nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý chủ yếu của gà mắc ornithobacterium rhinotracheale gây cho đàn gà nuôi tại huyện yên phong, tỉnh bắc ninh và thử nghiệm điều trị

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM --- --- NGUYỄN ĐỨC KIÊN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CHỦ YẾU CỦA GÀ MẮC ORNITHOBACTERIUM RHINOTRACHEA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

- -

NGUYỄN ĐỨC KIÊN

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ

CHỦ YẾU CỦA GÀ MẮC ORNITHOBACTERIUM

RHINOTRACHEALE GÂY CHO ĐÀN GÀ NUÔI

TẠI HUYỆN YÊN PHONG, TỈNH BẮC NINH VÀ

THỬ NGHIỆM ĐIỀU TRỊ

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI, NĂM 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

- -

NGUYỄN ĐỨC KIÊN

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ

CHỦ YẾU CỦA GÀ MẮC ORNITHOBACTERIUM

RHINOTRACHEALE GÂY CHO ĐÀN GÀ NUÔI

TẠI HUYỆN YÊN PHONG, TỈNH BẮC NINH VÀ

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu,

kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất

kì công trình nào khác

Tôi xin cam đoan các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ

rõ nguồn gốc./

Hà Nội, ngày 9 tháng 11 năm 2015

Tác giả luận văn

Nguyễn Đức Kiên

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi luôn nhận được sự quan tâm giúp đỡ của các tổ chức, cơ quan, các nhà khoa học, các thầy

cô giáo, bạn bè đồng nghiệp và những người thân trong gia đình

Nhân dịp này, tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ của các giảng viên khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã giảng dạy tôi trong suốt thời gian học tập Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc sự hướng dẫn, giúp đỡ chân tình, đầy trách nhiệm và hết lòng vì khoa học của PGS.TS Chu Đức Thắng

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới những người thân trong gia đình, đồng nghiệp

đã luôn quan tâm, động viên giúp tôi hoàn thành luận văn này

Hà Nội, ngày 9 tháng 11 năm 2015

Tác giả luận văn

Nguyễn Đức Kiên

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv

MỤC LỤC

Trang

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP VÀ NGUYÊN

2.3.8 Phương pháp kiểm tra khả năng mẫn cảm kháng sinh của chủng vi

2.3.9 Sử dụng một số loại kháng sinh để phòng trị bệnh do vi khuẩn

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi

3.1 Tình hình dịch bệnh trên đàn gà nói chung và tình hình mắc bệnh ORT

nói riêng nuôi tại huyện Yên Phong, tỉnh Bắc Ninh từ tháng 6 năm

3.1.3 Tình hình mắc bệnh ORT trên đàn gà nuôi tại huyện Yên Phong,

3.2 Kết quả nghiên cứu biểu hiện các triệu chứng lâm sàng và biến đổi

3.4 Kết quả xác định tính mẫn cảm của vi khuẩn với một số loại kháng

3.4.1 Kết quả xác định tính mẫn cảm của vi khuẩn với một số loại

3.4.2 Kết quả sử dụng một số loại kháng sinh phòng trị bệnh do vi

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

1 AGP Accelerated Graphics Port

2 BEAs Boiled Extract Antigens

3 BHB Brain Heart Infusion Broth

4 CBA Columbia Blood Agar

5 cDNA Complementary Deoxyribonucleic Acide

6 CRD Chronic Respiratory Disease

7 DIA Dot Immunobinding Assay

8 ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

9 GAP Agar Gel Precipitation

10 IB Infectious Bronchitis

11 ILT Infectious Laryngo Tracheitis

13 PAP Peroxidase - Anti Peroxidase

14 PB Pasteurella Broth

15 PBS Phosphate Saline Buffer

16 PCR Polymerase Chain Reaction

17 PGNR Pleomorphic Gram Negative Rod

18 RNA Ribonucleic Acide

19 rRNA Ribosomal Ribonucleic Acide

20 RT - PCR Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page viii

DANH MỤC BẢNG

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ix

DANH MỤC HÌNH

3.17 Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm của vi khuẩn ORT đối với các loại

3.18 Tỷ lệ gà khỏi bệnh khi sử dụng một số kháng sinh điều trị bệnh do

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 1

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Hiện nay, ở Việt Nam ngành chăn nuôi vẫn được xem là một ngành trọng yếu trong phát triển nông nghiệp vì vậy việc mở rộng các cơ sở chăn nuôi cũng như quy mô là một việc cần thiết Cùng với sự đi lên của ngành chăn nuôi nói chung và ngành chăn nuôi gia cầm nói riêng, sự phát triển kinh doanh, buôn bán

và giết mổ gia cầm không được kiểm soát chặt chẽ dẫn đến tình trạng lây lan một

số bệnh truyền nhiễm nguy hiểm như: Cúm gia cầm, Gumboro Newcastle,…

trong đó phải kể đến là Bệnh hô hấp phức hợp trên gà (hay được gọi là ORT)

Năm 1981, lần đầu tiên người ta phân lập một chủng ORT từ dịch nước mũi, dịch phù ở mặt, mủ và tơ huyết trên túi khí bị viêm của gà tây năm tuần tuổi tại phía Bắc nước Đức Bệnh hô hấp phức hợp trên gà (ORT) là một bệnh truyền

nhiễm nguy hiểm do vi khuẩn Ornithobacterium rhinotracheale gây ra hay gặp ở

gà và gà tây ở mọi lứa tuổi Ornithobacterium rhinotracheale lần đầu tiên được

mô tả năm 1993 Là bệnh khó phòng và điều trị gây giảm khả năng sản xuất, thiệt hại lớn về kinh tế với những triệu chứng, bệnh tích như: ho, khó thở, đớp không khí, màng niêm mạc mắt viêm thủy thũng, phế quản gốc có kén mủ, khí quản bị xung huyết, có nhiều dịch nhày, phổi viêm tơ huyết (Charlton, B.R., và cs.,

1993) Vi khuẩn Ornithobacterium rhinotracheale phát triển chậm trên môi

trường nuôi cấy đặc và được đặt tên vào năm 1994

Tại Việt Nam các nghiên cứu về vi khuẩn Ornithobacterium

rhinotracheale cũng như bệnh hô hấp phức hợp trên gia cầm vẫn còn rất hạn chế

Do đó việc chẩn đoán chính xác bệnh dựa trên các bệnh tích, triệu chứng lâm sàng còn gặp nhiều khó khăn và dễ nhầm lẫn với các bệnh gây ra trên đường hô hấp của gia cầm như: IB, CRD, Newcastle, ILT… Trước yêu cầu cấp thiết trên cần phải có các nghiên cứu về đặc điểm bệnh lý cũng như các phương pháp chẩn đoán phi lâm sàng: phân lập vi khuẩn hay giám định PCR… để giúp việc chẩn đoán sớm tìm ra vi khuẩn gây bệnh làm cơ sở cho phòng và trị bện đạt hiệu qur

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 2

cao Xuất phát từ yêu cầu cấp thiết trên, chúng tôi tiến hành triển khai đề

tài“Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý chủ yếu của gà mắc Ornithobacterium rhinotracheale gây cho đàn gà nuôi tại huyện Yên Phong, tỉnh Bắc Ninh và thử nghiệm điều trị”

2 Mục đích của nghiên cứu

1) Xác định định được những biểu hiện triệu chứng lâm sàng đặc trưng của bệnh ORT

2) Nghiên cứu các biểu hiện triệu chứng lâm sàng và biến đổi bệnh tích đại thể, vi thể trên đàn gà mắc ORT

3) Xác định được tính mẫn cảm của vi khuẩn với một số kháng sinh và thử nghiệm điều trị;

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

1) Các kết quả nghiên cứu về một số đặc điểm bệnh lý chủ yếu của đàn gà mắc bệnh ORT ở huyện Yên Phong, tỉnh Bắc Ninh; là những tư liệu khoa học bước đầu nghiên cứu trên đàn gà mắc bệnh ORT ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam

2) Qua kết quả nghiên cứu làm cơ sở khoa học đề ra được các biện pháp phòng và trị bệnh ORT trên đàn gà đạt hiệu quả cao, giảm tác hại của bệnh gây

ra cho ngành chăn nuôi gà ở nước ta

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Lịch sử và tình hình nghiên cứu bệnh ORT

Bệnh suy hô hấp do vi khuẩn Ornithobacterium rhinotracheale là một bệnh truyền nhiểm ở loài chim với đặc điểm là; gây trụy hô hấp, gây chết và làm giảm khả năng sinh trưởng Bệnh có các triệu chứng lâm sàng đa dạng, tỷ lệ gây chết khá cao, diễn biến phụ thuộc vào môi trường chăn nuôi như, quản lý chăm sóc kém, mật độ chuồng nuôi cao, chất lượng của chất lót chuồng kém, vệ sinh không khí, vệ sinh chuồng nuôi kém

Triệu chứng lâm sàng trong suốt giai đoạn bệnh và tỷ lệ chết do O rhinotracheale ở các ổ dịch bùng phát diễn biến khá đa dạng chúng chịu ảnh hưởng của rất nhiều các yêu tố môi trường như quản lý chăm sóc kém, độ thông thoáng kém, mật độ cao, hàm lượng amoniac cao, chất độn chuồng kém

Triệu chứng lâm sàng thường suất hiện ở gà thịt xuất hiện ở 3-6 tuần tuổi với tỷ lệ chết khoảng 5-10% với các triệu chứng ủ rũ, kém ăn, giảm tăng trọng, tăng tiết dịc, vẩy mỏ có hiện tượng phù mặt

Ở gà giống bố mẹ, bệnh thường xảy ra ở giai đoạn đầu của gà đẻ đạt đỉnh hay ngay trước khi đưa gà lên chuồng đẻ Có biểu hiện: tăng tỷ lệ chết, giảm ăn, giảm đẻ, giảm kích thước trứng, chất lượng vỏ trứng kém, tỷ

lệ có phôi và khả năng ấp nở cũng bị ảnh hưởng

Ở gà đẻ thương phẩm, giảm đẻ, tăng trứng méo và tăng tỷ lệ chết có

liên hệ tới sự nhiễm O Rhinotracheale

Ở gà thịt thương phẩm, các tổn thương đại thể thường gặp bao gồm viêm phổi, viêm màng phổi và viêm túi khí Khi giết thịt hoặc kiểm tra sau giết mổ sẽ thấy dịch dạng bọt, mầu trắng, chất dịch tiết này có màu giống sữa chua và có thể thấy rõ trong các túi khí Hầu hết các tổn thương chỉ tiến

triển ở một bên thùy phổi Các tổn thương do O Rhinotracheale có thể làm

tỷ lệ chết tăng cao tới 50% hoặc hơn Thêm nữa, phù thũng dưới da mặt,

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 4

gây viêm đầu, viêm xương tủy và viêm màng não được thấy ở gà

Lần đầu tiên người ta phân lập được một chủng ORT từ dịch nước mũi, dịch phù ở mặt, mủ và tơ huyết trên túi khí bị viêm của gà tây 5 tuần tuổi tại phía Bắc nước Đức Năm 1983, người ta đã tiến hành nuôi cấy vi khuẩn từ dịch khí quản của quạ non Năm 1986, ORT được phân lập từ gà tây tại Isarel ở nhiều lứa tuổi với bệnh tích viêm xuất huyết cấp tính ở phổi và viêm túi khí Năm 1987, ORT được phân lập từ giống vịt Bắc Kinh 10 tuần tuổi ở Hungary và người ta cho rằng cùng với bệnh tụ huyết trùng, vi khuẩn ORT được coi như một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm trên gà Giữa những năm 1986 và 1988 là thời điểm

ORT được nhận định như một chủng vi khuẩn giống Pasteurella, được phân lập

từ đàn gà tây giống ở Anh, kèm với triệu chứng như yếu ớt, giảm đẻ, ho, tỷ lệ chết thấp, túi khí viêm tơ huyết và viêm phổi

Năm 1986, người ta đã bắt đầu nghiên cứu phân lập ORT ở Califonia Kết quả: đã xác định được các đặc điểm của 14 chủng vi khuẩn thu thập và phân lập được từ năm 1980 đến 1981 trên các đàn gà tây và gà có triệu chứng của bệnh hô hấp (Charlton và cs, 1986) Vào năm 1991, Du Preez thấy rằng có các biểu hiện của bệnh hô hấp trên các bệnh hô hấp trên các đàn gà thịt thương phẩm tại Nam Phi, nơi sau đó cũng đã phân lập được ORT

Năm 1993, lần đầu tiên ORT được mô tả chính thức (Charlton và cs, 1993) Đến năm 1994, người ta đã công bố cây phát sinh loài, các genotype, phân loại sinh hóa học và các đặc trưng phenotype cổ điển của 12 chủng đã phân lập

và được đề xuất mang tên ORT (Vandamme và cs 1994) Tuy nhiên, sự phát hiện

và phân lập được vi khuẩn đã được thực hiện từ những năm trước 1993

ORT được báo cáo là nguyên nhân gây ra bệnh với các triệu chứng, bệnh tích giống tụ huyết trùng trên gà tây ở Đức vào năm 1993 và 1994 và gà tây giống 32 tuần tuổi tại Mỹ năm 1996 Và kể từ đó tới nay, có nhiều báo cáo phân lập của Vandamme và cs Vào năm 1994, ORT đã được phân lập từ chim hoang

dã ở nhiều quốc gia trên thế giới (Nguyễn Thị Lan và cs., 2014)

1.1.1 Tình hình nghiên cứu ORT trên thế giới

Năm 1981, lần đầu tiên người ta phân lập được một chủng ORT từ dịch

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 5

nước mũi, dịch phù ở mặt, mủ và tơ huyết trên túi khí bị viêm của gà tây 5 tuần tuổi tại phía Bắc nước Đức

Năm 1983, vi khuẩn được nuôi cấy từ dịch khí quản của quạ non

Năm 1986, ORT được phân lập từ gà tây tại Isarel ở nhiều lứa tuổi với bệnh tích viêm xuất huyết cấp tính phổi và viêm túi khí Năm 1987, ORT được phân lập

từ giống vịt Bắc Kinh 10 tuần tuổi ở Hungary và cùng với bệnh tụ huyết trùng, vi khuẩn ORT được coi như một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm trên gà Giữa những năm 1986 và 1988 là thời điểm ORT được nhận định như một chủng vi khuẩn

giống Pasteurella, được phân lập từ đàn gà tây giống ở Anh, kèm với triệu chứng

như yếu ớt, giảm đẻ, ho, tỷ lệ chết thấp, túi khí viêm tơ huyết và viêm phổi

Năm 1986, người ta đã bắt đầu nghiên cứu phân lập ORT ở Califonia Kết quả: đã xác định được các đặc điểm của 14 chủng vi khuẩn thu thập và phân lập được từ năm 1980 đến 1981 trên các đàn gà tây và gà có triệu chứng của bệnh hô hấp (Charlton và cs, 1986) Vào năm 1991, Du Preez thấy rằng có các biểu hiện của bệnh hô hấp trên các bệnh hô hấp trên các đàn gà thịt thương phẩm tại Nam Phi, nơi sau đó cũng đã phân lập được ORT

Năm 1993, một số gà tây đã được quan sát ở Hà Lan và Đức, với những triệu chứng lâm sàng như vảy mỏ, khó thở và sung huyết xoang hốc mắt, cùng với sự tăng trưởng chậm của gà thịt (Hafez H.M và Cs.,1996; K H Hinz và Cs., 1994)

Tại Đức, người ta thấy rằng tỷ lệ nhiễm chủ yếu ở gà tây 14 tuần trở lên (Hafez H.M và Cs.,1996) Sau đó, tìm thấy vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm

đường hô hấp gia cầm ở Israel (Bock et al., 1995), Bỉ (Wyffels & Hommez,

1990), và Mỹ (B R Charlton và Cs., 1993)

Ban đầu, các loại vi khuẩn mới chỉ được gọi tên như là một vi khuẩn

Gram âm, hình que (PGNR; B R Charlton và Cs., 1993), Pasteurella -like

(Hafez H.M và Cs., 1993) hoặc Kingella -like (P van Empel và Cs., 1994) Năm

1994, ORT được phân lập từ chim hoang dã và được đặt tên dùng cho đến nay (P Vandamme và Cs., 1994)

Tại Đức, đã thực hiện điều tra về việc nuôi cấy O rhinotracheale đã thấy

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 6

rằng ORT phân lập từ đường hô hấp của gà tây trong năm 1981 và ở quạ trong năm 1983 (P Vandamme và Cs., 1994) Nó cũng đã được phân lập ở Bỉ (Wyffels

& Hommez, 1990), Mỹ (B R Charlton và Cs., 1993) và Israel (R Bock và Cs.,

1995) O rhinotracheale đã được phân lập từ gà gô, gà lôi, chim bồ câu, chim

cút, vịt, chim đa đa, đà điểu, ngỗng, gà sao, gà và gà tây (B R Charlton và Cs.)

