TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN ===o0o=== PHẠM THỊ NHUNG HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG LAN KIM TUYẾN (ANOECTOCHILUS SETACEUS BLUME) BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật HÀ NỘI, 2016 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN ===o0o=== PHẠM THỊ NHUNG HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG LAN KIM TUYẾN (ANOECTOCHILUS SETACEUS BLUME) BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật Người hướng dẫn khoa học: TS La Việt Hồng HÀ NỘI, 2016 LỜI CẢM ƠN Trước hết xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc đến TS La Việt Hồng tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện giúp đỡ suốt trình thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn ban Lãnh đạo trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN trường học Sư phạm Hà Nội 2, tạo điều kiện cho học tập hoàn thành khóa luận Trong thời gian thực đề tài nhận giúp đỡ tận tình cô Mai Thị Hồng - Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật giúp đỡ, đóng góp ý kiến để hoàn thành khóa luận này, nhân xin chân thành cảm ơn Cuối xin cảm ơn gia đình bạn bè động viên, tạo điều kiện giúp đỡ suốt thời gian học tập hoàn thành khóa luận Mặc dù cố gắng điều kiện thời gian trình độ chuyên môn nhiều hạn chế nên không tránh khỏi thiếu sót, mong nhận góp ý quý thầy cô để khóa luận hoàn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 12 tháng 04 năm 2016 Sinh viên Phạm Thị Nhung LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết nghiên cứu đề tài: “Hoàn thiện quy trình nhân giống lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào” kết nghiên cứu riêng TS La Việt Hồng hướng dẫn Các số liệu, kết nghiên cứu trung thực chưa công bố Hà Nội, ngày 12 tháng 04 năm 2016 Sinh viên Phạm Thị Nhung DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT NAA: Napthlacetic acid BAP: 6-Benzyl amino purin KI: Kinetin MS: Murashige Skoog Nxb: Nhà xuất CT: Công thức ĐC: Đối chứng TDZ: Thidiazuron MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục đích nghiên cứu 3 Nội dung nghiên cứu Phạm vi nghiên cứu Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn NỘI DUNG Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu lan Kim tuyến 1.1.1 Phân loại 1.1.2 Đặc điểm thực vật học 1.1.3 Sinh học sinh thái 1.1.4 Phân bố 1.1.5 Công dụng lan Kim tuyến 1.1.6 Thực trạng khai thác phát triển lan Kim tuyến Việt Nam 1.1.7 Các loài lan Kim tuyến có Việt Nam 1.2 Tình hình nghiên cứu nhân giống bảo tồn lan Kim tuyến 10 1.2.1 Tình hình nghiên cứu giới 10 1.2.2 Tình hình nghiên cứu nước 12 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Vật liệu thực vật 15 2.2 Dụng cụ thiết bị thí nghiệm 15 2.2.1 Dụng cụ 15 2.2.2 Thiết bị 15 2.3 Môi trường nuôi cấy 15 2.4 Điều kiện nuôi cấy in vitro 15 2.5 Phương pháp nghiên cứu 16 2.5.1 Bố trí thí nghiệm 16 2.5.3 Phương pháp phân tích thống kê kết thực nghiệm 18 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 19 3.1 Hoàn thiện giai đoạn tái sinh lan Kim tuyến in vitro 19 3.2 Hoàn thiện giai đoạn rễ tạo lan Kim tuyến in vitro hoàn chỉnh 22 3.3 Hoàn thiện giai đoạn rèn luyện lan Kim tuyến với điều kiện tự nhiên 24 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO 27 