1 ĐẶT VẤN ĐỀ Nhiễm khuẩn bệnh viện (Hospital-Acquired Infections - HAI) (NKBV) nhiễm khuẩn mà bệnh nhân mắc phải thời gian nằm viện nguyên nhân gây tỷ lệ mắc, tử vong cao cho bệnh nhân bệnh viện giới [137] NKBV thường gây nên vi khuẩn kháng đa kháng sinh, gây nhiều khó khăn cho công tác điều trị, kéo dài thời gian mắc bệnh, nguy tử vong cao [112] Khi vi khuẩn kháng lại kháng sinh phải thay kháng sinh hệ có giá thành cao gây nên thiệt hại lớn kinh tế Tại liên minh châu Âu, tỷ lệ tử vong hàng năm bị nhiễm chủng vi khuẩn kháng thuốc 25.000 ca Mỹ 63.000 ca, gây thiệt hại cho kinh tế bao gồm chi phí điều trị tạo sản phẩm lao động Mỗi năm châu Âu 1,5 tỉ Euro Mỹ 1,87 tỉ đô la, cao nhiều chi phí cho công tác phòng chống bệnh cúm [43] Từ năm 2000, lây lan nhanh chóng chủng vi khuẩn Gram âm nguyên quan trọng gây nhiễm khuẩn bệnh viện có khả sinh enzyme (extended-spectrum beta-lactamases; ESBLs) ly giải hầu hết kháng sinh phổ rộng thuộc nhóm cephalosporin ghi nhận toàn giới [103] Carbapenem nhóm kháng sinh mạnh “thuộc nhóm lựa chọn cuối cùng” sử dụng để điều trị cho trường hợp bị nhiễm khuẩn bệnh viện nặng chủng vi khuẩn Gram âm sinh enzym ESBLs Tuy nhiên sử dụng rộng rãi loại kháng sinh tạo áp lực cho vi khuẩn kháng lại carbapenem [89] Enzym ly giải carbapenem mã hóa gen KPC, IMP VIM phát khắp nơi giới [89;108] Enzym OXA-48 ly giải carbapenem tập trung chủ yếu quốc gia vùng Địa Trung Hải, châu Âu Ấn Độ [82;101;102] Đặc biệt gần vào năm 2008, giới khoa học công bố thông tin chấn động, gây quan ngại lớn cho toàn giới việc phát chủng vi khuẩn kháng carbapenem mang gen New Delhi metallo-betalactamase-1 (NDM-1) bệnh nhân người Thụy Điển có tiền sử chữa bệnh Ấn Độ Các vi khuẩn mang gen NDM-1 có tính kháng kháng sinh mạnh, khả lây lan nhanh, dẫn đến nguy làm giảm hiệu vô hiệu hóa nhóm kháng sinh quan trọng thực hành lâm sàng Hiện chủng vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 báo cáo lây lan nhiều quốc gia giới [70;89;140] Điều cho thấy tính kháng kháng sinh vi khuẩn diễn đa dạng, phức tạp, xu hướng kháng kháng sinh ngày gia tăng nguy hiểm Đây vấn đề y tế nghiêm trọng mang tính toàn cầu tổ chức Y tế Thế giới cảnh báo, nghiên cứu kịp thời đưa giải pháp nhanh chóng hiệu kháng sinh để điều trị hiệu cho vi khuẩn – 10 năm tới Ở Việt Nam, nhiều báo cáo cho thấy tình trạng vi khuẩn kháng kháng sinh bệnh viện mức độ cao Trong báo cáo gần cho thấy số bệnh viện thành phố Hồ Chí Minh, vi khuẩn gram âm nguyên thường gặp gây nhiễm khuẩn bệnh viện kháng lại cephalosporin hệ gia tăng từ 25% năm 2000-2001 lên đến 42% vào năm 2009 [49] Kháng sinh nhóm carbapenem đưa vào thị trường Việt Nam vào đầu năm 2000 xu hướng sử dụng nhóm kháng sinh ngày gia tăng mở rộng đặc biệt bệnh viện lớn Hai nguyên gây nhiễm khuẩn bệnh viện thường gặp P aeruginosa A baumannii đánh giá bệnh viện năm 2008 cho thấy: 20% chủng P aeruginosa 50% chủng A baumannii kháng kháng sinh nhóm carbapenem [49] Bệnh viện Việt Đức bệnh viện ngoại khoa đầu ngành với qui mô 500 giường bệnh, năm bệnh viện thực khoảng 28.000 ca phẫu thuật thuộc nhiều chuyên khoa sâu, tình trạng tải, gây nhiều khó khăn cho công tác phòng chống nhiễm khuẩn Kháng sinh chiếm tỷ lệ lớn cấu thuốc sử dụng, kháng sinh hệ cephalosporin đặc biệt kháng sinh nhóm carbapenem sử dụng thường xuyên bệnh viện, điều dẫn đến nguy cao cho vi khuẩn kháng kháng sinh nói chung có carbapenem Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu đầy đủ, toàn diện tình trạng kháng kháng sinh nói chung đặc biệt nghiên cứu vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 Vấn đề vi khuẩn kháng carbapenem vấn đề nên chưa có nghiên cứu vấn đề Việt Nam Việc có hiểu biết chuyên sâu vấn đề bao gồm : dịch tễ học, lâm sàng, yếu tố nguy cơ, đặc điểm vi sinh sinh học phân tử vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 cấp thiết vô quan trọng giai đoạn Những số liệu khoa học giúp cho nhà chuyên môn, nhà quản lý nhà hoạch định sách y tế việc định hướng sử dụng thuốc, phối hợp thuốc đưa giải pháp khống chế lây lan vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 bệnh viện cộng đồng Việt Nam Chính cần thiết ý nghĩa thực tiễn nêu tiến hành đề tài nghiên cứu: “Một số đặc điểm dịch tễ học nhiễm khuẩn bệnh viện vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 bệnh viện Việt Đức-Hà Nội, 2010-2011” với mục tiêu cụ thể sau Mô tả số đặc điểm dịch tễ học bệnh nhân nhiễm khuẩn bệnh viện vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 phân lập bệnh viện Việt ĐứcHà Nội Mô tả tình trạng ô nhiễm vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 số mẫu môi trường bệnh viện Việt Đức Xác định số đặc điểm sinh học phân tử số chủng vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nhiễm khuẩn bệnh viện Nhiễm khuẩn bệnh viện: “Là nhiễm khuẩn xảy sau 48 kể từ vào viện, nhiễm khuẩn không xuất hay giai đoạn ủ bệnh lúc nhập viện” Định nghĩa bao gồm nhiễm khuẩn bệnh nhân sau viện nhiễm khuẩn nghề nghiệp nhân viên y tế bệnh viện [137] Dựa định nghĩa này, định nghĩa riêng, đơn giản không cần sử dụng tất kỹ thuật chẩn đoán phát triển cho loại nhiễm khuẩn bệnh viện thường gặp, qua sử dụng cho công tác giám sát nhiễm khuẩn bệnh viện thiếu hụt trang thiết bị chẩn đoán đại (bảng 1.1) [48;59;80;137] Bảng 1.1 Phân loại nhiễm khuẩn bệnh viện Loại nhiễm khuẩn Nhiễm khuẩn vết mổ Nhiễm khuẩn tiết niệu Nhiễm khuẩn đường hô hấp Nhiễm khuẩn đặt catheter Nhiễm khuẩn huyết Tiêu chuẩn Có dịch chảy từ vết mổ, abcess viêm mô lan tỏa vết mổ tháng sau phẫu thuật Nuôi cấy dương tính (1 vi khuẩn) với nồng độ >105vk/ml, có triệu chứng lâm sàng Có tối thiểu triệu chứng viêm nhiễm đường hô hấp xuất thời gian nhập viện: - Ho - Có đờm mủ - Có hình ảnh viêm phổi phim Xquang Có biểu viêm, hạch có mủ chảy từ vị trí đặt catheter Sốt rét kết cấy máu dương tính với tác nhân gây bệnh Hiện nhiễm khuẩn bệnh viện vấn đề nghiêm trọng tác động đến sức khoẻ toàn cầu Theo báo cáo tổ chức Y tế giới nhiễm khuẩn bệnh viện từ năm 1995 đến 2010 cho thấy: Tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện tính chung cho quốc gia có thu nhập cao nằm khoảng từ 5% đến 12% (hình 1.1) tỷ lệ chung cho tất quốc gia vào khoảng 7,6% [138] Theo ước tính trung tâm phòng chống kiểm soát bệnh châu Âu, hàng năm có khoảng 4.100.000 bệnh nhân bị nhiễm khuẩn bệnh viện khoảng 37.000 trường hợp tử vong Phần lớn trường hợp nhiễm khuẩn tiết niệu nhiễm khuẩn đường hô hấp, nhiễm khuẩn sau phẫu thuật, nhiễm khuẩn huyết số nhiễm khuẩn khác (bao gồm tiêu chảy Clostridium difficile) S aureus kháng đa kháng sinh chiếm khoảng 5% trường hợp nhiễm khuẩn bệnh viện liên minh châu Âu [40] Tại Mỹ năm 2002, tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện vào khoảng 4,5% tương đương với khoảng 1,7 triệu bệnh nhân bị mắc nhiễm khuẩn Nhiễm khuẩn đường tiết niệu chiếm tỷ lệ cao (36%) nhiễm khuẩn vết mổ (20%), nhiễm trùng huyết viêm phổi (11%) [5;67] Hình 1.1 Tỷ lệ phân bố nhiễm khuẩn bệnh viện nước có thu nhập cao *(nguồn WHO, 2011, Report on the Burden of Endemic Health CareAssociated Infection Worldwide) [138] Tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện quốc gia có thu nhập trung bình thấp dao động từ 5,7% đến 19,9% tỷ lệ tính chung khoảng 10,1/100 bệnh nhân (hình 1.2) [138] Trong nhiễm khuẩn vết mổ chiếm tỷ lệ cao (29,1%), nhiễm khuẩn tiết niệu (23,9%), nhiễm khuẩn huyết (19,1%), đường hô hấp (14,8%) nhiễm khuẩn khác 13,1% [138] Hình 1.2 Tỷ lệ phân bố nhiễm khuẩn bệnh viện nước có thu nhập thấp trung bình *(nguồn WHO, 2011, Report on the Burden of Endemic Health Care-Associated Infection Worldwide) [138] Có nhiều tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện tác động tác nhân khác nhóm bệnh nhân, bệnh viện, khoa điều trị quốc gia bao gồm: vi rút viêm gan B, C (lây qua đường tiêm truyền, chạy thận nhân tạo phẫu thuật nội soi) Vi rút rota vi rút đường ruột (lây truyền qua đường phân-miệng) [5;138] Một số loại ký sinh trùng Giardia lamblia nhiều loại nấm Candida albicans, Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans Cryptosporidium gây nhiễm trùng hội cho bệnh nhân sau điều trị kháng sinh dài ngày bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch lây truyền dễ dàng bệnh viện [137] Hiện vi khuẩn nguyên quan trọng hàng đầu gây nhiễm khuẩn bệnh viện bao gồm C perfringen nguyên nhân gây bệnh hoại thư sinh bệnh viện [137] Vi khuẩn Gram dương điển hình S aureus (sống ký sinh da mũi) nguyên nhân gây nhiều loại nhiễm khuẩn bệnh viện viêm phổi, xương, tim nhiễm khuẩn huyết [137] Đặc biệt 10 năm vừa qua vi khuẩn Gram âm Escherichia coli (E coli), Klebsiella pneumoniae (K pneumoniae), Pseudomonas aeruginosa (P aeruginosa) Acinetobacter baumanii (A baumannii) nguyên nhân quan trọng gây nhiễm khuẩn nặng bệnh viện nhiễm khuẩn vết mổ, viêm phổi, nhiễm khuẩn huyết, đặc biệt vi khuẩn kháng lại nhóm kháng sinh thệ đắt tiền sử dụng để điều trị nhiễm khuẩn bệnh viện cephalosporin carbapenem kháng sinh mạnh gia tăng cách nhanh chóng toàn giới Điều đe doạ thực đến hiệu điều trị cho bệnh nhân bệnh viện toàn giới [8;42;70;103;140] 1.2 Kháng sinh đề kháng kháng sinh vi khuẩn Việc phát minh kháng sinh kỷ 20 đóng vai trò quan trọng việc khống chế bệnh nhiễm trùng Cùng với việc cải thiện điều kiện vệ sinh, nhà ở, dinh dưỡng chương trình tiêm chủng mở rộng góp phần quan trọng làm giảm tỷ lệ tử vong bệnh nhiễm trùng tuổi thọ người nâng cao Cho đến nhiều hệ kháng sinh khác nghiên cứu chế tạo thành công đáp ứng kịp thời cho công tác điều trị Tuy nhiên gia tăng tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh bệnh viện cộng đồng vấn đề quan trọng hàng đầu giới cần nghiên cứu tìm giải pháp phòng chống cách hiệu 1.2.1 Lịch sử phát triển kháng sinh Năm 1929 Alexander Fleming người nghiên cứu phát minh loại thuốc kháng sinh có tên Penicillin, nghiên cứu tác giả quan sát thấy đĩa thạch bị nhiễm nấm penicillin (mold penicillin notatum) có khả ức chế phát triển tụ cầu, đĩa thạch xuất vòng vô khuẩn xung quanh khóm nấm tụ cầu khả mọc xung quanh khóm nấm Sau tác giả tiến hành nhiều thử nghiệm thấy huyền dịch nuôi cấy nấm có khả ức chế phát triển tụ cầu pha loãng huyền dịch nấm nuôi cấy tới 800 lần, hoạt chất đặt tên penicillin [115] Tuy nhiên phải đến năm 1939, Ernst Chain Howard Florey tách chiết thành công hoạt chất penicillin sử dụng để điều trị bệnh nhiễm khuẩn chiến tranh giới lần thứ II Năm 1946, penicillin bắt đầu sử dụng lâm sàng có đóng góp to lớn cho y học Những phát minh tạo cách mạng khoa học y học đại làm tiền đề nghiên cứu phát triển nhiều hợp chất kháng sinh có nguồn gốc từ thiên nhiên [29;115] Bác sỹ người Đức Gerhard Domagk công bố phát minh tổng hợp hoạt chất kháng sinh prontosil Đây hệ kháng sinh thuộc dòng sulfonamides sử dụng lâm sàng để điều trị bệnh nhiễm trùng đường tiết niệu hô hấp số bệnh nhiễm trùng khác Với phát minh Gerhard Domagk nhận giải thưởng Nobel năm 1939 [115] Thập kỷ 50 đến 70 kỷ 20 coi thời kỳ hoàng kim kháng sinh, nhiều loại kháng sinh giới thiệu bao gồm: streptomycin, chloramphenicol tetracycline sử dụng điều trị bệnh nhiễm trùng vi khuẩn Các loại thuốc khác para aminosalisylic acid isoniazid nghiên cứu, sản xuất thành công sử dụng rộng rãi để điều trị bệnh lao [31;115] Cho đến với phát triển khoa học kỹ thuật, nhiều nhóm hệ kháng sinh khác cephalosporins, fluoroquinolones, macrolides carbapenem nghiên cứu sản xuất thành công, góp phần to lớn cho công tác phòng điều trị bệnh nhiễm trùng 1.2.2 Sự đề kháng kháng sinh vi khuẩn 1.2.2.1 Sự phát triển đặc tính kháng kháng sinh vi khuẩn Trong tự nhiên phần lớn vi khuẩn sở hữu riêng gen kháng kháng sinh Điều quan sát thấy số chủng Staphylococcus đề kháng với penicillin sau đưa vào sử dụng năm 1946 Dưới áp lực chọn lọc tự nhiên đấu tranh sinh tồn giúp loài vi khuẩn có khả chống lại tác dụng kháng sinh, đề kháng kháng sinh vi khuẩn thường xuất nhanh sau kháng sinh đưa vào sử dụng, ví dụ streptomycin đưa vào sử dụng năm 1943 đến năm 1959 vi khuẩn lại kháng kháng sinh (bảng 1.2) Tương tự chủng Shigella dysenteriae phân lập vụ dịch lỵ Nhật Bản năm 1953 kháng đa kháng sinh bao gồm: chloramphenicol, tetracyclin, streptomycin sulfonamide Hiện hầu hết vi khuẩn gây bệnh kháng lại nhiều loại kháng sinh [127] Bảng 1.2 Sự phát triển đề kháng kháng sinh vi khuẩn [127] Năm sử dụng Năm phát đề kháng kháng sinh Sulfonamid 1930 1940 Penicillin 1943 1946 Streptomycin 1943 1959 Chloramphenicol 1947 1959 Tetracyclin 1948 1953 Erythromycin 1952 1988 Vancomycin 1956 1988 Methicillin 1960 1961 Ampicillin 1961 1973 Cephalosporin 1960 1960 Kháng sinh 10 Trong thời gian gần đây, khoảng 70% chủng vi khuẩn gây bệnh bệnh viện kháng lại loại kháng sinh thường dùng điều trị, đặc biệt số vi khuẩn E coli, K pneumoniae, P aeruginosa A baumannii kháng lại tất loại