ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ĐỖ VĂN TÙNG Tên đề tài: TỐI ƢU HÓA CÁC ĐIỀU KIỆN TẠO VỎ VI KHUẨN RỖNG (Bacterial ghost) SỬ DỤNG TÁC NHÂN HÓA HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Lớp :K 44 - CNSH Khoa : CNSH-CNTP Khóa học : 2012-2016 Thái Nguyên, năm 2016 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ĐỖ VĂN TÙNG Tên đề tài: TỐI ƢU HÓA CÁC ĐIỀU KIỆN TẠO VỎ VI KHUẨN RỖNG (Bacterial ghost) SỬ DỤNG TÁC NHÂN HÓA HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH-CNTP Khóa học : 2012-2016 Giảng viên hƣớng dẫn : PGS.TS Đồng Văn Quyền Viện Công nghệ Sinh học -Viện Hàn lâm Khoa học công nghệ Việt Nam 2.ThS Bùi Đình Lãm Khoa CNSH-CNTP, Trƣờng ĐH Nông Lâm Thái Nguyên Thái Nguyên, năm 2016 i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực nghiên cứu phòng thí nghiệm Vi sinh Phân tử, Viện Công Nghệ Sinh Học-Viện Hàn Lâm Khoa Học Công Nghệ Việt Nam, nỗ lực nhóm, em nhận đƣợc giúp đỡ nhiệt tình từ quý Thầy Cô Viện Công Nghệ Sinh Học-Viện Hàn Lâm Khoa Học Công Nghệ Việt Nam Để hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp này, em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Đồng Văn Quyền Phó viện trƣởng Viện Công Nghệ Sinh Học, Trƣởng phòng Vi sinh vật Phân tử tạo điều kiện cho em có đƣợc môi trƣờng tốt để phát huy khả thân suốt trình nghiên cứu, học tập trao đổi kiến thức phòng, giúp đỡ em tận tình để hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Minh Hƣờng anh chị làm việc nghiên cứu phòng Vi sinh vật Phân tử tận tình truyền đạt kiến thức, kĩ thao tác suốt trình nghiên cứu phòng Để từ em có tảng kiến thức kĩ thao tác hoàn thiện, vững giúp em hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn ThS Bùi Đình Lãm hƣớng dẫn tạo điều kiện tốt cho em hoàn thành đề tài Qua đây, em xin gửi lời cảm ơn đến Cha Mẹ, Anh Chị Em gia đình họ hàng, bạn bè động viên giúp cho em có tinh thần để hoàn thành tốt qua trình nghiên cứu vừa qua, Xin Chân Thành Cảm Ơn! Thái Nguyên, ngày 20 tháng năm 2016 SINH VIÊN THỰC HIỆN Đỗ Văn Tùng ii DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1: Các tác nhân hóa học sử dụng đề tài 27 Bảng 2: Các công thức thí nghiệm nghiên cứu tối ƣu quy trình tạo vỏ rỗng 32 Bảng 3: Ảnh hƣởng nồng độ tế bào đƣợc pha loãng sử dụng thí nghiệm đến kết quy trình tạo vỏ rỗng tế bào vi khuẩn 33 Bảng 4: Hình ảnh tế bào vỏ rỗng vi khuẩn tạo dƣới điều kiện nhiệt độ khác soi dƣới kinh hiển vi quang học độ phóng đại 100X 35 Bảng 5: Ảnh hƣởng thời gian ủ tới bất hoạt vỏ tế bào vi khuẩn rỗng 37 Bảng 6: Ảnh hƣởng nồng độ tác nhân NaOH đến hình thái 38 iii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1: Hình thái loại vi khuẩn [3] Hình 2: Cấu tạo tế bào vi khuẩn [3] Hình 3: Vi khuẩn Salmonella 12 Hình 4: Quá trình phân giải tế bào vi khuẩn tạo vỏ tế bào rỗng 20 Hình 5: Kết kính hiển vi điện tử quét cho thấy cấu trúc vỏ tế bào vi khuẩn rỗng tạo phƣơng pháp “Sponge-like” 23 Hình 6: Hình ảnh tế bào vỏ rỗng vi khuẩn biểu đồ thể trình gây đáp ứng miễn dịch vỏ tế bào rỗng vi khuẩn theo cách tác động khác Vinod cs năm 2014 24 Hình 7: Ảnh hiển vi quang học 36 iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VSV : Vi sinh vật DNA : Deoxyribonucleic acid RNA : Ribonucleic acid Cs : Cộng PBS : Dung dịch đệm SDS : Sodium dodecyl sulfate LPS : Lipopolysaccharide BGs : Bacterial ghost đvC : Đơn vị cacbon v MỤC LỤC PHẦN 1: MỞ ĐẦU .1 1.1 Đặt vấn đề .1 1.2 Mục tiêu yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục tiêu đề tài .2 1.2.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Ý nghĩa đề tài PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung vi khuẩn 2.1.1 Đặc điểm hình thái cấu tạo 2.1.1.1 Hình thái vi khuẩn .4 2.1.1.2 Cấu tạo tế bào vi khuẩn .7 2.1.2 Phân loại vi khuẩn 10 2.2 Giới thiệu chung chi Salmonella 11 2.2.1 Nguồn gốc vi khuẩn Salmonella .11 2.2.2 Đặc điểm hình thái phân loại 12 2.2.2.1 Hình thái cấu trúc vi khuẩn Salmonella .12 2.2.2.2 Phân loại vi khuẩn Salmonella 14 2.3 Khả chế gây bệnh 16 2.4 Tình trạng kháng kháng sinh chủng Salmonella gây bệnh .18 2.5 Giới thiệu vỏ vi khuẩn rỗng (bacterial ghost) 19 2.6 Vai trò vi khuẩn rỗng 21 2.6.1 Giá trị y học 21 2.6.2 Giá trị kinh tế 22 2.7 Tình hình nghiên cứu nƣớc giới 22 2.7.1 Tình hình nghiên cứu giới .22 2.7.2 Tình hình nghiên cứu nƣớc .25 PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 3.1 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu 26 vi 3.1.1 Đối tƣớng nghiên cứu 26 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 26 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành nghiên cứu 26 3.3 Thiết bị, dụng cụ hóa chất 26 3.4 Nội dung nghiên cứu .27 3.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 27 3.5.1 chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn .27 3.5.2 Phƣơng pháp nghiên cứu .27 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 4.1 Kết .31 4.1.1 Xác định nồng độ tế bào thích hợp quy trình tạo vỏ rỗng tế bào vi khuẩn 32 4.1.2 Xác định ảnh hƣởng nhiệt độ thời gian ủ đến quy trình tạo vỏ tế bào vi khuẩn rỗng 35 4.1.3 Đánh giá ảnh hƣởng nồng độ tác nhân NaOH đến hình thái hiệu suất tạo vỏ rỗng tế bào vi khuẩn 37 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 5.1 Kết luận 40 5.2 Kiến nghị .40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 I.Tài liệu tiếng việt .41 II Tài liệu tiếng anh .41 III Tài liệu internet 44 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ở Việt Nam thời kì phát triển kinh tế, hoạt động kinh tế sản xuất làm thay đổi môi trƣờng cách nhanh chóng, với điều kiện khí hậu nóng ẩm nhiệt đới Điều dẫn đến xuất nhiều loài vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm gây thiệt hại kinh tế nhƣ sức khỏe ngƣời nhƣ : vi khuẩn tả lợn (Vibrio cholera), vi khuẩn gây bệnh viêm phổi lợn, vi khuẩn gây bệnh đƣờng tiêu hóa(Salmonella, E coli)… Trong đó, việc sử dụng lạm dụng chất