Luận văn tốt nghiệp Hoàng Thị Thảo MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Đậu tương trồng ngắn ngày có giá trị dinh dưỡng giá trị kinh tế lớn Với thành phần hóa học chứa 38-45% prôtein , 18 – 23% lipit, đậu tương sử dụng làm thức ăn giàu đạm chất béo cho người, chế biến thức ăn gia súc cung cấp nguyên liệu cho ngành chế biến dầu thực vật [54] Ngoài ra, đậu tương đóng vai trò cải tạo đất, nhờ vi khuẩn nốt sần cố định đạm làm tăng độ phì cho đất Trên giới có nhiều nước sản xuất phát triển đậu tương, nước có diện tích sản lượng đậu tương lớn Mỹ, Brazin, Achentina, Trung Quốc [51] Ở Việt Nam, đậu tương truyền thống gieo trồng nhiều vùng nước Nhưng năm gần tập quán canh tác đặc biệt suất đậu tương đạt thấp, hiệu kinh tế sản xuất đậu tương không cao đậu tương chưa ý phát triển nước Hiện nay, với tiến kỹ thuật công tác tạo giống đậu tương cho suất cao, phẩm chất tốt, thích hợp với cấu xen canh, tăng vụ… làm cho sản xuất đậu tương nước ta bước phát triển Tuy nhiên sản lượng đậu tương nước đáp ứng đủ cho khoảng 15% nhu cầu tiêu dùng Hàng năm nước ta phải nhập khoảng 400500.000 đậu tương để chế biến dầu ăn thức ăn gia súc [53] Hạn nguyên nhân dẫn đến làm giảm suất đậu tương Các vùng trồng chuyên canh đậu tương nước ta, đặc biệt vùng cao thường xảy thiếu nước Bởi vậy, chọn tạo giống đậu tương có khả chống chịu hạn, thích ứng với vùng sinh thái bất lợi công nghệ sinh học giúp tăng suất, giảm giá thành đậu tương mục tiêu hàng đầu cho nhà khoa học nước Ngoài phương pháp chọn giống truyền thống, chuyển gen thực vật phương pháp hiệu để tạo dòng, giống mang tính trạng mong muốn Trong chuyển gen vi khuẩn Agrobacterium phương pháp hữu hiệu dùng để chuyển gen thực vật Phương pháp dùng Ti plasmid A.tumefaciens Ri plasmid A rhizogenes làm vectơ đưa ADN vào tế bào T-ADN thành Luận văn tốt nghiệp Hoàng Thị Thảo phần Ti plasmid, chuyển từ Agrobacterium vào tế bào thực vật, gắn gen muốn chuyển nạp vào T-ADN để đưa vào tế bào thực vật DT84 giống đậu tương cho suất cao, trồng phổ biến nước, khả chống chịu hạn Với mục tiêu nghiên cứu tạo sở ban đầu cho việc chuyển gen tạo giống đậu tương có khả chống chịu hạn cao, chọn đề tài “Nghiên cứu quy trình chuyển gen chống chịu hạn vào đậu tương giống DT84” Mục đích đề tài  Tối ưu hóa quy trình tái sinh đậu tương DT84 thông qua đa chồi từ nách mần hạt chín  Thiết kế vector mang gen P5CS đột biến (P5CSM) phục vụ tạo đậu tương chuyển gen chống chịu hạn thông qua A tumefaciens Nội dung đề tài  Tối ưu hóa quy trình tái sinh chuyển gen vào đậu tương DT84 thông qua đa chồi  Thiết kế vector chuyển gen mang gen chịu hạn P5CSM, tạo chủng Agrobacterium chứa gen P5CSM  Chuyển gen chịu hạn P5CSM vào giống đậu tương DT84 Đối tượng nghiên cứu 4.1 Thực vật  Giống đậu tương DT84 Trung tâm Nghiên cứu Phát triển đậu đỗ, Viện Cây lương thực Cây thực phẩm cung cấp  Giống thuốc Nicotiana tabacum L K326 nuôi cấy điều kiện in vitro Phòng Công nghệ Tế bào thực vật-Viện Công nghệ sinh học cung cấp 4.2 Chủng vi khuẩn A