Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện ex vitro đến sự biến đổi hình thái và sinh lý, sinh hoá của phong lan Phi điệp tím (Dendrobium anosmum) nuôi cấy mô giai đoạn ra ngôi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 TRƯƠNG TRỌNG KIÊN NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN ex vitro ĐẾN SỰ BIẾN ĐỔI HÌNH THÁI VÀ SINH LÝ, HÓA SINH CỦA PHONG LAN PHI Đ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

TRƯƠNG TRỌNG KIÊN

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN ex vitro

ĐẾN SỰ BIẾN ĐỔI HÌNH THÁI VÀ SINH LÝ, HÓA SINH CỦA

PHONG LAN PHI ĐIỆP TÍM (Dendrobium anosmum)

NUÔI CẤY MÔ GIAI ĐOẠN RA NGÔI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

HÀ NỘI, 2016

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

TRƯƠNG TRỌNG KIÊN

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN ex vitro

ĐẾN SỰ BIẾN ĐỔI HÌNH THÁI VÀ SINH LÝ, HÓA SINH CỦA PHONG LAN PHI ĐIỆP TÍM (Dendrobium anosmum)

NUÔI CẤY MÔ GIAI ĐOẠN RA NGÔI

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60.42.01.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS.Cao Phi Bằng

HÀ NỘI, 2016

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia Ďình, người thân và toàn thể bạn bè, Ďồng nghiệp Ďã cổ vũ, Ďộng viên, giúp Ďỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày 15 tháng 10 năm 2016

Tác giả

Trương Trọng Kiên

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam Ďoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này

là trung thực và không trùng lặp với các Ďề tài khác Tôi cũng xin cam Ďoan rằng mọi sự giúp Ďỡ cho việc thực hiện luận văn này Ďã Ďược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này Ďã Ďược ghi rõ nguồn gốc

Tác giả

Trương Trọng Kiên

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

LỜI CAM ĐOAN

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Nhiệm vụ nghiên cứu 2

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

5 Giả thuyết khoa học 2

PHẦN 2 NỘI DUNG 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 4

1.1 Giới thiệu chung về phong lan Phi điệp tím 4

1.1.1 Vị trí phân loại, phân bố 4

1.1.2 Đặc điểm hình thái 4

1.1.3 Ý nghĩa, tầm quan trọng của phong lan Phi điệp tím………4

1.2 Khái quát về nuôi cấy mô tế bào 6

1.2.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào 7

1.2.2 Các giai đoạn nuôi cấy 8

1.3 Các nghiên cứu nhân giống phong lan và giai đoạn ra ngôi 11

1.3.1 Các nghiên cứu nhân giống phong lan 11

1.3.2 Các nghiên cứu về giai đoạn ra ngôi 13

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng, phạm vi và thời gian nghiên cứu 16

2.2 Phương pháp nghiên cứu 16

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu hình thái 17

2.2.2 Phương pháp xác định các chỉ tiêu sinh lí, hóa sinh 18

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu giải phẫu 24

2.3 Phương pháp xử lý số liệu (4) 24

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 25

3.1 Đặc điểm hình thái của phong lan Phi điệp tím giai đoạn ra ngôi 25

3.1.1 Đặc điểm của lá 25

3.1.2 Đặc điểm của thân 26

3.1.3 Đặc điểm của rễ 27

3.2 Hàm lượng nước, hàm lượng chất khô trong mô lá cây Phi điệp tím 28

3.3 Khả năng giữ nước của mô lá 31

3.4 Cường độ thoát hơi nước của mô lá 33

3.5 Hàm lượng sắc tố quang hợp 35

3.6 Huỳnh quang diệp lục 37

3.7 Hoạt độ catalase 39

3.8 Hoạt độ peroxidase 41

3.9 Hàm lượng prolin trong mô lá 42

3.10 Đặc điểm giải phẫu của lan Phi điệp tím giai đoạn ra ngôi 45

PHẦN 3 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47

Kết luận 47

Kiến nghị 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 498

Tài liệu tiếng việt 499

Tài liệu tiếng nước ngoài 49

PHỤ LỤC ẢNH

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Hàm lượng nước, hàm lượng chất khô trong mô lá phong lan Phi điệp tím thời kì ra ngôi ex vitro 29 Bảng 3.2 Động thái sự mất nước của mô lá phong lan Phi điệp tím thời kì ra ngôi ex vitro 32 Bảng 3.3 Cường độ thoát hơi nước của mô lá phong lan Phi điệp tím thời kì

ra ngôi ex vitro 34 Bảng 3.4 Hàm lượng sắc tố quang hợp trong mô lá phong lan Phi điệp tím thời kì ra ngôi ex vitro 35 Bảng 3.5 Huỳnh quang diệp lục lá phong lan Phi điệp tím thời kì ra ngôi ex vitro……… ……… …………38 Bảng 3.6 Hoạt độ catalase phong lan Phi điệp tím thời kì ra ngôi ex vitro 39 Bảng 3.7 Hoạt độ peroxidase phong lan Phi điệp tím thời kì ra ngôi ex vitro 40 Bảng 3.8 Hàm lượng prolin của cây phong lan Phi điệp tím thời kì ra ngôi ex vitro……… ……….………….43

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Phong lan Phi điệp tím 5 Hình 3.1 Sinh trưởng tương đối của lá phong lan Phi điệp tím thời kì luyện

ex vitro 25 Hình 3.2 Sinh trưởng tương đối của thân cây phong lan Phi điệp tím thời kì luyện ex vitro 27 Hình 3.3 Sinh trưởng tương đối của rễ cây phong lan Phi điệp tím thời kì luyện ex vitro… 28 Hình 3.4 Hàm lượng nước và hàm lượng chất khô trong mô lá phong lan Phi điệp tím thời kì ra ngôi ex vitro 29 Hình 3.5 Khả năng giữ nước cả lá cây phong lan Phi điệp tím thời kì luyện

ex vitro……….….………33 Hình 3.6 Cường độ thoát hơi nước cả lá cây phong lan Phi điệp tím thời kì luyện ex vitro 34 Hình 3.7 Huỳnh quang diệp lục lá phong lan phi Điệp tím thời kì ra ngôi ex vitro………38 Hình 3.8 Hoạt độ catalase phong lan Phi điệp tím thời kì ra ngôi ex vitro.… 40 Hình 3.9 Hoạt độ peroxidase phong lan Phi điệp tím thời kì ra ngôi ex vitro… 41 Hình 3.10 Hàm lượng prolin của cây phong lan Phi điệp tím thời kì ra ngôi

ex vitro 43 Hình 3.11 Lát cắt ngang của rễ cây phong lan Phi điệp tím 45

DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

nhân giống loài lan này bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật (in vitro)