kháng sinh dẫn đến tình trạng gia tăng chủng kháng thuốc quần thể Các nghiên cứu gần cho thấy tỷ lệ cao chủng E coli Salmonella đa kháng đƣợc phát nguồn thức ăn Việt Nam [13] [21] [19] Đây nguyên nhân dẫn đến việc bùng phát dịch bệnh ngộ độc thức phẩm năm nƣớc ta Trƣớc tình hình trên, nhu cầu sử dụng vaccine nƣớc ta lớn Tuy nhiên, số lƣợng vaccine đƣợc sản xuất nƣớc ta hạn chế Vaccine sản xuất Việt Nam chủ yếu vaccine vi sinh vật bất hoạt Tuy nhiên số lƣợng sản xuất không đủ để đáp ứng dịch bệnh bùng phát Các nghiên cứu cần đƣợc thực để tìm phƣơng pháp chế tạo vaccine với thời gian sản xuất ngắn độ an toàn cao, nhằm giải tình trạng dịch bệnh nƣớc ta Vỏ tế bào vi khuẩn rỗng bƣớc tiến khoa học, nhƣ y học động vật Vỏ tế bào khuẩn rỗng đƣợc dùng để chế tạo loại vaccine với nhiều ƣu điểm hơn, việc tạo vỏ vi khuẩn rỗng đóng gói tƣơng đối đơn giản [26] Đặc biệt loại vaccine đƣợc chế tạo từ vỏ vi khuẩn rỗng không cần bảo quản kho lạnh nên giảm đƣợc chi phí vận chuyển sử dụng, chúng tiến hành đông cô bảo quản nhiệt độ bình thƣờng [11] Giúp tiết kiệm chi phí thời gian cho ngƣời sử dụng Cách thức tạo vi khuẩn rỗng chủ yếu sử dụng kĩ thuật chuyển gen kĩ thuật di truyền Phƣơng pháp hiệu nhƣng chứa nhiều nguy tạo chủng siêu vi khuẩn hay loại vi khuẩn khó kiểm soát Do đó, dƣới phát triển khoa học kĩ thuật nhƣ kinh nghiệm từ nghiên cứu số tác giả, nghiên cứu phƣơng pháp hóa học để sản xuất vỏ tế bào vi khuẩn rỗng Nguyên lý phƣơng pháp dựa khả phá vỡ thành tế bào vi khuẩn số chất hóa học nồng độ xác định Năm 2003, Amara cs thành công sản xuất vỏ tế bào vi khuẩn rỗng từ vi khuẩn E coli pha cân [6] qua ta “Tối ƣu hóa điều kiện để tạo vỏ vi khuẩn rỗng (Bacterial ghost) sử dụng tác nhân hóa học” phƣơng pháp hƣớng phát triển đắn tránh đƣợc nguy rủi ro Việc hoàn thiện quy trình nắm bắt đƣợc phƣơng pháp tái tạo này, mở bƣớc tiến lớn sinh học nhƣ y học động vật, y học ngƣời 1.2 Mục tiêu yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục tiêu đề tài Lựa chọn tác nhân hóa học cho hiệu suất tạo vỏ tế bào vi khuẩn rỗng cao tối ƣu hóa quy trình tạo vỏ tế bào vi khuẩn rỗng Đối tƣợng vi khuẩn đƣợc lựa chọn đề tài chủng Salmonella spp thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, nhóm vi khuẩn gây bệnh chủ yếu nƣớc ta 1.2.2 Yêu cầu đề tài - Tìm nồng độ vi khuẩn cho số lƣợng vỏ tốt nhiều - Độ sống sót vi khuẩn rỗng sau trình tạo thành bị bất hoạt 100% - Hình thái vỏ rỗng không bị vỡ nát, nguyên vẹn có độ rỗng cao 30 c) Kiểm tra khả sống sót tế bào: 30 µl tế bào sau xử lý đƣợc rải đĩa thạch NA chuẩn bị sẵn nuôi 37oC Kiểm tra số lƣợng khuẩn lạc mọc đĩa sau 24h nuôi cấy d) Đánh giá chất lượng vỏ tế bào kính hiển vi quang học: Mẫu tế bào sau xử lý mẫu đối chứng đƣợc nhuộm theo phƣơng pháp nhuộm Gram Quan sát hình thái tế bào sau nhuộm dƣới kính hiển vi quang học sử dụng vật kính dầu Nhuộm Gram để quan sát hình thái vỏ vi khuẩn rỗng đƣợc tạo ra: Cặn tế bào cuối quy trình