Header Page of 161 B GIO DC O TO B Y T TRNG I HC Y H NI NGUYN MINH H XáC ĐịNH ĐộT BIếN GEN EGFR Và GEN KRAS QUYếT ĐịNH TíNH ĐáP ứNG THUốC TRONG ĐIềU TRị BệNH UNG THƯ PHổI KHÔNG Tế BàO NHỏ LUN N TIN S Y HC H NI 2014 Footer Page of 161 Header Page of 161 B GIO DC O TO B Y T TRNG I HC Y H NI XáC ĐịNH ĐộT BIếN GEN EGFR Và GEN KRAS QUYếT ĐịNH TíNH ĐáP ứNG THUốC TRONG ĐIềU TRị BệNH UNG THƯ PHổI KHÔNG Tế BàO NHỏ Chuyờn ngnh : HểA SINH Y HC Mó s : 62720112 LUN N TIN S Y HC Ngi hng dn khoa hc: TB.BS Trn Võn Khỏnh GS. ỡnh H BVN KHNH èNH H H NI - 2014 Footer Page of 161 Header Page of 161 LI CM N Trc ht, tụi xin by t lũng tri n sõu sc ti GS. ỡnh H v TS.BS.Trn Võn Khỏnh, l nhng ngi thy, ngi hng dn khoa hc, ó tn tỡnh giỳp , ng viờn tụi sut quỏ trỡnh hc tp, trc tip hng dn tụi thc hin nghiờn cu, gúp ý v sa cha lun ỏn Tụi xin by t lũng bit n sõu sc ti GS.TS.T Thnh Vn, Phú Hiu trng Trng i hc Y H Ni l ngi ó tn tỡnh truyn t kin thc v nhng kinh nghim quý bỏu ng thi to mi iu kin thun li cho tụi quỏ trỡnh thc hin ti v hon thnh lun ỏn ny Tụi xin by t lũng bit n chõn thnh n nhng thy cụ, ng nghip, nhng ngi ó to mi iu kin, giỳp tụi quỏ trỡnh thc hin lun ỏn: - Ban Giỏm Hiu v Phũng o to Sau i Hc ca Trng i hc Y H Ni - PGS.TS Phm Thin Ngc, Trng B mụn Húa Sinh cựng cỏc thy cụ B mụn Húa Sinh Trng i hc Y H Ni - TS.BS Phm Tuyt Mai, Trng Khoa Ni Bnh Vin K Trung ng, cựng ton th cỏc bỏc s, iu dng ca Khoa - PGS.TS.Mai Trng Khoa v PGS.TS.Phm ỡnh H, l Giỏm c v Phú Giỏm c Trung Tõm Y hc ht nhõn v Ung Bu Bnh Vin Bch Mai cựng ton th cỏc bỏc s, iu dng ca Trung Tõm - Ton th cỏc ng nghip, cỏc nghiờn cu viờn ca Trung Tõm nghiờn cu Gen-Protein, Trng i hc Y H Ni Footer Page of 161 Header Page of 161 Xin c gi li cm n n cỏc bnh nhõn cựng gia ỡnh ca h ó giỳp tụi cú c cỏc s liu lun ỏn ny Xin cm n cỏc bn bố, ng nghip ó giỳp tụi quỏ trỡnh hc Cui cựng, tụi xin ghi nh cụng n sinh thnh, nuụi dng v tỡnh yờu thng ca b m tụi, b m chng tụi cựng s ng h, ng viờn ca chng, hai v cỏc em gia ỡnh, nhng ngi ó luụn bờn tụi, l ch da vng chc tụi yờn tõm hc v hon thnh lun ỏn H Ni, thỏng 12 nm 2014 Nguyn Minh H Footer Page of 161 Header Page of 161 LI CAM OAN Tụi l Nguyn Minh H, nghiờn cu sinh khúa 30 Trng i hc Y H Ni, chuyờn ngnh Húa Sinh Y Hc, xin cam oan: õy l lun ỏn bn thõn tụi trc tip thc hin di s hng dn ca Cụ Trn Võn Khỏnh v Thy ỡnh H Cụng trỡnh ny khụng trựng lp vi bt k nghiờn cu no khỏc ó c cụng b ti Vit Nam Cỏc s liu v thụng tin nghiờn cu l hon ton chớnh xỏc, trung thc v khỏch quan, ó c xỏc nhn v chp thun ca c s ni nghiờn cu Tụi xin hon ton chu trỏch nhim trc phỏp lut v nhng cam kt ny H Ni, ngy 20 thỏng12 nm 2014 Ngi vit cam oan Nguyn Minh H Footer Page of 161 Header Page of 161 DANH MC CC CH VIT TT ALK : Anaplastic