kháng sinh bao gồm kháng sinh mạnh cephalosporin carbapenem Đây mối lo ngại thách thức lớn y học đại [7;70;88;140] 1.2.2.2 Phân loại đề kháng Về nguyên lý kháng sinh ức chế phát triển vi khuẩn, môi trường kháng sinh nồng độ thường dùng mà vi khuẩn phát triển gọi đề kháng [1] Đề kháng chia làm hai loại đề kháng giả đề kháng thật Đề kháng giả Đề kháng giả tượng có biểu đề kháng chất di truyền Ví dụ vi khuẩn nằm ổ áp xe nằm tổ chức hoại tử bao bọc, kháng sinh không thấm tới ổ viêm chứa vi khuẩn nên không phát huy hết tác dụng Khi vi khuẩn trạng thái nghỉ (không nhân lên, không chuyển hóa) không chịu tác dụng thuốc kháng sinh ức chế trình tổng hợp vách Thêm vào đó, số bệnh nhân bị suy giảm hệ thống miễn dịch hay chức thực bào bị hạn chế, thể không đủ khả loại trừ vi khuẩn bị ức chế khỏi thể, không thuốc kháng sinh vi khuẩn phục hồi phát triển trở lại [1] Đề kháng thật + Đề kháng tự nhiên: Là cấu trúc di truyền số loài vi khuẩn, ví dụ số loài vi khuẩn hệ thống vận chuyển kháng sinh đích tác động kháng sinh Mycoplasma thuộc loại vi khuẩn vách không chịu tác động kháng sinh tổng hợp vách, 187 E Kết xét nghiệm Loại mẫu Ngày thu thập Thời gian kết thúc điều tra (24h): Kết giờ, ngày / _/201 Tên người điều tra: Chữ ký người điều tra: 188 PHỤ LỤC 6: Trang thiết bị, sinh phẩm dụng cụ tiêu hao - Tủ an toàn sinh học cấp 2, lò xấy khô, lò hấp ướt, tủ ấm 370C, tủ lạnh, tủ âm sâu - Máy ly tâm, ủ nhiệt, máy tập trung mẫu (Eppendorf, Đức) - Pipet định mức loại - Máy luân nhiệt PCR Applied Biosystem-veriti (Mỹ) - Máy giải trình tự gen Applied Biosystem ABI-3130 (Mỹ) - Hệ thống điện di CHEF-DR III (Bio-Rad laboratories, Richmond, Calif, Mỹ) - Hệ thống chuyển màng Biometra-analytic (hãng Jena, Pháp) - Lò lai ADN UPV HL-2000 HybriLinker (Đức) - Hệ thống điện di ngang ENDURTM GEL XL (Mỹ) - Bộ chụp ảnh gen UPV (Đức) Môi trường sinh phẩm dụng cụ tiêu hao - Thạch MacConkey (hãng Bio-Rad, Pháp) - Thạnh LB (Hãng invitrogen, Mỹ) - Canh thang LB (hãng invitrogen, Mỹ) - Thạch Mueller-Hinton (hãng Merck, Đức) - Thanh định danh API-20E (Bio-Merieux, Pháp) - Khoanh giấy kháng sinh (Bio-Merieux, Pháp): Imipenem (IMP), Meropenem (CTX), (MEM), Ceftazidime (CAZ), Cefotaxime Ciprofloxacin (CIP), Gentamicin (GM) Amikacin (AK) Colistin (CS) - Kháng sinh bột (hãng Sigma, Mỹ): Imipenem (IMP), Meropenem (MEM), Ceftazidime (CAZ), Cefotaxime (CTX), Ciprofloxacin (CIP), Gentamicin (GM) Amikacin (AK) Colistin (CS) - Bộ kít sodium mercaptoacetate (SMA) (Eiken Co., Tokyo-Nhật Bản) 189 - Thanh E-test MBL EDTA-Imipenem (AB bioMerieux- Nc) - Kít tinh ADN kít tách chiết plasmid Miniprep (QIAGEN, Mỹ) - 2X Go-taq Master-Mix (GoTaq® DNA Polymerase, Promega) - Bigdye 3.1v kít (Applied Biosystem, Mỹ) - Bigdye XTeminator kít, HiDi - Thang chuẩn ADN: 100bp, 1kb - Dung dịch TE, dung dịch ly giải tế bào - Thạch điện di, thạch Seakem gold - Dung dịch đệm chạy điện di: TAE, TBE - Enzyme giới hạn XbaI, ApaI S1 - Dung dịch nhuộm ethidium bromide - Dung dịch SSC 20X - Dung dịch HCL 0,25 M - Dung dịch biến tính (1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH) - Dung dịch trung hòa (1.0 M Tris-HCl, 1.5 M NaCl, pH 7.5) - Kít đánh dấu đoạn dò ADN: Direct Nucleic Acid Labelling and Detection system (Hãng ECLTM Amersham) - Gold hybridization buffer (Hãng ECLTM Amersham) - Kít phát ADN: nucleic acid ditection system (Hãng ECLTM Amersham) - Film Hyper (Hãng ECLTM Amersham) - Các chủng chuẩn: E coli ATCC 25922 (thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh), S braenderup H9812 làm thang chuẩn ADN, E coli J53 thử nghiệm khả truyền plasmid mang gen NDM-1… - Tăm lấy bệnh phẩm, que cấy, hộp lồng 9cm, pipet nhựa … - Đầu côn, tube PCR, 1,5ml, phiến nhựa 96 giếng chạy sequence… 190 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Phân loại nhiễm khuẩn bệnh viện 1.2 Sự phát triển đề kháng kháng sinh vi khuẩn 1.3 Một số đặc tính enzym ly giải carbapenem chủng vi khuẩn Gram âm 18 1.4 Mức độ kháng carbapenem P aeruginosa A baumannii bệnh viện năm 2008 22 1.5 So sánh ranh giới phát điểm gãy kháng sinh nhóm carbapenem với chủng vi khuẩn đường ruột 25 1.6 Các kỹ thuật phát metallo-beta-lactamase 26 2.1 Plasmid mang gen kháng kháng sinh 28 3.1 Một số đặc điễm tuổi giới đối tượng nghiên