sau đƣợc hòa vào 1ml đệm PBS đƣợc dùng để nhuộm Gram theo bƣớc sau: B1) Lấy dịch vi khuẩn QT (quy trình) bôi lên phiến kính để khô tự nhiên Sau cố định vi khuẩn cách hơ nóng lửa đèn cồn khoảng cách xa B2) Nhỏ vài giọt Crytal violet lên vết bôi để nhuộm, để yên phút, sau rửa nhanh nƣớc B3) Nhỏ vài giọt lugol lên vết nhuộm, để yên phút, sau rửa nhanh nƣớc B4) Tẩy màu vết nhuộm cách nghiêng phiến kính nhỏ từ từ ancohol lên vết bôi thấy màu tím ngừng ngay, sau rửa nƣớc B5) Nhỏ vài giọt safranine lên, để yên phút, sau rửa nƣớc Để khô tự nhiên, lắp lamen nhỏ giọt dầu soi lên soi dƣới kính hiển vi quang học 31 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết Trong thời gian thực tập phòng vi sinh phân tử, viện công nghệ sinh học từ 12/2015 đến 6/2016 dựa đề tài tạo vỏ rỗng vi khuẩn tác nhân hóa học tiến sĩ Nguyễn Minh Hƣờng phòng Vi sinh vật Phân tử - Viện Công nghệ Sinh học làm chủ đề tài, tiến hành tối ƣu hóa điều kiện tái tạo vỏ rỗng vi khuẩn từ vi khuẩn Salmonella enteritidis tác nhân hóa học Ở làm rõ nồng độ vi khuẩn để tiến hành tạo vỏ ban đầu nhƣ thích hợp tập chung vào tác nhân H2O2 , NaOH SDS để kết hợp sử dụng quy trình tạo vỏ vi khuẩn rỗng tác nhân hóa học Các tác nhân có tác động khác đến vi khuẩn, tác động làm lỏng cấu trúc thành tế bào vi khuẩn tạo lỗ hổng thành tế bào NaOH đƣợc nghiên cứu sử dụng rỗng rãi quy trình tách chiết tinh DNA plasmid từ vi khuẩn gram âm vi khuẩn gram dƣơng [22] SDS chất hoạt động bề mặt thƣờng đƣợc sử dụng phổ biến nhƣ tác nhân hòa tan cấu trúc phospholipid kép màng tế bào nhƣ lớp vỏ lipopolysaccharide vi khuẩn [9] NaOH kết hợp với SDS đƣợc sử dụng rỗng rãi nhƣ hỗn hợp để phân biệt nhanh vi khuẩn gram âm gram dƣơng dựa vào khác thành phần thành tế bào loại vi khuẩn H2O2 đƣợc sử dụng nhƣ chất sát trùng Tƣơng tác H2O2 với cấu trúc thành tế bào đƣợc nghiên cứu [23], H2O2 đƣợc sử dụng cung cấp gốc oxy hóa tự công thành phần cấu trúc thành vỏ tế bào vi khuẩn, làm lỏng lẻo cấu trúc vỏ tế bào, suy yếu thành tế bào vi khuẩn tạo điều kiện công cho tác nhân enzyme Việc sử dụng kết hợp tác nhân NaOH, SDS H2O2 nồng độ thấp có khả làm lỏng cấu trúc vỏ, thành màng tế bào vi khuẩn, kết hợp với dung dịch đẳng trƣơng nhƣợc trƣơng, với lực ly tâm kéo thành phần tế bào chất khỏi tế bào vi khuẩn đồng 32 thời giữ đƣợc toàn vẹn tƣơng đối vỏ thành tế bào Ethanol 60% có vai trò việc đảm bảo 100% vỏ tế bào bất hoạt Các công thức thí nghiệm đề tài đƣợc tổng hợp bảng 4.1 dƣới đây: Bảng 2: Các công thức thí nghiệm nghiên cứu tối ƣu quy trình tạo vỏ rỗng tế bào vi khuẩn sử dụng tác nhân hóa học sử dụng đề tài Phƣơng pháp Chủng vi khuẩn ĐC (đối chứng) S enteritidis ĐT_2 S enteritidis ĐT_3 S enteritidis Tổ hợp tác nhân PBS NaOH, SDS,H2O2, Ethanol NaOH, SDS,H2O2 Nồng độ tác nhân Nhiệt độ Thời gian ủ hóa chất 0% 25oC, 33oC 37oC 60’ 90’ 2X, 3X, 4X 25oC, 33oC 37oC 60’ 90’ 2X, 3X, 4X 25oC, 33oC 37oC 60’ 90’ Thí nghiệm đƣợc tiến hành chủng S