Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố định đạm cao trong tự nhiên

Hiện nay ở nước ta đã có một số nghiên cứu, phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh trong rễ lúa, rễ cây lạc, cây cà phê, rễ cây ngô…Tuy nhiên , những nghiên cứu về vi khuẩn cố định đạm cho

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công nghệ Lên men Trường đại học Nông Lâm Thái Nguyên

Hóa chất và thiết bị sử dụng

Bảng 3.1: Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu Tên hoá chất Xuất xứ Tên hoá chất Xuất xứ

KH 2 PO 4 Trung Quốc Xanh violet Trung Quốc

NaCl Trung Quốc Lugon Trung Quốc

CaSO 4 2H 2 O Trung Quốc Safranin Trung Quốc

Glucose Việt Nam Dầu soi Trung Quốc

Na 2 MoO 4 Trung Quốc FeCl 3 6H 2 O Trung Quốc

CaCl 2 Trung Quốc NaOH Trung Quốc

FeSO 4 7H 2 O Trung Quốc HCl Trung Quốc

MgSO 4 7H 2 O Trung Quốc Bromothymol blue Trung Quốc

KOH Trung Quốc Cồn Việt Nam

CaCO 3 Việt Nam Agar Việt Nam

K 2 HPO 4 Trung Quốc Acid malic Trung Quốc

Bảng 3.2: Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm Tên thiết bị Xuất xứ Tên thiết bị Xuất xứ

Nồi hấp thanh trùng Trung Quốc Cân phân tích Trung Quốc

Tủ sấy Trung Quốc Máy đo pH Trung Quốc

Tủ ấm Trung Quốc Kính hiển vi Việt Nam

Box cấy Trung Quốc Máy UV - VIS Việt Nam

Máy ly tâm lạnh Trung Quốc Tủ lạnh Việt Nam

Trong thí nghiệm, các dụng cụ quan trọng được sử dụng bao gồm micropipette, đầu côn, bình tam giác, que cấy, que trang, đĩa petri, ống nghiệm, ống phancol, đèn cồn và giá đỡ ống nghiệm Những dụng cụ này đóng vai trò thiết yếu trong việc thực hiện các quy trình thí nghiệm một cách chính xác và hiệu quả.

Môi truờng sử dụng

Bảng 3.3: Môi trường thạch Burk’ không đạm (Park et al.,2005) (g/l) Thành phần Hàm luợng Thành phần Hàm luợng

Bảng 3.4: Môi trường thạch Ashby (g/l) Thành phần Hàm luợng Thành phần Hàm luợng

Bảng 3.5: Môi trường Dobereiner và cộng sự (1976) (g/l)[8]

Thành phần Hàm luợng Thành phần Hàm luợng

MgSO 4 7H 2 O 0,2 Bromothymol blue (0,5%) 2 ml pH 6,8 - 7

Bảng 3.6: Môi trường nước chiết khoai tây (BMS) [25],[73]

Thành phần Hàm luợng Thành phần Hàm luợng

Nước chiết khoai tây 500ml (200g/l) FeSO 4 7H 2 O 0,005

Tất cả môi trường trên được hấp khử trùng ở 121 0 C trong vòng 20 phút Môi trường dịch thể không chứa agar

Môi trường nghiên cứu thay thế

- Môi trường nước cà chua

Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao trong tự nhiên

- Nội dung 2: Khảo sát khả năng sinh IAA của chủng được tuyển chọn

- Nội dung 3: Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các vi khuẩn đã tuyển chọn

- Nội dung 4: Định danh sơ bộ vi khuẩn tuyển chọn được ở nội dung trên

- Nội dung 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng phát triển của chủng.

Phương pháp nghiên cứu

3.6.1 Phương pháp thu thập mẫu

(Phương pháp lấy mẫu đất và chuẩn bị mẫu đất theo TCVN 5960-1995)

Phương pháp lấy mẫu rễ cây:

- Thu mẫu một cách ngẫu nhiên rễ cây (chè, lạc, lúa, đậu) trên các nền đất khác nhau, mỗi ruộng lấy 2 gốc

Toàn bộ rễ cây chè được thu thập và đặt trong túi nilon đã khử trùng, với mỗi mẫu được ghi nhãn rõ ràng về địa điểm, ngày thu và người thu mẫu Sau khi thu thập, rễ cây được rửa sạch dưới vòi nước chảy để loại bỏ đất bám, sau đó để ráo tự nhiên Các mẫu được phân lập hoặc bọc riêng trong túi nilon khử trùng, buộc chặt và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 5°C nếu không thể phân lập ngay.

