GIỚI THIỆU
Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) là loài cá da trơn nước ngọt phổ biến ở Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL), được nuôi thương phẩm từ những năm 1998-2000 nhờ thành công trong nghiên cứu quy trình sinh sản nhân tạo của Khoa Thuỷ sản - Đại học Cần Thơ Từ đó, sản lượng cá tra đã tăng mạnh, từ 30.000 tấn năm 1994 lên hơn 500.000 tấn năm 2005 Tuy nhiên, ngành nuôi cá tra vẫn gặp phải nhiều thách thức, đặc biệt là các vấn đề liên quan đến dịch bệnh như đốm đỏ, trắng da, và bệnh do ký sinh trùng, gây thiệt hại lớn cho người nuôi.
Bệnh trắng gan, hay còn gọi là bệnh mủ gan, do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (E ictaluri) gây ra, là một trong những bệnh phổ biến và nghiêm trọng trong nuôi cá tra thâm canh, xuất hiện quanh năm Đồng thời, bệnh đốm đỏ, hay bệnh xuất huyết, cũng gây ảnh hưởng lớn đến sức khỏe của cá tra.
Aeromonas hydrophila (A hydrophila) gây ra trên nhiều loài cá nước ngọt trong đó có cá tra nuôi (Từ Thanh Dung, 2005)
Bệnh vi khuẩn là một vấn đề quan trọng trong nuôi trồng thủy sản, và việc điều trị chủ yếu dựa vào hóa chất hoặc thuốc kháng sinh như penicillin, streptomycin, chloramphenicol, oxytetracycline, và tetracycline Tuy nhiên, việc sử dụng lâu dài các loại thuốc kháng sinh gặp nhiều khó khăn, bao gồm chi phí cao và hiện tượng kháng thuốc, dẫn đến giảm hiệu quả điều trị Thêm vào đó, ô nhiễm môi trường nước và dư lượng kháng sinh trong sản phẩm thủy sản ảnh hưởng đến chất lượng xuất khẩu và sức khỏe người tiêu dùng Một giải pháp thay thế là sử dụng cây thảo dược để điều trị bệnh vi khuẩn, mặc dù hiệu quả không nhanh chóng nhưng giúp khắc phục những vấn đề do hóa chất gây ra Tại Thái Lan, Trung Quốc, Ấn Độ và Việt Nam, một số cây thảo dược tự nhiên đã được thử nghiệm làm thuốc trong ngành thủy sản, như chiết xuất từ cây đậu (Clinacanthus nutans) có khả năng ức chế bệnh Yellowhead Baculovirus trên tôm sú (Penaeus monodon).
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Theo nghiên cứu của Direkbusarakom & ctv (1995) và Kamei (1988), chiết suất thảo dược từ cây ổi (Psidium guajava) có khả năng phòng trị các bệnh vi rút như IHNV, IPNV, và OMV trên cá Ngoài ra, Thanh Dung (1996) đã thành công trong việc nghiên cứu ảnh hưởng của cây thảo dược đối với vi khuẩn A hydrophila, nguyên nhân gây bệnh xuất huyết trên cá trê lai.
Nghiên cứu về cách phòng trị bệnh cho cá tra (Clarias macrocephalus x C.gariepinus) bằng thảo dược vẫn còn hạn chế trong tài liệu khoa học hiện có Do đó, đề tài “Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc Natsol (kháng sinh thực vật) lên vi khuẩn E ictaluri và A hydrophila” được thực hiện nhằm làm phong phú thêm phương pháp điều trị và đa dạng hóa danh mục thuốc phòng trị bệnh cho cá.
Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc Natsol lên vi khuẩn A hydrophila và E ictaluri
Kiểm tra nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp pha loãng và môi trường thạch trên vi khuẩn A hydrophila và E ictaluri
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
3.1.2 Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm bộ môn sinh học và bệnh thuỷ sản, khoa Thuỷ sản, trường đại học Cần Thơ.