cứu 65 3.2 Chẩn đoán bệnh lúc nhập viện 65 3.3 Mức độ thực phẫu thuật thủ thuật xâm nhập 66 3.4 Phân bố ca bệnh bị nhiễm vi khuẩn mang gen NDM-1 theo khoa điều trị 70 3.5 Một số yếu tố nguy liên quan đến nhiễm khuẩn vi khuẩn mang gen NDM-1 phân tích đơn biến 73 3.5 (tiếp theo) Một số yếu tố nguy liên quan đến nhiễm khuẩn vi khuẩn mang gen NDM-1 phân tích đơn biến 74 3.6 Một số yếu tố nguy liên quan đến nhiễm vi khuẩn mang gen NDM-1 phân tích đa biến 75 3.7 Tỷ lệ phát vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 môi trường bệnh viện Việt đức 76 3.8 Kết phát phát vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 theo loại mẫu xét nghiệm 77 3.9 Phân bố mẫu môi trường dương tính theo khoa điều trị 78 3.10 Phân bố mẫu môi trường dương tính với NDM-1 theo khoa điều trị loại vi khuẩn 78 191 Tên bảng Trang 79 Bảng 3.11 Mức độ nhạy cảm kháng sinh vi khuẩn mang gen NDM-1 3.12 Tỷ lệ vi khuẩn gram âm mang gen NDM-1 84 3.13 Mức độ nhạy cảm kháng sinh vi khuẩn mang gen NDM-1 86 3.14 Khả ức chế enzym New Delhi metallo-beta-lactamase chủng vi khuẩn mang gen NDM-1 88 3.15 Kết truyền plasmid mang gen NDM-1 sang E coli J53 96 3.16 Tỷ lệ gen kháng kháng sinh plasmid mang gen NDM-1 Việt Nam giới 99 192 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Tỷ lệ phân bố nhiễm khuẩn bệnh viện nước có thu nhập cao 1.2 Tỷ lệ phân bố nhiễm khuẩn bệnh viện nước có thu nhập thấp trung bình 1.3 Cấu trúc phân tử carbapenem 1.4 Đặc điểm vùng mang gen kháng kháng sinh plasmid tách chiết từ chủng K pneumoniae 34 1.5 So sánh mối liên hệ trình tự amino acid NDM-1 với enzym metallo-beta-lactamase 35 1.6 Tỷ lệ phân bố vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 giới 36 1.7 Kết Southern-blotting plasmid mang gen NDM-1 chủng vi khuẩn phân lập Anh 40 17 Cây phả hệ chủng K pneumoniae kháng carbapenem mang gen NDM-1 phân lập quốc gia phân tích kỹ thuật MLS 42 3.1 Tỷ lệ phát bệnh nhân nhiễm vi khuẩn kháng carbapenem 64 3.2 Tỷ lệ phát bệnh nhân nhiễm vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 67 3.3 Tỷ lệ số lượng vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 phát bệnh nhân 68 3.4 Tỷ lệ phân lập vi khuẩn mang gen NDM-1 theo giới 3.5 Tỷ lệ phân lập vi khuẩn mang gen NDM-1 theo nhóm tuổi 69 3.6 Phân bố ca bệnh nhiễm vi khuẩn mang gen NDM-1 phát khoa điều trị theo thời gian 71 3.7 Phân bố ca bệnh bị nhiễm vi khuẩn mang gen NDM-1 theo tháng 72 1.8 3.8 Kết đại diện phát gen NDM-1 kháng carbapenem chủng vi khuẩn gram âm phân lập môi trường bệnh viện Việt Đức 69 76 193 Hình Tên hình Trang 81 3.9 Tỷ lệ phân bố vi khuẩn gram âm kháng carbapenem 3.10 Kết PCR đại diện phát gen NDM-1 3.11 Kết đại diện so sánh giải trình tự gen NDM-1 với trình tự gen chuẩn 82 3.12 Tỷ lệ phân bố loại vi khuẩn mang gen NDM-1 83 3.13 Tỷ lệ phân lập vi khuẩn mang gen NDM-1 theo mẫu bệnh phẩm 3.14 Hình ảnh ức chế enzym New Delhi metallo-beta-lactamase C freundii mang gen NDM-1 87 3.15 Hình ảnh kiểu gen PFGE chủng E coli mang gen NDM-1 89 3.16 Hình ảnh kiểu gen PFGE chủng Enterobacter spp mang gen NDM-1 90 3.17 Kiểu gen PFGE chủng K pneumoniae mang gen NDM-1 3.18 Kiểu gen PFGE chủng Acinetobacter mang gen NDM-1 91 3.19 Kiểu gen PFGE chủng C freundii mang gen NDM-1 92 3.20 Kết đại diện phát số lượng plasmid từ số chủng vi khuẩn mang gen NDM-1 93 3.21 Kết đại diện phát plasmid mang gen NDM-1 số chủng vi khuẩn phân lập bệnh viện Việt Đức 94 3.22 Kết truyền plasmid mang gen NDM-1 từ chủng vi khuẩn mang gen NDM-1 sang chủng E.coli J53 95 3.23 So sánh plasmid mang gen NDM-1 chủng vi khuẩn phân lập bệnh viện Việt Đức từ chủng vi khuẩn số quốc gia giới 81 85 91 97 194 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nhiễm khuẩn bệnh viện 1.2 Kháng sinh đề kháng kháng sinh vi khuẩn 1.2.1 Lịch sử phát triển kháng sinh 1.2.2 Sự đề kháng kháng sinh vi khuẩn 1.2.2.1 Sự phát triển đặc tính kháng kháng sinh vi khuẩn 1.2.2.2 Phân loại đề kháng 10 1.2.3 Cơ chế kháng kháng sinh vi khuẩn 11 1.2.3.1 Làm thay đổi đích tác động 11 1.2.3.2 Tạo enzym 11 1.2.3.3 Làm giảm tính thấm màng nguyên sinh chất 12 1.2.4 Các yếu tố nguy gây kháng kháng sinh 12 1.2.4.1 Lạm dụng sử dụng kháng sinh cộng đồng 12 1.2.4.2 Sử dụng kháng sinh bệnh viện 13 1.2.4.3 Sử dụng kháng sinh chăn