Đ Ạ I H Ọ C Q U Ố C G IA H À N Ộ I T R Ư Ờ N G Đ Ạ• I H Ọ• C K H O A H Ọ• C T ự• N H IÊ N Đ o T h ị N h H oa THIÉT KẾ VECTOR BACULOR VIRUS MANG GEN HA CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 PHỤC v ụ CHO VIỆC PHÁT TRIỀN VACCINE THÉ HỆ MỚI BẰNG CÔNG NGHỆ VIRUS LIKE PARTICLE C h u y ên ngàn h : V i sinh vật học M ã số: 60.4 LU Ậ N V Ă N T H Ạ C SỸ K H O A H Ọ C N G Ư Ờ I HƯ ỚNG DẢN K H O A HỌC: TS ĐỒ NG VÃN QUYÊN H N ộ i - N ă m 2012 LÒI CẢM ON Trước hết, tơi xin bậy tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tói Tố Dồng Văn Quyền , ngưòi tận tỉnh bảo, quan tâm, giúp đỡ vả dìu dắt tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu, vả hồn thành luận văn, giúp tơi có nhiều kiến thức, kinh nghiệm quỷ báu Trong q trình nghiên cứu vừa qua, tơi nhận Phân đoạn có kích thước 2431 bp, m ã hóa tổng hợp protein enzym PB2 Enzym có khối lượng phân tử khoảng 84 kDa, tiểu đom vị thành phần phức hợp enzym polym erase chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã RNA virus Tính thích nghi nhiệt độ thể lồi vật chủ có liên quan đến vị trí amino axít 627 protein PB2 Luận văn thạc s ĩ sinh học Đào Thị N hư Hoa P B PB2 PA NP X NA M1 I M2 I NS2 41 NS1 Hình 1.2: Mơ hình cấu trúc virus cúm A /H 5N > Phân đoạn có kích thước 2431 bp, mã hóa tổng hợp enzym P B P B có khối lượng phân tử khoảng 87 kDa, tiểu đon vị xúc tác phức hợp enzym polym erase chịu trách nhiệm gắn mũ RNA trình tổng hợp RNA virus Gần đây, nhà khoa học phát thêm protein P B - F2 m ã hóa m ột khung đọc mở khác phân đoạn > Phân đoạn có kích thước 2233 bp, mã hóa tổng hợp protein enzym PA PA có khối lượng phân tử khoảng 83 kDa, tiểu đơn vị enzym polym erase chịu trách nhiệm kéo dài phiên mã RNA trình tổng hợp RNA virus Phân đoạn gen có tính bảo tồn cao > Phân đoạn chịu trách nhiệm m ã hóa tổng hợp protein HA - kháng nguyên bề m ặt virus cúm Phân đoạn gồm hai tiểu phần HA I HA2 có độ dài thay đổi tuỳ theo chủng virus cúm A, A/H1N1 1778 bp Protein HA có khối lượng phân tử khoảng 63 kDa, đóng vai trị quan trọng q trình xâm nhiễm virus có khả gây ngưng kết hồng cầu Vùng HA I HA2 m ột số am ino axít mang tính kiềm mã hóa chuỗi oligonucleotide Vùng chứa vị trí nhận biết cắt đặc hiệu số enzym protease vật chủ vùng định độc lực virus > Phân đoạn có kích thước khoảng 1556 bp, mã hóa tổng hợp nucleoprotein (NP) Protein NP thành phần phức hệ phiên mã chịu trách nhiệm vận chuyển Luận văn thạc s ĩ sinh học Đào Thị N hư Hoa 3.1.3 Thiết kế vector trung gian baculovirus mang hộp gen HA Vector pCRHA vector pBluBac4.5/V5-His-TOPO xử lý đồng thời bang BamW I Hind III, phân tách sản phẩm cắt gel agarose 1% sau cắt riêng biệt vùng gel chứa DNA hộp gen HA DNA khung vector mở vòng, tinh thu lại sản phẩm cắt kit gel Fermentas (Đức) Sản phẩm phân cắt sau tinh thu nhận kit gel, kiểm tra lại điện di gel agarose 1% Kết điện di cho thấy, băng có kích thước khoảng 1600 bp (hộp gen HA) băng có kích thước khoảng 5000 bp (vectơ pBluBac4.5/V5-His-TOPO) đường chạy tương ứng (Hình 3.3) Kết chứng tỏ hộp gen HA khung vector pBluBac4.5/V5-His-TOPO sau cắt BamH I Hind III tinh thu nhận 5000 bp 1500 bp Hình 3.3: Gen HA từ vectơ tách dòng pCRHA vectơ pBluBac4.5/V5-His-TOPO thu nhận lại từ gel agarose 1% sau xử lý BamH I Hind III 1: thang DNA chuẩn kb; 2: gen HA; 3: vectơ pBluBac4.5/V5-His-TOPO Để tạo vector pBluBac4.5/V5-His-TOPO tái tổ hợp mang hộp gen HA, tiến hành nối ghép đoạn DNA tinh thu lại với nhờ enzyme T4 DNA ligase Sản phẩm gắn biến nạp vào tế bào E coli D H 5a chọn lọc khuẩn lạc mơi trường LB có bổ sung Ampicilin 100 |ig/ml Chúng chọn ngẫu nhiên khuẩn lạc từ đĩa nuôi cấy sản phẩm gắn nối khuẩn lạc từ plasm id gốc để tách plasmid kiểm tra có mặt hộp gen HA bàng cắt phân tích với hai enzyme giới hạn BamH I Hind III Kết điện di sản phẩm phân cắt plasmid pBluBac4.5/V5-His-TOPO tái tổ hợp bàng BamH I Hind III trình bày Hình 3.4 Các plasmid tái tổ hợp có kích thước lớn hom plasmid 37 Đào Thị N hu Hoa Luận văn thạc s ĩ sinh học pBluBac4.5/V5-His-TOPO gôc không mang gen ngoại lai, căt băng BamH I Hind III cho hai đoạn DNA có kích thước khoảng 5000 bp 1600 bp tương ứng với kích thước plasmid pBluBac4.5/V5-His-TOPO hộp gen HA (giếng số 27, H ình 3.4A) Trong plasmid gốc cắt mở vịng với kích thước khoảng 5000 bp với kích thước vector pBluBac4.5/V5-His-TOPO (giếng 2, H ình 3.4A) gen HA Các dòng plasmid tái tổ hợp mang hộp gen HA chọn lọc cắt kiểm tra phân tích enzyme cắt giới hạn khẳng định lại PCR sử dụng cặp mồi lai Polyhedrin forward sequencing prim er (mồi xuoi-PFSP-F) bám vào vectơ pBluBac4.5/V 5-H is-TO PO mồi ngược HApBac-R bám vào hộp gen HA Với cặp mồi có plasmid pBluBac4.5/V5-His-TOPO tái tổ hợp mang hộp gen HA cho sản phẩm PCR đặc hiệu Chúng chọn 3/6 plasmid kiểm tra để phân tích tiếp bàng PCR Kết điện di (Hình 3.4B) cho thấy, sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi PFSP-F H ApBac-R cho băng có kích thước khoảng 1800 bp (hộp gen HA (1652 bp) + 120 bp vectơ) Kết chứng tỏ vectơ baculovirus trung gian m ang hộp gen HA virus cúm A /H 5N thu nhận Plasm id tái tổ hợp ký hiệu pBluBacHA 7 10 11 ~ 5000 bp *“ 1700 bD A B H ình 3.4: Điện di plasm id pBluBac4.5/V5-His-TOPO tái tổ hợp kiểm tra khả m ang hộp gen HA A: pBluBac4.5/V5-His-TOPO không mang gen (1), pBluBacHA (2-7); B: pBluBac4.5/V5-His-TOPO gốc cắt BamH I Hind III (1), pBluB acH A cắt bàng BamU I Hind III (2-7), thang DNA chuẩn kb (8), sản phẩm PCR nhân đoạn gen HA từ pBluBacHA clone 2, 3, cặp mồi PFSPF H A pBac-R (9-11) 38 Luận văn thạc s ĩ sinh học Đào Thị Như Hoa Gen HA biểu tế bào SÍ9 cấu trúc trình tự hộp gen chúng khơng bị biến đổi Vì vậy, số plasmid chọn lọc (Hình 8B) phân tích tiếp đọc trình tự DNA sử dụng cặp mồi đọc trình tự bám vào vector pBluBac4.5/V5-His-TOPO theo thiết kế nhà sản xuất Kết xác định trình tự (khơng nêu đây) lần khẳng định chắn tạo thiết kế thành công vector trung gian baculovirus mang hộp gen HA Hộp gen HA virus cúm A/H5N1 mang đầy đủ thành phần cần thiết cho biểu gen hệ thống tế bào côn trùng bao gồm trình tự Kozak, mã khởi đầu m ã kết thúc vector trung gian baculovirus mang hộp HA thiết kế thành công Vector trung gian tiếp tục nghiên cứu đồng chuyển nạp vào tế bào côn trùng với DNA khung baculovirus để tạo VLP biểu HA 3.2 Nuôi cấy bảo quản tế bào trùng Spodoptera frugiperda (Sf9) Te bào đóng vài trị then chốt thành công đề tài Việc ni cấy trì tế bịa địi hỏi phải tuân thủ cách nghiêm ngặt để trành làm tế bào bị sổc mặt học sinh lý tế bào Nếu tế bào yếu, sinh trưởng ảnh hưởng đến thí nghiệm Sau nhận tế bào côn trùng Sf9, ni cấy để nhân dịng sau bảo quản nitơ lỏng phục vụ cho công việc để tài mô tả phần vật liệu phương pháp nghiên cứu Mặc dù vậy, qúa trình ni cấy cất giữ giống làm tế bào bị nhiễm trùng chết điều kiện bảo quản khơng Hình 3.5: Anh tê bào Sf9 sau ngày nuôi cây, tê bào Sf9 bám dính vào chai ni cấy chiếm 70-80% diện tích đĩa ni cấy (trên kính hiển vi soi ngược độ phóng đại 300 lần) 39 Luận văn thạc s ĩ sinh học Đào Thị Như Hoa Để kiểm tra xem tế bào có bị ảnh hưởng sau qua trình cất giữ nitơ lỏng hay không trạng thái tế bào, tiến hành nuôi cấy lại tế bào bảo quản mơi trường thích hợp chai nuôi cấy T25 Kết cho thấy, sau bảo quản nitơ lỏng tế bào sinh trưởng tốt, thể tốc độ sinh trưởng nhanh hình thái tế bào khơng bị biến đổi Sau ngày ni 28°c mật độ tế bào đạt 80-90% diện tích bề mặt chai ni cấy, tể bào quan sát kính hiển vi chụp ảnh (Hình 3.5) Tế bào lúc dùng cho mục đích thí nghiệm 3.3 Đồng chuyển nạp tạo baculovỉrus tái tổ họp mang hộp gen H5 Để tạo hạt giả virus cúm A/H5N1 đòi hỏi nhiều bước, từ nhân dòng gen, kiến tạo hộp gen HA mang yếu tố cần thiết để biểu gen tế bào côn trùng, thiết kế vector baculovirus trung gian mang hộp gen HA cuối đồng chuyển nạp vector với DNA baculovirus vào tế bào côn trùng Sự thành cơng q trình đồng chuyển nạp phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: tình trạng tế bào, độ tinh DNA cần chuyển vào tế bào, tỷ lệ vector tái tổ họp mang gen đích với DNA baculovirus, lượng chất chuyển nạp, m ôi trường nuôi cấy M ột ngày trước đồng chuyển nạp (co-transfection), cấy chuyển tế bào sang đĩa ni cấy (60mm) mới, tính lượng tế bào cho ngày hôm sau mật độ tế bào đĩa 60 mm đạt khoảng 80-90% Tiếp theo đó, phức hợp vector baculovirus tái tổ hợp DNA khung baculovirus đồng chuyển nạp vào tế bào Quá trình đồng chuyển nạp mô tả mục phương pháp nghiên cứu Sau đồng chuyển nạp, tế bào tiếp tục ni cấy quan sát hình thành virus tái tổ hợp Trong tế bào, nhờ trình tài tổ hợp trình tự tương đồng, hộp gen HA baculovirus vector chuyển sang DNA khung baculovirus tạo nên virus tái tổ hợp mang gen đích Các virus tái tổ hợp có khả chép nhân lên tế bào côn trùng Kết cho thấy sau 72 virus 40 Đào Thị Như Hoa Luận văn thạc s ĩ sinh học tạo ra, thể xuất CPE (Cytopathic effect) tạm dịch tác động gây bệnh tể bào (Hình 3.6) A B H ình 3.6: Hình ảnh tế bào SÍ9 trước chuyển nạp (A), sau chuyển nạp 72 tạo baculovirus tái tổ hợp m ang gen HA (B) 3.4 Kiểm tra có mặt gen HA virus tái tổ họp phương pháp PCR Sau tạo baculovirus tái tổ hợp, phải kiểm tra xem liệu virus tái tổ hợp có mang gen HA không Đây khâu quan trọng qui trình tạo hạt giả virus cúm cơng nghệ virus-like particle Để kiểm tra có m ặt có gen HA sử dụng phương pháp PCR Neu baculovirus tái tổ hợp có m ang gen HA cho sản phẩm PCR đoạn gen HA mà chủng thiết kế vào vector trung gian baculovirus Cặp mồi dùng để tách dòng thiết kế vector baculovirus trung gian mang hộp gen HA dùng để kiểm tra có mặt gen HA virus tái tổ hợp có trình tự tương ứng sau: HApBac-F: ’- ACG GGA TCC GGT CAT GGA GAA A A T A G T GCT TC - ’ HApBac-R: 5’ - TCG GAA GCT TGA TTG CCA GAG CTA G G G - ’ 41 Đào Thị Như Hoa Luận văn thạc s ĩ sinh học Các mẫu DNA từ baculovirus tái tổ hợp tách chiết kit tinh R DNA Wizard plus s v minipreps (Promega), sau sử dụng làm khn đê kiểm tra có mặt gen H5 Sản phẩm PCR (gen HA) kiểm tra