Vật liệu nghiên cứu
3.2.1 Hoá chất và môi ttrường
Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: nutrient agar (NA, Merck), nutrient broth (NB, Merck), muller hinton agar (MHA, Merck)
Các loại hoá chất nhuộm Gram: dd I (ammonium oxalate, crystal violet), dd II (iodine), dd III (cồn tuyệt đối, ethanol (Merck)), dd IV (safranin)
Dầu xem kính hiển vi
Que cấy, pel, khay nhựa, bình xịt cồn, giấy vệ sinh, bút lông, kính hiển vi, lame, đèn cồn, hột quẹt
Cốc thuỷ tinh, lọ thuỷ tinh, que trãi thuỷ tinh, đĩa petri, ống đong, ống nghiệm
Pipet 1-5ml, 100-1000àl, 10-100àl, 5-40àl
Đầu col 5ml, 1ml, 100àl; ống falcon 50ml thanh trựng
Cân điện tử, nồi thanh trùng, máy li tâm, máy so màu quang phổ, cuvette 3ml, máy lắc, máy trộn mẫu, máy đếm khuẩn lạc
Giấy lọc làm đĩa kháng sinh
Tủ ấm, tủ lạnh, tủ sấy, tủ cấy, nồi chưng cất (water-bath)
Máy ảnh, sổ ghi chép theo dõi hàng ngày
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Vi khuẩn E coli LMG8223 từ nguồn Đại học Ghent, vương quốc Bỉ
Vi khuẩn E ictaluri và A hydrophila đã được phân lập từ cá tra, với nguồn cung cấp từ Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy sản thuộc Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ Tất cả các vi khuẩn này được bảo quản ở nhiệt độ -80°C trong môi trường BHI lỏng kết hợp với glycerol.
Hai chủng vi khuẩn E ictaluri: E.223 và E.3B3 Hai chủng vi khuẩn A hydrophila: CAF2 và CAF133
Phương pháp nghiên cứu
3.3.1.1 Chuẩn bị vi khuẩn Nuôi cấy và phục hồi vi khuẩn
Vi khuẩn được phục hồi bằng cách cho vào ống nghiệm chứa 10ml dung dịch NB lỏng, ủ ở 28-30 độ C hoặc lắc trên máy lắc (200 vòng/phút) trong 18-24 giờ, sau đó cấy sang đĩa môi trường để kiểm tra tính thuần dựa vào hình thái, màu sắc khuẩn lạc và kết quả nhuộm gram Hai loài vi khuẩn E ictaluri và A hydrophila được cấy phục hồi và tách ròng trên môi trường thạch NA, ủ ở 28 độ C trong 24 giờ đối với A hydrophila và 48 giờ đối với E ictaluri Vi khuẩn đã thuần được nuôi tăng sinh trong môi trường.
NB lỏng, ủ trong tủ ấm ở 28 0 C hoặc lắc đều trên máy lắc từ 18-24 giờ (Rahman
Để xử lý vi khuẩn, cho chúng vào ống falcon 50 ml và tiến hành ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 phút Sử dụng nước muối sinh lý 0,85% NaCl đã tiệt trùng để rửa vi khuẩn, lặp lại quy trình này từ 2 đến 3 lần Sau lần ly tâm cuối cùng, thêm môi trường NB vào và trộn đều mẫu.
Xác định mật độ vi khuẩn
Sau khi ly tâm, cho môi trường NB vào để đánh tan phần vi khuẩn lắng, tiếp theo tiến hành so màu bằng máy so màu quang phổ Mật độ vi khuẩn được đo ở bước sóng 590nm, với OD=0,1±0,02 tương đương mật độ vi khuẩn A hydrophila là 1x10^8 cfu/ml và OD=0,01±0,002 tương đương mật độ vi khuẩn E ictaluri là 1x10^7 cfu/ml (Lương Trần Thục Đoan, 2006) Sau đó, mỗi chủng vi khuẩn được cấy trên môi trường NA để kiểm tra kỹ thuật chuẩn bị dung dịch vi khuẩn trước khi thực hiện nghiên cứu.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
3.3.1.2 Chuẩn bị dung dịch thuốc kháng sinh
Natsol là sản phẩm được cung cấp bởi công ty BIOFLAVONOIDS của Ấn Độ Để chuẩn bị dung dịch gốc Natsol, hòa tan 5ml Natsol trong 100ml nước cất để đạt nồng độ 50000 àl/l Sau đó, sử dụng phương pháp pha loãng hai lần (double dilution method) để tạo ra các nồng độ 24000, 12000, 6000, 3000, 1500, 750, 375, 187,5, 93,75, 46,875 và 26,4375 àl/l Trong đó, nồng độ 24000ppm và 1500ppm được pha từ nồng độ 50000ppm.