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Ảnh hưởng BAP Kinetin đến khả tạo cụm chồi lan Kim tuyến 17 Bảng 2.2: Ảnh hưởng α - NAA đến tạo rễ lan Kim tuyến in vitro 17 Bảng 2.3: Ảnh hưởng giá thể tới tỉ lệ sống lan Kim tuyến in vitro 18 Bảng 3.1 Kết tái sinh chồi lan Kim tuyến (số chồi/mẫu) 19 Bảng 3.2 Ra rễ tạo hoàn chỉnh in vitro lan Kim tuyến Bảng 3.3 Rèn luyện in vitro tự nhiên 23 24 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 16 Hình 3.1 Cụm chồi lan Kim tuyến 21 Hình 3.2 Ra rễ tạo hoàn chỉnh in vitro từ chồi lan Kim tuyến 23 Hình 3.3 Rèn luyện lan Kim tuyến môi trường tự nhiên giá thể khác 25 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) thuộc họ Phong lan (Orchidaceae) loại thảo dược quý Việt Nam [1] Ở nước ta, lan Kim tuyến mọc rải rác rừng núi đá vôi, nơi ẩm, dọc theo khe suối, độ cao 300-1000 m Sa Pa (Lào Cai), Quản Bạ (Hà Giang), Tam Đảo (Vĩnh Phúc), Mĩ Đức (Hà Tây)… Lan Kim tuyến cấp báo thuộc nhóm IA Nghị định 32/2006/CP, nghiêm cấm khai thác mục đích thương mại [3] nhóm thực vật rừng nguy cấp EN A1a, c, d, sách đỏ Việt Nam [4] Trong y học, lan Kim tuyến sử dụng làm thuốc trị lao phổi, ho phế nhiệt, phong thấp, đau nhức khớp xương, chấn thương, viêm dày mãn tính, viêm khí quản, viêm gan mãn tính, suy nhược thần kinh, giúp tăng cường sức khoẻ, làm khí huyết lưu thông, có tính kháng khuẩn [24] Phương pháp nhân giống in vitro có khả khắc phục nhiều trở ngại mà phương pháp nhân giống khác thường gặp, sau ưu điểm chính: trẻ hóa bệnh, có tiềm sinh trưởng, phát triển đạt suất cao Tạo đồng mặt di truyền, bảo tồn tính trạng chọn lọc Tạo dòng tạp giao Tạo có gen (đa bội, đơn bội) Bảo quản lưu trữ tập đoàn gen Có khả sản xuất quanh năm Có thể nhân nhanh nhiều không kết hạt điều kiện sinh thái định hạt nảy mầm Hệ số nhân giống cực cao, rút ngắn thời gian đưa giống vào sản xuất đại trà [2] Về phương diện hệ số nhân giống, nhân giống in vitro phương pháp không so sánh kịp, kể phương pháp nhân giống hạt Theo Phạm Thị Nhung 2.5 Phương pháp nghiên cứu 2.5.1 Bố trí thí nghiệm Nghiên cứu tiến hành gồm thí nghiệm, thí nghiệm bố trí theo sơ đồ hình 2.1 Cây lan Kim tuyến in vitro + BAP + Kinetin Nhân nhanh lan Kim tuyến + NAA Tạo lan Kim tuyến in vitro hoàn chỉnh + Xơ dừa, đất, phân bò Rèn luyện in vitro môi trường tự nhiên Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu Các thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với lần nhắc lại 2.5.2 Phương pháp nghiên cứu 2.5.2.1 Thí nghiệm 1: Hoàn thiện giai đoạn nhân nhanh lan Kim tuyến kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật Thí nghiệm tiến hành môi trường bản: MS + 30 g/l đường, g/l agar có bổ sung KI BAP với nồng độ sau: Phạm Thị Nhung 16 Bảng 2.1: Ảnh hưởng BAP Kinetin đến khả tạo cụm chồi lan Kim tuyến Thành phần môi trường Công thức ĐC MS + 30 g/l saccarozơ + g/l agar L1 MS + 30 g/l saccarozơ + g/l agar + 0,3 mg/l Kinetin L2 MS + 30 g/l saccarozơ + g/l agar + 0,5 mg/l Kinetin L3 MS + 30 g/l saccarozơ + g/l agar + 0,7 mg/l Kinetin L4 MS + 30 g/l saccarozơ + g/l agar + 0,3 mg/l BAP L5 MS + 30 g/l saccarozơ + g/l agar + 0,5 mg/l BAP L6 MS + 30 g/l saccarozơ + g/l agar + 0,7 mg/l BAP Đánh giá thí nghiệm sau tuần tuần theo dõi dựa tiêu: hệ số nhân chồi, đặc điểm hình thái chồi 2.5.2.2 Thí nghiệm 2: Tạo hoàn chỉnh (ảnh hưởng nồng độ α - NAA đến khả hình thành rễ chồi lan Kim tuyến) Bảng 2.2: Ảnh hưởng α - NAA đến tạo rễ lan Kim tuyến in vitro Thành phần môi trường Công thức ĐC MS + 30 g/l saccarozơ + g/l agar + 0,00 mg/l NAA T1 MS + 30 g/l saccarozơ + g/l agar + 0,20 mg/l NAA T2 MS + 30 g/l saccarozơ + g/l agar + 0,25 mg/l NAA T3 MS + 30 g/l saccarozơ + g/l agar + 0,30 mg/l NAA Đánh giá thí nghiệm sau tháng theo dõi dựa tiêu: số rễ/chồi, chiều dài rễ (cm) Phạm Thị Nhung 17 2.5.2.