3.6.2 Phương pháp phân lập và tuyển chọn

1 Trước hết các mẫu đất phải được xử lý trước khi phân lập bằng cách phơi khô ở nhiệt độ phòng 2-3 ngày, sau đó dùng rây qua sàng có kích thước 2-3mm

2 Cân 1g đất đã xử lý cho vào 9ml nước cất khử trùng, dùng vortex hoà tan đất

3 Pha loãng mẫu ở các nồng độ pha loãng khác nhau: 10 -4 , 10 -5 là 2 nồng độ thích hợp để phân lập vi sinh vật trong đất ở Việt Nam

4 Hút 0,5 ml dịch pha loãng ở 2 nồng độ trên nhỏ lên đĩa Peptri chứa môi trường thạch Burk’ vô đạm Dùng que gạt trang đều dịch trên bề mặt thạch cho đến khi bề mặt thạch khô thì dừng lại

5 Đặt đĩa thạch trong tủ 30 0 C, phân vi sinh vật từ những khuẩn lạc riêng rẽ trên đĩa thạch sau khoảng thời gian 4- 10 ngày [7]

6 Sau khoảng thời gian từ 4 – 6 ngày , ta quan sát hình thái và khả năng phát triển của khuẩn lạc trên môi trường vô đạm, từ đó tách riêng rẽ những khuẩn lạc nghi ngờ là vi khuẩn cố định đạm, cấy chuyển nhiều lần sang môi trường như trên cho đến khi các khuẩn lạc tách rời và đều so với các khuẩn lạc khác trên môi trường

7 Tiến hành cấy giữ giống sau khi làm thuần, ta cấy giữ giống vào môi trường Burk’ trong ống thạch nghiêng và bảo quản ở 4 0 C Mỗi chủng giữ vào 2 ống thạch nghiêng, 1 để cất giữ và một để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo [36]

3.6.2.2.Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao trên môi trường Ashby thạch đĩa theo phương pháp Koch [9]

Cấy các chủng vi khuẩn đã phân lập vào đĩa petri chứa môi trường Ashby thạch và ủ ở 30 độ C trong 4-5 ngày Sau thời gian này, tiến hành quan sát và đo kích thước khuẩn lạc để chọn ra những chủng có kích thước lớn cho các bước tiếp theo.

Ngoài ra để xác định khả năng cố định đạm của các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn được bằng phương pháp định lượng đạm tổng số - Kjeldnhl

Nguyên lý đẩy muối amoni ra thể tự do sử dụng chất kiềm mạnh hơn amoniac, như Mg(OH)2 hoặc Na2CO3, để tránh ảnh hưởng đến thực phẩm Hơi nước được dùng để kéo amoniac đã giải phóng sang bình chuẩn độ, sau đó định lượng bằng H2SO4 0,1N với alizainnatri sunfonat làm chỉ thị màu.

Trong phương pháp định lượng amoniac, nước sử dụng cần phải hoàn toàn sạch sẽ, không chứa amoniac hay muối amoni Vì vậy, trước khi tiến hành cất kéo amoniac để thực hiện định lượng, việc rửa sạch máy móc là rất quan trọng để loại bỏ bất kỳ amoniac nào có thể tồn tại.

Cân hoặc hút chính xác mẫu với khối lượng m(g) hoặc thể tích V(ml), sau đó cho vào bình cầu B chứa nước trung tính đã được cất và kéo hơi nước để rửa máy, cùng với 0,5ml chỉ thị màu Tiếp theo, thêm bột MgO cho đến khi phản ứng kiềm xảy ra rõ rệt, tạo ra màu tím.

Chú ý: Đậy nút ngay để tránh amoniac bay ra Để tránh bọt sủi phồng lên có thể cho thêm vài giọt dầu paraffin hoặc cồn octylic

Khi đun sôi, hơi nước từ bình A sẽ kéo theo NH3 qua bình chứa thực phẩm B NH3 sau đó sẽ đi qua ống sinh hàn và ngưng tụ, rơi xuống bình chuẩn độ D, nơi đã chuẩn bị sẵn nước trung tính, chỉ thị màu và một lượng xác định (ml) H2SO4 0,1N.

Cất cho đến khi không còn hơi NH3 bay ra Hơi NH3 sẽ kết hợp với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4 Tiến hành chuẩn độ lượng H2SO4 dư bằng dung dịch NaOH 0,1N.