Trong các khu vực khác nhau ở Mỹ, O rhinotracheale gây ra viêm phổi

cấp tính với tỷ lệ tử vong từ 1 - 15%, và đôi khi thậm chí lên đến 50% ở gà tây

vào năm 1995 và 1996 Sự hiện diện của O rhinotracheale trên chim ở Nam Mỹ

và châu Á có thể đã được nghiên cứu, quan sát nhưng chưa được công bố ((P Vandamme và Cs)

Hiện nay, tình hình dịch bệnh ORT cũng như các nghiên cứu về chúng vẫn đang được tiến hành tại nhiều quốc gia

1.1.2 Tình hình nghiên cứu ORT tại Việt Nam

Trong những năm vừa qua tại Việt Nam có rất nhiều tỉnh thấy xuất hiện các đàn gia cầm chết với những triệu chứng, bệnh tích giống như các mô tả về bệnh ORT trên thế giới Tuy nhiên, tại Việt Nam không có nhiều các nghiên cứu

về ORT được công bố Tháng 6 năm 2014, lần đầu tiên người đã tổng hợp cụ thể

về tình hình nghiên cứu trên thế giới và các đặc điểm quan trọng của ORT làm cơ

sở cho việc chẩn đoán xét nghiệm (Nguyễn Thị Lan và Cs, 2014) Đến tháng 12 năm 2014, người ta đã tiến hành nghiên nhận dạng, phân lập và xác định mức độ

mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn Ornithobacterium rhinotracheale (Võ Thị Trà

An và Cs, 2014) Và cho đến nay vẫn chưa có thêm nghiên cứu nào về sự lưu

hành của vi khuẩn ORT trên gà tại Việt Nam

1.2 Căn bệnh

1.2.1 Phân loại

ORT nằm trong họ rRNA-V cùng với Cythophaga - Flavobacterrium -

Bacteroidesphylum và có mối quan hệ mật thiết với hai loại vi khuẩn khác gây bệnh

trên gia cầm là Riemerella anatipestifer và Coenonia anatine Trước đây, vi khuẩn này được biết đến với rất nhiều tên như: Pleomorphic Gram Negative Rod (PGNR),

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 7

vi khuẩn dạng Pasteurella, trực khuẩn Gram âm đa hình dạng trước khi có tên gọi

Ornithobacterium rhinotracheale được sử dụng cho đến ngày hôm nay (Bock, R., 1995; Charlton, B R., 1993; Hinz, K H., 1994)

1.2.2 Hình thái cấu trúc của vi khuẩn

ORT là một vi khuẩn Gram âm, đa hình thái, không có khả năng di động, dạng trực khuẩn nhỏ, không hình thành nha bào Trên môi trường thạch, chúng thường có dạng ngắn, trực khuẩn dạng dùi trống, với kích thước đường kính 0,2 - 0,9µm và dài 0,6 - 5µm Nhưng trong môi trường dạng lỏng, chúng rất dài, có thể

dài tới 15µm [Charlton, B R., 1993; Hafez, H M., 1996; Hinz, K H et al., 1994)

Hình 1.1: Hình thái vi khuẩn ORT dưới kính hiển vi

1.2.3 Tính chất nuôi cấy

ORT sinh trưởng trong điều kiện hiếu khí, hiếu khí tùy tiện và yếm khí tùy tiện Điều kiện sinh trưởng tối ưu là là ở nhiệt độ 37ºC, CO2 5%, thời gian nuôi cấy 24 - 72 giờ; tuy nhiên, chúng vẫn sinh trưởng tốt ở nhiệt độ từ 30ºC - 42ºC

Vi khuẩn này sinh trưởng mạnh trên môi trường thạch máu có 5 - 10% máu cừu (có bổ sung 10µg/ml Gentamycine), nhưng cũng sinh trưởng được trên môi trường thạch tryptose soy và môi trường chocolate agar Vi khuẩn không sinh trưởng trên các môi trường MacConkey Agar, Endo Agar, Gassner Agar, Drigalskil Agar hay Simon’s Citrate Sự phát triển của vi khuẩn trong các môi trường dạng lỏng cần phải được lọc kỹ, như môi trường BHB (Brain Heart

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 8

Infusion Broth), PB (Pasteurella Broth), hay Todd Hewitt Broth

ORT có khuẩn lạc rất nhỏ, không gây dung huyết ra xung quanh, màu xám tới trắng xám, đôi khi hơi đỏ thẫm, mặt lồi với bờ rõ ràng, sắc nét Ở những lần nuôi cấy đầu tiên, khuẩn lạc của ORT đạt kích thước lớn nhất (1 - 3 mm sau 48 giờ nuôi cấy) nhưng ở những lần nuôi cấy tiếp theo, khuẩn lạc thường nhỏ hơn và

biến dạng, không đồng nhất (Hinz, K H et al., 1994)

1.2.4 Sức đề kháng

ORT có thể sống 1 ngày ở 37ºC, 6 ngày ở 22ºC, 40 ngày ở 40ºC và ít nhất

là 150 ngày ở -102ºC Sự tồn tại của ORT ở nhiệt độ thấp có liên quan tới sự bùng phát các trường hợp bệnh tập trung vào các tháng mùa đông của năm Chúng không thể tồn tại quá 24 giờ ở nhiệt độ 42ºC

Các chủng ORT nhạy cảm với các yếu tố vật lý, hóa học Vi khuẩn bị vô hoạt hoàn toàn bởi dung dịch chứa formic và glyoxyl acid 0,5%, dung dịch có chứa hợp chất của aldehyde-based (20% glutaraldehyde) 0,5% sau 15 phút Các

dung dịch hỗn hợp 0,5% này cũng có thể vô hoạt O rhinotrachealeinvitro trong

gà trưởng thành (Hinz, K H et al., 1994)

Bệnh ORT có thể gặp trên gà và gà tây ở mọi lứa tuổi, hay gặp nhất ở lứa tuổi gà giò và gà lớn Gà thịt công nghiệp thường mắc ở độ tuổi từ tuần thứ 3 đến tuần thứ 6; gà lông màu, gà hậu bị, gà đẻ và gà giống thường mắc ở độ tuổi từ tuần thứ 6 trở đi và trong suốt quá trình đẻ trứng

Nhiều ca bệnh của ORT thường được phát hiện gây bệnh ghép với các

nguyên nhân gây bệnh hô hấp khác như Escherichia coli, Bordetella avium, Newcastle virus, IB virus, Metapneumovirus, Mycoplasma synoviae,

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 9

Chlamydophila psittaci và gần đây nhất là với chủng cúm H9N2 ở Trung Quốc Hầu hết các thí nghiệm nghiên cứu đều kết luận rằng, khi gây bệnh riêng lẻ do chính nó gây ra, ORT thường chỉ gây các triệu chứng tối thiểu ở gà và gà tây Chúng chỉ thực sự có triệu chứng bệnh nghiêm trọng khi đồng thời kết hợp với các virus, vi khuẩn gây bệnh hô hấp khác

Tuy nhiên, cũng có một số nghiên cứu cho rằng các tổn thương nghiêm trọng tương tự như trong thực địa ở gà và gà tây chỉ xuất hiện khi gây gây nhiễm thực nghiệm chỉ với ORT

1.3.2 Chất chứa mầm bệnh

Ở gà bệnh có thể tìm thấy vi khuẩn O.rhinotracheale thường có trong

phổi, túi khí, chất tiết của đường hô hấp như: nước mũi, nước mắt, dịch nhầy khí quản và ở hai bên phế quản

1.3.3 Phương thức truyền lây

ORT xuất hiện và truyền ngang thông qua sự tiếp xúc trực tiếp hay gián tiếp với mầm bệnh có trong không khí hay nước uống Do đó, các chuồng hở, sự thông thoáng của chuồng nuôi tạo điều kiện cho quá trình phát tán bệnh trở nên

dễ dàng hơn

Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể gà chủ yếu qua đường hô hấp, sinh sôi và phát triển ở niêm mạc đường hô hấp, sau đó đến cư trú ở cơ quan đích là phổi, hai phế quản gốc và gây nên bệnh tích đặc trưng của bệnh ORT ở đó