tumefaciens vector  Chủng A tumefaciens EHA 101 mang vector pPTN289 chứa gen gus intron gen chọn lọc bar kháng ppt Đại học Tổng hợp Nebraska, Hoa Kỳ cung cấp Luận văn tốt nghiệp Hoàng Thị Thảo  Chủng A tumefaciens Cv58C1 mang plasmid pGV2260, chủng vi khuẩn E coli DH5α Phòng Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học cung cấp  Plasmid pBT mang gen P5CSM, vector pBI121 Phòng Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học cung cấp Phương pháp nghiên cứu  Phương pháp nuôi cấy in vitro  Phương pháp sinh học phân tử Giả thuyết khoa học  Tạo chủng Agrobacterium mang vector chuyển gen chứa gen P5CSM mã hóa cho protein liên quan đến tính chống chịu hạn  Xây dựng quy trình chuyển gen P5CSM chịu hạn cho giống đậu tương DT84 có hiệu cao Luận văn tốt nghiệp Hoàng Thị Thảo Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX L MERRILL), GIÁ TRỊ KINH TẾ VÀ GIÁ TRỊ SỬ DỤNG 1.1.1 Nguồn gốc phân loại Cây đậu tương xem trồng truyền thống, loài trồng biết đến từ sớm Các chứng lịch sử, địa lý khảo cổ học đậu tương có nguồn gốc từ Trung Quốc Vào khoảng kỉ XVII trước công nguyên đậu tương hóa trồng làm thực phẩm Trung Quốc Đến khoảng kỷ thứ VIII, đậu tương truyền bá sang Nhật Bản, du nhập vào nhiều nước Châu Á khác như: Indonesia, Philippin, Thái Lan, Ấn Độ, Việt Nam,… vài kỷ sau Cây đậu tương trồng Châu Âu vào kỷ XVII Hoa Kỳ kỷ XVIII Cây đậu tương thuộc Phaseoleae, họ đậu Fabaceae, họ phụ cánh bướm Papilionoideae, chi Glycine với tên khoa học Glycine max (L.) Merrill Căn vào đặc điểm hình thái, phân bố địa lý số lượng nhiễm sắc thể Hymowit Newell (1984) cho chi Glycine có chi phụ Soja Chi Glycine chia thành loài hoang dại lâu năm, chi Soja gồm loài có loài đậu tương trồng Glycine max L Merrill (Ngô Thế Dân đtg, 1999) [3], (Trần Văn Điền, 2007) [4] 1.1.2 Đặc điểm sinh học Đậu tương hai mầm, thân thảo Thân có nhiều lông nhỏ, non thân có màu xanh tím, già chuyển màu nâu nhạt Màu sắc thân cho ta biết màu hoa sau này, thân có màu xanh hoa có màu trắng, thân có màu tím sau hoa có màu tím đỏ, chiều cao thân từ 0,3 - 1m tùy theo giống Cây đậu tương có ba loại lá: mầm, đơn, kép Mỗi kép thường có thuỳ (lá chét), kép mọc so le, phiến có nhiều lông tơ Hình dạng thay đổi theo giống, giống có dài nhỏ chịu hạn tốt, cho Luận văn tốt nghiệp Hoàng Thị Thảo suất thấp, giống to thường cho suất cao chịu hạn Hoa đậu tương phát sinh từ nách lá, đầu cành đầu thân Hoa mọc thành chùm, chùm thường có từ - hoa Hoa lưỡng tính nên đậu tương tự thụ phấn, tỷ lệ giao phấn thấp chiếm 0,5 - 1% Quả đậu tương thẳng cong, dài từ - 7cm Mỗi thường có - hạt Hạt đậu tương có hình tròn, bầu dục…, giống có hạt màu vàng có giá trị thương phẩm cao Khối lượng 1000 hạt dao động trung bình từ 100 - 200g Hình dạng màu sắc rốn hạt đặc trưng cho giống Bộ rễ đậu tương gồm rễ rễ phụ Trên rễ có nhiều nốt sần, kết cộng sinh vi khuẩn Rhizobium japonicum với rễ Nốt sần dài 1cm, đường kính - 6mm, hình thành có màu trắng sữa, phát triển tốt nốt sần có màu hồng Nốt sần tập trung