Ďược thực hiện ở nhiều nơi Hiện nay, nhiều nghiên cứu xây dựng quy trình

nhân giống loài lan này Ďã Ďược báo cáo [16] Đối với công nghệ nhân giống in vitro, giai Ďoạn ra ngôi (huấn luyện cây con Ďể chuyển từ giai Ďoạn ống nghiệm

ra môi trường tự nhiên) Ďóng vai trò rất quan trọng Trong giai Ďoạn này, cây con chịu ảnh hưởng của môi trường sống thay Ďổi từ môi trường nhân tạo Ďến môi trường tự nhiên trong một thời gian ngắn Để thích nghi, cơ thể chúng sẽ

có những biến Ďổi về hình thái, giải phẫu cũng như sinh lý rất Ďáng chú ý Ďể có thể phù hợp với môi trường mới [24; 38; 39] Những nghiên cứu về những Ďộng thái trên ở thực vật còn ít Ďược thực hiện, Ďặc biệt với loài lan Phi Ďiệp tím Những kết quả nghiên cứu về các biến Ďổi hình thái, giải phẫu và sinh lý của lan Phi Ďiệp tím giai Ďoạn ra ngôi có ý nghĩa lớn, cung cấp các thông tin khoa học bổ ích, Ďồng thời giúp con người Ďề ra các biện pháp kĩ thuật Ďể luyện cây một cách có hiệu quả

Từ những lí do trên, chúng tôi Ďề xuất Ďề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng

của điều kiện ex vitro đến sự biến đổi hình thái và sinh lý, hóa sinh của phong lan Phi điệp tím (Dendrobium anosmum) nuôi cấy mô giai đoạn ra

ngôi”

2 Mục đích nghiên cứu

- Xác Ďịnh Ďược những biến Ďổi hình thái của lan Phi Ďiệp tím trong giai

Ďoạn ra ngôi dưới tác Ďộng của môi trường tự nhiên ex vitro

- Xác Ďịnh Ďược những Ďộng thái sinh lý, hóa sinh của cây phong lan Phi

Ďiệp tím có nguồn gốc in vitro trong giai Ďoạn ra ngôi

- Xác Ďịnh Ďược Ďặc Ďiểm cấu tạo, giải phẫu của rễ phong lan Phi Ďiệp tím giai Ďoạn ra ngôi

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Nghiên cứu và phân tích các Ďặc Ďiểm hình thái một số cơ quan sinh dưỡng (lá, thân, rễ) của cây phong lan Phi Ďiệp tím có nguồn gốc nuôi cấy mô

tế bào thực vật ở giai Ďoạn ra ngôi

- Nghiên cứu các Ďộng thái sinh lý, hóa sinh của cây phong lan Phi Ďiệp tím dưới ảnh hưởng của môi trường tự nhiên trong giai Ďoạn ra ngôi

- Nghiên cứu Ďược Ďặc Ďiểm cấu tạo, giải phẫu của rễ phong lan Phi Ďiệp tím giai Ďoạn ra ngôi

4 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

Đối tƣợng nghiên cứu: Phong lan Phi Ďiệp tím (Dendrobium

anosmum) có nguồn gốc in vitro

Phạm vi nghiên cứu: Những biến Ďổi về hình thái, sinh lý, hóa sinh

của phong lan Phi Ďiệp tím giai Ďoạn ra ngôi

5 Giả thuyết khoa học

Đánh giá Ďược sự biến Ďổi các chỉ tiêu hình thái của cây phong lan Phi Ďiệp tím giai Ďoạn ra ngôi trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Đánh giá Ďược sự biến Ďổi các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa của cây phong lan Phi Ďiệp tím giai Ďoạn ra ngôi trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Cung cấp các dẫn liệu khoa học về những biến Ďổi hình thái và sinh lý,

hóa sinh của phong lan Phi Ďiệp tím (Dendrobium anosmum) nuôi cấy mô giai

Ďoạn ra ngôi Kết quả nghiên cứu của luận văn có thể dùng làm tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu tiếp theo, làm tài liệu cho việc ứng dụng nuôi cấy

mô thực vật và nhân giống cây trồng trong nông nghiệp và lâm nghiệp

PHẦN 2 NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu chung về phong lan Phi điệp tím

1.1.1 Vị trí phân loại, phân bố

Phong lan Phi Ďiệp tím có tên khoa học là Dendrobium anosmum, thuộc giống Hoàng thảo (Dendrobium), họ phong lan (Orchidaceae), Bộ Lan (Orchidales), lớp một lá mầm (Monocotyledone), ngành Ngọc Lan, thực vật hạt kín (Mangoliophyta) [1]

Chi Hoàng thảo (Dendrobium) rộng rãi từ Ấn Độ qua Malaysia Ďến

Philippines, trong Ďó có Việt Nam [46]

1.1.2 Đặc điểm hình thái

Lan Phi Ďiệp còn có tên gọi khác như Giả hạc… Đây là một giống phong lan thông thường thân cao chừng 40-60cm có khi tới 2m buông rũ xuống Lá mọc Ďối cách dài 8 – 12cm, rộng từ 4 – 7cm Hoa to tới 10cm mọc

từ 1- 3 chiếc ở các Ďốt Ďã rụng lá, nở vào mùa Xuân Dendrobium anosmum

có hai màu sắc chính là tím hồng và trắng Tuy nhiên có khá nhiều biến dạng hồng nhạt, hồng thẫm hoặc cánh trắng lưỡi tím Hoa có hương thơm ngào ngạt và lâu tàn (3 – 4 tuần lễ) Nhiều hoa trên phát hoa, một cây nếu mạnh khỏe có thể ra tới 50 – 70 hoa [1]

Rễ: Cây có hệ rễ khí sinh, có một lớp hút ẩm dày bao quanh gồm những

lóp tế bào chết chứa Ďầy không khí nên rễ ánh lên màu xanh bạc Vì vậy, rễ hút Ďược nước mưa chảy dọc trên vỏ cây gỗ hay nước lơ lửng trong không khí, hơi sương và hơi nước, giúp cây hút dinh dưỡng và chất khoáng, mặt khác giúp cây bám chặt vào giá thể, không bị gió cuốn Một số loài có thân lá kém phát triển thậm chí tiêu giảm hoàn toàn, có hệ rễ chứa diệp lục tố giúp

cây hấp thụ ánh sáng cần thiết cho sự ra hoa và quang hợp [46]

Hình 2.1 Phong lan Phi Ďiệp tím Thân: Dendrobium thuộc nhóm Ďa thân (còn gọi là nhóm họp trục) có

hệ thống nhánh nằm ngang bò dài trên giá thể hoặc nằm sâu trong Ďất gọi là thân rễ Một số Dendrobium lá chỉ có ở các mầm non, là loài chống tàn chủng vàng úa và rụng vào mùa thu, thân phì to giống như củ không có lá là nơi dự trữ năng lượng [1]