nuôi 14 1.2.4.4 Do bác sỹ 15 1.2.4.5 Chất lượng kháng sinh 15 1.2.4.6 Gia tăng lại quốc tế 15 1.2.4.7 Hệ thống giám sát kháng sinh 15 1.3 Kháng sinh nhóm carbapenem 16 Phân loại enzym ly giải kháng sinh nhóm carbapenem 17 1.4 Tình hình vi khuẩn kháng carbapenem giới 19 1.4.1 Kháng carbapenem enzym carbapenemase nhóm A 19 1.4.2 Kháng carbapenem enzym nhóm B 20 1.4.3 Enzym nhóm D 21 195 1.5.Tình hình kháng carbapenem Việt Nam 22 1.6 Tác động vi khuẩn kháng kháng sinh 23 1.7 Các kỹ thuật phát vi khuẩn kháng carbapenem 23 1.7.1 Kỹ thuật thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh 23 1.7.1.1 Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán thạch 23 1.7.1.2 Kỹ thuật xác định nồng độ tối thiểu kháng sinh 24 1.7.1.3 Kỹ thuật E-test 24 1.7.2 Kỹ thuật phát vi khuẩn sinh carbapenemase 24 1.8 Các kỹ thuật sinh học phân tử nghiên cứu vi khuẩn kháng kháng sinh 27 1.8.1 Phân tích plasmid 27 1.8.1.1 Tách chiết plasmid 28 1.8.1.2 Phân loại plasmid 28 1.8.1.3 Kỹ thuật Southern blotting phát plasmid mang gen kháng kháng sinh 29 1.8.1.4 Nghiên cứu khả truyền plasmid kháng kháng sinh 29 1.8.2 Kỹ thuật PCR phát gen kháng kháng sinh 30 1.8.3 Kỹ thuật RAPD-PCR 30 1.8.4 Kỹ thuật điện di xung trường 31 1.8.5 Kỹ thuật Southern blot phân tích hệ gen vi khuẩn 31 1.8.5.1 Kỹ thuật Ribotyping 31 1.8.5.2 Kỹ thuật phân tích đa hình chiều dài giới hạn 32 1.8.6 Kỹ thuật Multi Locus Sequence Typing 32 1.8.7 Kỹ thuật giải trình tự gen 32 1.9 Vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 33 1.9.1 Tình hình nghiên cứu nước 33 1.9.1.1 Đặc điểm dịch tễ ca bệnh nhiễm vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 36 196 1.9.1.2 Đặc điểm lâm sàng ca bệnh nhiễm vi khuẩn mang gen NDM-1 39 1.9.1.3 Đặc tính sinh học phân tử vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 39 1.9.2 Vi khuẩn mang gen NDM-1 Việt Nam 43 1.9.3 Các vấn đề tồn cần tập trung nghiên cứu Việt Nam 43 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 46 2.1 Địa điểm nghiên cứu: 46 2.2 Thiết kế nghiên cứu: Dịch tễ học mô tả phân tích 46 2.3 Thời gian nghiên cứu 46 2.4 Đối tượng nghiên cứu 47 2.4.1 Đối tượng nghiên cứu mục tiêu 47 2.4.2 Đối tượng nghiên cứu mục tiêu 47 2.4.3 Đối tượng nghiên cứu mục tiêu 48 2.5 Cỡ mẫu Nghiên cứu 48 2.5.1 Cỡ mẫu mục tiêu 1: 48 2.5.2 Cỡ mẫu mục tiêu 2: 49 2.5.3 Cỡ mẫu mục tiêu 3: 49 2.6 Lấy mẫu bệnh phẩm kỹ thuật xét nghiệm 49 2.6.1 Lấy mẫu bệnh phẩm 49 2.6.1.1 Bệnh phẩm mục tiêu 49 2.6.1.2 Bệnh phẩm mục tiêu 49 2.6.1.3 Mẫu cho mục tiêu 3: 50 2.6.2 Kỹ thuật xét nghiệm: 50 2.6.2.1 Xác định bệnh nhân nhiễm vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 50 2.6.2.1.1 Nuôi cấy phân lập vi khuẩn 50 2.6.2.1.2 Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán 50 197 2.6.2.1.3 Kỹ thuật ức chế nồng độ kháng sinh tối thiểu 51 2.6.2.1.4 PCR phát gen NDM-1 51 2.6.2.1.5 Giải trình tự xác định gen NDM-1 52 2.6.2.2 Xác định vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 môi trường 53 2.6.2.3 Phân tích đặc điểm sinh học phân tử chủng vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 53 2.6.2.3.1 Thử nghiệm khả sinh enzym New Delhi metallo-betalactamase 53 2.6.2.3.2 Phân tích mối liên hệ kiểu gen kỹ thuật PFGE 54 2.6.2.3.3 Phân tích số lượng plasmid phát plasmid mang gen NDM-1 54 2.6.2.3.3.1 Phân tích số lượng plasmid vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 54 2.6.2.3.3.2 Phát plasmid mang gen NDM-1 kỹ thuật SouthernBlotting 55 2.6.2.3.3.3 Thử nghiệm khả truyền plasmid mang gen NDM-1 55 2.6.2.3.4.4 Phân tích plasmid mang gen NDM-1 55 2.7 Vật liệu nghiên cứu 55 2.8 Chỉ tiêu nghiên cứu 55 2.8.1 Chỉ tiêu nghiên cứu cho mục tiêu 55 2.8.2 Chỉ tiêu nghiên cứu cho mục tiêu 56 2.8.3 Chỉ tiêu nghiên cứu cho mục tiêu 57 2.9 Phương pháp thu thập thông tin 57 2.10 Xử lý phân tích số liệu: 58 2.11 Kiểm soát sai số xảy trình nghiên cứu 58 2.12 Đạo đức nghiên cứu 60 198 2.13 Sơ đồ nghiên cứu 61 Sơ đồ Tóm tắt bước nghiên cứu đơn vị thực mục tiêu 61 Sơ đồ Tóm tắt bước nghiên cứu đơn vị thực mục tiêu 62 Sơ đồ Tóm tắt bước nghiên cứu đơn vị thực mục tiêu 63 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 64 3.1 Một số đặc điểm dịch tễ học bệnh nhân nhiễm khuẩn bệnh viện vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 phân lập bệnh viện Việt Đức-Hà Nội 64 3.1.1 Một số đặc điểm chung bệnh nhân nhiễm vi khuẩn kháng carbapenem nghiên cứu 64 3.1.2 Một số đặc điểm dịch tễ học 35 bệnh nhân nhiễm khuẩn bệnh viện vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 bệnh viện Việt Đức - Hà Nội 67 3.1.2.1 Một số đặc điểm 35 bệnh nhân nhiễm vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 67 3.1.2.2 Một số yếu tố nguy nhiễm vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 73 3.2 Tình trạng ô nhiễm vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 môi trường bệnh viện Việt Đức 76 3.3 Một số đặc điểm sinh học phân tử chủng vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 80 3.3.1 Một số đặc điểm chung chủng vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 80 3.3.1.1 Tỷ lệ phân bố chủng vi khuẩn gram âm kháng carbapenem 80 3.3.1.2 Kết phát gen NDM-1 kháng carbapenem kỹ thuật sinh học phân tử 81 199 3.3.1.3 Tỷ lệ phân bố chủng vi khuẩn gram âm kháng carbapenem mang gen NDM-1 83 3.3.1.4 Mức độ nhạy cảm kháng sinh vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 85 3.3.1.5 Khả sinh enzym metallo-beta-lactamase vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 87 3.3.2 Một số đặc điểm sinh học phân tử chủng vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 89 3.3.2.1 Kiểu gen PFGE vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 89 3.3.2.2 Số lượng plasmid chủng vi khuẩn mang gen NDM-1 93 3.3.2.3 Phát plasmid mang gen NDM-1 94 3.3.2.4 Thử nghiệm khả truyền plasmid mang gen NDM-1 95 3.3.2.5 Phân tích plasmid mang gen NDM-1 97 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 101 4.1 Đặc điểm dịch tễ học bệnh nhân bị nhiễm khuẩn vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 101 4.1.1 Một số đặc điểm bệnh nhân bị nhiễm vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 101 4.1.2 Một số yếu tố nguy liên quan đến nhiễm khuẩn vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 104 4.2 Tình trạng ô nhiễm vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 môi trường bệnh viện Việt Đức 106 Một số đặc điểm sinh học phân tử chủng vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 108 4.3.1 Một số đặc điểm vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 108 200 4.3.1.1 Tỷ lệ phát vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 108 4.3.1.2 Mức độ nhạy cảm kháng sinh vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 110 4.3.1.3 Khả sinh enzym metallo-beta-lactamase vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 112 4.3.2 Kiểu gen PFGE vi khuẩn mang gen NDM-1 113 4.3.3 Phân tích plasmid chủng vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 115 4.3.3.1 Số lượng plasmid vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 115 4.3.3.2 Phát plasmid mang gen NDM-1 115 4.3.3.3 Khả truyền plasmid mang gen NDM-1 vi khuẩn 116 4.3.3.4 Phân tích plasmid mang gen NDM-1 117 4.4 Bàn luận hướng nghiên cứu 118 KẾT LUẬN 121 Đặc điểm dịch tễ học bệnh nhân nhiễm khuẩn bệnh viện vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 bệnh viện Việt Đức 121 Tình trạng ô nhiễm vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 môi trường bệnh viện Việt Đức 121 Một số đặc điểm sinh học phân tử chủng vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 122 3.1 Một số đặc điểm chung vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 122 3.2 Một số đặc điểm sinh học phân tử chủng vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 122 201 KIẾN NGHỊ 123 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 124 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 125 TÀI LIỆU THAM KHẢO 126 PHỤ LỤC 1: DANH SÁCH BỆNH NHÂN TRONG NGHIÊN CỨU 145 PHỤ LỤC CÁC QUI TRÌNH KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM 152 PCR phát gen NDM-1 152 Phân tích mối liên hệ kiểu gen kỹ thuật PFGE 154 Phát plasmid mang gen NDM-1 kỹ thuật Southern-Blotting156 Thử nghiệm khả truyền plasmid mang gen NDM-1 158 PHỤ LỤC 3: Kết hình ảnh giải trình tự gen NDM-1 chủng vi khuẩn phân lập bệnh viện Việt Đức 160 PHỤ LỤC 4: PHIẾU CUNG CẤP THÔNG TIN NGHIÊN CỨU 179 BẢN THỎA THUẬN THAM GIA NGHIÊN CỨU 183 PHỤ LỤC 5: Phiếu điều tra 184 PHỤ LỤC 6: Trang thiết bị, sinh phẩm dụng cụ tiêu hao 188 [...]