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng giá thể dinh dưỡng đến tỷ lệ sống in vitro tự nhiên Bảng 2.3: Ảnh hưởng giá thể tới tỷ lệ sống lan Kim tuyến in vitro Công thức Giá thể E1 Xơ dừa E2 Đất E3 Đất + xơ dừa tỉ lệ 4:1 E4 Đất + phân bò tỉ lệ 4:1 Đánh giá thí nghiệm sau tháng theo dõi dựa tiêu: tỷ lệ sống, chiều cao chồi (cm) số lá/chồi 2.5.3 Phương pháp phân tích thống kê kết thực nghiệm Các số liệu thu phân tích thống kê theo tham số thống kê gồm giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, độ tin cậy,… chương trình Excel 2010 [8] Phạm Thị Nhung 18 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Hoàn thiện giai đoạn tái sinh lan Kim tuyến in vitro Việc nhân chồi in vitro có vai trò quan trọng việc tạo lượng lớn in vitro làm nguyên liệu cho trình nhân giống Đây trình quan trọng nói nhiệm vụ nhân giống vô tính Môi trường nhân nhanh chổi đa số thực vật thường chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin cytokinin Trong nghiên cứu này, BAP KI thuộc nhóm cytokinin sử dụng để tái sinh chồi từ cụm chồi Kết thể bảng 3.1 hình 3.1 Bảng 3.1 Kết tái sinh chồi lan Kim tuyến (số chồi/mẫu) Công thức Tuần Tuần Đặc điểm chồi ĐC 1,56 ± 0,71a 2,96 ± 1,09a Chồi yếu, xanh nhạt T1 2,24 ± 1,16b 4,24 ± 1,53bc Chồi xanh nhạt, có lông tơ T2 2,96 ± 1,30c 7,04 ± 1,24e Chồi khỏe, xanh đậm T3 2,36 ± 1,07b 5,36 ± 1,41d Chồi khỏe, xanh đậm T4 2,28 ± 0,93b 5,04 ± 1,83cd Chồi xanh nhạt T5 2,12 ± 1,01ab 3,92 ± 1,35b Chồi khỏe, xanh đậm T6 2,28 ± 0,98b 3,96 ± 1,54b Chồi khỏe, xanh đậm LSD0,05 0,58 0,81 Ghi chú: Các chữ a,b,c… cột thể khác biệt với mức ý nghĩa α = 0,05 theo phương pháp LSD Fisher Phân tích bảng 3.1 cho thấy BAP Kinetin có ảnh hưởng đến khả tái sinh chồi từ cụm chồi lan Kim tuyến Ở công thức đối chứng, không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng, lan Kim tuyến phát sinh chồi phát triển chậm, hệ số nhân sau tuần đạt 1,56 sau tuần 2,96 Ở công thức có bổ sung Kinetin BAP hệ số nhân Phạm Thị Nhung 19 tăng lên rõ rệt Đối với công thức bổ sung Kinetin hệ số nhân cao nồng độ 0,5 mg/l Kinetin với hệ số nhân sau tuần theo dõi đạt hệ số nhân 2,96 tăng nhanh tuần theo dõi đạt 7,04 (hình 3.1 D, F) Đối với công thức bổ sung BAP hệ số nhân chồi cao nồng độ 0,3 mg/l BAP với hệ số nhân sau tuần theo dõi 2,28 sau tuần đạt 5,04 (hình 3.1 C, E) Từ thí nghiệm cho thấy môi trường thích hợp cho nhân nhanh lan Kim tuyến môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l Kinetin Phạm Thị Nhung 20 Hình 3.1 Cụm lan Kim tuyến (A) Cây lan Kim tuyến in vitro 12 tuần tuổi (B) Đốt thân chứa thể chồi ban đầu (C), (D) Cụm lan sau tuần nuôi cấy môi trường 0,3 mg/l BAP 0,5 mg/l Kinetin (E), (F) Cụm lan sau tuần nuôi cấy môi trường 0,3 mg/l BAP 0,5 mg/l Kinetin Phạm Thị Nhung 21 Theo kết nghiên cứu Phùng Văn Phê cộng (2010), môi