Lá: Các lá mọc xen kẽ nhau và ôm lấy thân giả do lá có tận cùng bằng

một cuống hay thuôn dài xuống thành bẹ ôm thân, hình dạng và cấu trúc lá rất

Ďa dạng [1] Lá có hình kim, trụ có rãnh hay phiến mỏng Dạng lá mềm mại mọng nước nạc, dai, có màu xanh bóng, Ďậm hay nhạt tuỳ thuộc vào vị trí sống của cây Phiến lá trải rộng hay gấp lại theo gân vòng cung như cái quạt hay chỉ gấp lại theo gân giữa như hình chữ V Những lá sát dưới gốc Ďôi khi giảm Ďi chỉ còn những bẹ không phát triển hay giảm hẳn thành [1]

Hoa: Dendrobium thuộc nhóm phụ ra hoa ở nách lá Chồi hoa mọc từ

các mắt ngủ giữa các Ďọt lá trên thân gần ngọn và cả trên ngọn cây Sự biểu hiện trước khi ra hoa khác biệt như có nhiều loài rụng hết lá trước khi ra hoa Thời gian ra hoa Ďầu mùa mưa hay Ďầu tết Hoa Phi Ďiệp tím thường mọc ở gần Ďốt trên thân cây [1; 46]

Quả: Họ Orchidaceae Ďều có quả thuộc quả nang, khi hạt chín, các nang

bung ra chỉ còn dính lại với nhau ở Ďỉnh và gốc Ở một số loài, khi chín quả không nứt ra nên hạt chỉ ra khỏi quả khi quả bị mục nát [1]

Hạt: Những hạt giống không chứa các chất dinh dưỡng do gió gieo vãi,

Ďể Ďược nẩy mầm cần có nấm cộng sinh hỗ trợ các chất cần thiết, Ďặc biệt ở Ďầu các giai Ďoạn phát triển [1]

1.1.3 Ý nghĩa, tầm quan trọng phong lan Phi điệp tím

Phong lan Phi Ďiệp tím là loài lan Ďẹp, phổ biến, dễ trồng, hoa dạng chùm rủ xuống, lâu tàn, có hương thơm nồng nàn và lan tỏa nên lan Phi Ďiệp tím ngày càng Ďược người tiêu dùng ưa chuộng Ngoài việc dùng trang trí, làm cảnh ra ở một số nước trên thế giới lan Phi Ďiệp tím còn Ďược dùng làm thuốc chữa bệnh (tên thuốc Ďược dùng trong Ďông y là Thạch hộc hay Kẹp thảo) như tác dụng giảm Ďau, chống viêm [24]

Trên thế giới, lan Phi Ďiệp tím Ďược nuôi trồng phổ biến ở nhiều nước như Myanmar, Thái Lan, Malaysia, Lào, Việt Nam, Trung Quốc, và Ďã mang lại giá trị kinh tế cao

1.2 Khái quát về nuôi cấy mô tế bào

1.2.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào

Kỹ thuật nhân giống in vitro Ďã Ďược phát triển trên những cơ sở lý

thuyết về tế bào học và cơ sở sinh lý học thực vật

Tính toàn năng của tế bào

Theo Haberlandt (1902) mỗi tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật Ďa bào Ďều có khả năng tiềm tàng Ďể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Theo quan niệm sinh học hiện Ďại thì: “Mỗi tế bào riêng rẽ Ďã phân hóa Ďều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và Ďủ của cả cơ thể sinh vật Ďó Khi gặp Ďiều kiện thích hợp, mỗi tế bào Ďều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh” Đó chính là tính toàn năng của tế bào Tính toàn năng của tế bào chính là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào Cho Ďến nay, con người Ďã hoàn toàn chứng minh Ďược khả năng tái sinh của một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ [2]

Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào

Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều

cơ quan chức năng khác nhau, trong Ďó có nhiều loại tế bào khác nhau thực hiện các chức năng cụ thể khác nhau Tuy nhiên tất cả các loại tế bào Ďó Ďều bắt nguồn từ tế bào phôi sinh “Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào của mô chuyên hoá, Ďảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể” Tuy nhiên, khi tế bào Ďã phân hoá thành mô chức năng chúng không hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình Trong trường hợp cần thiết, Ďiều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và

lại phân chia mạnh mẽ Quá trình Ďó gọi là sự phản phân hoá tế bào, ngược lại với sự phân hoá tế bào

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực chất là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào xét cho Ďến cùng là kĩ thuật Ďiều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong Ďiều kiện nhân tạo, vô trùng) một cách Ďịnh hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật Để Ďiều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, người ta thường bổ sung vào trong môi trường nuôi cấy hai nhóm chất Ďiều tiết sinh trưởng thực vật Ďó là auxin và cytokinin Tỷ lệ hai nhóm chất này trong môi trường sẽ kéo theo sự phát sinh hình thái khác nhau của thực vật [2]

Sự trẻ hóa

Trong nuôi cấy in vitro, khả năng ra chồi, rễ ở các thành phần khác nhau

là rất khác nhau Vì vậy Ďể chọn mẫu cấy phù hợp phải căn cứ vào trạng thái sinh lý hay tuổi mẫu Các mẫu non trẻ có sự phản ứng với các Ďiều kiện và môi trường nuôi cấy nhanh, dễ tái sinh, Ďặc biệt trong nuôi cấy mô sẹo, phôi Ngoài ra mô non trẻ mới Ďược hình thành, sinh trưởng mạnh, mức Ďộ nhiễm mầm bệnh ít hơn Vì vậy việc trẻ hoá là một biện pháp quan trọng nhất trong nhân giống sinh dưỡng [2]

1.2.2 Các giai đoạn nuôi cấy

Giai đoạn chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ

Mục Ďích chủ yếu của giai Ďoạn này là chọn Ďược nguồn nguyên liệu thực vật cho quá trình nuôi cấy Cây mẹ (là cây cho nguồn mẫu nuôi cấy) Ďược Ďưa ra khỏi nơi phân bố tự nhiên Ďể chúng thích ứng với môi trường mới, Ďồng thời giảm bớt khả năng nhiễm bệnh của mẫu nuôi cấy và chủ Ďộng nguồn mẫu trong công tác nhân giống Cây mẹ phải sạch bệnh, Ďặc biệt là

bệnh virut và ở giai Ďoạn sinh trưởng mạnh Thông thường, cây mẹ là cây có những tính trạng tốt, Ďạt tiêu chuẩn của các nhà chọn giống hoặc là những Ďối tượng Ďang có nguy cơ tuyệt chủng Trong trường hợp cần thiết có thể làm trẻ hoá vật liệu giống [8]