Bệnh lây truyền từ gà bệnh cho gà khỏe qua tiếp xúc trực tiếp Gà bệnh bài thải mần bệnh ra ngoài không khí qua chất tiết đường hô hấp (hắt hơi) và từ

đó lây cho gà khỏe bằng đường hít thở Ngoài ra, mầm bệnh có thể lây lan theo đường gió, qua dụng chăn nuôi, xe vận chuyển, động vật mang mầm bệnh và con người cũng đóng vai trò lớn trong sự truyền lây của bệnh ORT

Ở những vùng chăn nuôi gà tập trung theo hình thức công nghiệp nhưng không đảm bảo các điều kiện vệ sinh như môi trường bị ô nhiễm (mùi phân, độ thông thoáng kém…) hay nuôi gà nhiều độ tuổi khác nhau trong cùng một khu vực luôn là điều kiện lý tưởng cho bệnh ORT bùng phát và lây

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 10

lan với tốc độ nhanh

Ngoài ra, vi khuẩn này có những bằng chứng cho thấy chúng có khả năng chuyền dọc Thêm nữa, ORT cũng được phân lập từ buồng trứng, ống dẫn trứng, trứng nở, trứng đã thụ tinh, trứng không được thụ tinh, trứng chết phôi và chết bệnh trong vỏ của gà và gà tây Tuy nhiên, khi tiêm ORT vào trứng gà có phôi, phôi được giết ở ngày thứ 9 và không phân lập được ORT từ trứng đó Như vậy,

có thể thấy rằng ORT không truyền qua trứng trong quá trình ấp (Nguyễn Thị

Lan và cs, 2014; Hinz, K H et al., 1994)

1.3.4 Định serotype và phân loại chủng

Sử dụng boiled extract antigens (BEAs) và kháng huyết thanh đơn trong

agar gel precipitation (GAP) và kit ELISA để định type, 18 serotype (từ A tới R) của ORT đã được định rõ Serotype A là serotype phổ biến nhất trong số các

chủng phân lập từ gà (97%) và từ gà tây (61%) Dường như có sự tương quan về

mối quan hệ giữa nguồn gốc địa lý của ORT phân lập với các serotype của chúng

Serotype C có thể phân lập được chỉ từ gà và gà tây ở Nam Mỹ và Mỹ Không

thấy dấu hiệu đặc trưng của các serotype ở các vật chủ

Hafez và Sting so sánh hiệu quả của việc sử dụng các kháng nguyên tách

chiết từ các chủng (heat-stable, proteinnase K-stable và sodium dodecyl sulfate) trong định type ORT bằng xét nghiệm AGP và ELISA Kết quả chỉ ra rằng với các xét nghiệm AGP với kháng nguyên các chủng bằng heat-stable hay

proteinnase K-stable là phương pháp thích hợp cho định type

Sử dụng một phương pháp thực nghiệm mới kết hợp với sự suy giảm miễn

dịch và vận chuyển thụ động của hệ miễn dịch trong cùng một cơ thể, Schuijffel

và cộng sự thấy rằng kháng thể trung gian gây miễn dịch ở gà là một thành phân

quan trọng trong việc bảo vệ giúp chống lại ORT

1.3.5 Khả năng miễn dịch

Có rất ít thông tin nói về khả năng miễn dịch của O.rhinotracheale Khả

năng miễn dịch chủ động được tạo ra khi tiêm văc xin vô hoạt được xác định ở các serotype cụ thể, còn văc xin sống có thể tạo ra miễn dịch chéo giữa một vài

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 11

serotype Miễn dịch thụ động có thể kéo dài từ 3 - 4 tuần do các kháng thể truyền

từ mẹ sang con (Hinz, K H., 1994)

1.4 Triệu chứng và bệnh tích

1.4.1 Triệu chứng của gà mắc ORT

Triệu chứng lâm sàng, trong suốt giai đoạn bệnh và tỷ lệ chết do ORT ở các

ổ dịch bùng phát diễn biến khá đa dạng Chúng thường chịu ảnh hưởng bởi rất nhiều các nhân tố môi trường như quản lý chăm sóc kém, độ thông thoáng kém, mật độ nuôi cao, hàm lượng NH3 cao, chất lót nền kém, vệ sinh kém, ghép bệnh

và chủng loại mầm bệnh thứ phát (Charlton, B R et al, 1993; Hinz, K H., 1994)

Triệu chứng lâm sàng ở gà thịt thương phẩm thường xuất hiện ở 3 - 6 tuần tuổi với tỷ lệ chết vào khoảng 2 - 10% với các triệu chứng ủ rũ, giảm ăn, giảm tăng trọng và tăng dịch tiết và vảy mỏ, kèm theo có hiện tượng phù mặt [16,19] ORT có thể là nguyên nhân gây chết đột ngột (dưới 20% trong 2 ngày) ở gà con với sự nhiễm trùng não và xương sọ kèm theo hoặc không kèm theo các triệu chứng hô hấp

Ở gà giống bố mẹ, bệnh thường xảy ra ở giai đoạn đang đẻ trứng, giai đoạn đầu của gà đang đẻ đạt đỉnh hay ngay trước khi đưa gà lên chuồng đẻ Có

sự tăng nhẹ tỷ lệ chết, giảm ăn và các triệu chứng hô hấp nhẹ Tỷ lệ chết thừơng biến động và ít có liên hệ ở các ca không bị ghép bệnh Có thể gặp các biểu hiện giảm đẻ, giảm kích thước trứng và chất lượng vỏ trứng kém Tỷ lệ có phôi và khả năng ấp nở cũng có thể bị ảnh hưởng

Ở gà đẻ thương phẩm, giảm đẻ, tăng trứng méo và tăng tỷ lệ chết có liên

hệ tới sự nhiễm ORT

Roepke đã tìm ra rằng các triệu chứng bệnh và tỷ lệ chết cao hơn ở các gà tây trưởng thành và ở các gà non chủ yếu chỉ có các triệu chứng bệnh thông thường Ở một số trường hợp, gà non mắc bệnh từ 2 đến 8 tuần tuổi Tỷ lệ chết thường trong khoảng 1 - 15% trong pha cấp tính (8 ngày), nhưng tỷ lệ nhiễm có thể tăng cao với tỷ lệ chết tới 50%

Các triệu chứng ban đầu bao gồm ho, vảy mỏ và kèm theo dịch nhày; ở

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 12

một số trường hợp có hiện tượng trụy hô hấp nặng, khó thở, vươn cổ và viêm

xoang mũi (Charlton, B R et al, 1993) Các triệu chứng sẽ kéo theo các triệu

chứng giảm ăn và giảm uống nước Ở đàn gà tây giống, cũng thấy có hiện tượng giảm đẻ và tăng tỷ lệ trứng ấp nở không đạt tiêu chuẩn

ORT được báo cáo là nguyên nhân gây ra các triệu chứng thần kinh hoặc liệt do viêm màng não, viêm xương và viêm xương tủy ở gà và gà tây

1.4.2 Bệnh tích của gà mắc ORT

Bệnh tích đại thể

Ở gà thịt thương phẩm, các tổn thương đại thể thường gặp bao gồm: viêm phổi, viêm màng phổi và viêm túi khí Khi giết thịt hoặc kiểm tra sau giết mổ sẽ thấy dịch dạng bọt, màu trắng, chất dịch tiết này có màu giống sữa chua và có thể thấy rõ trong các túi khí (thùy túi bụng trước), hầu hết các tổn thương chỉ tiến triển ở một bên thùy phổi Các tổn thương do ORT có thể làm tỷ lệ chết tăng cao tới 50% hoặc hơn Thêm nữa, phù thũng dưới da mặt, tại các điểm tiếp giáp có sụn gây viêm đầu, viêm

xương, viêm xương tủy và viêm màng não được báo cáo thấy ở gà

Ở gà tây, có hiện tượng phù và viêm một bên phổi hoặc đối xứng 2 bên với các tơ huyết trên màng phổi Ngoài ra, có thể có các hiện tượng viêm mủ

tơ huyết gây viêm túi khí, ngoại tâm mạc, màng bao tim và khí quản Trong một số trường hợp, gan và lách có thể sưng cũng như có sự biến đổi ở cơ tim

có thể quan sát được Hiện tượng nhiễm khuẩn tại khớp, xương sống có thể

bắt gặp ở gà lớn (Hinz, K H et al, 1994; Sprenger, S et al, 1998)

tán và thâm nhiễm các đại thực bào với số lượng ít hơn các tế bào heterophil

Các ổ hoại tử lan rộng ở trung tâm các lòng cuống phổi và nhu mô lân cận Ổ hoại tử thường chứa đầy chặt hỗn hợp của các tế bào hoại tử, heterophil