enteritidis với nồng độ tế bào vi khuẩn đƣợc pha loãng nồng độ khác nhau, sau xử lí tế bào NaOH, SDS H2O2 phƣơng pháp sử dụng thí nghiệm đƣợc dựa phƣơng pháp sponge-like Amara cộng công bố năm 2013 [22] 4.1.1 Xác định nồng độ tế bào thích hợp quy trình tạo vỏ rỗng tế bào vi khuẩn Chúng tiến hành thí nghiệm với nồng độ tế bào đƣợc pha loãng mức khác Kết cho thấy nồng độ vi khuẩn ảnh hƣởng lớn đến kết thí nghiệm Nồng độ tế bào đƣợc xem kết tốt sau đƣợc trải đĩa thạch petri phải quan sát đƣợc khuẩn lạc rõ ràng nhất, khuẩn lạc phải có hình tròn trơn, màu trắng trong, quan sát kĩ tâm có chấm đen nhỏ đĩa đối chứng, đĩa thí nghiệm xuất khuẩn lạc Trong đề tài tập trung vào ĐT_3, bƣớc xử lí ethanol 60% nhằm đảm bảo 33 độ an toàn cho quy trình tạo vỏ, xong việc xử lí ethanol để bất hoạt dẫn đến số biến đổi thành phần protein thành tế bào Do đó, kiểm tra thực thí nghiệm rút ngắn cách loại bỏ bƣớc xử lí ethanol Kết đƣợc tổng hợp bảng dƣới đây: Bảng 3: Ảnh hƣởng nồng độ tế bào đƣợc pha loãng sử dụng thí nghiệm đến kết quy trình tạo vỏ rỗng tế bào vi khuẩn Nồng độ tế Hình thái khuẩn lạc bào sau mẫu đối chứng pha loãng (OD600) 0,74 0,46 0,141 Tế bào sau quy trình ĐT_3 Tế bào sau quy trình ĐT_2 34 0,071 0,038 0,016 Từ bảng kết chứng minh nồng độ ban đầu tế bào vi khuẩn để tiến hành thí nghiệm quan trọng Do phƣơng pháp tạo vỏ sử dụng tác nhân hóa học nồng độ thấp, nên nồng độ tế bào cao không đảm bảo an toàn cho quy trình tạo vỏ, tế bào không bị bất hoạt 100% Từ thí nghiệm kiểm tra, thấy với nồng độ tế bào vi khuẩn OD600 = 0,016 an toàn với quy trình tạo vỏ, đảm bảo độ bất hoạt 100% mẫu tế bào sau quy trình tạo vỏ Kết cấy trải đĩa thạch cho thấy hình thái khuẩn lạc rõ ràng đĩa đối chứng Từ chọn nồng độ vi khuẩn OD600= 0,016 cho thí nghiệm sau 35 4.1.2 Xác định ảnh hưởng nhiệt độ thời gian ủ đến quy trình tạo vỏ tế bào vi khuẩn rỗng a) Ảnh hƣởng nhiệt độ ủ: Chúng tiến hành kiểm tra thí nghiệm nhiệt độ ủ 25oC, 33oC 37oC Kết mà thu đƣợc cho thấy phạm vi nhiệt thay đổi nhiệt độ không ảnh hƣởng rõ ràng đến kết trình tạo vỏ rỗng tế bào vi khuẩn Trong điều kiện nhiệt độ, tế bào sau xử lí với tác nhân hóa học quy trình tạo vỏ tế bào rỗng vi khuẩn nguyên vẹn, không bị nát, cấu trúc 3D vỏ đƣợc giữ nguyên Kết kiểm tra kính hiển vi đƣợc tổng hợp bảng dƣới đây: Bảng 4: Hình ảnh tế bào vỏ rỗng vi khuẩn tạo dƣới điều kiện nhiệt độ khác soi dƣới kinh hiển vi quang học độ phóng đại 100X Phƣơng pháp Đối chứng (ĐC) ĐT_3 o 25 C Nhiệt độ 33oC 37oC 36 Từ kết bảng lựa chọn điều kiện nhiệt độ 25oC cho thí nghiệm Vì khuẩn khổ thí nghiệm điều kiện 25oC với mức nhiệt độ phòng không gây ảnh hƣởng rõ rệt đến chất lƣợng hình thái vỏ rỗng vi khuẩn B A C Hình 7: Ảnh hiển vi quang học (A)Tế bào Salmonella chứng âm không xử lí; (B)vỏ tế bào S enteritidis sau xử lí theo quy trình ĐT_2; (C)Vỏ tế bào S enteritidis sau xử lí theo quy trình ĐT_3 Kết tế bào sau nhuộm gram kiểm tra dƣới kính hiển vi quang học, quan