Giai đoạn nuôi cấy khởi động

Là giai Ďoạn khử trùng và Ďưa mẫu vào nuôi cấy in vitro Khi Ďã có

nguồn nguyên liệu nuôi cấy, tiến hành lấy mẫu và xử lý mẫu cấy trong những Ďiều kiện vô trùng Khi lấy mẫu cần chọn loại mẫu cấy phù hợp, Ďúng loại

mô, Ďúng giai Ďoạn phát triển, thường lấy chồi Ďỉnh hay chồi nách Ďể nuôi cấy

in vitro, cũng có thể sử dụng Ďoạn thân, mảnh lá, Ďể tiến hành nuôi cấy

Một số loại hoá chất thường Ďược sử dụng là HgCl2 0,1 %, cồn 700, H2O2, Ca(OCl)2 dùng Ďể khử trùng mẫu cấy Để tăng tính linh Ďộng của hóa chất diệt khuẩn, thường sử dụng thêm các chất làm giảm sức căng bề mặt như tween 20, tween 80, teepol, Mẫu sau khi Ďược khử trùng Ďem cấy vào môi trường nuôi cấy khởi Ďộng Giai Ďoạn này cần Ďảm bảo các yêu cầu như tỷ lệ nhiễm bệnh thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt [8]

Giai đoạn nhân nhanh

Một trong những ưu thế lớn nhất của phương pháp nhân giống in vitro so

với các phương pháp nhân giống truyền thống là có hệ số nhân cao Giai Ďoạn nhân nhanh Ďược coi là giai Ďoạn then chốt của toàn bộ quá trình nhân giống Giai Ďoạn này sẽ kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng thông qua các con Ďường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất Ďịnh và tạo phôi vô tính Phải xác Ďịnh Ďược môi trường dinh dưỡng và môi trường vật lý phù hợp Ďể Ďạt hiệu quả cao nhất Vai trò của các chất Ďiều hòa sinh trưởng, chất phụ gia (nước dừa, khoai tây, ) là Ďặc biệt quan trọng Tăng cường chiếu sáng (16 giờ/ngày, cường Ďộ ánh sáng tối thiểu 1000 lux, ánh sáng tím) là yếu

tố quan trọng kích thích mô phân hoá mạnh Bảo Ďảm chế Ďộ nhiệt 20 - 300

C Yêu cầu cần Ďạt Ďược trong giai Ďoạn này là tạo Ďược hệ số nhân cao [8]

Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh

Các chồi Ďã Ďạt kích thước nhất Ďịnh và Ďược chuyển từ môi trường ở công Ďoạn 3 sang môi trường nuôi cấy tạo rễ Ďể hình thành cây hoàn chỉnh Ở giai Ďoạn này môi trường cần giảm lượng cytokinin và tăng lượng auxin Ďể rễ phát triển Các chất α-Naphthalene acetic acid (α-NAA), indole-3-acetic acid (IAA), Indole-3-butyric acid (IBA) thường Ďược sử dụng ở nồng Ďộ 1 - 5 mg/l

Ďể tạo rễ cho hầu hết các loài cây trồng Từ những chồi riêng lẻ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh Lúc này cây con rất nhạy cảm với ẩm Ďộ

và bệnh tật do hoạt Ďộng của lá và rễ mới sinh rất yếu, cây chưa chuyển sang giai Ďoạn tự dưỡng Yêu cầu cần Ďạt Ďược trong giai Ďoạn này là cây con tạo

ra Ďủ tiêu chuẩn (chiều cao, số lá, số rễ) [8]

Giai đoạn ra ngôi

Đây là giai Ďoạn quan trọng trong quy trình nhân giống vô tính vì cây con

dễ bị chết do sự khác biệt về Ďiều kiện sống giữa in vitro và ex vitro Cây in vitro Ďược nuôi cấy trong Ďiều kiện ổn Ďịnh dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt Ďộ, Ďộ

ẩm nên khi chuyển sang môi trường mới với Ďiều kiện hoàn toàn khác hẳn như dinh dưỡng thấp, ánh sáng có cường Ďộ mạnh, nhiệt Ďộ cao, Ďộ ẩm thấp… cây con dễ bị stress, dễ mất nước và mau héo dẫn Ďến hiện tượng chết [8]

Ở giai Ďoạn này cây con phải chịu nhiều sự thay Ďổi của môi trường sống Ďể thích nghi với Ďiều kiện mới thì chúng phải có những biến Ďổi nhất Ďịnh về sinh lý thay Ďổi các thông số quang hợp Ďảm bảo khả năng tự dưỡng của cây trồng với tỷ

lệ tương ứng với Ďiều kiện tự nhiên, hàm lượng diệp lục tăng lên giúp cây thích nghi với Ďiều kiện ánh sáng cao, Ďộ ẩm không khí giảm, bộ rễ phát triển giúp cây hút nước nhờ Ďó mà cây tồn tại, sinh trưởng và phát triển Ďược [8]

1.3 Các nghiên cứu nhân giống phong lan và giai đoạn ra ngôi

1.3.1 Các nghiên cứu nhân giống phong lan

Do là loài có nhiều giá trị nên các loài lan, trong Ďó có chi Hoàng thảo (Dendrobium) thu hút Ďược nhiều sự quan tâm của các nhà nghiên cứu Đầu tiên là những người làm công tác giống Trong lĩnh vực nhân giống, Ďối với lan Hoàng thảo có thể nhân giống bằng phương pháp tách thân hoặc nhân giống bằng hạt nhưng phương pháp tốt nhất Ďể nhân giống loại lan này là

phương pháp nhân giống in vitro

Do là chi lan có nhiều giá trị nên Ďến tháng 1 năm 2015 Ďã có khoảng

gần 100 nghiên cứu nhân giống in vitro các loài Hoàng thảo Ďược công bố,

trong Ďó các loài Ďược nghiên cứu nhiều là D candidum (D officinale), D nobile, D huoshanense và các giống lai [54] Kết quả nghiên cứu nhân giống hạt phong lan Phi Ďiệp tím lấy từ quả 7-9 tháng trên môi trường rắn cho tỷ

lệ nảy mầm tốt trên môi trường MS bổ sung 100ml/l nước dừa [16; 56]

Ở Việt Nam, một số loài thuộc chi Hoàng thảo cũng Ďã Ďược nhân

giống in vitro thành công Nghiên cứu nhân giống in vitro lan Thạch hộc Ďã

Ďược báo cáo Kết quả cho thấy nguyên liệu sử dụng thích hợp là quả lan 5 tháng tuổi; môi trường gieo hạt là MS + (100ml ND + 10g saccharose +