lymphoma kinase AKT : Gen thuc h v-akt murine thymoma viral oncogene homolog ASCO : Hip hi ung th hc lõm sng Hoa K (American Society of Clinical Oncology) ATP : Adenosine triphosphate BRAF : Gen thuc h v-Raf murine sarcoma viral oncogen, mó húa cho protein serinee/threonine-protein kinase B-raf COSMIC : Danh mc cỏc t bin sinh dng bnh ung th (Catalogue of Somatic Mutations In Cancer) CT : Chp ct lp vi tớnh húa (computerised tomography) Ct : Chu k ngng (Cycle of threshold) CTCAE : Tiờu chun ỏnh giỏ c tớnh v tỏc dng ph ca húa cht ca Vin Ung th quc gia M (National Cancer Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events) DNA : Deoxyribonucleic acid dNTP : Deoxyribose nucleoside triphosphate EGFR : Th th yu t phỏt trin biu bỡ (Epidermal Growth Factor Receptor ) FDA : Cc Qun lý Thc phm v Dc phm Hoa K (Food and Drug Administration) FISH : Lai ti ch phỏt hunh quang (fluorescence in situ hybridization) HGFR : Th th yu t phỏt trin t bo gan (Hepatocyte Growth Factor Receptor) HR : T s nguy c (Hazard Ratio) GAP : Guanosine activated protein (protein hot húa GTPase) GDP : Guanosine diphosphate Footer Page of 161 Header Page of 161 GEFs : Yu t chuyn i nucleotide guanine (Guanine nucleotide Exchange Factors) GTP : Guanosine triphosphate IASLC : Hip hi quc t nghiờn cu Ung th phi (International Associaton for the Study of Lung Cancer) kDa : kiloDalton KRAS : Gen thuc h v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogen LPTT : Liu phỏp iu tr trỳng ớch MAPK : Mitogen-activated protein kinase MEK : Protein thuc nhúm serinee/threonine-selective protein kinases MIBI : Methoxy-Isobutyl-Isonitrite MRI : Chp cng hng t (magnetic resonance imaging) mRNA : RNA thụng tin (messenger RNA) MSCT : Chp ct lp in toỏn a lỏt ct (Multi-slides Computed Tomography) mTOR : Mammalian target of rapamycin OD : Mt quang (Optical Density) OS : Thi gian sng thờm ton th (Overall Survival) ORR : T l ỏp ng (overall response rate) PCR : Phn ng khuch i chui (polymerase chain reaction ) PI3K : Phosphatidyl inositol 3-kinase RFLP : S a hỡnh v chiu di cỏc phõn on ct hn ch (Restriction Fragment Length Polymorphism) PET-CT : Chp ct lp phỏt x positron (Positron Emission Tomography) PFS : Thi gian sng thờm bnh khụng tin trin (Progression-Free Survival) Scorpion ARMS : Scorpion Amplification Refractory Mutation System SMAP : Smart Amplification Process Footer Page of 161 Header Page of 161 SNP : Bin i a hỡnh thỏi n nucleotid (Single Nucleotide Polymophism) SPECT : Chp ct lp in toỏn bc x n photon (Single-photon Emission Computed Tomography) TKI : Cht c ch hot tớnh tyrosine kinase (tyrosine kinase inhibitor) UTP : Ung th phi UTPKTBN : Ung th phi khụng t bo nh VEGF :Yu t phỏt trin ni mụ mch mỏu (Vascular Endothelial Growth Factor) Footer Page of 161 Header Page of 161 MC LC T VN CHNG 1: TNG QUAN TI LIU 1.1 TNG QUAN V BNH UNG TH PHI KHễNG T BO NH 1.1.1 C ch phõn t bnh 1.1.2 Lõm sng 1.1.3 Cỏc giai on ca ung th phi 1.1.4 Cn lõm sng 1.1.5 iu tr 13 1.1.6 Tiờn lng 14 1.2 VAI TRế CA CON NG TN HIU EGFR TRONG C CH BNH V IU TR UTPKTBN 15 1.2.1 Th th yu t phỏt trin biu mụ 15 1.2.2 t bin gen EGFR 17 1.2.3 Cỏc bin i cp phõn t ca ng tớn hiu EGFR 19 1.2.4 Hiu qu iu tr ca cỏc cht c ch tyrosine kinase ca EGFR 23 1.2.5 Tỡnh hỡnh nghiờn cu t bin gen EGFR, gen KRAS v hiu qu ca EGFR TKIs iu tr UTPKTBN ti Vit Nam 29 1.3 PHNG PHP PHT HIN T BIN GEN EGFR V KRAS 31 1.3.1 K thut PCR-RFLP 31 1.3.2 K thut gii trỡnh t gen 33 1.3.3 K thut Scorpion ARMS 34 1.3.4 K thut Smart Amplification Process 36 CHNG 2: I TNG V PHNG PHP NGHIấN CU 38 2.1 I TNG NGHIấN CU 38 2.1.1 Xỏc nh t bin gen EGFR v gen KRAS 38 2.1.2 ỏnh giỏ hiu qu iu tr 39 2.2 PHNG PHP NGHIấN CU 40 2.2.1 Thit k nghiờn cu 40 2.2.2 Phng phỏp tin hnh nghiờn cu 40 Footer Page of 161 Header Page 10 of 161 2.3.PHNG PHP X Lí THNG Kấ 47 2.4 DNG C, TRANG THIT B V HểA CHT NGHIấN CU 48 2.4.1 Dng c 48 2.4.2 Húa cht 48 2.5 VN O C TRONG NGHIấN CU 50 CHNG 3: KT QU NGHIấN CU 51 3.1 XC NH T L T BIN GEN EGFR V GEN KRAS 51 3.1.1 Kt qu tỏch chit DNA t mu mụ ung th 51 3.1.2 Kt qu khuch i exon 18-21 gen EGFR v exon gen KRAS 54 3.1.3 Kt qu xỏc nh t bin bng k thut gii trỡnh t gen 55 3.1.4 Kt qu xỏc nh t bin bng k thut Scorpion ARMS 66 3.1.5 Kt qu xỏc nh t l t bin gen 74 3.2 NH GI HIU QU IU TR 82 3.2.1 c im bnh nhõn 82 3.2.2 Hiu qu iu tr 83 3.2.3 Tỏc dng ph ca erlotinib 87 CHNG 4: BN LUN 88 4.1 XC NH T L T BIN GEN EGFR V GEN KRAS 88 4.1.1 K thut xỏc nh t bin gen EGFR v KRAS 88 4.1.2 T l t bin gen EGFR 100 4.1.3 T l t bin gen KRAS 109 4.2 NH GI HIU QU IU TR CH BC BNG ERLOTINIB TRấN BNH NHN UTPKTBN Cể T BIN GEN EGFR 111 4.2.1 ỏp ng iu tr 112 4.2.2 Thi gian sng thờm 120 4.2.3 Tỏc dng ph ca erlotinib 122 KT LUN 125 KIN NGH 126 DANH MC CC CễNG TRèNH CễNG B TI LIU THAM KHO PH LC Footer Page 10 of 161 Header Page 179 of 161 PH LC IN DI SN PHM PCR TRấN GEL AGAROSE Chun b gel agarose 1,5% - Cõn 1,5g agarose hũa tan 10ml boric acid EDTA (TBE) (s dng lũ vi súng) Sau agarose tan ht, ngui 55- 60C, vo khuụn gel, tựy thuc vo s lng ging cn cho in di m ci lc lm ging t 4- 6- 8- 12 rng - Pha dung dch TBE 10X : Tris 0,89M; acid boric 0,89M; EDTA 0,02M Tin hnh k thut in di - Chun b dung dch in di Thnh phn Dung dch Marker ng chun ng bnh nhõn 10l Sn phm PCR - 9l Dung dch m 10X - 1l 10l 10l Tng s - a gel agarose vo mỏy in di, cho TBE n ngp gel - Dựng pipet v u cụn nh hỳt ln lt dung dch mi ng a vo ging (10l/ging) - a gel vo mỏy in di 80-100V (Mupid-Nht