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 13

thâm nhiễm hoặc chất tiết, và có thể có sự phân tán thành các cụm nhỏ của vi khuẩn Nhiều mao mạch bị căng phồng do các cục huyết khối Màng phổi và túi khí có thể dày lên nghiêm trọng và phù nề do lắng đọng tơ huyết ở các kẽ

(Charlton, B R et al, 1993)

1.5 Chẩn đoán

1.5.1 Chẩn đoán lâm sàng

Dựa trên các triệu chứng lâm sàng: ủ rũ, giảm ăn, giảm uống nước, ở gà

đẻ có hiện tượng giảm đẻ, tỷ lệ trứng ấp nở không đạt tiêu chuẩn

Các triệu chứng điển hình của bệnh hô hấp phức hợp trên gia cầm như: ho, vảy mỏ kèm theo dịch nhầy, một số trường hợp có hiện tượng trụy hô hấp, khó thở, vươn cổ và viêm xoang mũi

Bệnh tích điển hình như viêm phổi hóa mủ, viêm màng phổi, viêm túi khí, túi khí dày lên gan lách có thể sưng

Tuy nhiên, rất khó để có thể chẩn đoán chính xác dựa trên các dấu hiệu lâm sàng do dễ nhầm lẫn với các bệnh về hô hấp khác Để chẩn đoán chính xác phải dựa vào các chẩn đoán phòng thí nghiệm như phân lập vi khuẩn, phát hiện kháng nguyên

1.5.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm

Phân lập, nuôi cấy vi khuẩn

Các mô, cơ quan như phổi, khí quản, túi khí được xem là tối ưu nhất khi

sử dụng để phân lập được ORT Ngoài ra, xoang dưới hốc mắt và hốc mũi cũng là những vị trí phù hợp phục vụ cho việc nuôi cấy Nhưng, ORT dễ dàng bị bao phủ bởi sự phát triển quá nhanh của các vi khuẩn khác Nuôi cấy vi khuẩn từ máu tim

và mô của gan dưới các điều kiện thực tế cho kết quả âm tính, mặc dù trước đó vi khuẩn đã được phân lập từ các cơ quan cũng như ở các khớp xương, não, buồng

trứng và ống dẫn trứng sau khi gây bệnh thực nghiệm (Karrimi, V et al, 2010)

ORT cũng có thể được phân lập một cách thông thường, trên thạch máu

thường hoặc thạch chocolate (Charlton, B R et al, 1993) Khuẩn lạc phát triển tốt

trong 24 giờ, nhưng tốt nhất nên giữ các đĩa gấy nhiễm từ 48 - 72 giờ trong điều kiện không khí làm giàu từ 7,5 - 10% CO2 Khuẩn lạc sẽ xuất hiện có kích thước

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 14

từ đầu đinh ghim tới nhỏ (đường kính khoảng 1 - 2 mm), màu xám tới trắng, mặt lồi với cạnh sắc nét Nhuộm Gram cho kết quả vi khuẩn Gram âm đa hình thái đặc trưng Khuẩn lạc âm tính với catalase và dương tính với oxidase Nuôi cấy ORT thuần khiết có mùi riêng biệt, tương tự như mùi acid butyric Các thử nghiệm bổ sung là rất cần thiết để xác định các đặc tính của ORT (Charlton, B R

et al , 1993; Karrimi, V et al, 2010)

Trong các mẫu bị tạp nhiễm với sự phát triển nhanh của các vi khuẩn khác

như E.coli, Proteus sp hoặc Pseudomonas sp, khuẩn lạc của ORT có thể phát

triển quá mức và rất khó để xác định khi kiểm tra thường xuyên Vì đã chứng minh được rằng hầu hết các ORT đều kháng Gentamycin, nên khuyến khích sử dụng 10µg Gentamycin cho mỗi ml môi trường thạch máu để có thể phân lập được ORT từ các mẫu bị tạp nhiễm Thạch máu có chứa 5µg/ml gentamicin và

polymixin B cũng cho hiệu quả tốt (Charlton, B R et al, 1993

Kiểm tra ngưng kết nhanh trên phiến kính cũng được sử dụng cho mục đích chẩn đoán Trong một nghiên cứu với 112 mẫu phân lập, tuy nhiên hiện

tượng tự ngưng kết thường xuất hiện (Ferreri, M., 2013; Charlton, B R et al, 1993; Soriano, V E et al, 2002)

Kiểm tra Accelerated Graphics Port (AGP) sử dụng kháng huyết thanh dương tính đã biết có thể được sử dụng để xác định và định typ ORT đã phân lập (Charlton,

B R et al, 1993)

Một phương pháp khác được sử dụng để phát hiện các chủng phân lập nghi ngờ là PCR

Phát hiện kháng nguyên

PCR được sử dụng để phát hiện các ORT trong mẫu dịch khí quản được lấy

từ các gà mắc bệnh nặng Ngoài ra, xét nghiệm bằng miễn dịch huỳnh quang cũng

đã được sử dụng để phát hiện ORT trên gà Sau đó, Van Veen và cộng sự đã thấy rằng các xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang và kỹ thuật peroxidase - anti peroxidase (PAP) nhạy cảm như nhau Sử dụng các xét nghiệm này có thể xác định một tỷ lệ nhiễm ORT cao ở đàn gà thịt sau giết mổ khi so sánh với các phương pháp chẩn

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 15

đoán thông thường như huyết thanh học hoặc vi khuẩn học (Charlton, B R et al, 1993; Karrimi, V et al, 2010)

ELISA đã được phát triển bằng sử dụng các serotype khác nhau và chiết tách kháng nguyên của ORT Kháng nguyên cô đặc được sử dụng cho việc định type, có khả năng cho những kết quả chính xác nhất cho các serotype cụ thể Ngược lại kháng thể SDS chiết tách và dịch tiết từ lớp màng protein của ORT sẽ cho kết quả nhiều phản ứng kháng chéo, cho phép phát hiện các kháng thể chống lại của nhiều serotype khác nhau trong cùng một lần xét nghiệm

Điều tra thực địa sử dụng các kỹ thuật ELISA hoặc bộ kit ELISA thương mại (VDPro ® CSFV AB C-ELISA) rất hữu dụng khi theo dõi đàn gia cầm và chẩn đoán mắc ORT

Erganis và Cs phát triển phương pháp DIA (Dot Immunobinding Assay), một xét nghiệm dường như ít nhạy hơn so với các xét nghiệm ngưng kết khác Popp và Hafez đã nghiên cứu ảnh hưởng của việc sử dụng Amoxicillin trong điều trị tới động học kháng thể sau khi gây bệnh thực nghiệm Họ nhận thấy rằng việc điều trị tức thì không ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch, trong khi điều trị sau 7 ngày gây nhiễm sẽ cho một đáp ứng kháng thể thấp hơn (Nguyễn

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 16

Thị Lan và cs, 2014; Charlton, B R et al, 1993)

1.6 Biện pháp phòng và trị bệnh

1.6.1 Phòng bệnh

Việc phòng bệnh phải áp dụng các giải pháp tổng hợp mới cho kết quả tốt bao gồm các bước:

Công tác vệ sinh thú y trong chăn nuôi phải được đảm bảo: chuồng gà ấm

về mùa đông, thoáng về mùa hè, nền chuồng phải luôn khô ráo, tránh gió lùa Dọn vệ sinh thường xuyên khu vực chăn nuôi, máng ăn, máng uống đảm bảo sạch sẽ, sát trùng chuồng trại thường xuyên, định kỳ bằng các thuốc sát trùng: Iodine, Benkocid, Omecide… hạn chế khí độc chuồng nuôi H2S, NH3, CO2,

SO2… Hạn chế tối đa các yếu tốt stress có hại: Chăm sóc nuôi dưỡng gà tốt, không được để gà quá đói hoặc khát quá, đảm bảo ổn định chất lượng nguồn thức