nhiều tầng đất có độ sâu từ - 20cm, có vai trò quan trọng việc cố định đạm từ nitơ không khí, với lượng đạm cung cấp cho khoảng 30 - 60 kg/ha Dựa vào thời gian sinh trưởng, đậu tương chia thành loại: chín sớm: thu hoạch sau 80-90 ngày; chín sớm: thu hoạch sau 90 - 100 ngày; chín trung bình: thu hoạch sau 100 - 110 ngày; chín muộn trung bình: thu hoạch sau 110 - 120 ngày; chín muộn: thu hoạch sau 130 - 140 ngày; chín muộn: thu hoạch sau 140 150 ngày (Ngô Thế Dân đtg, 1999) [3], (Trần Văn Điền, 2007) [4] 1.1.3 Giá trị kinh tế giá trị sử dụng đậu tương Đậu tương trồng ngắn ngày có giá trị kinh tế cao, sản phẩm dùng làm thực phẩm cho người, thức ăn cho gia súc, nguyên liệu cho công nghiệp, làm hàng xuất loài cải tạo đất trồng tốt Giá trị mặt thực phẩm: Hàm lượng protein đậu tương cao cá, thịt cao gấp lần loại đậu đỗ khác, protein hạt đậu chiếm khoảng 35 - 50% (phụ thuộc vào giống điều kiện chăm sóc), dễ tiêu hóa thịt thành phần tạo cholesterol Đậu tương xem cung cấp dầu thực vật quan trọng, lipit đậu tương chứa thành phần axit béo không no cao, Luận văn tốt nghiệp Hoàng Thị Thảo tổng số chất béo chiếm khoảng 18% Trong hạt đậu tương chứa nhiều loại vitamin, đáng kể vitamin nhóm B như: B1, B2, B6, vitamin E,… Ngoài ra, chứa sắt, canxi, photpho thành phần giúp ích cho sức khỏe người phytosterol, lecithin, isoflavon, phytoestogen sản phẩm ức chế phân hủy protein [4] Giá trị mặt công nghiệp: Hiện giới, đậu tương đứng đầu cung cấp nguyên liệu cho ép dầu, dầu đậu tương chiếm 50% dầu thực vật, dầu đậu tương khô chậm, số iốt cao 120 - 127, nhiệt độ ngưng tụ -15 đến -18°C từ dầu người ta làm nến, xà phòng, nilon,…Đậu tương nguyên liệu nhiều ngành công nghiệp khác như: chế biến cao su nhân tạo, mực in, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt lỏng,… Giá trị mặt nông nghiệp: Toàn đậu tương tươi khô dùng làm thức ăn cho gia súc Đậu tương có vai trò quan trọng cải tạo đất trồng, đậu tương sinh trưởng phát triển tốt để lại đất 30 - 60 kg nitơ, thân với hàm lượng đạm cao dùng để bón cho đất thay cho phân hữu Việc luân canh đậu tương với trồng khác xem biện pháp cải tạo đất trồng hữu hiệu 1.1.4 Tình hình sản xuất đậu tương giới Việt Nam Trên giới: Nhận thấy với giá trị kinh tế dinh dưỡng cao đậu tương, nên xem loại trồng quan trọng bậc nhiều quốc gia với vị trí đứng sau lúa, ngô lúa mì Do có khả thích nghi rộng với điều kiện khí hậu sinh thái khác nên đậu tương trồng rộng rãi năm châu lục, tập trung nhiều Châu Mỹ, tiếp đến Châu Á Bình quân hàng năm giới có khoảng 91 triệu đậu tương gieo trồng với suất bình quân cao 22-23 tấn/ha Mỹ nước có diện tích gieo trồng sản lượng đậu tương lớn giới, Brazil, Achentina, Trung Quốc [51] Ở Việt Nam: Đậu tương gieo trồng từ sớm, trồng trước đậu xanh đậu đen Tuy nhiên với phương pháp canh tác truyền thống, Luận văn tốt nghiệp Hoàng Thị Thảo giống suất thấp, sản xuất nhỏ lẻ, giá thành cao, lãi suất thấp, giá thành đậu tương nước khả cạnh tranh với đậu tương nhập nguyên nhân khiến cho nông dân không mặn