Bảng 3.1: Pha loãng nồng độ thuốc natsol cho hai chủng vi khuẩn theo phương pháp pha loãng hai lần Ống nghiệm
Nồng độ cần pha (ppm)
Thể tích thuốc kháng sinh natsol
Thể tích nước cất (ml)
Ống nghiệm có nồng độ thuốc 24000 và 1500ppm sẽ được pha loãng từ dung dịch gốc 50000ppm với natsol và ở chloramphenicol thì các nồng độ
512 và 128ppm pha loãng từ dung dịch gốc 1.024ppm (Bảng 3.3)
Cần lắc đều dung dịch thuốc trước khi pha loãng các nồng độ tiếp theo
Nồng độ thuốc sẽ giảm đi phân nửa khi cho dung dịch vi khuẩn vào
Ghi tên thuốc và nồng độ thuốc trước khi bắt đầu thí nghiệm
Trước khi pha loãng thuốc ở nồng độ tiếp theo, cần lắc đều dung dịch thuốc Lưu ý rằng, ở mỗi nồng độ pha loãng, hàm lượng thuốc sẽ giảm đi một nửa sau khi thêm dung dịch vi khuẩn (theo Bảng 3.2 và Bảng 3.4).
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Bảng 3.2: Nuôi vi khuẩn ở các hàm lượng thuốc natsol khác nhau (cho 1 chủng vi khuẩn) Ống MIC
Nồng độ thật thuốc natsol
Thể tích thuốc natsol (ml)
Thể tích vi khuẩn (ml)
Bảng 3.3: Pha loãng nồng độ thuốc chloramphenicol cho hai chủng vi khuẩn theo phương pháp pha loãng hai lần Ống nghiệm
Nồng độ cần pha (ppm)
Thể tích thuốc kháng sinh chloramphenicol (ml)
Thể tích nước muối sinh lý
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Bảng 3.4: Nuôi vi khuẩn ở các hàm lượng thuốc chloramphenicol khác nhau (cho 1 chủng vi khuẩn) Ống MIC
Thể tích thật thuốc kháng sinh chloramphenicol (ppm)
Thể tích thuốc kháng sinh (ml)
Thể tích vi khuẩn (ml)
Chuẩn bị dung dịch gốc chloramphenicol bằng cách pha 2 ống nghiệm thuốc gốc, mỗi ống 50 ml Ống thứ nhất chứa thuốc với hàm lượng 1024 ppm, trong khi ống thứ hai có hàm lượng 256 ppm Để pha chế, cần sử dụng dung môi phù hợp theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Pha thuốc với độ pha loãng từ 4-1024 ppm trong ống nghiệm 50ml, theo Bảng 3.2 Hàm lượng thuốc 512 ppm và 256 ppm được pha từ ống thuốc gốc 1024 ppm bằng cách thêm nước muối sinh lý, trong khi hàm lượng thuốc 128 ppm và 64 ppm cũng được pha chế tương tự.