trường phù hợp để nhân nhanh chồi lan Kim tuyến in vitro Knud* bổ sung 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l KI + 0,3 mg/l NAA+100 ml/l nước dừa + 100 g/l dịch chiết khoai tây + 20 g/l saccarozơ + g/l agar + 0,5 g/l AC (than hoạt tính) cho hệ số nhân nhanh thể chồi 5,33 [9] Kết nghiên cứu Nguyễn Quang Thạch cộng (2012) môi trường tốt có hệ số chồi cao 6,55 [13] Tuy nhiên theo kết nghiên cứu chúng tôi, hệ số chồi in vitro môi trường MS + 30 g/l saccarozơ + 0,5 mg/l KI + g/l agar đạt 7,04 Như vậy, hệ số nhân nhanh chồi lan Kim tuyến nghiên cứu so với công bố trước cao 3.2 Hoàn thiện giai đoạn rễ tạo lan Kim tuyến in vitro hoàn chỉnh Sau hoàn thành việc nhân nhanh chồi lan Kim tuyến in vitro, tiếp tục giai đoạn kích thích chồi rễ tạo hoàn chỉnh để chúng sống độc lập, phát triển tốt chuyển trồng vào bầu đất vườn ươm α-NAA auxin hay sử dụng nông nghiệp nhân giống thực vật in vitro lẽ α-NAA có độ bền vững hóa học cao, có tác dụng kích thích sinh trưởng mạnh, kích thích hình thành rễ đặc biệt rễ bất định cành giâm, cành chiết mô nuôi cấy αNAA nồng độ 0,1 - mg/l dùng phổ biến việc tạo rễ chồi in vitro đa số loài thực vật [7], [12], [15] Trong thí nghiệm này, để nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ α-NAA lên trình hình thành rễ chồi lan Kim tuyến, lấy chồi lan Kim tuyến độc lập tương đối đồng (3 - cm), thân phát triển tốt, cấy vào môi trường MS có bổ sung α-NAA với nồng độ thay đổi 0,2; 0,25; 0,3 (mg/l) Sau 30 ngày nuôi cấy, thu kết bảng 3.2 hình 3.2 Phạm Thị Nhung 22 Bảng 3.2 Ra rễ tạo hoàn chỉnh in vitro lan Kim tuyến Công thức Số rễ/chồi Chiều dài rễ (cm) ĐC 1,88 ± 0,78a 1,06 ± 0,31a L1 2,68 ± 1,06bc 1,20 ± 0,27ab L2 2,36 ± 1,09ab 1,25 ± 0,28bc L3 3,04 ± 1,14c 1,39 ± 0,26c LSD0,05 0,57 0,16 Ghi chú: Các chữ a,b,c… cột thể khác biệt với mức ý nghĩa α = 0,05 theo phương pháp LSD Fisher Qua kết bảng 3.2 cho thấy việc bổ sung α-NAA vào môi trường có tác động tốt cho hình thành rễ từ chồi in vitro, sau 10 ngày nuôi cấy bắt đầu xuất rễ Cụ thể môi trường công thức L3 ( MS + 0,3 mg/l NAA) tốt cho hình thành rễ, tỷ lệ rễ đạt 100%, số rễ trung bình đạt 3,04 chiều dài rễ 1,39 (hình 3.2 D) Kết đồng với kết nghiên cứu tác giả Ket N.V cộng (2004), tỷ lệ rễ đạt 100% [19] Hình 3.2 Ra rễ tạo hoàn chỉnh in vitro từ chồi lan Kim tuyến A- Cây lan Kim tuyến công thức ĐC B- Cây lan Kim tuyến công thức L1 C- Cây lan Kim tuyến công thức L2 D- Cây lan Kim tuyến công thức L3 Phạm Thị Nhung 23 3.3 Hoàn thiện giai đoạn rèn luyện lan Kim tuyến với điều kiện tự nhiên Rèn luyện vườn ươm giai đoạn đưa in vitro đảm bảo tiêu chuẩn rễ, thân, thích nghi dần với điều kiện tự nhiên Ở giai đoạn này, cần có loại giá thể chế độ chăm sóc phù hợp Trong thời gian rèn luyện, lan Kim tuyến trồng loại giá thể là: Xơ dừa, đất dinh dưỡng, đất + xơ dừa (4:1), đất + phân bò (4:1) Kết huấn luyện, thích nghi lan Kim tuyến sau 30 ngày thể bảng 3.3 hình 3.3 Bảng 3.3 Rèn luyện in vitro tự nhiên Giá thể Tỷ lệ sống Chiều cao (%) (cm) Xơ dừa 86,7% 5,96 ± 0,78a 4,12 ± 0,78a Đất dinh dưỡng 23,3% 6,04 ± 1,39a 3,96 ± 0,79a Đất + xơ dừa (4:1) 80% 6,28 ± 1,24a 4,08 ± 0,81a Đất + phân bò (4:1) 53,3% 5,76 ± 1,09a 4,04 ± 0,79a 0,66 0,45 LSD0,05 Số lá/cây (lá) Ghi chú: Các chữ a,b,c… cột thể khác biệt với mức ý nghĩa α = 0,05 theo phương