MIỄN DỊCH bài 7 kết hợp kháng nguyên kháng thể

MỤC TIÊU• Trình bày các đặc tính và lực liên kết của phản ứng kết hợp kháng nguyên KN-kháng thể KT.. • Trình bày nguyên lý và các loại phản ứng tủa • Trình bày nguyên lý và các loại phả

KẾT HỢP KHÁNG NGUYÊN-KHÁNG THỂ

MỤC TIÊU

• Trình bày các đặc tính và lực liên kết của

phản ứng kết hợp kháng nguyên (KN)-kháng thể (KT).

• Trình bày nguyên lý và các loại phản ứng tủa

• Trình bày nguyên lý và các loại phản ứng

ngưng kết

• Trình bày các loại miễn dịch đánh dấu

1 ĐẠI CƯƠNG

1.1 Ba đặc tính của phản ứng kết hợp KN-KT.

• Đặc hiệu : KT chỉ kết hợp đặc hiệu với KN Ứng dụng nhiều trong chẩn đoán bệnh và nghiên cứu

• Thuận nghịch : Kết hợp và phân ly, cấu trúc

KN và KT không thay đổi Sự phân ly phụ

thuộc vào một số yếu tố như pH, nồng độ muối, nhiệt độ

• Tạo nhiệt : 2-4Kcal/mol

1.2 Các lực liên kết giữa KN-KT

Là những lực hóa lý thông thường, gặp trong các liên kết

enzyme-cơ chất, hocmon với receptor…

Hydro liên kết với các nguyên

tử mang điện âm (N,O)

Chuyển động của các đám mây điện tử xung quanh các phân tử làm cho phân

tử có cực

Các nhóm kỵ nước gần nhau tương tác và giải phóng các phân tử H20

1.3 Khái niệm epitop và paratop

1.4 Ái tính và háo tính

1.4.1 Ái tính (affinity) của

KTvới KN được biểu thị

1.4.2 “ Háo tính ”(avidity) của KT

là biểu thị tất cả các lực liên

kết giữa các KT và KN đa hóa

trị

• Háo tính phụ thuộc vào số

epitop của KN và số hóa trị

của KT (IgG, IgM ), pH, các

• Phản ứng tủa

• Phản ứng ngưng kết

• Phản ứng miễn dịch đánh dấu

2 CÁC LOẠI PHẢN ỨNG KẾT HỢP KN-KT

2.1 Phản ứng tủa

Nguyên lý chung

Các KN hoặc KT ở dạng

hòa tan kết hợp với KT

hoặc KN đặc hiệu tương

2.1.1 Phản ứng tủa trong môi trường lỏng

KN 100µl

KT 100µl

Tủa : mờ, đục

2.1.1.2 Tủa đều trong môi trường lỏng

- Cho KT vào một ống nghiệm

- Thêm một lượng KN tương ứng

- Lắc đều và quan sát tủa hình thành

Dung dịch

KT

Lượng KN tăng dần

Thừa KN Thừa KT

2.1.2.3 Kết tủa

trong môi trường

lỏng: Heidelberger

và Kendall

2.1.2 Kết tủa trong môi trường gel (argarose)

• Khuếch tán một chiều trong gel

• Khuếch tán vòng đơn Mancini

• Điện di tên lửa-Laurell

• Điện di miễn dịch hai chiều

Khuếch tán vòng kép-Ouchterlony

tạo nên đường tủa khi gặp KT và KN tương ứng.

đều và có độ dày khoảng 3mm Để ở nhiệt độ phòng cho thạch đông lại, sau đó

để ở 4độ C khoảng 15-20 phút cho thạch đông chắc.

mm.

giờ.

Khuếch tán vòng kép-Ouchterlony

β2m thỏ

1

3 2

KT1

KT1 KT2

• Chuẩn bị lam gen thạch: Giống như Ouchterlony

• Đục 1(hay 2) giếng ở gianh giới 1/3 lam gen thạch, nhỏ KN vào đó (huyết thanh

người và IgG).

• Đặt lam gen thạch vào máy điện di sao cho lỗ chứa KN gần cực âm hơn cực

dương Kết quả, tốc độ di chuyển của các thành phần KN trong huyết thanh sẽ khác nhau tùy theo TLPT.

• Bỏ lam gen thạch ra khỏi máy, đục một rãnh dài theo chiều dọc lam gen thạch

và nhỏ vào đó KT(kháng HT người toàn phần) và chút ít chất đánh dấu.

• Để lam thạch vào buồng ẩm trên một tiết diện phẳng, ở nhiệt độ phòng trong

24 giờ.

đục.

Kỹ thuật Mancini

Nguyên lý:

• KN hòa tan từ một giếng khuếch tán ra xung quanh vào gen thạch chứa KT

tương ứng Sự tiếp xúc KN-KT sẽ tạo một vòng tủa hình tròn Diện tích vòng tủa tỉ lệ thuận với nồng độ KN.