32, 16, 8 và 4 ppm được pha từ ống gốc thứ 2 (256 ppm)
Tiến hành nghiên cứu thăm dò gồm các bước như sau:
Chuẩn bị dung dịch gốc natsol cho thí nghiệm thăm dò nồng độ thuốc natsol trên vi khuẩn E ictaluri, sử dụng chủng E.223, bắt đầu từ nồng độ gốc 50000ppm Các nồng độ được pha loãng lần lượt là 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000, 1000, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 và 10ppm, theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn (như 3.3.1.1)
Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp xác định MIC bằng phương pháp pha loãng
Cho 2 ml vi khuẩn vào mỗi ống nghiệm chứa 2 ml thuốc kháng sinh với các nồng độ 10-10000ppm.Tất cả các ống nghiệm và đĩa cấy kiểm tra ủ với điều kiện nhiệt độ 28-30 o C Sau 24 giờ đọc kết quả các ống MIC: so sánh độ đục giữa các ống MIC Kiểm tra khoảng ống MIC có độ đục khó phân biệt bằng cách kiểm tra sự phát triển của vi khuẩn trên đĩa petri môi trường thạch Tuỳ theo từng độ đục khác nhau mà ta có thể pha loãng theo nồng độ giảm dần sao cho có thể dễ dàng đếm các khuẩn lạc trên đĩa thạch Chọn nồng độ nào có mật độ vi khuẩn thấp nhất (giảm 80% so với mật độ vi khuẩn gốc) là nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Vì sau 24 giờ chưa đủ thời gian cho vi khuẩn E ictaluri phát triển trên đĩa môi trường Do đó, ghi nhận kết quả các ống MIC sau 24 giờ rồi ủ lại trong tủ ấm, để đủ 48 giờ đọc kết quả các ống MIC lại cùng với đĩa môi trường vi khuẩn E ictaluri
3.3.2.1 Phương pháp lập kháng sinh đồ
Kiểm tra độ nhạy của natsol lên vi khuẩn E ictaluri và A hydrophila bằng đĩa kháng sinh natsol, gồm các bước sau:
Chuẩn bị dung dịch gốc natsol (như 3.3.1.2) Chuẩn bị đĩa kháng sinh thảo dược:
Để chuẩn bị đĩa kháng sinh, bạn cần sử dụng giấy lọc và tạo thành những khoanh tròn nhỏ có đường kính khoảng 6mm, tương đương với đĩa kháng sinh thương mại Sau đó, hãy gói những đĩa giấy này bằng giấy nhôm và tiệt trùng chúng trong khoảng 2 giờ ở nhiệt độ 180°C.
Để chuẩn bị dung dịch thuốc kháng sinh, sử dụng chai tiệt trùng pha thuốc với nồng độ tương tự như đĩa kháng sinh thương mại Lấy khoảng 50 đĩa giấy tiệt trùng và ngâm vào 10ml dung dịch thuốc kháng sinh trong khoảng 24 giờ hoặc qua đêm Sau khi ngâm xong, dùng pel tiệt trùng để chuyển từng đĩa thuốc sang đĩa petri tiệt trùng cho đến khi chúng khô ở nhiệt độ phòng Cuối cùng, bảo quản các đĩa kháng sinh trong chai lọ tiệt trùng ở nhiệt độ 4 - 6 độ C để sử dụng lâu dài.
Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn (như 3.3.1.1) Lập kháng sinh đồ
Sử dụng pipet tiệt trùng để hút 0.2ml dung dịch vi khuẩn và cho vào môi trường thạch MHA Tiếp theo, dùng que trải thủy tinh đã tiệt trùng để trải đều dung dịch cho đến khi vừa khô Sau khoảng 1 phút, sử dụng pel tiệt trùng để lấy đĩa thuốc kháng sinh và đặt vào đĩa.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ hướng dẫn cách bố trí đĩa thuốc kháng sinh trên đĩa petri, yêu cầu khoảng cách giữa hai tâm đĩa kháng sinh là 24mm và khoảng cách từ tâm đĩa đến mép đĩa petri là 10-15mm Mỗi đĩa môi trường chỉ nên đặt tối đa 6 đĩa kháng sinh.
Tất cả các nồng độ thuốc được kiểm tra lặp lại từ 2-3 lần và ủ ở nhiệt độ 28°C Kết quả được đọc sau 48 giờ đối với vi khuẩn E ictaluri và sau 24 giờ đối với vi khuẩn A hydrophila, sau đó đo đường kính vòng vô trùng Vùng ức chế được xác định là đường kính vòng vô trùng ủ trong khoảng thời gian 24-48 giờ với sự sai khác gần nhất giữa các lần lặp lại.