điện di gel agarose 1% M m HA Hình 3.7: Kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại gen HA M: DNA marker, 1-4: sản phẩm PCR gen HA Kết điện di cho thấy có m ột băng DNA với kích thước khoảng 1,6 kb, tương đương với kích thước hộp gen HA (Hình 3.7) theo lý thuyết thiết kế 1664 bp Kết chứng tỏ tạo thành công hai baculovirus tái tổ hợp m ang gen HA virus cúm A /H 5N 42 Luận • văn thạc • sĩsin li học é Đào Thị N hư Hoa KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ KÉT LUẬN Đã thiết kế hộp gen HA virus cúm A/H5N1 mang thành phần thiết yếu cho việc biểu gen tế bào trùng SÍ9 Đã thiết kế thành cơng vector tách dịng mang hộp gen HA virus cúm A/H5N1 Đã thiết kế thành công vector trung gian baculovirus mang hộp gen HA virus cúm A/H5N1 Đã nghiên cứu nhân dòng bảo quản tế bào côn trùng Sf9 Đã tạo baculovirus tái tổ hợp mang hộp gen HA virus cúm A/H5N1 KIÉN NGHỊ Được tiếp tục nghiên cứu tiến tới tạo chủng sản xuất vaccine cúm A /H 5N hệ công nghệ VLP 43 Luận •_ văn thạc • s ĩ sinh học • Đào Thi Như Hoa TÀI LIỆU THAM KHAO Tài liêu tham khảo tiếng Việt: [1] Hồ Huỳnh Thùy Dương (1997), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục, Hà Nội [2] Lê Thanh Hòa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, Phạm Việt Cường, Nguyễn Thị Bích Nga, Lê Trần Bình (2008), Vấn đề dịch tễ học, tiến hóa, hình thành genotype tương đồng kháng nguyên - miễn dịch - vaccine Tạp chí công nghệ sinh học 6(4).tr 529 - 560 [3] Lê Thanh Hịa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nơng Văn Hải, Trương Nam Hải, Lê Trần Bình (2004), Virus cúm A gia cầm mối quan hệ lây nhiễm động vật sang người Tạp chí cơng nghệ sinh học, 2(1): 1-5 [4] Văn Thị Như Ngọc, Đỗ Thị Huyền, Nguyễn Thanh Nhàn, Nguyễn Phước Hải, Trương Văn Dung, Trương Nam Hải (2007), Biểu gen HA5-1 mã hóa tiểu phần kháng nguyên Hemagglutinin (HA) virus cúm A/H5N1 Escherichia coli Tạp chí cơng nghệ sinh học, 5(3): 313-320 [5] Tô Long Thành (2004), Bệnh cúm gia cầm ngicời vấn đề phịng chống Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, tập XI, sổ 3, trang 76-83 [6] Phạm Văn Ty (2005), Virus học N hà xuất Giáo dục, Hà Nội Tài liệu tham khảo tiếng Anh; [7] A nonym ous (2006), Pandemics and pandemic threats since 1900 Departm ent o f Health and Human Services (w w w pandem icflu.gov) [8], A nonym ous (2007), Cum ulative num ber o f confirm ed hum an cases o f avian influenza A/(H5N1) reported to WHO World Health Organization (WWW.■ w ho.inư en/) [9], Bachm ann M.F., Rohrer Ư.H., Kündig T.M , Bürki K., Hengartner H., Zinkem agel R.M (1993), The influence o f antigen organization on B cell responsiveness Science 262: 1448-1451 44 Dao Tlti N hu Hoa Luän vän thgc s i sinh hoc 110] Bachmann M.F., Zinkemagel R.M (1997), Neutralizing antiviral B cell response Annu Rev Immunol 15: 235-270 [11] Bosio C.M., M oore B.D., W arfield K.L., Ruthel G., M ohamadzadeh M., Aman M.J., Bavari S (2004), Ebola and M arburge virus-like particles activate human myeloid dendritic cells Virology 326: 280-287 [12] Brunswick M., Finkelman F.D., Highet P.F., Inman J.K., Dintzis H.M., M ond J.J (1988), Picogram quantities-Ig antibodies coupled to dextran induce B cell proliferation J Immunol 140: 3364-3372 [13] Buck C.B., Pastrana D.V., Lowy D.R., Schiller J.T (2004), Efficient intracellular assembly o f Papillomaviral vector J Virol 78: 751-757 [14] Bublot M., Le Gros F.X., Nieddu D., Pritchard N., M ickle T.R., Swayne D.E (2007), Efficacy o f two H5N9-inactivated vaccines against challenge with a recent H5N1 highly pathogenic avian influenza isolate from a chicken in Thailand Avian Dis 51: 332-337 [15] Chackerian B., Lenz P., Lowy D.R., Schiller J.T (2006), Virus and virus-like particle-based immunogens for A lzheim er’s disease induce antibody response against am yloid-p without concomitant T cell responses Vaccine 24: 6321-6331 [16] Chang M.H (1997), Univeral hepatitis B vaccination in Taiwan and the incidence o f hepatocellular carcinom a in children Taiwan Childhood H epatom a Study Group N Engl J M ed 336: 1855-1859 [17] Craw ford A.M., M iller L.K (1998), Characterization o f an early gene accelerating expression o f late genes o f the baculovirus Autographa carlifornia nuclear polyherosis virus J Virology 62: 2773-2781 [18] Fehr T (2003), T cell -independent type I antibody response against B cell epitopes expressed repetitively on recom binant virus particles Proc Natl Acad S c iV S A 95:9477-9481 [19] Fifis T., Gamvrellis A., Crimeen-Irwin B., Pietersz G.A., Li J., M ottram P.L., M cKenzie I.F., Plebanski M (2004), Size-dependent immunogenicity: 45 Luän vän thac s i sinh hoc Dao Thi N hu Hoa therapeutic and protective properties o f nano-vaccines against tumors J Immunol 173: 3148-3154 [20] Harper D.M., Franco E.L., W heeler C.M., M oscicki A.B., Romanowski B., Roteli-M artins C.M., Jenkins D., Schuind A., Costa Clemens S.A., Dubin G (2006), Sustained efficacy up to 4.5 years o f a bivalent LI virus-like particle vaccine against human Papillomavirus types 16 and 18: follow-up from a random ized control trial Lancet 367: 1247-1255 [21] Harro C.D., Pang Y.Y., Roden R.B., Hildesheim A., W ang Z., Reynolds M.J., M ast T.C., Robinson R., M urphy B.R., Karron R.A., Dillner J., Schiller J.T., Lowy D.R (2001), Safety and immunogenicity trial in adult volunteers o f a hum an Papillomavirus 16 L I virus-like particle vaccine J Natl Cancer Inst 93:284-292 [22], Hofmann K.J., Cook J.C., Joyce J.G., Brown D.R., Schultz L.D., George H.A., Rosolowsky M., Fife K.H., Jansen K.U (1995), Sequence determ ination o f human Papillom avirus 6a and assembly o f virus-like particles in sacharomyces cerevisiae Virology 209: 506-518 [23] Holm an D.H., Wang D., Raja L.M , M oore K.M., W onraratanadh J., Mytle N., Don J.Y (2008), M ulti-antigen vaccines based on com plex adenovirus vectors induce protective immune responses against H5N1 avian influenza viruses Vaccine 26: 2627-2639 [24] http://w w w.w ho.int/influenza/human_anim al_interface/EN_GIP_20121217Cum ulativeNum berH5N 1cases.pdf [25] Jegerlehner A., Stomi T., Lipowsky G., Schmid M., Pumpens P., Bachmann M.F (2002), Regulation o f IgG antibody responses by epitope density and CD 21-m ediated costimulation Eur J Immunol 32: 3305-3314 [26], K ong Q., Richter L., Yang Y.F., A m tzen C.J., M ason H.S., Thanavala Y (2001), Oral immunization w ith hepatitis B surface antigen expressed in transgenic plants PNAS 98: 11539-11544 46 Dao Thi Nhir Hoa Luän vän thgc sisinh hoc [21] Kratz P.A., Böttcher B., Nassal M (1999), Native display