ăn, nước uống, mật độ nuôi phù hợp theo đúng lứa tuổi, giống gà

Tằng cường sức đề kháng cho gà bằng các thuốc bổ như: B.comlex, điện giải, giải độc gan, điện giải thảo dược, Redmin…

Khống chế ảnh hưởng của thời tiết như: chắn gió lùa, che mưa, giảm độ nóng vào mùa hè bằng việc xây chuồng 2 mái, có hệ thống phun nước chống nóng lên mái

Dùng một trong các loại thuốc sau để phòng: Timicocin, Spiramycin, Lincomycin, doxycycline

1.6.2 Điều trị

Phương pháp điều trị gia cầm mắc bệnh do ORT bằng kháng sinh là một điều rất khó bởi rất nhiều chủng của ORT có khả năng làm giảm độ nhạy hoặc có tính kháng cao với nhiều loại kháng sinh như amoxicillin, ampicillin, doxycycline, enrofloxacin, flumequine, gentamycin, lincomycin, tetracycline và

tylosin (Võ Thị Trà An và cs., 2014; Alongkorn Amonsin et al., 1997; Charlton,

B R et al, 1993)

Tính nhạy cảm với kháng sinh có thể phụ thuộc vào chế độ sử dụng kháng sinh ở ngành chăn nuôi gia cầm ở các quốc gia, khu vực khác nhau Ví dụ: ở một

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 17

số quốc gia, trứng thường được nhúng vào một loại kháng sinh như enrofloxacin thì gần như tất cả các chủng sẽ có thể kháng với kháng sinh đó

Năm 2006, Hafez báo cáo rằng cho uống amoxicillin pha với liều 250ppm cho 3 - 7 ngày cho kết quả khá tốt ở nhiều trường hợp và việc sử dụng chlortetracycline với liều 500ppm pha nước uống 4 - 5 ngày cũng cho hiệu quả Trong một vài trường hợp, tiêm tetracycline và penicillin cũng cho hiệu quả cao

Ngoài ra, theo một số nghiên cứu ở các nước như Đức, Mỹ thì các chủng phân lập ở mỗi nước sẽ có độ mẫn cảm khác nhau với một số loại kháng sinh như

ampicillin, erythromycin, tylosin, neomycin,…(Charlton, B R et al, 1993)

1.6.3 Triệu chứng lâm sàng của một số bệnh đường hô hấp của gà

- Bệnh Cúm Gia Cầm

Gà có tỷ lệ mắc cao và chết rất cao Gà sốt cao, uống nhiều nước, sưng phù thủng hoại tử mào tích Mào tím thâm, tím tái xoăn mào hoạc tụt mào Viêm sưng phù thũng đầu và măt

Gà thở khó, há mồm để thở có biểu hiện hen khẹc, hắt hơi và sổ mũi Biểu hiện ở đường tiêu hóa; tiêu chảy phân xanh vàng, phân xanh, phân lẫn máu và có mùi hôi thối

Gà đẻ có biểu hiện giảm sản lượng trướng hoặc tắt đẻ hoàn toàn

Ngoài ra gà mắc bệnh cúm còn có những biểu hiện của triệu chứng thần kinh, ngẹo đầu, nghẹo cổ đi lại mất thăng bằng

Gà chậm lớn, kém ăn, hay vẩy mỏ, kèm theo viêm mí mắt, thối mắt, nhiều

gà bị mù mắt, đầu sưng một bên hoặc hai bên hoặc sưng cả đầu

- Bệnh Newcatstle

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 18

Ở gà nhỏ; lúc đầu gà ho hen, há mồm thở ở một số con, sau bốn ngày gà lan nhanh ra toàn đàn Gà tụm đống lại dưới bóng sưởi hoặc tại góc chuồng

Gà khó thở, nên nhiều con dướn cổ thật dài hoặc thật cao đẻ hít khí kèm theo tiếng rít mạnh, cuối cơn rít thở gà phát tác tiếng “tooc’ tiếng đanh và gọn Đây là triệu chứng điển hình của Newcastle

Gà ỉa chảy, lúc đàu loãng trắng sau đó chuyển sang xanh trắng hoặc xanh

Gà kém ăn, ủ rũ, sút gâỳ rất nhanh, chân, mỏ kém bóng láng, thậm chí khô đét, lông xù

Một số gà bại chân, bại cánh nên loạng choạng, thất điều, mất thăng bằng khi khua đuôi Diều gà chứa đầy hơi, dốc ngược chảy ra nước mùi chua và thối

- Bênh IB ( viêm phế quản truyền nhiễm)

Đối với gà con trên một tháng tuổi bệnh xảy ra rất nhanh trong toàn đàn với các triệu chứng; sốt, ủ rũ, xù lông, kém ăn, thở khó, thở bằng miệng và luôn kèm theo tiếng khò khè, chảy nước mũi, nước mắt nhiều trường hợp sau một đến hai tuần gà khỏi bệnh nhưng cũng chêt đến 40%

Đối với gà đẻ nhiều khi không có triệu chứng lâm sàng nào ngoài giảm tỷ lệ

đẻ, giảm đột ngột tới 70% và kéo dài hàng tháng Chất lượng trứng và vỏ trứng kém

- Bệnh ILT (Viêm thanh quản truyền nhiễm)

Bệnh chủ yếu biểu hiện ở đường hô hấp trên như; ho hen, hắt hơi, khó thở, đau mí mắt tiến thở có nhiều đờm

Gà có máu ở mỏ, trên tường, nền chuồng, lông xơ xác…tỷ lệ chết thấp, chết là do dịch viêm bịt kìn thanh quàn khiến gà chết gạt

Tỷ lệ đẻ giảm xuống từ 10% đến 40% kéo dài

Bảng phân biệt các triệu chứng lâm sàng

Bệnh Biểu hiện lâm sàng

Bên ngoài Hô hấp Tiêu hóa Cúm gia cầm - Triệu chứng thần kinh

- Sốt cao

- Uống nước nhiều, ủ rũ, lông ướt

- Mào tích sưng, sung huyết

- Chân suất huyết

Thở khó, khó khè,

Tiêu chảy, phân vàng xanh, lẫn máu

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 19

CRD - Chảy nước mắt, nước mũi,

xưng mắt, lông xù, gầy

- Khò khè, nhiều đờm, ngáp để thở

- Phân trắng loãng

Newcastle -Gà rù, lông bết, chân khô,

mào tích thâm tím

- Gà sốt cao, ủ rũ kém ăn có biểu hiện thần kinh nghẹo đầu nghẹo cổ

- Thở khó, ngáp kèm theo “tóoc”

- Tiêu chảy lặng, lúc đầu phân trắng loãng sau đó chuyển sang xanh trắng

IB - Gà sốt ủ rũ xả ra nhanh

toàn đàn

- Đẻ giảm 70% thở khó

- Gà thở khó, sưng mắt nhẹ

- Tiêu chảy phân loãng trắng

- Phân loãng trắng

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 20

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP VÀ NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Gà mắc hoặc nghi mắc ORT nuôi tại các hộ/trang trại chăn nuôi ở huyện Yên Phong, tỉnh Bắc Ninh

2.2 Nội dung nghiên cứu

1) Xác định tình hình dịch tễ trên đàn gà ở huyện Yên Phong, tỉnh Bắc Ninh mắc bệnh ORT;

2) Nghiên cứu các biểu hiện triệu chứng lâm sàng và biến đổi bệnh tích đại thể, vi thể trên đàn gà mắc ORT;

3) Nuôi cấy và phân lập vi khuẩn ORT bằng các phương pháp;

4) Xác định được tính mẫn cảm của vi khuẩn với một số kháng sinh và thử nghiệm điều trị;

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp quan sát các triệu chứng lâm sàng

Chúng tôi tiến hành theo dõi, quan sát và lấy mẫu gà trên các đàn gà nghi mắc ORT nuôi tại các xã: Đông Tiến, Tam Giang, Dũng Liệt, Hòa Tiến, Long Châu và Yên Phụ thuộc huyện Yên Phong, tỉnh phía Bắc Ninh; sau đó ghi chép các triệu chứng lâm sàng của gà nghi mắc ORT còn sống Gà có các triệu chứng như: ủ rũ, gà ngáp khó thở, đôi khi hắt hơi, vảy mỏ, mũi có dịch viêm, đau mắt…

2.3.2 Phương pháp mổ khám

Với những gia cầm có triệu chứng rõ ràng, chúng tôi tiến hành mổ khám để kiểm tra bệnh tích đại thể của tất cả các cơ quan theo quy trình mổ khám gia cầm của Cục Thú Y