sát thấy hình thái rõ ràng tế bào sau xử lí theo quy trình ĐT_2 ĐT_3 đƣợc bảo toàn hình thái không gian chiều Trong thí nghiệm tạo vỏ tiếp theo, chọn quy trình ĐT_3 để sử dụng b) Ảnh hƣởng thời gian ủ: Thời gian ủ tế bào có ảnh hƣớng đáng kể đến kết thí nghiệm, thời gian ủ với NaOH yếu tố định đến bất hoạt tế bào vi khuẩn rỗng Trên 80% tế bào vi khuẩn rỗng bị bất hoạt bƣớc này, thí nghiệm thực xử lí bƣớc ủ với NaOH khoảng thời gian 60 phút 90 phút, bƣớc xử lí giữ nguyên 60 phút Kết đƣợc tổng hợp bảng dƣới đây: 37 Bảng 5: Ảnh hƣởng thời gian ủ tới bất hoạt vỏ tế bào vi khuẩn rỗng Thời gian ủ Phƣơng pháp 60 phút 90 phút ĐT_3 Nhƣ từ kết cho thấy, thời gian xử lí NaOH 90 phút cho độ bất hoạt 100%, đảm bảo độ an toàn Độ bất hoạt tuyệt đối quan trọng xét theo định hƣớng ứng dụng vỏ tế bào vi khuẩn rỗng vào y dƣợc trực tiếp nhƣ vaccine chất mang, việc không đảm bảo độ bất hoạt 100% vi khuẩn gây bệnh hạn chế lớn cho hƣớng ứng dụng sau 4.1.3 Đánh giá ảnh hưởng nồng độ tác nhân NaOH đến hình thái hiệu suất tạo vỏ rỗng tế bào vi khuẩn Để kiểm tra đƣợc ảnh hƣởng tác nhân NaOH đến hình thái chất lƣợng vỏ Chúng tiến hành tạo vỏ rỗng vi khuẩn sử dụng nồng độ tác nhân mức 2X, 3X, 4X, tế bào thu đƣợc sau xử lí đƣợc cấy kiểm tra độ sống sót nhuộm gram tiến hành soi dƣới kinh hiển vi quan học Vì thời gian ngắn nên tập chung vào tác nhân NaOH thay đổi nồng độ tác nhân giữ nguyên nồng độ tác nhân lại nồng độ 3X Kết đƣợc tổng hợp bảng dƣới đây: 38 Bảng 6: Ảnh hƣởng nồng độ tác nhân NaOH đến hình thái hiệu suất tạo vỏ rỗng vi khuẩn Nồng độ tác nhân NaOH (g/ml) Tế bào sau xử lí cấy trải đĩa thạch Tế sau xử lí đƣợc nhuộm gram soi dƣới kính hiển vi 2X (0,005 g/ml) 3X (0,0075 g/ml) 4X (0,01 g/ml) Qua bảng cho thấy với nồng độ NaOH 0,005g/ml thấp bất hoạt hoàn toàn tế bào vi khuẩn, nồng độ NaOH mức 0,0075 g/ml 0,01 g/ml cho thấy độ bất hoạt tế bào vi khuẩn 100% Hình ảnh 39 soi dƣới kính hiển vi quang học cho thấy với nồng độ 2X NaOH tế bào vỏ rỗng vi khuẩn có đƣợc tạo thành nhƣng số lƣợng ít, hiệu suất không cao, dịch tế bào không phát rõ thành phần nội chất thoát Kết trải đĩa thạch nồng độ 2X NaOH số lƣợng nhiều tế bào sống, điều không đáp ứng đƣợc độ an toàn cho ứng dụng Mặt khác nồng độ NaOH mức 3X 4X cho thấy kết tốt, tế bào sau xử lí cấy trải đĩa thạch cho thấy độ bất hoạt 100% Hình ảnh tế bào sau xử lí đƣợc soi dƣới kính hiển vi quang học thể vỏ tế bào đƣợc tạo cách nguyên vẹn, không bị vỡ nát Thành phần nội chất thoát bên nhiều rõ nét thể hình ảnh soi, xong kết soi độ rỗng tế bào chƣa hoàn toàn Kết chứng minh hiệu suất tạo vỏ nồng độ NaOH 3X, 4X cao, đảm bào độ an toàn cho ứng dụng vỏ tế bào vi khuẩn tạo đƣợc Với định hƣớng sử dụng trực tiếp vỏ tế bào vi khuẩn rỗng nhƣ vaccine, điều thiết thực với vỏ rỗng vi khuẩn đƣợc tạo theo quy trình ĐT_3 có độ bất hoạt 100% độ rỗng chƣa hoàn toàn Từ định chọn nồng độ tác nhân NaOH 3X thích hợp đƣợc dùng cho thí nghiệm sau Vì với