6,0g agar)/lít môi trường Trong nhân in vitro kinh Ďiển, môi trường nhân

nhanh protocorm tối ưu là KC+ (100ml ND + 10g saccharose + 6,0g agar)/lít; nhân nhanh cụm chồi tốt nhất là MS+ (100ml ND + 10g

saccharose + 6,0g agar)/lít Trong nhân in vitro cải tiến thì nuôi cấy lỏng

lắc nút bông và lỏng lắc màng thoáng khí Ďã tăng hệ số nhân protocorm Ďạt

1,9 và 2,3 lần so với nhân in vitro kinh Ďiển Nuôi cấy Ďặc thoáng khí giúp

giảm 25% lượng saccharose bổ sung vào môi trường và tăng hệ số nhân protocorm lên gấp 1,4 lần so với nuôi cấy kinh Ďiển Nhân nhanh cụm chồi bằng kỹ thuật bioreactor giảm nửa thời gian nhân giống Môi trường tối ưu

tạo cây hoàn chỉnh là RE+ (10g sucrose + 0,5g THT)/lít, cường Ďộ ánh

sáng 2300lux [3] Sau Ďó, lan Thạch hộc thiết bì (D officinale Kimura et

Migo) cũng Ďược nhân giống thành công Nhân giống bằng gieo hạt trên môi trường VW+ 10g sucrose + 6g agar + 100ml nước dừa (ND)/lít môi trường, nhân nhanh cụm chồi tốt nhất trên môi trường MS + 100ml ND + 20g sucrose + 6g agar + 60g chuối chín/lít môi trường Nhân giống vô tính

thông qua nuôi cấy Ďoạn thân mang mắt ngủ sử dụng Ďoạn thân in vitro

mang 2 mắt ngủ và nuôi cấy trên môi trường MS + 20g sucrose + 10% ND + 0,5 mg/l BA + 0,5mg/l α-NAA + 6g agar/lít môi trường Môi trường tạo cây hoàn chỉnh là RE + 10g sucrose + 6g agar + 0,3g THT + 0,5 mg/l α-

NAA [7] Lan Hoàng thảo Long nhãn (D fimbriatum Hook.) là loài lan Ďẹp

Ďược sử dụng làm cảnh và làm thuốc, Ďang Ďe dọa tuyệt chủng Tiến hành

nghiên cứu nhân in vitro với mục Ďích bảo tồn và phát triển nguồn gen loài

lan quý Kết quả nghiên cứu Ďã chỉ rõ: Nguyên liệu sử dụng là quả lan 3 tháng tuổi; Môi trường thích hợp cho nảy mầm và phát sinh protocorm của hạt là môi trường MS + 100ml ND + 10g saccharoza + 6,0g agar/lít môi trường; Môi trường nhân nhanh protocorm tốt nhất là môi trường KC + 100ml ND + 10g sucrose + 60g khoai tây + 6,0g agar/lít môi trường; Môi trường MS + 100ml ND + 20g sucrose + 60g chuối chín + 6,0g agar/lít môi

trường là thích hợp nhất cho nhân nhanh chồi in vitro ; Môi trường tạo cây

hoàn chỉnh là RE + 10g sucrose + 1g THT + 6,0g agar/lít môi trường [6]

Lan Phi Ďiệp tím cũng Ďã Ďược nhân giống thành công nhờ công nghệ in vitro ở Việt Nam Cac chồi lan D anosmum cấy trên môi trường MS có bổ

sung 0,5 mg/l BA và 1,0 mg/l kinetin sinh trưởng mạnh Khi phối hợp 0,5 mg/l BA với 1,0 mg/l IBA có hiệu quả nhất trong việc kích thích tạo chồi

cây lan D anosmum in vitro và các chỉ tiêu khác như chiều cao cây, dài rễ,

trọng lượng tươi và khô [9]

1.3.2 Các nghiên cứu về giai đoạn ra ngôi

Các nghiên cứu về các Ďặc Ďiểm hình thái, sinh lí, hóa sinh của cây trồng trước những biến Ďổi của khí hậu, Ďiều kiện nuôi trồng cũng Ďược quan tâm

sâu sắc Gần Ďây, những Ďặc Ďiểm này của cây trong giai Ďoạn ra ngôi ex vitro

các cây có nguồn gốc nuôi cấy mô cũng Ďược quan tâm

Hofman nghiên cứu giai Ďoạn ra ngôi ở Ďối tượng là cây thuốc lá khi

chuyển từ trạng thái in vitro sang ex vitro sau 35 ngày có sự biến Ďổi về hàm

lượng diệp lục, khả năng quang hợp và hàm lượng tinh bột [22]

Tương tự, cây phong lan Doritaenopsis in vitro cũng có những sự thay

Ďổi về Ďặc Ďiểm của hệ sắc tố quang hợp (tăng tỉ lệ carotenoid), hình thái lá

sau 30 ngày ra ngôi ex vitro [27]

Trên phương diện hóa sinh, Van Huylenbroeck nghiên cứu trên cây Spathiphyllum thấy có sự giảm hoạt tính enzyme sucrose-p-synthase và sự hoạt hóa ADPG pyrophosphorylase sau giai Ďoạn ra ngôi [57]

Sự hóa gỗ của cây trong quá trình ra ngôi ex vitro cũng Ďược nghiên cứu

ở cây dương [29]

Trong thời kì ra ngôi ex vitro, ở một số thực vật có những lá hình thành trong Ďiều kiện in vitro không thể tiếp tục phát triển tiếp và dần Ďược thay thế

bằng các lá mới hình thành [17; 41]

Nghiên cứu của Pospóšilová trên cây thuốc lá, ở loài này, số lượng lá

tăng ngay khi chuyển cây ra môi trường ex vitro, trong Ďiều kiện in vitro cây

thuốc lá có 6,7 lá; sau ra ngôi 17 ngày và 45 ngày số lượng lá lần lượt là 13,3

lá và 22,7 lá [40] Trong một số nghiên cứu trước Ďây cũng chỉ ra rằng khi

chuyển cây từ Ďiều kiện in vitro ra ngoài môi trường tự nhiên, Ďộ dày lớp biểu

bì, lớp cutin có xu hướng tăng lên [58]

Nghiên cứu hàm lượng nước giai Ďoạn ra ngôi trên cây Malus pumilacủa Díaz-Pérez, hàm lượng nước của cây này giảm sau 10 ngày ra ngôi và Ďược

phục hồi tương Ďương với hàm lượng nước cây in vitro ở thời kì sau ra ngôi,

hàm lượng chất khô của cây này tăng sau 10 ngày ra ngôi và thời kì sau ra ngôi

hàm lượng chất khô tương Ďương với thời Ďiểm cây trong Ďiều kiện in vitro [19]