Tiến hành

• Điều chế gen thạch chứa KT: Đun sôi cách thủy gen thạch cho tới khi tan đều,

để gen thạch và KT vào nồi ấm cách thủy 56độ C Cho KT vào gen thạch theo

tỉ lệ 2-5%.

• Đổ gen thạch chứa KT lên lam kính sao cho lớp gen thạch có độ dày 2mm, để

ở nhiệt độ phòng 20-30 phút, sau để ở 4độ C cho đông.

• Dùng khuôn có đường kính 2mm đục các lỗ trên bản gen thach(khoảng cách

• KN và KT tương ứng sẽ khuếch tán và hình thành các vòng tủa trắng đục

Căn cứ vào đường chuẩn, sẽ tính được nồng độ KN của mẫu thử.

Mancini- KN: HT ngựa bình thường+ KT kháng chuỗi gamma

- A6 - A1:HT ngựa: Không pha loãng, ½, ¼ …

- B: IgG ngựa tinh khiết đã biết nồng độ (từ

trái sang phải: 30,15,7,2 và 15 mg/ml)

- C: Các mẫu HT ngựa cần định lượng IgG

Điện di tên lửa

Nguyên lý:

• KN di chuyển trong điện trường gặp KT tương ứng trong gen sẽ tạo một vòng tủa hình “tên lửa” Chiều dài hình “tên lửa” tỉ lệ thuận với nồng độ KN, kết quả đọc sau 2-6 giờ thay vì 48 giờ của Mancini.

Tiến hành

• 1 Điều chế gen thạch chứa KT: Đun sôi cách thủy gen thạch cho tới khi tan

đều, để gen thạch và KT vào nồi ấm cách thủy 56độ C Cho KT vào gen thạch theo tỉ lệ 2-5%.

• 2 Đổ gen thạch chứa KT lên lam kính sao cho lớp gen thạch có độ dày 2mm,

để ở nhiệt độ phòng 20-30 phút, sau để ở 4độ C cho đông.

• 3 Dùng khuôn có đường kính 2mm đục các lỗ trên bản gen thach(khoảng cách

Điện di tên lửa KT đã được

trộn đều trong gel

Nồng độ KN

Nơi đặt mẫu

KT đã trộn đều trong gel

Điện di miễn

dịch hai chiều

2.2.2 Các loại ngưng kết:

– Chủ động (KN là các tế bào hồng cầu, bạch

cầu, tiểu cầu, tinh trùng…).

– Thụ động (KN hoặc KT gắn nhân tạo lên các hạt

… Khi KN gắn lên hạt nhân tạo như HC nhóm O,

HC cừu hoặc hạt latex thì phản ứng gọi là ngưng kết thụ động thuận, còn khi KT gắn lên các hạt trên thì gọi là thu động ngược).

Mẹ Rh - , Con Rh + Trực tiếp Gián tiếp

HC con+KT mẹ Huyết thanh mẹ

Phản ứng miễn dịch đánh dấu

1 Nguyên lý chung

KN hoặc KT được gắn với các chất “đánh

dấu”(enzym, chất màu huỳnh quang, phóng xạ) sẽ làm tăng khả năng nhận biết phức hợp KN-KT lên rất nhiều lần.

2 Đặc điểm:

• Độ nhạy rất cao: có thể phát hiện được các

phân tử KN hoặc KT ở nồng độ hoặc mật độ thấp

• Các chất đánh dấu không làm biến tính KN

hoặc KT và không dễ bong

• Thường phải đọc kết quả ở các thiết bị

chuyên dụng.

3 Các loại kỹ thuật đánh dấu

3.1 Kỹ thuật MD huỳnh quang

Nguyên lý: Phát hiện phản ứng MD nhờ đánh dấu bằng chất màu huỳnh quang, sau đó quan sát phản ứng KN-KT dưới kính HVHQ Nhận định kết quả (hình vẽ)

Ánh sáng kích thích Ánh sáng phát ra

Các loại kỹ thuật MDHQ

• MDHQ trực tiếp: Xác định các kháng

nguyên trên bề mặt tế bào hoặc lát cắt tổ chức

• MDHQ gián tiếp: Phát hiện kháng thể có

trong huyết thanh mẫu thử

• Kỹ thuật bánh kẹp “Sandwich”: phát hiện

kháng nguyên trong huyết thanh mẫu thử

+ Gián tiếp: phát hiện KT/

huyết thanh người thử và

Enzyme phân hủy

cơ chất, tạo màu

3.3 Kỹ thuật MD phóng xạ

• Nguyên lý:Tương tự hai kỹ thuật trên chỉ khác chất

là đồng vị phóng xạ (thimidin H3, Cacbon 14 )