3.3.2.2 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên môi trường thạch (Lila Ruangpan, 2004):
Nghiên cứu xác định nồng độ MIC của natsol đối với vi khuẩn E ictaluri và A hydrophila được thực hiện bằng phương pháp thạch theo Lila Ruangpan (2004), với một số điều chỉnh do thiếu dụng cụ trong phòng thí nghiệm Các bước thực hiện thí nghiệm sẽ được trình bày chi tiết để đảm bảo tính chính xác và hiệu quả của kết quả.
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch kháng sinh thực vật natsol (như 3.3.1.2)
KẾT QUẢ THẢO LUẬN
Kết quả nghiên cứu thăm dò khoảng nồng độ ức chế của thuốc kháng sinh thực vật natsol lên vi khuẩn gây bệnh trên cá tra
Thuốc kháng sinh Natsol chưa được nghiên cứu cho việc điều trị bệnh do vi khuẩn E ictaluri và A hydrophila trên cá tra, do đó chưa xác định được nồng độ thuốc phù hợp và khoảng nồng độ ức chế của thuốc đối với các vi khuẩn này Theo Từ Thanh Dung (1996), nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của kháng sinh từ Eugenia caryophyllus trên vi khuẩn A hydrophila gây bệnh trên cá trê vẫn cần được làm rõ.
Giá trị MIC của thuốc chiết xuất từ cỏ roi ngựa (Verbesina seriphioides) đối với vi khuẩn Bacillus subtilis là 31,2ppm (Luis Scardapane & ctv, 2006) Nồng độ thuốc kháng sinh thảo dược trong điều trị bệnh cá thường cao hơn so với thuốc kháng sinh thông thường Do đó, thí nghiệm thăm dò nồng độ thuốc natsol trên vi khuẩn E ictaluri với chủng E.223 được thực hiện ở các nồng độ cao: 10000; 8000; 6000; 5000; 4000; 3000; 2000; 1000; 500; 400; 300; 200; 100; 50; 45; 40; 35; 30; 25; 20; 15 và 10ppm.
Thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc natsol bằng môi trường lỏng cho thấy thuốc nhạy với vi khuẩn E ictaluri ở nồng độ cao từ 200-10000ppm, trong khi vi khuẩn vẫn phát triển ở nồng độ thấp 10-40ppm Độ đục của các ống MIC ở nồng độ 45, 50 và 100ppm có sự khác biệt rõ rệt so với các nồng độ cao và thấp Kiểm tra trên đĩa môi trường cho thấy vi khuẩn không phát triển ở nồng độ 100ppm nhưng chỉ phát triển rất ít ở 45 và 50ppm Do đó, nồng độ 45-100ppm được xác định là khoảng nồng độ ức chế của thuốc natsol đối với E ictaluri Kết quả thí nghiệm này cũng có thể làm cơ sở cho việc xác định MIC của thuốc natsol trên vi khuẩn A hydrophila gây bệnh trên cá tra.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Bảng 4.1: Kết quả nghiên cứu thăm dò nồng độ ức chế tối thiểu của thuốc kháng sinh thảo dược natsol trên vi khuẩn E ictaluri
Số lần lặp lại Nồng độ (ppm) 1 2 Số lần lặp lại
Dấu (-) tượng trưng cho độ trong của ống MIC, không có vi khuẩn phát triển
Dấu (-): ống MIC có độ trong rất trong, rất rõ ràng
Dấu ( ): ống MIC có độ trong không rõ ràng
Dấu ( -): ống MIC có độ đục khó phân biệt bằng mắt thường
Dấu (+) tượng trưng cho độ đục của ống MIC, có vi khuẩn tồn tại và phát triển trong ống MIC
Dấu (+): ống MIC có độ đục khó phân biệt bằng mắt thường
Dấu (++): ống MIC có độ đục hơi đục
Dấu (+++): ống MIC có độ đục rất đục, rất rõ rang
Xác định nồng độ MIC
Kết quả thí nghiệm cho giá trị MIC của thuốc kháng sinh Chloramphenicol trên vi khuẩn E.coli là 4àl/ml Theo Lila Ruangpan ctv (2004), thuốc khỏng sinh
Chloramphenicol cú giỏ trị MIC