Bn), ng cng 90V in di 30 phỳt - Sau in di, gel c ngõm vo Ethidium bromide 20 phỳt, qua nc ct v a vo soi di ốn UV, chp nh, lu nh vo mỏy vi tớnh hoc in giy Footer Page 179 of 161 Header Page 180 of 161 PH LC QUY TRèNH TINH SCH SN PHM PCR TRấN GEL AGAROSE S dng Promega Wizard SV gel clean-up system (Promega, USA) 1.Chun b dung dch mng (Membrane Wash Solution) (ch thc hin bt u s dng hp sn phm mi) : Thờm ethanol 95% vo l dung dch mng Lng ethanol cho thờm vo ph thuc vo th tớch ca l dung dch mng (c quy nh sn kit) 2.Ct phn gel agarose cú cha sn phm PCR mong mun (hin th di ốn chiu UV) c lng trng lng ming gel Cho ming gel vo ng cú dung tớch 1,5mL, thờm vo 10 àL dung dch bỏm mng (Membrane Binding Solution) cho mi 10 mg trng lng ming gel 4.Nh nhng trn u hn hp ng v ng 50 65oC 10 phỳt hoc cho n quan sỏt thy ming gel tan hon ton Ly tõm ng ton b DNA trung xung ỏy ng 5.t ct lc (SV Minicolumn) vo mt ng thu thp (Collection Tube) Chuyn ton b hn hp gel ó hũa tan vo ct lc v phỳt nhit phũng 6.Ly tõm phc hp ct lc-ng thu thp tc 14 000 vũng/ phỳt phỳt 7.G ct lc ra, b phn dung dch ng thu thp Sau ú t ct lc li ng thu thp 8.Thờm vo ct lc 700 àL dung dch mng v ly tõm tc 14 000 vũng/ phỳt phỳt Lp li bc Footer Page 180 of 161 Header Page 181 of 161 Thờm vo ct lc 500 àL dung dch mng v ly tõm tc 14 000 vũng/ phỳt phỳt 10.Chuyn ct lc sang mt ng 1,5 mL mi Thờm vo ct 50 àL Nuclease-Free Water nhit phũng phỳt, sau ú ly tõm tc 14 000 vũng/ phỳt phỳt 11.B ct lc,dung dch ng cha DNA ớch ó c tinh sch Tip tc thc hin cỏc k thut hoc tr ng -20oC PH LC QUY TRèNH GII TRèNH T GEN Footer Page 181 of 161 Header Page 182 of 161 1.Quy trỡnh PCR khuch i gen EGFR v KRAS s dng BigDye kit Thc hin tun t theo cỏc bc sau: 1.Cho vo ng dung tớch 200 àL cỏc thnh phn sau : Thnh phn Th tớch (àL) Sn phm sau PCR ó c tinh sch 0,5 Big Dye Buffer 5X 1,5 Big Dye 2,5X 1,0 Nc siờu sch 6,0 Mi n (5pmol/àL) 1,0 Tng th tớch 10 (thc hin ng cho mu: ng cho mi xuụi, ng cho mi ngc) 2.Ci t chu trỡnh nhit : 96oC phỳt 96oC 10 giõy 50oC giõy x 25 chu k 60oC phỳt 3.Sau kt thỳc phn ng khuch i, gi lnh ng 4oC hoc tin hnh bc tinh sch tip theo 2.Quy trỡnh tinh sch sn phm sau PCR s dng BigDye kit Thc hin tun t theo cỏc bc sau: Thờm 5àL EDTA 0,125M vo ng 200 àL cú cha sn sn phm PCR Thờm 60 àL cn 100o, trn u, 15 phỳt nhit phũng Ly tõm ng vi tc 15 000 vũng/phỳt 15 phỳt b phn dung dch, gi li phn cn lng ỏy ng Thờm vo ng 250 àL ethanol 70%, trn u Ly tõm ng vi tc 15 000 vũng/phỳt 10 phỳt b phn dung dch, gi li phn cn lng ỏy ng mnh sn phm PCR khụ t nhiờn nhit phũng Lp tc s dng kt ta ca sn phm PCR ny thc hin bc tip theo l c trỡnh t gen Footer Page 182 of 161 Header Page 183 of 161 3.Quy trỡnh gii trỡnh t xỏc nh t bin gen EGFR v KRAS Ngay sau ly mnh DNA khụ va tinh sch bng cn sau phn ng PCR khuch i bng BigDye kit, thc hin tun t cỏc bc sau: 1.Cho vo mi ging 20 àL dung dch Hi-Di (formamide) hũa tan sn phm PCR 2. 