Chú ý: Đầu ra của bộ chưng cất phải nhúng chìm vào dung dịch H 2 SO 4 ở bình tam giác

Hàm lượng NH3 trong 1000ml V

3.5.2.4 Phương phá p xác đi ̣nh khả năng tạo IAA của các chủng vi khuẩn b ằng phương pháp salkowski (glickman và Dessaux, 1995) Định lƣợng IAA do vi khuẩn sinh ra

- Chuẩn bị các dòng vi khuẩn và môi rường LGIP lỏng (không N) hoặc

- Cho 15 ml môi trường LGIP (Burk’) vào các ống nghiệm nắp đen khử trùng dưới nhiệt ướt 121 o C trong 20 phút

- Để nguội, chủng vi khuẩn gốc, thí nghiệm lắp lại 3 lần

- Nuôi các dòng khuẩn trên máy lắc 150 vòng/phút, trùm kín các ống nghiệm trong bọc nilon để tránh IAA sinh ra bị phân hủy bởi ánh sáng

- Định lượng IAA trong các ngày1, 2, 3, 4,5, 6 (sau khi chủng)

- Chuẩn bị thuốc thử salkowski R2: 4,5 g FeCl 3 trong 1 lít H 2 SO 4 10,8M

- Chuẩn bị phosphate buffer 200 ml:

A: KH 2 PO 4 0,136 g/100ml nước cất

Lấy 39 ml A và 61 ml B cho thêm nước cất vừa đủ 200 ml, điều chỉnh pH = 7 Đo nồng độ IAA trong dịch khuẩn:

- Hút 1,5 ml dịch vi khuẩn trong các ống nghiệm nắp đen cho vào các ống eppendorf

- Ly tâm 5500 vòng/phút trong 5 phút

- Hút cẩn thận 1 ml phần dịch trong sau khi ly tâm cho vào các ống nghiệm

- Cho 2 ml thuốc thử Salkowski R2 đã pha ở trên vào các ống nghiệm trên

- Vortex và ủ hỗn hợp trong tối 15 phút dể phản ứng xảy ra hoàn toàn sau đó đo quang phổ OD ở bước sóng 530 nm

Dựa vào đường chuẩn định lượng nồng đọ IAA của vi khuẩn:

- Chuẩn bị đường chuẩn IAA: cân 0,0016 g IAA tinh khiết hòa tan với 10 ml phosphate buffer được nồng đọ là 160 ug/ml Sau đó pha loãng ra các nồng độ 10,

- Kết quả đo quang phổ OD của IAA tinh khiết ở các nồng độ 0, 10, 20, 30,

Để vẽ đồ thị đường chuẩn IAA trên Excel, sử dụng nồng độ IAA từ 0 đến 80 µg/ml trên trục hoành và phổ OD từ 0 đến 3 trên trục tung Các nồng độ 40 và 80 µg/ml sẽ được biểu diễn để tạo ra đồ thị chính xác.

- Kết quả đo của các dòng vi khuẩn được thay vào phương trình đường chuẩn , từ đó suy ra được nồng độ IAA của các dòng

Xử lý số liệu và phân tích thống kê:

Sử dụng phần mềm MS Excel và phần mềm IRRISTAT để xử lý số liệu

3.6.3 Phương pha ́ p mô tả đặc điểm hình thái , đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn cố đi ̣nh đạm

3.6.3.1 Phương pháp mô tả đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn cố định đạm

Mô tả các đặc điểm hình thái của các chủng dưới kính hiển vi, đồng thời xác định đặc điểm sinh học và định dạng theo khóa phân loại của Bergey (1994) là một bước quan trọng trong việc nghiên cứu và phân loại vi sinh vật Việc phân tích hình thái giúp nhận diện các chủng khác nhau, từ đó hỗ trợ trong việc hiểu rõ hơn về sinh thái và chức năng của chúng trong môi trường.

Nhuô ̣m gram bằng bô ̣t kít nhuô ̣m : Crystol Violet, Lugol, ethanol 95%, dung dịch safanin 0,5%, nước cất

- Cố định tiêu bản bằng cồn 90 o và hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn

- Nhỏ 2 – 3 giọt tím tinh thể hoặc xanh violet trong 1 phút, rửa nước

- Nhỏ 2 – 3 giọt dung dịch lugon trong 1 phút, rửa nước

- Tẩy màu bằng cồn 90 o trong 30 giây đến 1 phút, rửa nước

- Nhuộm bổ sung Fucsin hoặc Safranin trong 1 phút, rửa nuớc và làm khô

- Nhỏ dầu soi và tiến hành quan sát dưới kính hiển vi quang học Olympus dưới vật kính 100

- Vi khuẩn Gram dương bắt màu xanh tím

- Vi khuẩn Gram âm bắt màu đỏ vàng với thuốc nhuộm Safranin, đỏ tía với thuốc mhuộm Fuchsin [10][20]

2 Phương pháp thử khả năng di động

Vi sinh vật có khả năng di động nhờ vào cấu trúc protein gọi là tiên mao, điều này giúp phân biệt các loại vi sinh vật Khả năng di động của chúng có thể được quan sát thông qua sự sinh trưởng và hoạt động trong môi trường thạch mềm.