pháp LSD Fisher Sự biến động tỷ lệ sống cá thể lớn Cụ thể giá thể đất dinh dưỡng tỷ lệ sống thấp đạt 23,3%, số lá/cây đạt 3,96 lá, cao giá thể phân bò + đất (4:1) 53,3%, số lá/cây 4,04 Đặc biệt giá thể xơ dừa tỷ lệ sống cao với tỷ lệ sống 86,7%, số lá/cây đạt 4,12 Tuy nhiên, giá thể xơ dừa chiều cao 5,96 cm thấp so với giá thể đất + xơ dừa (4:1) 6,28 cm Từ thí nghiệm rút kết luận giá thể tốt cho lan Kim tuyến xơ Phạm Thị Nhung 24 dừa Sau 30 ngày ươm giá thể phát sinh thêm rễ sau chuyển đất trồng Theo tác giả Zhou YuMei cộng (2009) nghiên cứu xây dựng quy trình nhân nhanh giống A formosanus Kết cho thấy: Giá thể vườn ươm tốt rêu sử dụng dinh dưỡng Hyponex (20: 20: 20) bón tốt cho A formosanus vườn ươm [23] Hình 3.3 Rèn luyện lan Kim tuyến môi trường tự nhiên giá thể khác Phạm Thị Nhung 25 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Các kết nghiên cứu xác định quy trình kỹ thuật nuôi cấy in vitro cho lan Kim tuyến sau: Môi trường thích hợp cho giai đoạn nhân nhanh MS + 30 g/l sacarozơ + g/l agar + 0,5 mg/l KI cho hệ số nhân chồi 7,04 chồi/ mẫu Môi trường thích hợp cho giai đoạn rễ MS + 30 g/l sacarozơ + g/l agar + 0,3 mg/l -NAA, tạo hoàn chỉnh phù hợp cho chồi lan Kim tuyến in vitro Cây hoàn chỉnh lấy từ ống nghiệm trước trồng vào đất giâm giá thể xơ dừa 30 ngày cho tỷ lệ sống cao 86,7% Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu cải tiến, hoàn thiện môi trường nhân giống in vitro lan Kim tuyến để đạt hiệu cao Tiếp tục nghiên cứu để tìm giá thể cho tỷ lệ sống cao Sản xuất thử nghiệm giống lan Kim tuyến để đáp ứng nhu cầu sử dụng lan Kim tuyến làm dược liệu Phạm Thị Nhung 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Tiến Bân (chủ biên) (2005), Danh lục loài thực vật Việt Nam Tập III, Nxb Nông nghiệp Hà Nội Lê Trần Bình (1997), Công nghệ sinh học thực vật cải tiến trồng, Nxb Nông nghiệp Hà Nội Bộ Khoa học & Công nghệ (2007), Sách đỏ Việt Nam (Phần II Thực vật) Nxb Khoa học Tự nhiên Công nghệ Hà Nội Chính phủ nước CHXHCN Việt Nam (2006), Nghị định số 32/2006/NĐ-CP Đỗ Mạnh Cường cộng (2015) , Ảnh hưởng số yếu tố lên trình sinh trưởng phát triển lan Gấm (Anoectochilus setaceus Blume), Tạp chí Khoa học Phát triển, tập 13, số 3: 337-344 Phạm Hoàng Hộ (1999-2000) Cây cỏ Việt Nam Quyển 1-3 Nxb Trẻ, Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Như Khanh (1996), Sinh lý học sinh trưởng phát triển thực vật, Nxb giáo dục Nguyễn Văn Mã, La Việt Hồng, Ong Xuân Phong (2013), Phương pháp nghiên cứu sinh lý học thực vật, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội Tr 111 - 114 Phùng Văn Phê, Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn Trung Thành (2010), Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi in vitro loài lan Kim tuyến Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học tự nhiên Công nghệ, 26: 248-253 Phạm Thị Nhung 27 10 Phùng Văn Phê, Nguyễn Trung Thành, Vương Duy Hưng (2010), Đặc điểm hình thái, phân bố loài lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume vườn quốc gia Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học tự nhiên Công nghệ, 26:104-109 11 Mai Thị Tân, Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Minh Tấn cộng (1993), “Phục tráng khoai tây Thường Tín phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng”, Kết