Tác giả Nautiyal, 1994 nghiên cứu về hàm lượng chất khô trên thân và rễ

cây bạch Ďàn in vitro, hàm lượng chất khô của cây này tăng mạnh trong thời

kì 4 ngày Ďưa cây ra ngoài môi trường tự nhiên, sau Ďó giảm dần vào thời kỳ sau ra ngôi [37]

Nghiên cứu của các tác giả Sciutti và Morini trên cây Prunus cerasifera,

cây trong ống nghiệm với Ďộ ẩm tương Ďối là 100% sẽ bị mất nhiều nước hơn

so với cây Ďược trồng ở Ďộ ẩm tương Ďối từ 70% Ďến 80% [47]; theo Khan et

al, cây Quercus robur trong bình thủy tinh mất nước mạnh hơn so với cây

ngoài tự nhiên trong thời gian 30 phút Ďến 90 phút thí nghiệm [31]; nghiên

cứu của tác giả Romano & Martins-Loucao cho thấy cây in vitro mất nước nhiều hơn so với cây ex vitro, mất tới 53% và 14% trong 30 phút thí nghiệm [44] Theo một số nghiên cứu trước Ďây, khi chuyển cây in vitro ra ngoài môi

trường tự nhiên, lớp biểu bì, lớp cutin có xu hướng dày lên cùng với sự giảm

số lượng khí khổng bề mặt lá và hoạt Ďộng Ďóng mở khí khổng hiệu quả hơn

Do vậy, khi Ďưa cây ra ngoài sẽ xảy ra hoạt Ďộng bất thường của khí khổng là nguyên nhân làm cho cường Ďộ thoát hơi nước ở lá diễn ra mạnh hơn [48; 52] Chỉ số Fv/Fmở một số loài, trong thời kì Ďầu ra ngôi lá bị mất nước nhanh, chỉ số Fv/Fm giảm xuống nhanh chóng như cây thuốc lá [22], cây khoai lang Ďược trồng vào môi trường nhân tạo có bổ sung 40g sucrose /lít môi trường [11] hay cây Doritaenopsis khi Ďược Ďặt ở Ďiều kiện Ďộ ẩm không khí dưới 70% hoặc nhiệt Ďộ môi trường bằng 15°C, 20°C hoặc 35°C [24] Hoạt Ďộ catalase của cây Đầu Ďài Ấn Độ tăng lên trong thời kì Ďầu ra

ngôi ex vitro, sau Ďó hoạt Ďộ enzyme này giảm vào cuối thời kì ra ngôi [20]

hoặc cây Tam phỏng [23]

Chakrabarty D nghiên cứu trên cây Cúc Ďồng tiền, hoạt Ďộ catalase giảm

mạnh khi Ďưa cây ra môi trường ex vitro Ďược 5 ngày và hoạt Ďộenzyme này

tiếp tục giảm vào các thời Ďiểm ngày thứ 10, 15, 20 và 25 ra ngôi [12]

Silva Junior và cộng sự nghiên cứu về giải phẫu rễ của cây L purpurata, cây Ďược Ďưa ra ngoài trồng trong môi trường có chứa 75% urê

cho thấy sự thay Ďổi trong cấu trúc giải phẫu rễ, Ďặc biệt có sự gia tăng diệp lục a và b với cây Ďược xử lý 50, 75 và 100% urê so với cây trong ống nghiệm [50] và nghiên cứu giải phẫu lá cây Yến Mạch của Aracama và cộng

sự [10] trong giai Ďoạn ra ngôi

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, phạm vi và thời gian nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Phong lan Phi Ďiệp tím (Dendrobium anosmum) thuộc giống Hoàng thảo (Dendrobium), họ phong lan (Orchidaceae), bộ Lan (Orchidales), lớp một lá mầm (Monocotyledone), ngành Ngọc Lan, thực vật hạt kín (Mangoliophyta)

- Địa Ďiểm nghiên cứu: Trung tâm nghiên cứu CNSH, khoa Khoa học Tự

nhiên- Trường Đại học Hùng Vương và Khoa Sinh học - KTNN, Trường Đại

học Sư phạm Hà Nội 2

- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 11/2015 Ďến tháng 7/2016

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Cây phong lan Phi Ďiệp tím in vitro có nguồn gốc từ hạt Ďược nuôi cấy 8

tuần trên môi trường Murashige và Skoog (MS) có bổ sung 30 g/l Ďường sucrose, 2 g/l than hoạt tính, 6 g/l agar (Qualigens, Mumbai, India) Các bình cây Ďược Ďặt trong phòng nuôi cây với Ďiều kiện nhiệt Ďộ 25°C/22°C (ngày/Ďêm), chu kì 12h sáng/12h tối, Ďiều kiện Ďộ ẩm tương Ďối 100%, chiếu sáng với Ďèn Neon (hãng Rạng Đông, Việt Nam), cường Ďộ ánh sáng khoảng 1920-1990 lux

Sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường tạo rễ, cây có tối thiểu 2-3 lá Ďược

sử dụng cho quá trình ra ngôi ex vitro trong Ďiều kiệntự nhiên (nhiệt Ďộ 20 –

300C, Ďộ ẩm 70 -83% ; cường Ďộ ánh sáng 1236 – 1541 lux)

Các mẫu Ďược thu vào các thời Ďiểm:

- Ngày Ďầu tiên chuyển bình cây ra ngoài môi trường tự nhiên (D0)

- Bình chứa cây Ďược Ďặt ra ngoài cửa sổ cho tiếp xúc với ánh sáng tự nhiên 7 ngày (D7)

- Cây ở thời Ďiểm (D7) Ďược loại bỏ agar nhẹ nhàng và ngâm cây 5 phút

trong dung dịch KMnO4 0,1%; rửa sạch bằng nước, sau Ďó chuyển ra Ďặt trên

bề mặt khay có chứa nước dưới Ďáy trong thời gian 5 ngày, phun sương một lần/2 ngày (D12)

- Trồng cây D12 vào chậu chứa giá thể rêu khô,Ďặt trong nhà lưới tại Trung tâm nghiên cứu CNSH, Trường Đại học Hùng Vương với Ďiều kiện chiếu sáng và Ďộ ẩm tự nhiên, phun sương 3 ngày/lần và thu mẫu ở ngày 28 (D28), ngày thứ 56 (D56) tính từ thời Ďiểm (D0)

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu hình thái

Trong quá trình ra ngôi ex vitro, chọn những cây lan Phi Ďiệp tím trong

bình TN to, khỏe, phát triển tốt, có từ 3 - 4 lá và 4 - 5 rễ to dài Để nghiên cứu hình thái, ở mỗi mẫu chọn chiếc lá thứ 2 từ trên xuống, rễ thì chọn rễ mập, chắc, khỏe có sức sống tốt

