window opens” Nat Rev Drug Discov 10 p.671 [74] Vander Heiden M G et al (2009) “Understanding the warburg effect: The metabolic requirements of cell proliferation” Science 324 pp 1029–1033 [76] Wang J et al (2010) “1H-NMR-based metabolomics of tumor tissue for the metabolic characterization of rat hepatocellular carcinoma formation and metastasis” Tumor Biol., 32(1), p 223 [79] Wencheng Ge (2014) “NMR-Based Metabolic Profiling: Methods and Application in Cancer Biomarker Discovery” A dissertation submitted in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy (Chemistry) in the University of Michigan [82] Yan Ni et al (2014) “Metabonomics of Human Colorectal Cancer: New Approaches for Early Diagnosis and Biomarker Discovery” Journal of Proteome Research 13 3857−3870 [83] Yauch R L Settleman J (2012) “Recent advances in pathwaytargeted cancer drug therapies emerging from cancer genome analysis” Curr Opin Genet Dev 22, pp 45–49 30 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ Nơi cơng bố S Tên cơng trình (bài báo, cơng Tác tt trình ) Additionnal Information to giả Đồng Poster Hội nghị optical Spectroscopic Data on tác giả quang học quang bố Cancer Researches With phổ tòan quốc lần NMR Spectroscopy thứ VIII Using H-NMR Spectra For [1] Colorectal cancer Screening Năm công Báo cáo Hội 08/2014 11/2014 nghị Hóa học quốc tế VN- Malaysia Xây dựng mơ hình thử Vũ thị nghiệm thống kê đa biến nhận Kim biết ung thư đại trực tràng Bài báo đăng 02/2015 Tạp chí Hóa học Ngọc T 53(1) 90-94 Colorectal cancer Screening Đồng Báo cáo The 2nd By Using Urine NMR tác giả gene and dựa phổ NMR nước tiểu Spectra 9/2015 Innunotherapy Conference Studies of colorectal cancer [2] Bài báo đăng by nuclear magnetic International resonance spectroscopy Journal of Magnetism & Nuclear Science Int J Magn Nucl Sci 1(1), 1-5 31 1/2016 S Tên cơng trình (bài báo, cơng Tác tt trình ) Colorectal cancer Screening giả Vũ thị Nơi công bố Năm công bố Bài báo đăng By Using Urine NMR Kim Malaysian Journal Spectra Ngọc of Chemistry - 1/2016 MJChem 18(1) [1] Vũ thị Kim Ngọc, V.H.Thái, L.T.Tụ, P.T.Hải (2014), “Additionnal Information To optical Spectroscopic Data on Cancer Researches With Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy” Hội nghị quang học quang phổ tòan quốc lần thứ VIII [2] Nguyễn Tiến Tài Vũ thị Kim Ngọc Vũ Hùng Thái Lê Thành Tụ, Nguyễn Quang Tâm (2015) “Xây dựng mơ hình thử nghiệm thống kê đa biến nhận biết ung thư đại trực tràng dựa liệu phổ NMR mẫu nước tiểu” Tạp chí Hóa học T 53(1), pp 90-94 [3] Pham Van Huong, Vu thi Kim Ngoc, Vu HT, Thanh Le T, Phan TH (2015) “Studies of colorectal cancer by nuclear magnetic resonance spectroscopy” International Journal of Magnetism & Nuclear Science 1(1), pp 1-5 [4] Vu thi Kim Ngoc, Le Thanh Tu, Phan Thanh Hai, Pham Van Huong (2016) “Colorectal cancer Screening By Using Urine NMR Spectra” MalaysianJournal of Chemistry 18(1), pp 1-5 32 ... cho mơ hình chẩn đốn phát sớm ung thư đại- trực tràng áp dụng cho người Việt Nam  Luận án nghiên cứu “ Sử dụng kỹ thuật NMR để phân tích nước tiểu hỗ trợ chẩn đốn ung thư đại- trực tràng? ?? khảo... “ Sử dụng kỹ thuật NMR để phân tích nước tiểu hỗ trợ chẩn đoán ung thư đại- trực tràng? ?? nghiên cứu mẫu nước tiểu bệnh nhân Việt Nam Ngoài đặc trưng riêng cá thể ảnh hưởng lên thành phần chất chuyển... giới c/ Thiết lập mơ hình phân biệt nước tiểu bệnh nhân ung thư đại- trực tràng so với người khơng bệnh Mơ hình đề xuất cơng cụ hỗ trợ chẩn đốn phát sớm ung thư đại- trực tràng theo cách không xâm