- Nếu gia cầm còn sống phải dùng các biện pháp làm chết tránh gây biến đổi lớn về mức độ quan sát bệnh tích (dùng điện, cắt tiết…)

- Kiểm tra bên ngoài: thể trạng cơ thể, da, lông, u, các lỗ tự nhiên, khớp,

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 21

ngoại ký sinh trùng và các tổn thương…

- Mổ khám kiểm tra nội tạng bên trong

- Ghi báo cáo mổ khám và phiếu gửi bệnh phẩm

Xử lý tiêu độc xác gia cầm

2.3.3 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu làm tiêu bản

Các mẫu được lấy theo quy định của ngành

Mẫu cơ quan tổ chức cần: lấy đúng cơ quan, đúng vùng tổn thương điển hình, lấy đủ (đủ thành phần cấu tạo cần nghiên cứu và đủ lượng cấn thiết)

Mẫu có thể là dịch ngoáy mũi, dịch hầu họng và dịch khí quản và dịch phế quản của gà mắc bệnh ở mọi lứa tuổi

1) Đối với dịch ngoáy mũi và dịch ngoáy hầu họng dùng tăm bông vô trùng ngoái sâu vào lỗ mũi/hầu họng của gà bệnh đã được lau sạch bằng cồn 70º để một thời gian cho dịch mũi thấm vào tăm bông → Để tăm bông vào ống nghiệm chứa môi trường vận chuyển (Stuart Transport Medium), môi trường nước thịt vô trùng hoặc dung dịch PBS, đậy nút và ghi nhãn rồi đưa về phòng thí nghiệm sau 2 - 8h Nếu ở xa phòng thí nghiệm thì môi trường vận chuyển phải để ở tủ lạnh Sau vận chuyển bệnh phẩm phải được cấy vào môi trường phân lập thích hợp

2) Đối với dịch khí quản hay dịch phế quản: dùng kéo vô trùng cắt dọc khí quản hay phế quản, sau đó dùng tăm bông vô trùng đưa dọc theo dường ống để lấy dịch Đặt tăm bông vào trong môi trường như trên, đậy nút ghi nhãn và vận chuyển về phòng thí nghiệm

3) Với mẫu là tổ chức phổi: sau khi mổ khám gà, dùng kéo vô trùng cắt lấy tổ chức phổi ở vùng định xét nghiệm

4) Với mẫu là tổ chức bệnh khác như ruột, hạch phổi… làm tương tự

2.3.4 Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn

Phân lập vi khuẩn là việc tách riêng vi khuẩn từ quần thể ban đầu nhằm mục đích đưa vi khuẩn về dạng thuần khiết Vi sinh vật ở dạng thuần khiết là giống vi sinh vật được tạo ra từ một tế bào ban đầu Đây là một khâu có ý nghĩa rất quan trọng trong việc nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật Bằng cách phương

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 22

pháp phân lập vi sinh vật sẽ phân lập được vi khuẩn thuần khiết để từ đó xác định một số đặc điểm sinh vật, hóa học gây bệnh của vi khuẩn

Bước 1: Cấy mẫu bệnh phẩm nghi chứa vi khuẩn lên trên môi trường

thạch máu Colombia đã chuẩn bị từ trước (bổ sung 5-10% máu thỏ hoặc máu cừu

Bước 6: Cấy chuyển những khuẩn lạc trên sang môi trường BHB (môi

trường dinh dưỡng máu tim)

Bước 7: Ủ đĩa môi trường trong tủ ấm 37ºC, CO2 5% trong thời gian từ

24 - 72 giờ

Bước 8: Thử phản ứng Indol

2.3.5 Phương pháp thực hiện các phản ứng nhận biết

Phản ứng KOH: dùng que cấy lấy khuẩn lạc của vi khuẩn ORT mọc trên môi trường thạch máu (khuẩn lạc nhỏ, to bằng đầu đinh gim, tròn, đục, có mầu xám đến xám trắng hoặc gây dung huyết yếu hoặc không gây dung huyết) lên một phiến kính sạch đã có sẵn một giọt dung dịch KOH 10% đánh tan rồi nhấc que cấy lên Nếu khuẩn lạc không vón cục, tan ra và không tạo nhớt phản ứng âm tính Phản ứng Catalase: thực hiện tương tự như phản ứng KOH nhưng thay KOH bằng H2O2 Nếu không quan sát thấy hiện tượng sủi bọt bong bóng trong vài giây thì vi khuẩn kiểm tra sẽ được đánh giá là có phản ứng Catalase âm tính

Vi khuẩn ORT cho phản ứng Catalase âm tính

Phản ứng Oxidase: sử dụng thuốc thử của hãng Remel Nhỏ một giọt thuốc thử trên vào tấm giấy thấm; lấy một vòng khuẩn lạc ORT trên môi trường thạch máu phiết đều lên tâm giấy thấm có sẵn giọt Oxidase Trong vòng 10 giây

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 23

đầu, nếu môi trường chuyển sang màu tím than, phản ứng cho kết quả dương tính ORT cho phản ứng Oxidase dương tính

Phản ứng Indol/Kovac’s: dùng canh khuẩn được tăng sinh trong môi trường BHB cho vào ồng nghiệm sạch Nhỏ một giọt dung dịch Indol/Kovac’s vào trong ống nghiệm trên Nếu môi trường xuất hiện một vòng tròn đỏ trong ống nghiệm, phản ứng cho kết quả dương tính ORT cho phản ứng Indol/Kovac’s âm tính

2.3.6 Phương pháp hóa mô miễn dịch

Bước 1: Chuẩn bị tiêu bản làm hóa miễn dịch

Từ các block là mẫu bệnh phẩm của gà nghi mắc bệnh ORT đã được đúc trong parafin cắt thành các tiêu bản mỏng có kích thước 3µm để khô ở 37oC trong 24 giờ

Khử tiêu bản trong xylen, cồn và rửa nước tương tự như trong nhuộm Haematoxylin – Eosin

Bước 2: Hoạt hóa enzym

Ngâm ngập tiêu bản trong dung dịch PBS và hấp ướt ở 121oC/5 phút

Bước 3: Khử peroxydase nội sinh

Dùng H2O2 trong dung môi Methanol theo tỷ lệ 1/9, ngâm tiêu bản trong

10 phút

Bước 4: Gắn kháng thể

Nhỏ kháng thể 1 lên tiêu bản

Để tủ ấm 37oC/1 giờ hoặc 4oC/qua đêm

Rửa tiêu bản bằng dung dịch PBS 3 lần (5 phút/lần)

Bước 5: Gắn kháng kháng thể

Nhỏ kháng thể 2 lên tiêu bản

Để tủ ấm 37oC/1 giờ

Rửa PBS 3 lần (5 phút/lần)

Bước 6: Cho cơ chất

Ngâm tiêu bản trong dung dịch DAB khoảng 5 – 7 phút Dung dịch DAB gồm: Tris 0,05M: 75ml; H2O2: 25µl; DAB: 0,035g

Kiểm tra trên kính hiển vi thường Nếu thấy xuất hiện màu vàng nâu trên lát

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 24

cắt thì dừng phản ứng bằng nước sạch Phản ứng âm tính nếu không xuất hiện màu

Bước 7: Nhuộm nhân và đọc kết quả

Nhuộm nhân bằng Haematoxylin, làm sạch, gắn lamen và quan sát bằng kính hiển vi quang học

2.3.7 Phương pháp PCR

2.3.7.1 Phương pháp chiết tách DNA

Chúng tôi sử dụng bộ kit QIAamp DNA Mini Kit của Hãng QIAGEN (QIAGEN Inc., USA) để tách chiết DNA tổng số theo các bước:

Bước 1: Cho 20µ l Proteinase K vào ống Eppendorf Thêm 180 µl

Buffer ATL, trộn đều ủ ở 56oC trong 3 giờ

Bước 2: Thêm 4µl ARNase và 200 µl Buffer AL Ủ ở 70oC trong 30 phút

Bước 3: Thêm 200 µ l Ethanol (96 - 100%), trộn đều

Bước 4: Chuyển mẫu sang cột có màng lọc, ly tâm 13000 vòng/phút

trong 1 phút Loại bỏ dịch ở dưới

Bước 5: Thêm 500µl Buffer AW1, rồi ly tâm 8000 vòng/phút trong 1

phút, bỏ dịch dưới

Bước 6: Thêm 500µ l Buffer AW2, ly tâm 13000 vòng/phút trong 2

phút, bỏ dịch dưới Tiếp tục ly tâm thêm 1 lần nữa như trên

Bước 7: Chuyển cột lọc đã giữ lại ADN hệ gen của vi khuẩn trong

màng lọc sang ống Eppendorf loại 1,5ml Thêm 100 µ l Buffer AE, để ở nhiệt

độ phòng trong 5 phút Sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, thu dịch lỏng bên dưới, bảo quản ở -20oC