mà với đậu tương Vì vậy, diện tích sản lượng đậu tương nước ta phát triển chậm Bảng 1.1 Tình hình sản xuất đậu tương Việt Nam từ năm 2003 đến 2010 [52] Năm 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 Chỉ tiêu Diện tích (1000 ha) 165,6 183,8 204,1 185,6 187,4 192,1 146,2 197,8 Năng suất (tạ/ha) 13,3 13,3 14,3 13,9 14,7 14,0 14,6 15,0 Sản lượng (1000 tấn) 219,7 245,9 292,7 258,1 275,2 267,6 213,6 296,9 (Nguồn: Tổng cục thống kê, 2011) Về diện tích, đậu tương gieo trồng diện tích chiếm tỉ lệ thấp khoảng 1,5-1,6 %, xét tốc độ diện tích gieo trồng tăng qua năm Năm 1980, diện tích trồng đậu tương 48,8 nghìn ha, tính đến năm 2010, diện tích tăng lên gấp 4,05 lần Về suất: suất bình quân đậu tương nước ta thấp, 50% - 70% suất đậu tương giới Mặc dù sản lượng diện tích canh tác đậu tương tăng theo năm, chưa đáp ứng nhu cầu tiêu dùng ngày cao nước ta.Sản lượng đậu tương năm đạt khoảng 0,3 triệu tấn, đáp ứng khoảng 15% nhu cầu ngày phụ thuộc vào lượng đậu tương nhập Lượng đậu tương nhập này, ¾ dành cho sản xuất thức ăn chăn nuôi, ¼ lại sản xuất sản phẩm phục vụ người Để nâng cao suất đậu tương đáp ứng nhu cầu tiêu dùng cần phải có biện pháp đồng việc chọn tạo giống đậu tương cho suất cao, chống chịu tốt, đặc biệt chống chịu hạn định hướng phát triển chiếm lược đậu tương năm tới Việt Nam Luận văn tốt nghiệp Hoàng Thị Thảo 1.2 CƠ CHẾ SINH LÝ, HÓA SINH VÀ PHÂN TỬ CỦA ĐẬU TƯƠNG TRONG ĐIỀU KIỆN HẠN Tính chịu hạn thực vật thích nghi có chất di truyền thể thích nghi đa dạng mặt hình thái sinh lý Điều biểu thực vật chịu hạn cách giảm thiểu thoát nước nhờ có lớp cutin dày, khí khổng nằm sâu, hình thành protein sốc có tác dụng bảo vệ gen khỏi tác động gây hư hại sử dụng nước cách có hiệu cách tiến hành quang hợp theo đường CAM Các chế đa dạng chia thành ba chế bao gồm: chế trốn thoát điều kiện hạn (drought escape), chế tránh hạn (drought avoidance) chế chống chịu hạn (drought tolerance) Đối với chế tránh hạn giống đậu tương có chế để trì lượng nước thể giai đoạn hạn thông qua việc tăng khả hấp thu nước từ rễ giảm trình thoát nước phận khác Ở giống đậu tương có khả chống chịu hạn, trì sức căng mô tế bào, trình trao đổi chất diễn bình thường điều kiện lượng nước bên môi trường xuống thấp Sức căng mô tế bào trì thông qua việc tổng hợp mạnh chất chống áp suất thẩm thấu, chất trao đổi (Nguyen đtg, 2007) 33 1.2.1 Sự biến đổi rễ Ở đậu tương thích nghi với điều kiện hạn hán cách phát triển rễ trụ dài hơn, hệ thống lông rễ lớn tìm nước lớp đất phía ẩm hút dinh dưỡng kali Một yếu tố ảnh hưởng đến độ đâm sâu hệ rễ đậu tương tỉ lệ kéo dài rễ Rễ trụ dạng rễ đầu đậu tương, xác định kiểu hình rễ trụ điều kiện không stress cho phép xác định khả đâm sâu rễ Kaspar cs lấy 105 kiểu hình khác đậu tương từ nhóm có tính trưởng thành khác Độ dài rễ trụ nhóm trưởng thành biến thiên vào khoảng 1,3 cm/ngày Các kết cho thấy nhóm giống có tỉ lệ kéo dài rễ nhanh thường hút nước đất sâu 120 cm bề mặt Dưới điều kiện hạn, số lượng rễ đơn Luận văn tốt nghiệp Hoàng Thị Thảo vị chiều dài rễ trụ tăng lên đáng kể, không tăng chiều dài hay đường kính rễ trụ Bởi vì, sinh trưởng rễ phân phối nước định để trì chức điều kiện môi trường khác nhau, đặc tính mềm dẻo rễ yếu tố định khả tìm nguồn nước Stress nước hướng tới gia tăng sinh khối rễ, gia tăng tỉ lệ rễ : thân Các không tưới nước cho thấy gia tăng kích thước rễ so sánh với tưới nước, xuất tương quan đặc trưng sức chịu đựng hạn với đặc điểm đa dạng rễ khối lượng khô, kích thước toàn hệ rễ, khối lượng số lượng rễ phụ [28] Phân tích proteomic rễ đậu tương xử lý hạn, phát 35 protein tạo có nhiều thay đổi quan trọng vùng rễ bị stress nước so sánh với điều kiện bình thường Số lượng số protein gia tăng, ferritin, khu vực kéo dài rễ bị xử lý stress, có vai trò quan trọng bảo vệ tế bào chống lại dạng oxy hoạt hoá Thông tin từ proteomic cho thấy mối quan hệ gần gũi sinh tổng hợp phenylpropanoid sinh trưởng rễ điều kiện nước thấp, gia tăng lớn lượng isoflavon vách phenolic, bao gồm lignin vùng chóp rễ vùng [37] 1.2.2 Khả cố định đạm điều kiện hạn Khả cố định đạm họ đậu nhạy cảm với hàm lượng nước đất Trong điều kiện hạn, đậu tương không bị cân lượng CO2 tích lũy làm giảm phát triển diện tích lá, mà lượng nitơ liên kết không giữ vững Đất khô làm giảm hàm lượng nitơ cho trình tạo protein, làm giảm suất trồng chất lượng hạt giống Một vài yếu tố liên quan đến ức chế nitơ liên kết điều kiện hạn bao gồm: hạn chế lượng oxy vào; giảm dòng cacbon đến nốt sần; giảm hoạt động tổng hợp đường nốt sần; đồng thời tăng tích lũy urê amino acid tự [28], [37] Hoạt động nitrogenase cho thấy giảm 70% ngày đầu gây hạn, quang hợp giảm 5%, điều cho thấy stress nước tạo tác động đến hoạt động nitrogenase, mà không phụ thuộc tỉ lệ quang hợp Nó cho thấy thiếu nước tác động đến hoạt động nốt sần thông qua gia tăng khả chịu đựng khuếch tán oxy đến Luận văn tốt nghiệp Hoàng Thị Thảo bacteriod Khả chống lại khuếch tán oxy tăng cường; giảm hô hấp nitrogenase liên kết hoạt động enzyme; tích lũy chất hô hấp lipid bị oxy hóa; điều tiết ngược gen chống lại oxy hóa; với hoạt động tập trung hô hấp bacteriod bị làm suy yếu điều kiện hạn, hư hại oxy hóa xảy nốt sần trước đến tác động tới sinh tổng hợp đường hay leghemoglobin Đất khô thường điều khiển tích lũy urê đậu tương biết tới nhân tố hạn chế tạo nốt sần [37] 1.2.3 Sự biến đổi hình thái Hệ thống lông tơ đặc điểm chung loài thực vật chịu hạn, có đậu tương Thông thường, độ dày lông tơ gia tăng hệ số phản xạ từ lá, dẫn đến giảm nhiệt độ điều kiện chiếu sáng cao Độ dày lông tơ đặc điểm thích ứng quan trọng cho đậu tương điều kiện hạn Lông tơ dày đặc tăng cường sức sinh trưởng, rễ dày đặc mở rộng xuống sâu Sự gia tăng độ dày lông tơ làm tăng lớp ranh giới chống lại stress lên 50%, giảm nhiệt độ lá, hạn chế thoát nước tăng cường trình quang hợp Hơn nữa, gia tăng độ dày lông tơ làm giảm đáng kể phạm vi ảnh hưởng bệnh khảm virus đậu tương [37] 1.2.4 Sự biến đổi đặc điểm sinh lý thân Một đặc điểm sinh lý liên quan đến thân tác động đến khả chịu