o f complete foreign protein domains on the surface o f hepatitis B virus capsids Proc Natl Acad Sei USA 96: 1915-1920 [28], Lenz P., Day P.M., Pang Y.Y., Frye S.A., Jensen P.N., Lowy D.R., Schiller J.T (2001), Papillomavirus-like particles induce acute activation o f dendritic cells JIm m unol 166:5346-55 [29] Li Q., Cao C., Chackerian B., Schiller J., Gordon M., Ugen K.E., M organ D (2004), Overcom ing antigen masking o f anti-amyloidbeta antibodies reveals breaking o f B cell tolerance by virus-like particles in am yloidbeta immunized amyloid precursor protein transgenic mice BMC Neurosci :2 [30], M ao C., Koutsky L.A., Ault K.A., W heeler C.M., Brown D.R., Wiley D.J., Alvarez F.B., Bautista O.M., Jansen K.U., Barr E (2006), Efficacy o f human papillom avirus-16 vaccine to prevent cervical intraepithelial neoplasia: a randomized controlled trial Obstet Gynecol 107: 18-27 [31] M ason H.S., Ball J.M., Shi J.J., Jiang X., Estes M.K., A m tzen C.J (1996), Expression o f Norwalk virus capsid protein in transgenic tobacco and potato and its oral immunogenicity in mice Proc Natl Acad Sei USA 93: 5335— 5340 [32] M aurer P., Jennings G.T., W illers J., Rohner F., Lindman Y., Roubicek K., Renner W A., Miiller P., Bachmann M F (2005), A therapeutic vaccine for nicotine dependence: preclinical efficacy, and Phase I safety and immunogenicity Eur J Immunol 35: 2031-2040 [33] M ilich D.R (1997) Role o f B cells in antigen preparation o f the hepatitis B core Proc Natl Acad Sei USA 94: 14648-14653 [34] M oron G., Dadaglio G., Leclerc C (2004), New tools for antigen delivery to the MHC class I pathway Trends Immunol 25: 92-97 [35], N ardelli-H aefliger D., Roden R.B., Benyacoub J., Sahli R., Kraehenbuhl J.P., Schiller J.T., Papillom avirus Lachat type P., 16 Potts A., virus-like 47 De Grandi particles P expressed (1997), in Human attenuated Luän • vän thac • s i sinh hoc • Dao Thi N hu Hoa Salmonella typhimurium elecit mucosal and systemic neutralizing antibodies in mice Infect Immun 65: 3328-3336 [36] Neirynck S., Deroo T., Saelens X., Vanlandschoot P., Jou W.M., Fiers W (1999), A universal influenza A vaccine based on the extracellular domain o f the M2 protein Nat M ed 5: 1157-1163 [37] Pattenden L.K., M iddelberg A.P.J., N iebert M., Lipin D.I (2005), Toward the Preparative and Large Scale Precision M anufacture o f Virus-Like Particles Trends Biotechnol 23: 523-529 [38] Peabody D.S (2003), A viral platform for chemical modification and m ultivalent display J Nanobiotechnology 1: [39] Peiris J.S.M , de Jong M.D., Yi G (2007), Avian Influenza Virus (H5N1): a Threat to Human Health Clin Microbiol Rev 20(2): 243-267 [40] Pushko P., Tumpey T.M., Bu F., Knell J., Robinson R., Smith G (2005), Influenza virus-like particles comprised o f the HA, NA, and M proteins o f H9N2 influenza virus induce protective immune responses in BALB/c mice Vaccine , 23(50): 5751-5759 [41] Raja K.S., Wang Q., Gonzalez M J., M anchester M., Johnson J.E., Finn M.G (2003), Hybrid virus-polym er materials Synthesis and properties o f PEGdecorated cowpea mosaic virus Biomacromolecules 4: 472-476 [42] Rock K.L (1996), MHC class I molecules m onitor the outside world Immunol Today 17: 131-137 [43] Rohn T.A., Jennings G.T., H ernandez M., Grest P., Beck M., Zou Y., K opf M., Bachmann M.F (2006), Vaccination against IL-17 suppresses autoim m une arthritis and encephalomyelitis Eur JIm m ul [44] R udolf M.P., Fausch S.C., Da Silva D.M., Kast W.M (2001), Human dendritic cells are activated by chim eric human papillomavirus type-16 virus­ like particles and induce epipote-specific human T cell response in vitro J Immunol 166: 5917-5924 48 Luän van thac s i sinh hoc [45] Dao Thi Nhir Hoa Schodel F., W irtz R., Peterson D., Hughes J., W arren R., Sadoff J., Milich D (1994), Immunity to malaria elicited by hybrid hepatitis B virus core particles carrying circumsporozoite protein epitopes J Exp Med 180: 10371046 [46] Subbarao K., Klimov A., Katz J., Regnery H., Lim W., Hall H., Perdue M., Swayne D., Bender C., Huang J., Hemphill M., Rowe T., Shaw M., Xu X., Fukuda K., Cox N (1998), Characterization o f an avian influenza A (H5N1) virus isolated from a child with a fatal respiratory illness Science 279: 393396 [47] Tacket C.O., M ason H.S., Losonsky G., Clements J.D., Levine M.M., A m tzen C.J (1998), Imm unogenicity in hum ans o f a recombinant bacterial antigen delivered in a transgenic potato Nat Med 4: 607-609 [48] Taubenberger J.K., Reid A.H., Krafft A.E., Bijwaard K.E., Fanning T.G (1997), Initial gentic characterization o f the 1918 “ Spanish” influenza virus Science 275:1793-1796 [49] Thyagarajan R., Arunkumar N., Song W (2003), Polyvalent antigens stabilize B cell antigen receptor surface signaling microdomains J Immunol 170: 6099-6106 [50] Tsunetsugu-Y okota Y., M orikawa Y., Isogai M., Kawana-Tachikawa A., Odawara T., N akam ura T., Grassi F., Autran B., Iwamoto A (2003), Yeastderived hum an immunodeficiency virus type p55(gag) virus-like particles activated dendrictic cells (DCs) and induce perforin expression in Gagspecific CD8(+) T cells by crosspresentation o f DCs J Virol 77: 1025010259 [51] Vialrd J., Lalumiere M., V em et T., Briedis D., Alkhatib G., Henning D., Levin D., Richardson C (1990), Synthesis o f the membrane fusion and hem agglutinin proteins o f m easles virus, using a novel baculovirus vector containing the fl-galactosidase gene Journal o f Virology 64,37-50 49 Luän s i sinh hoc • van thac • > [52] Dao T hiN huH oa • W ang Q., Lin T., Johnson J.E., Finn M.G (2002), Natural supramolecular building blocks Cysteine-added mutants o f cowpea mosaic virus Chem Biol 9: 813-819 [53] W arzecha H., M ason H.S., Lane C., Tryggvesson A., Rybicki E., Williamson A.L., Clements J.D., Rose R.C (2003), Oral immunogenicity o f human papillom avirus-like particles expressed in potato J Virol 77: 8702-8711 [54] W entao G., Adam C.S., et al (2006), Protection o f M ice and Poultry from Lethal H5N1 Avian Influenza Virus through Adenovirus-Based Immunization J Virol 80(4): 1959-1964 [55] Zhang L.F., Zhou J., Chen S., Cai L.L., Bao Q.Y., Zheng F.Y., Lu J.Q., Padm anabha J., Hengst K., M alcolm K., Frazer I.H (2000), HPV6b virus like particles are potent immunogens without adjuvant in man Vaccine 18: 1051-1058 50 Đào Thị Như Hoa Luận thạc ĩ sinh học • văn _ • _s _ * PHỤ LỤC Phụ lục 1: Trình tự nucleotide gen mã hóa protein HA virus cúm A/H5N1 tách dòng a t g g a g a a a a t a g t g c t t c t t c t t g c a a t a g t c a g t c t t g t t a a a a