nồng độ hóa chất thấp đảm bảo độ an toàn giảm chi phí 40 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Dựa vào công bố trƣớc phƣơng pháp tạo vỏ tế bào vi khuẩn rỗng sử dụng tác nhân hóa học đặc biệt nghiên cứu TS Nguyễn Minh Hƣờng viện Công nghệ sinh học- viện Hàn Lâm khoa Học Công nghệ Việt Nam, nghiên cứu tiến hành tối ƣu số điều kiện quy trình tạo vỏ rỗng vi khuẩn sử dụng tác nhân hóa học (1) nồng độ tế bào ban đầu, (2) nhiệt độ thời gian ủ, (3) nồng độ tác nhân NaOH ảnh hƣởng đến hình thái hiệu suất tạo vỏ Kết luận, quy trình ĐT_3 với nồng độ tế bào vi khuẩn ban đầu tƣơng đƣơng mức OD600= 0,016 điều kiện nhiệt độ ủ 25oC tốc độ lắc 150 v/p, thời gian ủ 90 phút, nồng độ NaOH 0,0075 g/ml, SDS 0,00375g/ml H2O2 0,00975ml/ml, cho hiệu suất tạo vỏ chất lƣợng vỏ tế bào vi khuẩn tốt Nhƣng độ rỗng vỏ tế bào vi khuẩn chƣa hoàn toàn hạn chế cho ứng dụng nhƣ làm chất mang, chất dẫn thuốc Nhƣng với kết đạt đƣợc tin hƣớng triển vọng y học, y dƣợc động vật, ngƣời 5.2.Kiến nghị - Tiếp tục tối ƣu quy trình tạo vỏ rỗng tế bào vi khuẩn sử dụng tác nhân hóa học, cải thiện độ rỗng hoàn toàn vỏ - Tìm cách tăng nồng độ tế bào bƣớc đầu, nhƣng đảm bảo bất hoạt 100% - Tiếp tục phát triển ứng dụng vỏ tế bào rỗng tạo đƣợc 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO I.Tài liệu tiếng việt Văn Thị Hƣờng (2013), “Nghiên cứu số đặc tính sinh học vi khuẩn Salmonella phân lập đƣợc từ lợn sau cai sữa bị tiêu chảy chế tạo thử nghiệm vacxin phòng bệnh”, Luận văn thạc sỹ, Trƣờng Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Nguyễn Minh Hƣờng (2014-2015), “ Nghiên cứu phƣơng pháp tạo vỏ rỗng vi khuẩn (bacterial ghost) sử dụng tác nhân hóa học”, Đề tài nghiên cứu khoa học mã số CS-1205, viện công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam Nguyễn Xuân Thành, Nguyễn Bá Hiên, Hoàng Hải, Vũ Thị Hoan (2010), Giáo trình vi sinh vật công nghiệp, Nhà xuất Giáo Dục 250tr Lê Văn Tạo (1993), “Phân lập, định danh vi khuẩn Salmonella gây bệnh cho lợn”, báo cáo khoa học mã số KN02-15, NXB nông nghiệp, Hà Nội II Tài liệu tiếng anh Amro A Amara, M.M.S.-B., Fars K (2013), Alanazi, Preparing of Bacterial Ghost for E.coli JM109 Using “Sponge-Like reduced Protocol “ Asian Journal of Biologycal Sciences Volume: Issue: | Page No.: 363-36 Amro A Amara, M.M.S.-B., Fars K Alanazi (2013), A New Protocol for Preparing Bacterial Ghosts The Scientific World Journal: Article ID 545741, pages 42 Amro A Amara, Mounir M Salem-Bekhit,and Fars K (2013), Alanazi, Sponge-Like: A New Protocol for Preparing Bacterial Ghosts Scientific world journal 545741(10), pp 18 Andino, A and I Hanning (2015), Salmonella enterica: survival, colonization, and virulence differences among serovars Scientific world journal pp 520-179 Archibald, A.R., H.E Coapes, and G.H (1969), Stafford, The action of dilute alkali on bacterial cell walls Biochemical Journal 113(5), :p 899-900 Bergey’s (1994), Manual of