hạn suy giảm lượng nước sử dụng toàn thể thực vật đất bị thiếu nước Khi nước đất gia tăng, thực vật phải chịu đựng thời kỳ chuyển tiếp từ trạng thái bão hòa nước, mà lượng nước toàn thể thực vật sử dụng không phụ thuộc vào lượng nước đất; sang trạng thái thứ hai mà nước sử dụng liên quan trực tiếp tới lượng nước dùng đất Việc chuyển trạng thái kết hợp với giảm số dẫn truyền trung bình khí khổng, xảy phụ thuộc lượng nước đất khác nhau, nhiều loài khác Tính dẫn truyền khí khổng tác động quan trọng đến thay đổi trao đổi khí thoát nước Các tác động hạn đến sinh trưởng lá, dẫn truyền khí khổng mối quan hệ với lượng nước 10 Luận văn tốt nghiệp Hoàng Thị Thảo KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Tối ưu quy trình tái sinh đậu tương DT84 thông qua đa chồi Nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho: môi trường tạo đa chồi 1,5 mg/l BAP; môi trường kéo dài chồi 0,5 mg/l GA3 + 0,1 mg/l IAA; môi trường rễ 0,1 mg/l IBA Hiệu chuyển gen Gus thu 4,2% 1.2 Thiết kế vector chuyển gen mang gen chịu hạn P5CSM (pBI121/35SP5CSM) biến nạp thành công vào chủng vi khuẩn A tumefaciens pGV2260 1.3 Đối với dòng thuốc chuyển gen mang cấu trúc P5CSM, có tượng tăng khả chịu nước mảnh khả chịu hạn nhân tạo, dẫn đến khả sống sót cao đối chứng (không chuyển gen) Khả phục hồi dòng chuyển gen nhanh đối chứng 1.4 Chuyển gen 35S-P5CSM vào đậu tương DT84, bước đầu thu 24 dòng phát triển môi trường chọn lọc Kan, có dòng dương tính PCR với primer đặc hiệu Đề nghị Tiếp tục chuyển gen phân tích dòng đậu tương chuyển gen điều kiện khô hạn Có thể chuyển cấu trúc pBI121/P5CSM vào trồng khác 63 Luận văn tốt nghiệp Hoàng Thị Thảo TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Lê Trần Bình, Hỗ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, NXB Nông Nghiệp Lê Trần Bình (2008), Phát triển trồng chuyển gen Việt Nam, NXB Khoa học tự nhiên công nghệ Ngô Thế Dân cộng (1999), Cây đậu tương, NXB Nông Nghiệp Trần Văn Điền (2007), Giáo trình đậu tương, NXB Nông Nghiệp Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Chu Hoàng Hà, Lê Văn Sơn (2010), “Nghiên cứu khả tái sinh biến nạp gen qua nách mầm giống đậu tương (glycine max L.) DT84 DT12 Agrobacterium”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, Hội nghị khoa học miền Trung -Tây nguyên Phạm Xuân Hội (2011), Phân lập thiết kế vector mang gen điều khiển tính chịu hạn phục vụ công tác tạo giống chuyển gen, Báo cáo tổng kết đề tài khoa học Nông nghiệp phát triển nông thôn Nguyễn Thị Thúy Hường (2011), “Phân lập, tạo đột biến điểm gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn thử nghiệm chuyển vào đậu tương Việt Nam”, Luận án tiến sĩ sinh học Nguyễn Như Khanh (2008), Sinh học phát triển thực vật, NXB Giáo dục Nguyễn Như Khanh, Cao Phi Bằng (2008), Sinh lý học thực vật, NXB Giáo dục 10 Nguyễn Hải Tuất, Ngô Kim Khôi (1996), Xử lý thống kê kết nghiên cứu thực nghiệm nông lâm ngư nghiệp máy vi tính, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội 64 Luận văn tốt nghiệp Hoàng Thị Thảo 11 Khuất Hữu Thanh (2006), Kỹ thuật gen nguyên lí ứng dụng, NXB Khoa học kỹ thuật 12 Nguyễn Đức Thành (2003), Chuyển gen thực vật, NXB Khoa học kỹ thuật 13 Lê Thị Thủy, Lê Văn Sơn, Bùi Phương Thảo, Chu Hoàng Hà (2010) Nghiên cứu tái sinh đậu tương (Glycine max L.) thông qua nách mầm hạt chín Tạp chi khoa học ĐHQGHN, KHTN&CN 26 (2S): 247-254 14 Phạm Thị Vân, Nguyễn Văn Bắc, Lê Văn Sơn, Chu Hoang Hà, Lê Trần Bình (2008), “Tạo thuốc kháng bệnh khảm dưa chuột kỹ thuật RNAi”, Tạp chí công nghệ sinh học, 6(4A), tr 679-687 15 Đỗ Năng Vịnh (2002), Công nghệ sinh học trồng, NXB Nông Nghiệp TÀI LIỆU TIẾNG ANH 16 Armengaud P, Thiery L, Buhot N, Grenier-de March G, Savouré A (2004) “Transcriptional regulation of proline biosynthesis in Medicago truncatula reveals developmental and environmental specific features“ Physiologia plantarum 120(3), 442-450 17 Borsani O, Zhu J, Verslues PE, Sunkar R, and Zhu JK (2005) “Endogenous siRNAs derived from a pair of natural cis-antisense transcripts regulate salt tolerance in Arabidopsis” Cell, 123: 1279–1291 18 Csonka LN, Gelvin SB, Goodner BW, Orser CS, Siemieniak D, and Slightom JL (1988), “Nucleotid sequence of a mutation in the proB gene of Escherichia coli that confers proline overproduction and enhanced tolerance to osmotic stress” Gene 64(2): 199-205 65 Luận văn tốt nghiệp Hoàng Thị Thảo 19 Delauney AJ, Hu CAA, and Kishor PB, Verma, D P S (1993) “Cloning of ornithine δ- aminotransferase cDNA from Vigna aconitifolia by trans-complementation in Escherichia coli and regulation of proline biosynthesis” Journal of Biological Chemistry, 268: 18673-18678 20 Dorothea B, Ramanjulu S (2005), “Dought and salt tolerance in palnts”, Critical Reviews in Plant Sciences, 23-58 21 Hong Z, Lakkineni K, Zhang Z, Verma DPS (2000) Removal of feedback inhibition of -pyrroline -5- carboxylate synthetase results in increased prolinee accumulation and protection of plants from osmotic stress” Plant Physiology, 122: 1129-1136 22 Hong H.P., Zhang H., Olhoft P., Hill S., Wiley H., Toren E., Hillebrand H., Jones T., Cheng M (2007), “Organogenic callus as the target for plant regeneration and transformation via Agrobacterium in soybean (Glycine max (L.) Merr.)”, In Vitro Cell.Dev.Biol.—Plant, 43, pp 558–568 23 Huang Bingru (2006), Plant-environment interactions, Third edition, Spinger, 15-40 24 Hu CA, Delauney AJ, Verma DPS (1992) “A bifunctional D1enzymee- pyrroline-5-carboxylate synthetase catalyzes the first two steps in proline biosynthesis in plants” Proc Natl Acad Sci USA, 89: 9354 – 9358 25 Hua X, Van De Cotte B, Van Montagu, M., Verbruggen N (1999) “A 69 bp fragment in the pyrroline-5-carboxylate reductase promoter of Arabidopsis thaliana activates minimal CaMV 35S promoter in a tissue-specific manner” FEBS Letters 458:193–196 66 Luận văn tốt nghiệp Hoàng Thị Thảo 26 Jefferson RA, Kavanagh TA, and Bevan MW (1987), “GUS fusion: β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants” EMBO 