Gt g a t c a g a t t t g c a t t g g t t a c c ATGCAAACAACTCGACAGAGCAGGTTGACACAATAATGGAAAAGAACGTTACTGTTACACATGCCCAAGA CATACTGGAAAAGACACACAACGGGAAGCTCTGCGCTCTAGATGGAGTGAAGCCTCTAATTTTGAGAGAT TGTAGTGTAGCTGGATGGCTCCTCGGAAACCCAATGTGTGACGAATTCATCAATGTGCCGGAATGGTCTT ACATAGTGGAGAAGGCCAATCCAGTCAATGACCTCTGTTACCCAGGGGATTTCAATGACTATGAAGAATT GAAACACCTATTGAGCAGAATAAACCATTTTGAGAAAATTCAGATCATCCCCAAAAGTTCTTGGTCCAGT CATGAAGCCTCATTAGGGGTGAGCTCAGCATGTCCATACCAGGGAAAGTCCTCCTTTTTCAGAAATGTGG TATGGCTTATCAAAAAGAACAGTACATACCCAACAATAAAGAGGAGCTACAATAATACCAACCAAGAAGA TCTTTTGGTACTGTGGGGGATTCACCATCCTAATGATGCGGCAGAGCAGATAAAGCTCTATCAAAACCCA ACCACCTATATTTCCGTTGGGACATCAACACTAAACCAGAGATTGGTACCAAGAATAGCTACTAGATCCA AAGTAAACGGGCAAAGTGGAAGGATGGAGTTCTTCTGGACAATTTTAAAACCGAATGATGCAATCAACTT CGAGAGTAATGGAAATTTCATTGCTCCGGAATATGCATACAAACTTGTCAAGAAAGGGGACTCAACAATT ATGAAAAGTGAATTGGAATATGGCAACTGCAACACCAAGTGTCAAACTCCAATGGGGGCGATAAACTCTA GTATGCCATTCCACAATATACACCCTCTCACCATCGGGGAATGCCCCAAATATGTGAAATCAAACAGATT AGTCCTTGCGACTGGGCTCAGAAATAGCCCTCAAAGAGAGAGAAGAAGAAAAAAGAGAGGATTATTTGGA GCTATAGCAGGGTTTATAGAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTAGATGGTTGGTATGGGTACCACCATAGCA ATGAGCAGGGGAGTGGGTACGCTGCAGACAAAGAATCCACTCAAAAGGCAATAGATGGAGTCACCAATAA GGTCAACTCGATCATTGACAAAATGAACACTCAGTTTGAGGCCGTTGGAAGGGAATTTAACAACTTAGAA AGGAGAATAGAGAATTTAAACAAGAAGATGGAAGACGGGTTCCTAGATGTCTGGACTTATAATGCTGAAC TTCTGGTTCTCATGGAAAATGAGAGAACTCTAGACTTTCATGACTCAAATGTCAAGAACCTTTACGACAA GGTCCGACTACAGCTTAGGGATAATGCAAAGGAGCTGGGTAACGGTTGTTTCGAGTTCTATCATAAATGT GATAATGAATGTATGGAAAGTGTAAGAAGCGGAACGTATGACTACCCGCAGTATTCAGAAGAAGCAAGAC TAAAAAGAGAGGAAATAAGTGGAGTAAAATTGGAATCAATAGGAATTTACCAAATACTGTCAATTTATTC TACAGTGGCGAGTTCCCTAGCTCTGGCAATCATGGTAGCTGGTCTATCCTTATGGATGTGCTCCAATGGG TCGTTACAATGCAGAATTTGCATT Phụ lục 2: Trình tự acid amine protein HA dịch mã từ gen HA M EK IV LLL A IV SL V K SD Q IC IG Y H A N N ST E Q V D TIM E K N V T V T H A Q D ILE K TH N G K LC A LD G V K PL ILR D C SV A G W L L G N P M C D E F IN V PE W SY IV E K A N PV N D L C Y PG D FN D Y E E LK H L L SR IN H FE K IQ IIPK SSW SSH EA SL G V SSA C PY Q G K SSFFR N V V W L IK K N ST Y PT IK R SY N N T N Q E D L L V L W G IH H PN D A A E Q IK L Y Q N PTT Y ISV G T S TLN Q R L V PR IA TR SK V N G Q SG R M EFFW TILK PN D A IN FESN G N FIA PEY A Y K LV K K G D STIM K SELEY G N C N T K C Q TPM G A IN SSM PFH N IH PLTIG EC PK Y V K SN R LV LA TG LRN SPQ R ER RR K K R G LFG A IA G FIEG G W Q G M V D GW YGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKM EDGFLDVW TYNAELLVLM ENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECM ESVRSGTYDYPQYSEE A R L K R E E IS G V K L E S IG IY Q I L S IY STV A SSLA LA IM V A G LSLW M C SN G SLQ C RICI 51 ... M13 Forward {-20) Prirrer AGT G^G TCG TA T TA c AAT TCA CTG GCC GTC GTT TTA c A A C G T CGT QAC TGG GAA AAC T C A CTC AGC ATA A ljG T T A Aß T Ig».C CGG CAG CAA m l g It T G C A GCA c t g ACC CTT... hộp gen HA virus cúm A/ H5N1 mang thành phần thiết yếu cho việc biểu gen tế bào trùng SÍ9 Đã thiết kế thành cơng vector tách dịng mang hộp gen HA virus cúm A/ H5N1 Đã thiết kế thành công vector. .. GAA ACA GCT A A d c A~ G ATT ACG CCA AGC T G GTA d G T A C TAA TGC GGT TCG AAC C AT GTC CTT TGT C 3A TAC I J '' - CCG AGC TCG GAT G X CG AGC CTA BSÍX Ị EcoR i Spe I 1I CCA CTA Q3T GAT EcoR I I G IA