nghiên cứu khoa học, Nxb Nông nghiệp Hà Nội 12 Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch (2002), Chất điều hòa sinh trưởng trồng, Nxb nông nghiệp 13 Nguyễn Quang Thạch, Phí Thị Cẩm Miện (2012), Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) in vitro bảo tồn nguồn dược liệu quý, Tạp chí Khoa học Phát triển, 10(4):579-603 14 Trần Thị Hồng Thúy, La Việt Hồng, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà (2014), Ảnh hưởng Kinetin kết hợp Kinetin 2,4-D đến trình hình thành protocom-like bodies lan Kim tuyến, Tạp chí Khoa học, 33:53-61, trường ĐHSP Hà Nội 15 Vũ Văn Vụ (1999), Sinh lý thực vật ứng dụng, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội Tài liệu tiếng Anh 16 N Ahamed Sherif, J H Franklin Benjamin, S Muthukrishnan, T Senthil Kumar and M V Rao (2012), “Regeneration of plantlets from nodal and shoot tip explants of Anoectochilus elatus Lindley, an endangered terrestrial orchid”, African Journal of Biotechnology, 11 (29), pp 7549-7553 Phạm Thị Nhung 28 17 Gangaprasad A, Latha PG, Seeni S (2000), “Micropropagation of terrestrial orchids, Anoectochilus sikkimensis and Anoectochilus regalis”, Indian J Exp Biol, 38(2), pp 149-154 18 Huang H, Liu X, Wu X, Zhang S (2002), “Study on seedling inducement from seed of Anoectochilus roxburghii”, Journal of Chinese Medicinal Materials, 25(1), pp.35 19 Ket N.V, Hahn E.J, Park S.Y, Chakrabarty D and Paek K.Y (2004), “Micropropagation of an Endangered Orchid Anoectochilus formosanus”, Biologia plantarum, 48(3), pp 339-344 20 Murashige T Skoog F (1962), “A revised medium for rupid growth and bioassays with tobacco tissue culture”, Physiol Plant 15: 473 - 479 21 Pati P.K, Rath S.P, Sharma M, Sood A, Ahuja PS (2006) In vitro propagation of rose - a review Biotechnol Adv 24(1):94-114 22 Shiau Y.J, Nalawade S.M, Hsai C.N and Tsay H.S (2005), “Propagation of Haemaria discolor via in vitro seed germination”, Biologia Plantarum, 49 (3), pp 341-346 23 Zhou YuMei, Chen Li, Cui YongYi, Paek KeeYoeup (2009), “Construction of rapid propagaation system for Anoectochilus formosanus”, Journal of Northeast Forestry University, 37(12), pp 43-47 Tài liệu từ Internet 24 https://vi.wikipedia.org/wiki/Lan_kim_tuy%E1%BA%BFn 25 http://www.caythuocviet.com.vn/home/cay-lan-gam-kim-tuyen.72.html 26 http://onmua.com/tin-tuc/39/tac-dung-khong-ngo-toi-cua-lan-gam-.htm 27.http://www.corenarm.org.vn/?pid=91&id=1375 Phạm Thị Nhung 29 Phụ lục Một số hình ảnh minh họa làm thí nghiệm Hình a: Thao tác box cấy vô trùng Hình b: Kiểm tra mẫu nuôi cấy phòng Phòng Sinh lý thực vật, Khoa Sinh-KTNN, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Phạm Thị Nhung 30 ... cứu đề tài: Hoàn thiện quy trình nhân giống lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào nhằm cải thiện số giai đoạn quy trình nhân giống in vitro loài lan với mục... thiện giai đoạn nhân nhanh giống lan Kim tuyến kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật Hoàn thiện giai đoạn rễ lan Kim tuyến in vitro Hoàn thiện giai đoạn rèn luyện lan Kim tuyến in vitro Phạm vi nghiên... KHOA SINH – KTNN ===o0o=== PHẠM THỊ NHUNG HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG LAN KIM TUYẾN (ANOECTOCHILUS SETACEUS BLUME) BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: