DƯỢC LIỆU CHỨA TANNIN

• Định nghĩa & Phân loại tannin • Cấu trúc của 2 loại tannin chính • Các tính chất lý hóa chính của tannin • Các phương pháp chiết xuất tannin • Các phương pháp định tính, định lượng tan

• Định nghĩa & Phân loại tannin

• Cấu trúc của 2 loại tannin chính

• Các tính chất lý hóa chính của tannin

• Các phương pháp chiết xuất tannin

• Các phương pháp định tính, định lượng tannin

• Tác dụng và Công dụng của tannin

• Ba* dược liệu tiêu biểu có tannin (Ngũ bội tử, Măng cụt, Ổi)

Trình bày được

3

1 Khái niệm & Định nghĩa về tannin

2 Phân loại các tannin

2.1 Theo tính thuộc da (tannin thực & pseudo)

2.2 Theo cấu trúc hóa học

2.3 Theo khả năng thủy phân*

7 Định lượng Tannin7.1 Phương pháp dùng bột da7.2 Phương pháp oxy-hóa (Lowenthal)7.3 Phương pháp dùng Đồng acetat7.4 Phương pháp đo màu với thuốc thử Folin7.5 Phương pháp đo màu với thuốc thử Folin-Ciocalteu7.6 Phương pháp dùng HPLC

8 Tác dụng & Công dụng của Tannin

• Về nguồn gốc, tannin là những hợp chất biến dưỡng thứ cấp

của các thực vật bậc cao, có bản chất polyphenol.

• Về cấu tạo, tannin có thể là

- các ester của galloyl (và dẫn chất) với nhiều loại polyol khác

nhau (glucose, acid quinic, catechin, ).

- các oligomer hoặc polymer của PAC* (và dẫn chất từ PAC),

với các liên kết flavanyl (C − C)

• Về từ nguyên, tanna = gỗ Sồi (Oak, Fir) trong tiếng Đức cổ.

Tiếng Anh: to tan, tanning (Pháp: tanner) = (sự) thuộc da

B Theo Edwin Haslam (1989): Tannin là

- các hợp chất polyphenol, MW # 500 –20.000 đvC

- cho các phản ứng thông thường của phenolic

- tạo tủa với alk., gelatin, protein khác và 1 số polysaccharid

A Theo E.C Bate-Smith (1962): Tannin là

- các hợp chất phenol, MW # 500 − 3.000 đvC

- cho các phản ứng thông thường của phenolic

- tạo tủa với alkaloid, gelatin và các protein khác

C Theo Peter Horvath (1981): Tannin là

- các hợp chất polyphenol, MW lớn

- chứa n ×φOH & các nhóm thích hợp khác (carboxyl)

- tạo phức với protein & nhiều đại phân tử khác trong đk đặc biệt

2.1 Theo khả năng kết hợp với protein (≈ tính thuộc da)

→ Tannin thực (true) và tannin giả (pseudo-tannin; ψT)

2.2 Theo cấu trúc hóa học (≈ cách tổ hợp phân tử)

→ Tannin pyrogallic (TG) và tannin pyrocatechic (TC)

Có nhiều cách phân loại tannin:

2.3 Theo tính thủy phân (trong tannase hoặc acid loãng)

→ Tannin thủy phân được và tannin ko thủy phân được

= Tannin ngưng tụ = condensed tannin

10(Goldbeater's skin test)

11

Có thể chia các “tannin thực” thành 4 nhóm chính

A1 Tannin gallic (= gallo-tannin)*

Thường là polyester của vài mono-, di-, tri-galloyl (hay ∆’ của

chúng) với 01 phân tử polyol (glucose*, acid quinic )

A2 Tannin ellagic (= ellagi-tannin)*

Thường là polyester của acid ellagic, luteolic, HHDP (hay ∆’ của

chúng) với 01 phân tử polyol (glucose*, acid quinic )

B Tannin [pyro]catechic (= tannin ngưng tụ, condensed tannin)

= PAC, là các oligomer, polymer của Flavan-3-ol (nối C → C)

thường gặp kiểu liên kết (C4 →C8) hay (C4 →C6)

C Tannin phức hợp (complex tannin)

Dựa vào tính thủy phân, tannin có 2 loại chính:

• Tannin thủy phân được (gồm gallo-tannin & ellagi-tannin).

• Tannin ko thủy phân được (= tannin ng tụ, pyrocatechic).

thủy phân được

(tanin pyrogallic)

gallo-tannin ( acid gallic)n

ellagi-tannin ellagic, luteolic

ko thủy phân được

(tanin pyrocatechic) n x catechin (flavan 3-ol; 3,4-diol)n

Điều kiện thủy phân: enzym tannase hay acid loãng

3.2 Cấ́u tạo các tannin thực: thuộc da (+) 3.2.1 Tannin pyrogallic (TG) = Tannin thủy phân được.

a Gallo-tannin (polyol + ∆’ acid n-gallic)

b Ellagi-tannin (polyol + ∆’ acid ellagic)

c hỗn hợp (polyol + acid n-gallic + acid ellagic)

3.2.2 Tannin pyrocatechic (TC): Không thủy phân được.

3.2.3 Tannin phức hợp: (catechin − polyol − gallic/ellagic)

3.1 Cấu tạo các pseudo-tannin: thuộc da (−)

15

Tiếng Hy lạp: phloios (φλoιὀς) = vỏ cây (bark)

baphe (βαφή) = chất nhuộm màu (dye)

Hai định nghĩa thông dụng về phlobaphen:

• Trong hóa thực vật học:

Phlobaphen là các hợp chất phenol có màu đỏ chiết từ thực vật.

Các hợp chất này tan trong cồn nhưng không tan được / nước

• Trong công nghệ thuộc da:

Phlobaphen là những sản phẩm có màu đỏ (= đỏ tannin) được

tạo thành khi xử lý các dịch chiết có tannin với các acid vô cơ.

Các hợp chất này không tan đươ•c trong nước.

+ OH/glc

• Về cấu trúc hóa học, thường gặp chúng ở dạng:

- các dẫn chất acid phenol đơn giản

- các tổ hợp (n-caffeoyl−acid quinic); các flavo-lignan

- mono và dimer, trimer của acid gallic

- mono và dimer của catechin và ∆’-catechin

(≥ trimer được xếp vào nhóm PAC/ tannin ngưng tụ)

Là các polyphenol đơn giản, phân tử (và MW) nhỏ Tính chất:

• cho các ph.ứng chung của polyphenol (ph.ứng của vòng thơm,

diazo-hóa, phản ứng của -OH như tạo phức với Pb2+, Fe3+ )

• không cho phản ứng thuộc da; Chỉ khi ở nồng độ cao, đôi khi

chúng mới có thể tạo tủa với dung dịch protein (khác tannin)

• khả năng tạo phức với các đại phân tử thì rất kém (khác tannin)

COOH O

1 3 4 5

HO

HO

OH HO

COOH

1 2 3 4 5

acid quinicacid chlorogenic

(3-caffeoyl quinic)

acid iso-chlorogenic = (5-caffeoyl quinic)

cynarin(1,3-dicaffeoyl quinic)

2

CO H

H HO

HO

O

HO

OH HO

COOH

1 2 3 4 5

caf O

HO

HO

COOH OH

1 3

O HO

OH

OH

OH OH

3

O HO

OH

OH

OH OH

OH

OH

OH OH 2

3

Vị trí trung tâm là 1 glycon ( ) có cấu trúc polyol

Polyol - thường gặp nhất là βD-glucopyranose (βD-Glc)

- ít khi là ∆ ’ acid quinic, acid caffeic, shikimic

- rất ít khi là ∆ ’ glucitol, hamamelose

Mỗi -OH/polyol này có thể nối ester với 1 nhóm -COOH

của phần acid n-gallic (thường thì n = 1 → 3)

Điển hình là các polygalloyl glucose và acid tannic có

trong Ngũ bội tử ( Galla chinensis ), Sồi ( Quercus spp.)

a Các gallo-tannin

22

O

O HO HO O G

G

H H

1 2 3

4 5

hamameli-tannin(∆’-hamamelose)

O

O O O O

O G

G G

G

G

1 2 3

4 5 6

penta-galloyl glucose (PGG*)

O

O O O O

O G

G G

G

G O O

O

O O G G

G

1 2 3

4 5 6

2

6 HO

HO

OH OH

OH

O COO

HO

HO

OH

βD-glc

Nhóm -COOH / acid meta n-gallic nối ester với 1 nhóm -OH / glc

Các đơn vị acid gallic nối meta với nhau bằng đường nối depsid

O O O

O O

G

G G G

O G G G

1 2 3

4 5 6

(G = galloyl)

HO HO HO

Ellagitannin có trong quả Chiêu liêu (Terminalia chebula),

vỏ quả Lựu, vỏ Sồi (Quercus spp.), lá Trà

O OH HO

HO HO HO

O O

CH 2 O

G OH G

O OH

OH OH

OH OH

1

1

O O

O O

O

G G HO

6

2 3

4 C1 1 C4

• Khi mở 1 vòng (→acid luteolic): tạo 1 nhóm COOH mới ( )

• Khi mở cả 2 vòng lacton (→HHDP): tạo 2 nhóm COOH mới ( )

COOH COOH

OH OH

• Khi không mở vòng: nhóm -OH (♥) của acid ellagic có thể

nối với -OH của polyol (như glucose…) và tạo 1 O-glycosid

Các nhóm -COOH ( ) này sẽ nối ester với các nhóm -OH của

polyol (như glucose…), tạo pseudo-glycosid(# ellagi-tannin)

: nối ester kiểu depsid (kém bền nhất): nối acetal (tạo O-glycosid; kém bền): nối ester (tạo ψ-glycosid; kém bền): nối C − C ( , rất bền!)

• Trong phân tử acid ellagic

• Giữa acid ellagic và glucose

• Giữa acid monogallic và glc

• Giữa 2 vòng thơm

6 O OH

HO HO

COO COO

OH HO

HO

HO

COO

HO HO HO

OH OH

1

6

O OH O

O O

O G G

G G

(G = galloyl)

27

Mỗi ph tử HHDP có 2 nhóm -COOH Chúng có khuynh hướng tạo

một diester với 2 nhóm -OH/glc gần nhau trong không gian, ví dụ:

- dạng 4C1-glc → diester ở (2 + 3), ở (4 + 6), hay ở (3 + 4)

- dạng 1C4-glc →diester ơ› (6 + 1), ở (6 + 3), hay ơ› (2 + 4)

hai dạng ghế của D-glucopyranose

(kém bền) O

OH HO

OH OH

OHOH

1 2 3 4 5 6

(Tham khảo)

Enzym tannase (ví dụ từ môi trường nuối cấy Aspergillus niger)

thì không cắt (thủy phân) được nối ester giữa HHDP & glucose

28

1

6

O OH O

O O

O G G

G G

(Tham khảo)

• Các liên kết ester giữa HHDP với glucose (kém bền) dễ bị cắt đứt

• Liên kết C − C ( ) giữa 2 vòng thơm (rất bền) không bị cắt

Sản phẩm thủy phân ngừng ở acid ellagic (ko tới được acid gallic!)Khi thủy phân các ellagi-tannin (nước nóng, acid yếu ) thì:

• Phần HHDP sau thủy phân sẽ nhanh chóng sắp xếp lại cấu trúc (xoay và đóng vòng) để tạo acid ellagic (ko tới được acid gallic!)

O O

CH 2 O

G OH G

4

1

O O

O O

O

G G HO

6

2 3

Phần aglycon vừa có acid gallic, vừa có acid ellagic / luteolic / HHDP

O O O O

O

O CO

HO HO OH

G G

G G

COOH COOH

G G

HHDP

• Gallic có thể là mono, di, hoặc tri-galloyl

• Ellagic có thể là ellagyl, luteolyl, HHDP-yl

• Có thể có liên kết giữa các đơn vị gallic & ellagic gần nhau

30

O

OH OH

OH HO

O

OH OH

OH HO

O

OH OH

OH

HO

4 4

4 8

8 8

(OH)

(OH)

(OH)

OH OH OH

Còn gọi là tannin catechic (TC), tannin ngưng tụ (condensed tannin), hay proanthocyanidin (PAC), phlobatanin (ít dùng)

Là tổ hợp nhiều đơn vị [flavan-3(4)-ol] nhờ liên kết (C−C) rất bền ( ) PAC có thể thẳng ( nối 4/8) hoặc tạo nhánh ( nối 4/6)

n

terminal extension

31

O

OH OH

OH

4

4 4

8

8

8 8 8

Acid tannic là một hỗn hợp chủ yếu gồm các ester của βD-glucose*

với acid n-gallic (n = 1, 2, 3) Acid di- hay trigallic tạo bởi nối depsid

βD-glucose đóng vai trò trung tâm, xung quanh là các acid n-gallic

Do được khai thác từ các nguồn khác nhau, công thức của acid tannic

cũng có nhiều công bố khác biệt (về giá trị n của phần acid n-gallic)

Cũng có tài liệu nói đến sự có mặt của acid quinic (thay cho một số

vị trí của glucose)

Acid tannic = poly-galloyl-βD-glucose = C6H12O6 (C7H4O4)5→10

MW = 180 + (760→1520) = (940→1700)

O O O O

Shoji Tomoda (1982), Plant Pharm Chem., p 93,discloses that the structural formula of the principal component of tannic acid is as follows:

O O

E Fisher

*1396*

= 8 ± 1

7 →9 galloyl(1982)

*1294*

1244MW

= (22/3)Hagerman

4 ×galloyl + trigalloyl / G2

Gn (nối với các OH glucosyl)

= 7Britton

Σ galloylTác giả mô tả

Acid tannic có trong các tổ chức sùi ra (galls) ở lá & cành non của

- một số loài Sồi, Sến (Quercus infectoria, Q lusitanica )

- một số loài Muối tạo Ngũ bội tử (Rhus chinensis = R semialata ) Sản phẩm này có thành phần chủ yếu là digalloyl vàβD-glucose

Acid tannic còn có trong hạt cây Caesalpinia spinosaFabaceae

Sản phẩm này có thành phần chủ yếu là digalloyl và acid quinic

1 2 3

4 5 6

OH OH

OH OH

2 3 4

COOH OH OH OH

OH

1 2 3

4 5

6 O OH OH HO

HO HO

acid quinicTham khảo

Cấu trúc rất phức tạp Có thể có hoặc không có polyol (glucose )

Phần aglycon đa dạng (các ∆’ catechin, các ∆’ acid gallic, ellagic )

Vd: Các guavin / lá Ổi, camellia-tannin / lá Trà, stenophyllanin A / Sồi

Stenophyllanin A

(trong Quercus stenophylla)

O O

O

O

O

Hax G

7 HHDP

O O

OH OH

2

3

7 8

Cinchonain (trong Cinchona spp.)

∆’ acid caffeic

38

4.1 Lý tính 4.1.1 Chung của TG và TC 4.1.2 Riêng của TG

4.1.3 Riêng của TC

4.2 Hóa tính 4.2.1 Chung của TG và TC 4.2.2 Riêng của TG

4.2.3 Riêng của TC

39

4.1.1 Lý tính chung của 2 loại tannin TG & TC

- thường là bột vô định hình, màu vàng ngà đến nâu sáng

- không mùi hoặc mùi rất nhẹ; có vị chát

- gây săn se niêm mạc, kích ứng niêm mạc dạ dày

- MW # 500 → 5.000+ (TG); 900 → 20.000+(TC).

- tính chất thay đổi tùy xuất xứ, tùy cách chiết.

- dễ tan / kiềm loãng, cồn-nước, aceton-nước.

- tan được* / EtOAc, glycerin, propylen glycon.

- không tan / d.môi kém ph.cực (hexan, EP, Bz, Cf, Et2O)

40

Khi thử nghiệm tính tạo tủa của tannin với protein:

cần điều chỉnh pH của môi trường!

• Độ tan của các tannin

- (epi)-catechin monomer và dimer: dễ tan / EtOAc.

- các PAC oligomer: kém tan / EtOAc.

- các PAC polymer có MW quá lớn: rất khó tan / EtOAc.

• Với các dung dịch nước của protein (albumin, gelatin ):

- tạo phức tủa bền → có tính thuộc da làm da bền, ít thấm nước, không bị thối rữa (khả năng tạo tủa sẽ tối ưu tại pHi của protein)

4.1.1 Lý tính chung của 2 loại tannin TG & TC (cont.)

• Sắc ký rây phân tử: ví dụ với Sephadex (Pharmacia*)

- với Sephadex LH-20: Rửa giải tannin với (aceton + nước)

EtOH không rửa giải các tannin được (nên dùng để loại tạp!)

- với Sephadex G-25: Rửa giải bằng nước hoặc cồn + nước

Nói chung, tannin là những hợp chất rất phân cực, phân tử lớn

• Sắc ký hấp phụ (ví dụ với Si-gel NP): Tannin thường bị hấp phụ chặt

vào pha tĩnh và rất khó giải hấp (≠ cơ chế phân bố trên Si-gel RP)

→SKC si-gel NP: tannin di chuyển rất chậm; SKLM: Rf thấp + kéo vệt

42

- dễ tan trong nước *, cồn-nước, aceton-nước

- MW trung bình: có thể kết tinh được.

- MW càng lớn thì càng kém tan trong nước.

- MW thường 900 – 5000, hàm lượng / cây: thường lớn.

- chưng cất khô ở # 200 oC → các pyrogallol* (tri-OH).

- khả năng tạo tủa với protein: rõ rệt với ≥ triester của [≥ 3 nhóm OH / glc] & [≥ 5 đơn vị galloyl] (MW ≥ 940)

484

+ 180 = MW

(10) = 1520(5) = 760

(2) = 304

(n) x galloyl

(glucose = 180; acid gallic = 170; galloyl = 152 Da)

43

4.1.3 Lý tính của các tannin ngưng tụ (TC)

- tan trong cồn, trong aceton (giống TG)

- khó tan / nước, khó kết tinh (khác TG)

- các TC có MW thấp: tan được / EtOAc

- MW = 500 − 20.000 (lớn hơn tannin gallic)

- Cất khô →phloroglucinol (A), pyrocatechin (B)

Lưu ý: TC không → glucose (khác TG)

- các trimer trở lên (n ≥ 3) mới có tính thuộc da

(mới được coi là Tannin Catechic chính thức)

- Tính thuộc da của các TC >> TG

- TC chiếm # 90% tổng sản lượng tannin toàn cầu

- TC có trong lá Trà, vỏ Canhkina, hạt Nho, vỏ Thông, Quebracho,

cây Dẻ, Keo Acacia & nhiều cây gỗ vùng nhiệt đới

OH HO

4.1.4 Phổ UV & Phổ IR của tannin

• Phổ UV (và phổ IR) của tannin thực tế ít được khai thác

Nếu có, chỉ là 1 trong các tiêu chuẩn kiểm nghiệm tannin.

• Với các tannin catechic, nếu vòng B có nhóm -OH ở

- 3’,4’ sẽ có λmax~ vùng 280 nm, ví dụ (epi)catechin.

- 3’,4’,5’ sẽ có λmax~ vùng 270 nm, ví dụ (epi)gallocatechin.

• Phổ UV của các phức màu [tannin + thuốc thử] thường được khai thác hơn để định lượng tannin, polyphenol (PP so màu th thử vanillin-HCl, DMACA, Folin-Ciocalteu )

A Chung của 2 loại tannin TG và TC4.2.1 Ph.ứng tạo tủa với protein4.2.2 Ph.ứng kiềm phân

4.2.3 Ph.ứng thủy phân4.2.4 Ph.ứng Oxy hóa4.2.5 Ph.ứng với muối kim loại

B Riêng của tannin catechic (TC)

C Riêng của tannin gallic (TG)

C Riêng của tannin gallic (TG)4.2.a Ph.ứng v

4.2.b Ph.ứng v4.2.c Ph.ứng v4.2.d Ph.ứng v

B Riêng của tannin catechic (TC)4.2.6 Ph.ứng với ROH / H+4.2.7 Ph.ứng với aldehyd / H+4.2.8 Ph.ứng với aldehyd / OH−4.2.9 Ph.ứng với dung dịch Brom

4.2.0 Ph.ứng với

O O O

O Gn

Gn O

Gn

O Gn Gn

O HO

OH

OH

OH

O R 3 (OH)

R O

NH C R O

NH C R O

protein

52

• Phức tủa [protein − tannin] sẽ dễ hình thành khi môi trường

có pH # pHi (đẳng điện) của protein tương ứng.

• Trong m trường kiềm, các -OH → (O−); protein cũng ở dạng

anion: tủa phức [protein − tannin] không được tạo thành.

• Để tạo tủa với protein, k’ thước (và MW) của các tannin phải:

- đủ bé để xâm nhập được vào khe của các sợi protein

- đủ lớn để liên kết với chuỗi peptid ở nhiều vị trí.

54

4.2.2 Phản ứng kiềm phân Với kiềm đặc và nóng, tannin → các mảnh đơn giản (dùng để nghiên cứu cấu trúc tannin)

O O O

O Gn

Gn O

Gn

O Gn Gn

pyrogallolacid gallic

O HO

OH

OH

OH

O R 3 (OH)

pyrocatecholphloroglucinol

acid n-gallic, ellagic, luteolic, HHDP (gallo)catechin

4.2.3 Phản ứng thủy phân (bởi acid loãng, tannase)

- PG bị thủy phân → acid phenol + (glucose, acid quinic )

- PC bị trùng hiệp → các phlobaphen màu đỏ

Lưu ý:

Tuy thuộc nhóm tannin ko thủy phân được, nhưng các PAC có nhóm

ester ở C-3 (như EGCG, ECG ) vẫn có thể bị cắt tại vị trí ester này;

nhưng tannase, acid/kiềm loãng ko cắt được nối C − C (C4 →C6/8)

O HO

OH

OH

OH

O 3 (OH)

OH OH

OH

OH OH

OH OH

HO

O OH OH

OH OH

OH OH HO

O

OH OH OH OH

OH

OH OH

OC

OH OH OH

nối ester (khá bền)

♦

O O O

4

5

6

O O O O O

G G G G

1 2 3

4 56

O OH HO

HO HO

thủy phân ko hoàn toàn

thủy phân hoàn toàn

58

• Nếu dùng MeOH: acid gallic thành methyl gallat

• Nếu dùng EtOH: acid gallic thành ethyl gallat

59

O

O HO

OH O

O

OH HO

HO

OH OH O

HO

OH OH O

βD-glucose

acid gallic

X

Trong m.trường acid hay base, ellagi-tannin sẽ bị cắt liên kết ester → HHDP

HHDP nhanh chóng được sắp xếp lại, đóng vòng và chuyển thành acid ellagic

Acid ellagic này sẽ tan / môi trường (nước) và không tiếp tục cho ra acid gallic

acid / base

60

4.2.4 Phản ứng Oxy hóa

- oxy hóa yếu (không khí, dung dịch Fehling…),

luôn kèm theo sự trùng hiệp, tạo các sản phẩm

có phân tử lớn không tan / nước.

- oxy hóa mạnh (K2Cr2O7, KMnO4)

kèm phá vỡ cấu trúc → mảnh phân tử nhỏ hơn

Tannin tạo phức tủa màu với các muối Pb2+, Cu2+, Fe3+, Al3+

Màu phức sẽ thay đổi tùy theo

* loại muối: muối sắt → xanh rêu đến xanh đen

muối chì → trắng ngà đến vàng

* số lượng nhóm OH phản ứng (ortho-di-OH, gallo-tri-OH)

• Ứng dụng

- loại bỏ tannin (+ tạp polyphenol) khỏi dịch chiết

- sơ bộ nhận định số lượng nhóm –OH

• Chú ý

- các phức [polyphenol - kim loại] có thể tan lại / cồn cao độ

Do đó muốn loại tạp polyphenol bằng dung dịch chì acetat

(tr tính hoặc kiềm) thì dịch cần loại tạp phải có độ cồn < 25%

- phản ứng này không đặc hiệu cho tannin

4.2.5 Phản ứng tạo phức với muối kim loại (của 2 loại tannin)

62

3+

Càng nhiều nhóm -OH lân cận, màu phức sẽ càng xanh đen Ví dụ:

• Các gallo-tannin (nhóm tannin thủy phân được)

• Các gallo-catechin (nhóm tannin ngưng tụ, 3 nhóm OH / vòng B)

hay ester 3-galloyl

O Fe O O

O Fe O +

+

O

O

O O

O O

OH

OH

OH

OH 8

4

A

B

O O

4'

(OH)

(OH)

(HO) (OH)

O

O OH

O HO

OH

OR

O O

OH

OH RO

- catechin & TC → sản phẩm trùng hợp không tan / nước

- TG →không tạo tủa (ph biệt với tannin TC)

4.2.8 Phản ứng thế trên nhân thơm (của TC)

- TC + halogen (nước brom …) → sản phẩm thế khó tan

4.2.9 Phản ứng với formaldehyd/kiềm (của TC)

- TC + HCHO/OH− → phức keo (làm keo dán gỗ!)

4.2.6 Phản ứng với ROH / H+ (quan trọng / TC)

Với MeOH, EtOH, n-BuOH trong môi trường acid (HCl )

a ở nhiệt độ phòng là đủ

Catechin (flavan 3-ol và ∆ ’) → AC (màu đỏ/H+)

b ở nhiệt độ nóng (phải đun vài giờ)

Tannin catechic (PAC) → → AC (màu đỏ/H+)

Đây còn được gọi là phản ứng alcol-phân (≠ thủy phân),

là một phản ứng oxy-hóa cắt mạch (oxidative cleavage).