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR:

Giai đoạn Bước Nhiệt độ (ºC) Thời gian Số vòng

2

Duỗi mạch 94 30 giây

45 Gắn mồi 52 60 giây

Tổng hợp sợi mới 72 90 giây

3 Hoàn chỉnh 72 7 phút 1

Dừng phản ứng 4

2.3.7.3 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR

Bước 1: Chuẩn bị thạch Agarose 1.2%: Cân 1.2g Agarose cho vào 100ml dung dịch TBE 1X, đun sôi trong lò vi sóng, để nguội đến khoảng 40oC bổ sung thêm 10 µl Syber green, đổ thạch có số giếng tương ứng số mẫu cần điện di

Bước 2: Chuẩn bị mẫu: Thêm 2 µl loading dye vào 8µl sản phẩm RT-PCR Bước 3: Chuẩn bị bể điện di: Chuyển thạch đã đông vào bể điện di, thêm TBE 1X đến ngập thạch

Bước 4: Nhỏ marker và sản phẩm PCR đã trộn với loading dye vào các giếng với thể tích 6µl maker 100bp và 10µl sản phẩm PCR mỗi giếng

Bước 5: Điện di ở hiệu điện thế 100V trong 30 phút

Bước 6: Quan sát kết quả điện di sản phẩm PCR trên máy chụp ảnh gel và chụp ảnh

2.3.8 Phương pháp kiểm tra khả năng mẫn cảm kháng sinh của chủng vi khuẩn ORT phân lập được

Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của chủng vi khuẩn ORT phân lập được xác định bằng phương pháp khuếch tán trên thạch

Chủng vi khuẩn cần kiểm tra được tăng sinh trong môi trường BHB, nuôi trong tủ ấm 37ºC, 5% CO2 trong vòng 24 - 48 giờ Pha loãng canh khuẩn đến nồng độ

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 26

màu thích hợp (so với ống đục chuẩn); hút 100µl dung dịch canh khuẩn trên láng đều trên bề mặt thạch máu (đã chuẩn bị sẵn) Để cho bề mặt đĩa thạch khô tự nhiên ở nhiệt

độ phòng khoảng 5 phút, rồi tiến hành đặt giấy tẩm kháng sinh lên bề mặt thạch Tiến hành đọc kết quả sau khi nuôi cấy khoảng 24 - 48 giờ

Dùng thước đo đường kính vòng vô khuẩn và đánh giá kết quả theo các tiêu chuẩn lâm sàng trong phòng thí nghiệm của Hội đồng Quốc gia Mỹ (The United State National Committe for Clinical Laboratory Standards Guidelines-NCCLS, 1997) theo

3 mức: mẫn cảm mạnh, mẫn cảm trung bình, hoặc kháng thuốc

2.3.9 Sử dụng một số loại kháng sinh để phòng trị bệnh do vi khuẩn ORT gây

ra ở lợn

Dựa vào khả năng mẫn cảm với một số loại kháng sinh của chủng vi khuẩn ORT phân lập được, lựa chọn loại khang sinh có tỷ lệ mẫn cảm cao, tiến hành điều trị các thể bệnh so vi khuẩn ORT gây ra ở gà tại một số trại và hộ chăn nuôi thuộc huyện Yên Phong, tỉnh Bắc Ninh

Đánh giá hiệu quả triều trị căn cứ vào tỷ lệ khỏi bệnh, thời gian điều trị khỏi trung bình

Các loại kháng sinh được lựa chọn điều trị: Amoxicilline/Clavulanic acid, Ampicillin và Tetracycline hoặc Erythromycin

1) Eryvet powder (công ty cổ phần dược phẩm xanh việt nam)

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 27

Sử dụng phương pháp thống kê sinh học, Excel

2.4 Nguyên liệu nghiên cứu

1) Mẫu bệnh phẩm: Gà và các mẫu bệnh phẩm mắc hoặc nghi mắc ORT thu thập được như: phổi, hạch phổi, khí quản, phế quản, mẫu Swab (dịch nước mũi, mắt, miệng, ổ nhớp), lách, ruột, hạch …

2) Máy móc: Tủ ấm 37ºC, tủ -86ºC, kính hiển vi, máy ly tâm, máy votex, máy PCR, máy chạy điện di, máy chụp gel, các máy hấp, sấy dụng cụ…

3) Dụng cụ: Dao, kéo, pank kẹp, khay, eppendorf, lamen, lam kính, bộ dụng cụ nhuộm, cốc đong hóa chất, đèn cồn, ống đựng formol 10%, ống nghiệm, dụng cụ bảo hộ lao động (khẩu trang, áo blouse, găng tay…)

4) Hóa chất: dung dịch formol 10%, cồn, xylen, thuốc nhuộm Gram (tím Gentian, đỏ fucxin, dung dịch lugol, cồn axeton), ethanol, PBS, DAB…, H2O2

3%, thuốc thử Kovac’s, các loại kháng sinh; hóa chất dùng trong chiết tách RNA, thực hiện phản ứng PCR

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 28

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Tình hình dịch bệnh trên đàn gà nói chung và tình hình mắc bệnh ORT nói riêng nuôi tại huyện Yên Phong, tỉnh Bắc Ninh từ tháng 6 năm 2014 đến tháng 9 năm 2015

3.1.1 Tình hình mắc một số bệnh truyền nhiễm theo lứa tuổi của gà

Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi đã tiến hành điều tra, thu thập số liệu,

gà chết đều được mổ khám, kiểm tra bệnh tích và ghi chép lại từ đó đánh giá khả năng thích nghi, nhiễm bệnh để có biện pháp phòng bệnh chủ động Qua các số liệu thống kê ở tại các trại nuôi gà chúng tôi đã thu thập được số liệu từ mọi độ tuổi của

gà và chia làm 3 giai đoạn: từ 0 - 6 tuần tuổi, từ 7 - 20 tuần tuổi và giai đoạn sinh sản

≥ 20 tuần tuổi Kết quả thu được tổng hợp và trình bày thông qua bảng 3.1

Kết quả cho thấy, mặc dù gà nuôi đã được phòng văc xin từ 1 ngày tuổi song bệnh truyền nhiễm vẫn xảy ra Số lượng gà ốm chết ở các giai đoạn phát triển khác nhau là khác nhau Giai đoạn từ 0 - 6 tuần tuổi chiếm tỷ lệ cao nhất là 69,07%; giai đoạn 7 - 20 tuần tuổi có tỷ lệ chiếm 66,15%; giai đoạn ≥ 20 tuần tuổi có tỷ lệ nhiễm thấp nhất, chiếm tỷ lệ 63,50% Khi thống kê số gà chết ở các giai đoạn chúng tôi nhận thấy:

Giai đoạn gà con (từ 0 - 6 tuần tuổi) có tỷ lệ chết do bệnh truyền nhiễm là thấp nhất 30,93% Vì trong giai đoạn này gà vẫn đang ở trong giai đoạn gà úm, chế độ chăm sóc được chu đáo hơn giai đoạn trưởng thành Trong đó, tỷ lệ nhiễm

do bệnh bạch lỵ là 22,51% và chỉ thấy chết ở giai đoạn gà con là chủ yếu, đây

là bệnh do Salmonella pullorum gây ra với triệu chứng gà ỉa phân trắng, quan

sát bệnh tích thấy gan lách có nhiều điểm hoại tử màu đỏ trắng lấm tấm như đầu

đinh ghim, lòng đỏ không tiêu Đối với bệnh do E.coli gây nên, với tỷ lệ nhiễm

thấp nhất chiếm 30,93%; với bệnh CRD, tỷ lệ này chiếm khoảng 2,23%; đối với bệnh IB, chiếm tỷ lệ 1,72%; tỷ lệ nhiễm này cũng tăng dần đối với bệnh Gumboro (chiếm khoảng 3,09%)