determinative bacteriology, th edition, by the Williams and wilkings company Chakameh Azimpour Tabrizi, Petra Walcher, Ulrike Beate Mayr1, Thomas Stiedl, Matthias Binder, John McGrath and Werner Lubitz (2004), Bacterial ghosts – biological particles as delivery systems for antigens, nucleic acids and drugs Current Opinion in Biotechnology (15), pp 530–537 Crump, J.A and E.D Mintz (2010), global trends in typhoid and paratyphoid fever Clin Infect dis 50(2), pp 214-6 Dyar, OJ (2012), High prevalence of antibiotic resistance in commensal Escherichia coli among children in rural Viet Nam BMC infect dis 12(92), pp 1471-2334 10 Ebensen T, P.S., Link C, Kudela P, de Domenico C, Lubitz W (2004), bacterial ghost are an efficient delivery system for DNA vaccins J immunol.172, pp 6858-6865 11.Halfmann, G and W.lubitz (1986), differential induction of Escherichia coli autolysis by penicillin and the bacteriophage phi X174 gene E product, Journal of bacteriology 166(2), pp 683-685 43 12 Halfmann, G., M Leduc, and W.lubitz (1984), different sensitivity of autolytic deficient Escherichia coli mutants to the mode of induction FEMS Microbiology letters 24(2-3), pp 205-208 13 Hawi Jaleta, Bedaso Mamo and Haimanot Disassa (2015), Review on Bacterial Ghost and its Application, International Journal of Microbiological Research (3), pp 200-210 14 Jones J.W, Richardson A.L (1981), “the attachment to invasion of helacells by Salmonella typhimurium the contribution of manose sensitive and manose- sensitive heamaglutinate activities”, J.gen microbial, V127 pp 361-370 15 Nguyen.T.V (2005), An tibiotic resistance in diarrheagenic Escherichia coli and shigella stains isolated from children in Ha Noi, Viet Nam Antimicrob agents chemother 49(2), pp 816-819 16 Saeed Khoshnoud, Aghil Bahramian, Mehdi Goudarzi (2015) “BACTERIAL GHOSTS: NEW CHALLENGES IN MEDICAL AND PHARMACEUTICAL APPLICATIONS” 59(3), pp 1475-2474 17 Van, T.T.H (2007), Antibiotic resistance in Food-Borne bacterial contaminants in Viet Nam Applied and environmental microbiology 73(24), pp 790-797 18 Vinod (2014), Chemically induced Salmonella enteritidis ghost as a novel vaccine candidate against virulent challenge in a rat model Vaccine 32(26), pp 3249-3255 19 Voskuil, M.I and G.H (1993), Chambliss, rapid isolation and sequencing of purified plasmid DNA from bacillus subtilis Appl environ microbial 59(4), :p 1138-1142 20 Witte A, W.G., Blasi U, Halfmann G, Szostak M, Lubitz W (1990), Endogenous transmembrane tunnel formation mediated by phiX174 lysis protein E J bacterial 172, pp 4109-4114 44 III Tài liệu internet 25 Nguyễn Hữu Liêm, Khóa luận tìm hiểu Salmonella, http://doc.edu.vn/tai-lieu/khoa-luan-tim-hieu-ve-vi-khuansalmonella-11369/#.(25)Werner 26 Lubitz,Institute of Microbiology and Genetics,University of Vienna, Austria www.bird-c.com; Bacterial Ghosts as Carrier and Targeting Systems for Mucosal Antigen Delivery