* MeOH + acid yếu (hay dd đệm): chỉ cắt được nối depsid

(ko cắt được nối ester bình thường) trong tannin gallic.

O

OH OH OH HO

OH

3 4 8

O

OH

OH OH HO

OH 3 4 8

OH

OH

OH OH

O

OH

OH OH HO

OH

3 4 8

3 4 8

procyanidin ( λ max 280 nm)

cyanidin (280; 535 nm)

catechin (277 nm)

ROH/H + ∆

ROH/H + ∆ 1

4.2.7 Phản ứng với thuốc thử Stiasny* 1905, (HCHO + HCl)

Thuốc thử Stiasny (Formaldehyd 37% + HCl đđ.)

được mô tả với 2 tỉ lệ (2 : 1) hay (1 : 1) tùy tài liệu.

[Dịch TC loãng] + [th’.thử Stiasny] → tủa vón nặng, màu đỏ gạch.

- Các catechin monomer, dimer cũng cho tủa (rất lưu ý!).

- Các tannin pyrogallic (TG) thì không cho tủa vón nặng.

- Đây là 1 phản ứng đơn giản để phân biệt TG và TC.

TC (+) là do vòng thơm A còn có H tự do (H-6 và/hay H-8):

(a) các vị trí H-6 / H-8 này sẽ cộng hợp với phân tử H-CHO,

(b) sau đó ngưng tụ lại theo nhiều cách khác nhau

(c) để cho nhiều tổ hợp phức polymer có màu nâu đỏ gạch.

Theo T Takano et als (2008), J Wood Sci., 54, 329-331

+ HCHO / H+methylolation

O HO

OH

OH

OH

OH A

6 8 8

6

OH HO

3

H

H O HO

OH

OH

OH

OH A

+

condensation

CH 2

O

8 8

A

O HO

OH

A 5 6 7 8

HCHO

70

Các aldehyd thơm thường dùng: dimethyl-amino-cinnamaldehyd (DMACA) hay vanillin Phản ứng xảy ra trong môi trường acid Các catechin (và PAC, TC) có H tự do ở 6/8 sẽ tạo phức với adehyd thơm này

A Ar HO

OH

H

A CHO

Me

CHO HO

MeO

CHO : VANILLIN DMACA:

O HO

OH

OH

OH OH

O HO

OH

OH

OH OH

OH

OH

OH OH

Ar CH

−H2O

O HO

CHO MeO

HO

8

6 O

OH

OH

OH

OH HO

CH OH

HO MeO

H A

O MeO

H A

p-dimethylamino-cinnamaldehyd = DMACA

Tham khảo

DMACA is a dye particularly useful for localization of PACs in plant

histology The use of the reagent results in blue staining

It can also be used to titrate PACs A colorimetric assay based upon

the reaction of A-rings with the chromogen

DMACA has been developed for flavanoids (monomer) in beer that

can be compared with the vanillin procedure

The DMACA reagent may be superior to the vanillin procedure for

the detection of catechins (monomer!)

DMACA (+) to monomer & polymer of catechins!

The DMACA reagent changes color over several days when exposed

to air but when refrigerated can be stored for up to 2 weeks

The DMACA reagent # the Renz & Loew reagent

Tham k

hảo

74

p-Dimethylaminocinnamaldehyd = DMACATham k

hảo

75

4.2.a Phản ứng cồn-phân + oxy hóa bằng KIO3

Với [MeOH + H2SO4], các TG sẽ cho glucose và methyl gallat.

Methyl gallat tiếp tục bị oxy hóa bởi KIO3→ phức màu đỏ

(đo màu ở 525 – 550 nm).

Tham khảo: methalolysis

4.2.b Phản ứng với Rhodanin (của acid gallic tự do)

Sau thủy phân, acid gallic tự do được tác dụng với dung dịch

rhodanin/MeOH, trong môi trường kiềm, để cho các sản phẩm

có màu hồng đỏ (đo màu ở 520 nm).

76

LOD = 1,5 µ g methyl gallat

4.2.a Phản ứng cồn-phân + oxy hóa bằng KIO3