Các chỉ tiêu về kích thước rễ, thân, lá Ďược xác Ďịnh bằng thước palmer (Mitutoyo digimatic micrometer, Nhật) có Ďộ chính xác tới milimet Bắt Ďầu

Ďo lần Ďầu tiên khi cây vừa Ďược lấy ra từ trong bình TN có nguồn gốc in vitro (D0), dùng bút Ďánh dấu các vị trí Ďo ở rễ, thân, lá Ďể làm dấu hiệu cho

những lần Ďo tiếp theo D28 và D56

- Đo chiều dài lá (mm): Đo từ gốc phiến lá Ďến chóp của lá, Ďo ở những lá

Ďã thành thục

- Đo chiều rộng lá (mm): Khoảng cách của phần rộng nhất của phiến lá

- Đo Ďộ dày phiến lá (mm): Khoảng cách giữa mặt trên và mặt dưới của lá

- Đo chiều cao thân (mm): Đo từ sát gốc Ďến chóp ngọn (nách lá thấp nhất)

và Ďánh dấu vị trí cố Ďịnh Ďo cho các lần Ďo sau

- Đo Ďường kính thân (mm): Đo tại vị trí gần sát gốc và Ďánh dấu vị trí cố Ďịnh Ďo cho các lần Ďo sau Đo ở 2 Ďiểm Ďối diện nhau của thân

- Đo chiều dài rễ (mm): Đo rễ dài nhất còn sống trên cây, Ďo từ phần tiếp giáp với thân Ďến chóp rễ và Ďánh dấu rễ cố Ďịnh Ďo cho các lần Ďo sau

- Đo Ďường kính rễ (mm): Đánh dấu rễ cần Ďo, vị trí Ďo cho các lần

Ďo sau Đo ở 2 Ďiểm Ďối diện nhau của rễ

2.2.2 Phương pháp xác định các chỉ tiêu sinh lí, hóa sinh

Cây phong lan Phi Ďiệp tím Ďược sử dụng trong các TN nghiên cứu về chỉ tiêu sinh lý, hóa sinh ở các giai Ďoạn:

+ D0: Cây trong bình TN có nguồn gốc in vitro (8 tuần nuôi cấy)

+ D7: Cây trong bình TN có nguồn gốc in vitro Ďể ngoài cửa sổ 7 ngày

+ D12: Cây từ D7 cho ra ngoài môi trường, Ďặt trên giá 5 ngày

+ D28, D56: Cây trồng trong giá thể ở nhà lưới lần lượt 28, 56 ngày

kể từ thời Ďiểm D0

Ở mỗi giai Ďoạn dùng 3 cây khác nhau Ďể lặp lại thí nghiệm

2.2.2.1 Xác định hàm lượng nước, hàm lượng chất khô [4]

Lấy cây lan Phi Ďiệp tím cân trên cân kỹ thuật Ďược khối lượng tươi (Mt), sau Ďó cho vào tủ sấy ở nhiệt Ďộ 105oC trong 2h Sau Ďó tiếp tục sấy ở 80o

C trong vòng 24h Cân tiếp Ďến khi cây có khối lượng khôngĎổi ta thu Ďược Mk Hàm lượng nước Ďược tính theo công thức:

Mt – Mk

H (%) = x 100

Mt

Trong Ďó: H là hàm lượng nước ( % )

Mt là khối lượngtươi ban Ďầu của cây (g)

Mk là khối lượng khô của cây (g) Hàm lượng chất khô của cây tính theo công thức:

Mk

K (%) = x 100

Mt

Trong Ďó: K là hàm lượng chất khô của cây (%)

Mt là khối lượng tươi ban Ďầu của cây (g)

Mk là khối lượng khô của cây (g)

2.2.2.2 Cường độ thoát hơi nước của mô lá [4]

Thoát hơi nước làm giảm khối lượng của lá cây Do Ďó trong thời gian ngắn (60 phút) có thể Ďo Ďược cường Ďộ thoát hơi nước của cây theo mức giảm khối lượng của lá

Lấy lá cây lan Phi Ďiệp tím ra khỏi bình, rửa nhẹ nhàng bằng nước cất, dùng giấy thấm nước thấm khô Cho lá lên cân (m1) rồi dùng Ďồng hồ bấm giờ trong thời gian 60 phút rồi cân lại (m2) Sau Ďó Ďặt lá lên tờ giấy A4 Lấy bút chì kim vẽ lại hình của lá Lấy kéo cắt theo hình của lá cây lan Phi Ďiệp tímrồi Ďêm cân (T1) Cắt 1 mảnh giấy có diện tích 1dm2

rồi Ďem Ďi cân (T2) Cường Ďộ thoát hơi nước theo công thức:

(m1 - m2)x60

I (g/dm2/giờ) =

txS Trong Ďó: I là cường Ďộ thoát hơi nước

m1 là khối lượng tươi ban Ďầu của lá

m2 là khối lượng tươi của lá sau 60 phút thoát hơi nước

t là thời gian thoát hơi nước của lá

S là diện tích của lá cây TN Diện tích của lá cây TN tính theo công thức:

T1

S (dm2) =

T2

Trong Ďó: T1 là khối lượng giấy cắt theo hình lá cây lan Phi Ďiệp tím

T2 là khối lượng giấy có diện tích 1dm2

2.2.2.3 Xác định khả năng giữ nước của mô lá [4]

Lấy cây lan Phi Ďiệp tím tại mỗi thời Ďiểm khác nhau, Ďem cân và cắt rời

lá Ďể cân riêng khối lượng từng lá Sau Ďó Ďể lá mất nước tự nhiên trên bàn không có ánh nắng chiếu trực tiếp, ở nhiệt Ďộ phòng Sau mỗi thời gian 30 phút

Ďem cân lại (Ďể xác Ďịnh mức Ďộ mất nước theo thời gian) Thời gian TN là 120 phút Sau Ďó, sấy khô lá, thân ở 80oC Ďến khối lượng khô không Ďổi (khoảng 24 giờ) Ďể tính khối lượng khô

Khả năng giữ nước tính bằng lượng nước mất khi héo hoặc lượng nước còn lại sau héo:

Trong Ďó: a – Lượng nước mất khi héo/ lượng nước tổng số;

B – Khối lượng tươi lá ban Ďầu;

b – Khối lượng tươi lá sau khi héo;

A – Lượng nước tổng số (A = B – V trong Ďó V – Khối lượng khô) Hoặc: (Lượng nước còn lại/ Lượng nước tổng số)

2.2.2.4 Xác định hàm lượng sắc tố quang hợp (diệp lục, carotenoid) [4]

Hàm lượng sắc tố quang hợp Ďược Ďo bằng máy quang phổ hấp phụ UV-VIS GENESYS 10UV (Thermo Electron Corporation, Mỹ)