... sử đi chữa bệnh tại Ấn Độ và Pakistan, cho thấy các chủng vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 phân lập tại Anh có thể lây từ Ấn Độ và Pakistan [70] 1.9.1.1 Đặc điểm dịch tễ ca bệnh nhiễm vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1 Tại châu Âu từ năm 2008 đến 2010 có 13 quốc gia phát hiện được 77 bệnh nhân nhiễm vi khuẩn kháng carbapenem mang gen NDM-1, nhiều nhất được phát hiện tại Anh và số ca tăng... các bệnh vi n thực hiện tốt công tác giám sát tình trạng sử dụng kháng sinh của phác đồ 1 và 2 sẽ làm giảm áp lực chọn lọc cho vi khuẩn kháng lại kháng sinh trong các bệnh vi n Ngoài ra, bệnh nhân điều trị dài ngày trong bệnh vi n có sức đề kháng yếu, thường sử dụng kháng sinh kéo dài và dễ bị nhiễm khuẩn chéo với các chủng vi khuẩn kháng đa kháng sinh trong các bệnh vi n Nhiễm khuẩn bệnh vi n là yếu... nhà khoa học đã dựa vào hệ gen của vi khuẩn để nghiên cứu và phát triển các kỹ thuật sinh học phân tử cho phép đánh giá sự thay đổi kiểu gen của các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh, đặc tính, cơ chế kháng, nguồn truyền nhiễm, giám sát dịch tễ học các vụ dịch do vi khuẩn kháng kháng sinh và đặc biệt về các mối liên quan giữa các chủng vi khuẩn ở các thời gian và địa điểm khác nhau trong phạm vi quốc... cảm với các vi khuẩn gram âm, là căn nguyên chính gây nhiễm khuẩn bệnh vi n ở Vi t Nam Hai căn nguyên gây nhiễm khuẩn bệnh vi n thường gặp là P aeruginosa và A baumannii được đánh giá ở 6 bệnh vi n năm 2008: 20% các chủng P aeruginosa và 50% các chủng A baumannii kháng kháng sinh nhóm carbapenem (bảng 1.4) [49] Bảng 1.4 Mức độ kháng carbapenem của P aeruginosa và A baumannii tại 6 bệnh vi n năm 2008... nghiên cứu của Tatsuya và cộng sự cho thấy các chủng A baumannii và P aeruginosa đã kháng carbapenem ở mức độ cao 23 và gen OXA-23 đóng vai trò quan trọng qui định tính kháng carbapenem của các chủng A baumannii [121] Tỷ lệ kháng carbapenem của các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh vi n không thể đánh giá một cách chính xác, do Vi t Nam chưa có hệ thống giám sát tính kháng kháng sinh của vi khuẩn Trong... gen NDM-1 đều kháng tất cả các kháng sinh ở mức độ cao ngoại trừ colistin; (2) kháng sinh carbapenem là nhóm kháng sinh mạnh nhất hiện nay và hiện chưa có kháng sinh thế hệ mới thay thế, (3) hầu hết các chủng vi khuẩn này đều có khả năng truyền các plasmid mang gen NDM-1 trong 36 mô hình phòng thí nghiệm, (4) điều tra dịch tễ học của 37 bệnh nhân nhiễm vi khuẩn mang gen NDM-1 tại Anh có nhiều bệnh. .. chung vi khuẩn gram âm kháng carbapenem trong các bệnh vi n rất đa dạng, do rất nhiều các cơ chế kháng khác nhau Hầu hết các quốc gia trên thế giới đều ghi nhận sự có mặt của các chủng vi khuẩn gram âm kháng carbapenem Tuy nhiên không thống kê được tỷ lệ mắc bệnh do các vi khuẩn kháng carbapenem do 22 phần lớn các quốc gia đều không có các báo cáo đầy đủ về mức độ nhạy cảm kháng sinh của vi khuẩn Điều... gây dịch, kháng kháng sinh, hay sinh độc tố nhằm giám sát sự lây truyền của chúng trong phạm vi quốc gia và trên thế giới [11] 1.8.7 Kỹ thuật giải trình tự gen Đây là kỹ thuật được sử dụng rộng rãi để giải trình tự các gen kháng kháng sinh, đặc biệt là phân tích các plasmid mang gen kháng kháng sinh 33 của vi khuẩn Đây là phương pháp chính xác nhất để xác định các đặc tính kháng kháng sinh của vi khuẩn. .. trọng [49] Ngay cả vi c không tuân thủ các quy định thực hiện chống nhiễm khuẩn trong bệnh vi n, đơn giản như rửa tay và thay găng trước và sau khi thăm khám cho bệnh nhân của các nhân vi n y tế, đây là nguyên nhân chủ yếu gây nhiễm khuẩn tại hầu hết các bệnh vi n trên thế giới và tạo điều kiện thuận lợi cho sự lây lan của 14 các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh không chỉ trong bệnh vi n mà còn có nguy... ngoài nhiễm sắc thể của hầu hết các chủng vi khuẩn gây bệnh và có thể xác định qua qui trình ly giải tế bào và điện di trên thạch Phân tích các plasmid được sử dụng để mô tả đặc điểm dịch tễ học của nhiều loại vi khuẩn Trong các vụ dịch, phân tích plasmid cho phép nhanh chóng xác định sự lây lan của các chủng vi khuẩn gây dịch, đặc biệt là các chủng mang các plasmid kháng kháng sinh [35] Đây là cơ chế kháng