95oC 3-5 phỳt (trong block nhit) gn Hi-Di vo cỏc si n DNA 3.Ly mu block nhit -20oC phỳt 4.Trn u hn hp 5.t cỏc ging cha mu vo mỏy c trỡnh t v ng chng trỡnh chy 6.Phõn tớch trỡnh t gen bng h thng ABI Prism 310 (Applied Biosystems) 7.So sỏch kt qu gii trỡnh t gen vi trỡnh t gen chun tng ng ca GenBank 4.Mó quy c cho ký hiu trỡnh t nucleotid phn ng gii trỡnh t gen Mó quy c A T C G R Y W S Trỡnh t nucleotid Adenine Thymine Cytosine Guanine A hoc G C hoc T A hoc T G hoc C Mó quy c M K H B V D N Trỡnh t nucleotid A hoc C G hoc T A hoc T hoc C G hoc C hoc T G hoc A hoc C G hoc A hoc T A hoc T hoc C hoc G Bng mó quy c ny c trớch t: Nomenclature for Incompletely Specified Bases in Nucleic Acid Sequences (Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry (NC-IUB), Recommendations 1984, World Wide Web version Prepared by G P Moss, Department of Chemistry, Queen Mary University of London, UK, available at http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/misc/naseq.html) PH LC QUY TRèNH K THUT SCORPIONS ARMS Footer Page 183 of 161 Header Page 184 of 161 1.Quy trỡnh ỏnh giỏ nng DNA ti u vi cp mi gen ni chun GADPH s dng k thut Scorpions ARMS: S dng gen ni chun nhm kim tra cht lng DNA sau tỏch chit ng thi ỏnh giỏ nng DNA cho mi phn ng, t ú chn nng DNA cho vo mi phn ng thớch hp - Pha loóng DNA chun vi cỏc nng 20ng, 100ng, 500ng - Chun b phn ng realtime PCR: Chun b trờn khay lnh (th tớch àL) TT Thnh phn EGFR KRAS Th tớch Th tớch Th tớch Th tớch Master mix i chng 19,5 19,5 19,8 19,8 Taq DNA polymerase 0,5 0,5 0,2 0,2 DNA khuụn: 3.1 i chng dng : DNA dng tớnh kit 3.2 i chng õm: Nc Tng th tớch 5,0 5,0 5,0 25 25 5,0 25 25 - Trn u cỏc thnh phn sau ú spin nh cho ton b dch xung ỏy ng; - t mu vo mỏy realtime PCR ó c ci t sn chng trỡnh chy; - Ci t chng trỡnh cho mỏy realtime PCR: Bt mỏy realtime PCR, nht l ốn ca u c realtime ớt nht 15 phỳt trc chy chng trỡnh Bt mỏy tớnh v ch cho mỏy tớnh ng xong, gi chng trỡnh realtime PCR lờn Phi kim tra chc chn mỏy realtime PCR v mỏy tớnh ó kt ni vi (xem hng dn s dng mỏy realtime PCR) Chn chc nng ch cho n Heat lid t 1050C thỡ chng trỡnh luõn nhit mi bt u Ci t v trớ mu Plate setup trờn phn mm ỳng vi v trớ mu ó t trờn mỏy realtime PCR Vi mu: Chn loi mu l Unknown t tờn hoc s tng ng vi ký hiu ca mu Footer Page 184 of 161 Header Page 185 of 161 Vi chng dng v õm: t tờn Chng dng, Chng m tng ng Chn mu FAM v HEX cho mu, chng dng v chng õm Ci t chng trỡnh Protocol cho mỏy realtime PCR hot ng: chu k: 950C-4phỳt; 40 chu k: 950C-30 giõy, 600C-1 phỳt (chn c kt qu ti bc ny), gi mu 150C - Cỏch phõn tớch kt qu kim tra chng ni chun: Sau kt thỳc quỏ trỡnh realtime PCR, chuyn sang ch Analysis phõn tớch kt qu Phõn tớch chng dng v õm: Chn mu FAM phõn tớch kt qu, chng dng (PC) phi cho tớn hiu rừ dng v cú giỏ tr Ct t 26,26 30,95 Chng õm phi chc chn rng khụng b ngoi nhim tc l khụng cho tớn hiu Phõn tớch mu: Chn mu FAM phõn tớch kt qu: o Mu cho tớn hiu Ct t 26.26-30.95: mu t yờu cu thc hin phn ng vi cỏc mi t bin o Mu cho tớn hiu Ct t 30.69-37.00: Mu cho tớn hiu yu cú th cú th lm cho t bin khụng th phỏt hin Trng hp ny phi tng thờm lng DNA khuụn bng cỏch cho gp ụi lng DNA s cho tớn hiu gim chu k o Mu cho tớn hiu Ct t 37.00-40.00 : Kt qu cho tớn hiu quỏ yu chng t ch cú mt vi DNA c khuch i Khụng th phỏt hin c t bin nu cỏc DNA c khuch i ú khụng phi hu ht l DNA mang t bin Trng hp ny phi tỏch chit DNA li o Mu cho tớn hiu Ct < 23.00 : trng hp ny phi tin hnh pha loóng DNA a kt qu tớn hiu v 26.69-30.95 bng cỏch c pha loóng ẵ lng DNA thỡ s cho tớn hiu tng lờn chu k 2.Quy trỡnh chy chng dng v chng õm vi cỏc mi t bin: - Chun b Master mix cho phn ng (7 mi t bin gen EGFR): Thc hin trờn khay lnh (Th tớch àL) Footer Page 185 of 161 Header Page 186 of 161 Control 19,5 T790M 19,5 Xúa on exon 19 19,5 L858R 19,5 L861Q 19,5 G719X 19,5 S768I 19,5 Thờm on exon 20 19,5 Taq DNA pol 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 DNA khuụn (ó chun nng ) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 Tng thờ tớch 25 25 25 25 25 25 25 25 - Chun b Master mix cho phn ng ( mi t bin gen KRAS): Thc hin trờn khay lnh (Th tớch àL) Control 19,8 G12D 19,8 G12V 19,8 G12A 19,8 G12R 19,8 G12C 19,8 G12S 19,8 G13D Taq DNA 19,8 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 DNA khuụn 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 Tng thờ tớch 25 25 25 25 25 25 25 25 polymerase - DNA khuụn ln lt l: Chng dng (PC): l DNA ó xỏc nh cú c t bin trờn chy vi cp mi t bin s cho kt qu dng tớnh c pha nng thớch hp Footer Page 186 of 161 Header Page 187 of 161 Chng õm ( NC) : l nc PCR khụng cha DNA chy vi cỏc cp mi t bin cho kt qu õm tớnh - Trn u cỏc thnh phn sau ú ly tõm nh cho ton b dch xung ỏy ng - t mu vo mỏy realtime PCR ó c ci t sn chng trỡnh chy - Ci t chng trỡnh cho mỏy realtime PCR: Bt mỏy realtime PCR, nht l ốn ca u c realtime ớt nht 15 phỳt trc chy chng trỡnh Bt mỏy tớnh v ch cho mỏy tớnh ng xong, gi chng trỡnh realtime PCR lờn Phi kim tra chc chn mỏy realtime PCR v mỏy tớnh ó kt ni vi (xem HDSD mỏy realtime PCR) Chn chc nng ch cho n Heat lid t 1050C thỡ chng trỡnh luõn nhit mi bt u Ci t v trớ mu Plate setup trờn phn mm ỳng vi v trớ mu ó t trờn mỏy realtime PCR Vi mu: Chn loi mu l Unknown t tờn hoc s tng ng vi ký hiu ca mu Vi chng dng v õm: t tờn Chng dng, Chng m tng ng Chn mu FAM v HEX cho mu, chng dng v chng õm Ci t chng trỡnh Protocol cho mỏy realtime PCR hot ng: chu k: 950C-4phỳt; 40 chu k: 950C-30 giõy, 600C-1 phỳt (chn c kt qu ti bc ny), gi mu 150C Footer Page 187 of 161 Header Page 188 of 161 - Cỏc mi t bin c s dng xỏc nh t bin gen EGFR v gen KRAS: Gen EGFR Gen KRAS STT Mi t bin Mi t bin Deletions Reaction Mix 19 G12A Reaction Mix 12 L858R Reaction Mix 21 G12D Reaction Mix 12 L861Q Reaction Mix 21 G12V Reaction Mix 12 G719X Reaction Mix 18 G12R Reaction Mix 12 S768I Reaction Mix 20 G12C Reaction Mix 12 Insertion Reaction Mix 20 G12S Reaction Mix 12 T790M Reaction mix 20 G13D Reaction mix 13 Exon STT Exon - Cỏch phõn tớch kt qu real-time vi cỏc mi t bin: Sau kt thỳc quỏ trỡnh realtime PCR, chuyn sang ch Analysis phõn tớch kt qu Phõn tớch chng dng v õm: Chn mu FAM phõn tớch kt qu, chng dng (PC) vi cỏc mi t bin phi cho tớn hiu rừ dng v cú giỏ tr Ct t 26,26 30,95 Chng õm phi chc chn rng khụng b ngoi nhim tc l cho tớn hiu khụng vt qua tớn hiu nn Phõn tớch mu: Chn mu FAM phõn tớch kt qu: o Mu chy vi mi t bin cho kt qu l ng biu din tớn hiu õm tớnh (khụng vt qua tớn hiu nn) Mu ny khụng cú t bin vi mi tng ng o Mu chy vi mi t bin cho kt qu l ng biu din tớn hiu dng tớnh (vt qua tớn hiu nn), tin hnh tớnh toỏn giỏ tr Ct theo cụng thc: Ct t bin Ct chng = Ct So sỏnh giỏ tr Ct vi giỏ tr ngng Cutoff (Bng 2.3) Nu mu cú giỏ tr Ct thp hn hoc bng giỏ tr cutoff thỡ mu ú c coi l (+) vi t bin ú, cũn nu mu cú giỏ tr Ct cao hn giỏ tr cutoff thỡ mu ú c coi l (-) vi t bin ú hoc ngoi gii hn phỏt hin ca kit Footer Page 188 of 161 Header Page 189 of 161 Giỏ tr cutoff ca gen EGFR v gen KRAS Gen EGFR Gen KRAS t bin Giỏ tr cutoff Ct t bin Giỏ tr cutoff Ct T790M 6,38 G12A 6,5 Xúa on exon 19 9,06 G12D 8,0 L858R 8,58 G12R 8,0 L861Q 9,26 G12C 7,0 G719X 9,32 G12S 9,0 S768I 9,26 G12V 6,5 Thờm on exon 20 7,91 G13D 9,0 Footer Page 189 of 161 Header Page 190 of 161 PH LC 10 BNG TểM TT CC PHN MT S TC DNG PH CA HểA CHT c tớnh Trờn h to huyt: Bch cu 3,9 2,9 1,9 10ln/24h hoc cn nuụi dng ngoi ng tiờu húa 10 ln/ngy, a mỏu i th hoc cn nuụi dng ngoi ng tiờu húa Thng hoc chy mỏu Bnh huyt Sc phn v thanh, co tht ph qun, yờu cu nuụi dng ngoi h tiờu húa Trờn gan: Billirubin BT BT < 1,5 ln BT 1,5-3 ln BT > ln BT AST, ALT BT < 2,5 ln BT 2,6-5 ln BT 5,1-20 ln BT > 20 ln BT Footer Page 190 of 161 Header Page 191 of 161 Trờn thõn : Creatinine Ure BT < 1,5 ln BT BT hoc 7,6-10,9 < 7,5 1,5-3 ln BT 11-18 3,1-6 ln BT >18 > ln BT Ni ban gõy nga, vựng tn thng 50% din tớch da c th Rng hon ton - Viờm loột, nhim trựng da Trờn da: Ban da khụng Rng túc khụng Viờm múng khụng (BT: bỡnh thng) Footer Page 191 of 161 Ni ban , Ni ban gõy khụng nga nga, vựng tn thng