Cân 0,2g lá cây Ďem nghiền trong cối xứ với 5ml axeton 80% Sau khi

lá Ďã Ďược nghiền nhuyễn, thêm 5ml axeton 80% vào tiếp tục nghiền Sau Ďó

Ďổ dung dịch nghiền Ďược sang ống Ďong, cho thêm axeton 80% vào tráng cối, rồi lại Ďổ vào ống Ďong Ďó làm sao cho Ďạt Ďược Ďủ 10ml

Sau Ďó chuyển dung dịch từ ống Ďong sang ống li tâm Ďể li tâm với tốc

Ďộ 4000vòng/phút trong thời gian 5 phút Sau khi li tâm, chuyển dung dịch nổi sang ống nghiệm Ďo OD của dịch chiết ở các bước sóng 663nm, 647nm và 470nm trên máy quang phổ hấp phụ UV-VIS GENESYS 10UV (Thermo Electron Corporation, Mỹ)

Nồng Ďộ sắc tố quang hợp Ďược tính theo công thức (Mac – Kinney, 1941):

Ca = 12,7.E663 – 2,69.E647

Cb = 22,9.E647 – 4,68.E663

Ca+b = 8,02.E663 + 20,3.E647

Cx+c = (1000.E470 - 1,82.Ca - 85,02.Cb)/198 Trong Ďó: Ca, Cb, Ca+b, Cx+clà các trị số Ďo nồng Ďộ (mg/l) tương ứng của các Chl a, Chl b, Chl a+b và Car

Hàm lượng sắc tố (mg/g lá tươi) Ďược tính theo công thức sau:

CxV A(mg/g lá tươi) =

Px1000 Trong Ďó: A: Hàm lượng sắc tố (mg/g lá tươi)

C: Nồng Ďộ sắc tố (mg/l) V: Thể tích dịch chiết (ml) P: Khối lượng mẫu tươi (g)

2.2.2.5 Xác định thông số huỳnh quang diệp lục [4]

Huỳnh quang chlorophyll Ďược Ďo trực tiếp từ lá của ít nhất năm cây khác nhau, mỗi cây Ďo một lá bằng máy OS30p+ (OPTI-SCIENES, Mỹ) theo

phương pháp Ďược mô tả bởi Nguyễn Văn Mã và nnk [4]

Máy Ďo xác Ďịnh các chỉ tiêu:

- F0: Huỳnh quang tối thiểu

- Fm: Huỳnh quang cực Ďại

- Fvm (Fv/Fm): Hiệu suất huỳnh quang biến Ďổi

Cân 0,2g mẫu lan Phi Ďiệp tím, nghiền trong cối sứ thêm vài giọt Ďệm pH7

và một ít CaCO3 Ďể trung hòa dịch chiết (Ďến khi ngừng tạo bọt CO2) Chuyển Ďịnh lượng toàn bộ mẫu Ďã nghiền nhỏ vào ống Ďong 100ml thêm Ďệm và dẫn

Ďến vạch 40ml, lắc Ďều Sau Ďó Ďem lọc qua bông và giấy lọc, thu dịch trong Ďể xác Ďịnh hoạt Ďộ catalase

Lấy 2 bình nón dung tích 100ml

- Bình 1 (TN): Cho 10 ml dung dịch H2O2 0,1%, 10ml dịch chiết enzyme, ủ

ở 30oC trong 30 phút thêm 3ml H2SO4 10% chuẩn Ďộ bằng dung dịch KMnO4 0,1N cho Ďến khi xuất hiện màu hồng bền

- Bình 2 (ĐC): Cho 10 ml dịch chiết enzyme vào bình, Ďặt vào nồi cách thủy Ďang sôi trong 5 phút Ďể kìm hãm enzyme Thêm vào bình 10ml H2O2

0,1%, giữ 30 phút ở 30oC, thêm 5ml H2SO4 10% và chuẩn Ďộ như bình TN

Số mg H2O2 bị phân giải dưới tác dụng của enzyme tính theo công thức:

Trong Ďó: A – Số ml KMnO4 0,1N Ďã dùng Ďể chuẩn Ďộ H202 của bình ĐC

B – Số ml KMnO4 0,1N Ďã dùng Ďễ chuẩn Ďộ H2O2 trong bình TN

V1 – Tổng thể tích dịch chiết enzyme (=100ml)

V2 – ml dung dịch enzyme lấy Ďể phân tích (10ml)

a – Số gam mẫu lấy Ďể nghiên cứu

Số Ďơn vị catalase trong 1 gam mẫu (µmol) H2O2 bị phân giải sau 1 phút là:

30 – Thời gian enzyme tác dụng (phút)

+ Dùng pipet hút 3 ml dung dịch Ďệm, 0,05 ml dung dịch guaiacol, 0,1 ml dung dịch enzim, và 0,03ml dung dịch H2O2 vào cuvet Test (Ďặt dung dịch Ďệm vào nhiệt Ďộ 25oC trước khi phân tích, cuvet Blank cho các thành phần tương tự, thay 0,1 ml enzim bằng dung dịch Ďệm)

Đảo Ďều, Ďặt cuvet vào máy Ďo quang phổ Đợi Ďến khi Ďộ hấp thu tăng Ďến 0,05 Dùng Ďồng hồ Ďếm giây ghi lại khoảng thời gian (Δt) cần thiết Ďể Ďộ hấp thụ tăng lên giá trị 0,1

5 phút Bổ sung vào bình phản ứng 2ml toluen, lắc Ďều (15 – 20 giây) Đợi

ở nhiệt Ďộ phòng cho tới phản ứng có màu Lấy phần dịch màu hồng ở trên Ďem Ďo OD 520nm bằng máy Ďo quang phổ

Hàm lượng prolin Ďược xác Ďịnh dựa vào Ďường chuẩn prolin và tính toán theo công thức sau:

Trong Ďó: X – giá trị OD520 của mẫu; V - thể tích dịch chiết (= số ml toluen); df – hệ số pha loãng (trường hợp này là 5); w – khối lượng mẫu

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu giải phẫu [5]

Dùng dao lam cắt ngang mẫu rễ, cắt cho Ďến khi Ďược mẫu mỏng và Ďều, không bị rách

Lát cắt Ďược ngâm vào dung dịch Javen 5% trong 5 phút Ďể loại bỏ màu của mẫu thì lấy ra, rửa với nước cất 2 lần

Ngâm trong dung dịch xanhmetylen 0,1% trong 9 phút rồi lấy ra, rửa nhanh với nước cất 2 lần

Đưa mẫu cắt lên, lên kính hiển vi và quan sát ở các Ďộ phóng Ďại khác nhau (10x và 40x) Chụp lại mẫu ở Ďộ phóng Ďại 40x của vật kính