6: 3901-3907 27 Kishor PBK, Sangam S, Amrutha RN, Sri Laxmi P, Naidu KR, Rao K R S S, Sreenath Rao, Reddy K J, Theriappan P, Sreenivasulu N (2005) “Regulation of proline biosynthesis, degradation, uptake and transport in higher plants: Its implications in plant growth and abiotic stress tolerance” Current Science 88: 424 – 438 28 Lakshmi P.M, Satish K.G (2009), “Physiological and molecular approaches to improve dought resistance in soybean”, Plant Cell Physiology 50, 1260-1276 29 Liu Qiang, Mie Kasuga, Yoh Sakuma (1998), “Two transcription factors, DREB1 and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in doughtand low-temperature –responsive gene expression, respectively, in Arabidopsis”, The Plant Cell 10, 1391-1406 30 Mattioli R, Falasca G, Sabatini S, Altamura MM, Costantino P, and Trovato M (2009) “The proline biosynthetic genes P5CS1 and P5CS2 play overlapping roles in Arabidopsis flower transition but not in embryo development” Physiologia Plantarum 137: 72–85 31 Matysik J, Ali Bhalu,B, Mohanty P (2002) “Molecular mechanism of quenching of reactive oxygen species by proline under water stress in plants” Current Sciences 82: 525-532 32 Murakeozy EP, Nagy Z, Duhaz C, Buchereau A, Tuba Z (2003) “Seasonal changes in the levels of compatible osmolytes in three halophytic species of inland saline vegetation in Hungary” Journal of Plant Physiology, 160:395–401 67 Luận văn tốt nghiệp Hoàng Thị Thảo 33 Nguyen HT, Babu RC, Blum A (1997) “Breeding for drought resistance in rice: physiology and molecular genetics considerations” Crop Sciences, 37: 1426-1434 34 Olhoft P.M et al (2007), “A novel Agrobacterium rhizogenesmediated transformation method of soybean [Glycine max (L.) Merrill] using primary-node explants from seedlings”, In Vitro Cell Dev Biol.—Plant, 43, pp 536–549 35 Olhoft P.M and Somers D.A (2001), “L-Cysteine increases Agrobacterium-mediated T-DNA delivery into soybean cotyledonary-node cells”, Plant Cell Rep, 20, pp 706–711 36 Paz1 M.M., Shou H., Guo Z., Zhang Z., Banerjee A.K & Wang K (2004), “Assessment of conditions affecting Agrobacteriummediated soybean transformation using the cotyledonary node explant”, Euphytica, 136, pp 167–179 37 Phan Tran Lam-Son, Keiichi Mochida (2010), “Functional genomics of soybean for improvement of productivity in adverse conditions”, Function Integration Genomics, 10, 447–462 38 Phang Tsui-Hung, Li Man-Wah (2010), “Molecular responsive to osmotic stresses in soybean”, Soybean – Molecular Aspects of Breeding, chapter 10, 216-239 39 Ren-Gao X., Hong-Feng X and Zhang B (2006), “A multi-needleassisted transformation of soybean cotyledonary node cells”, Biotechnol Lett, 28, pp 1551–1557 40 Sairam R.V., Franklin G., Hassel R., Smith B., Meeker K., Kashikar N., Parani M., Abed D.A., Ismail S., Berry K & Goldman S.L (2003), “A study on the effect of genotypes, plant growth regulators and sugars in promoting plant regeneration via organogenesis from soybean cotyledonary nodal callus”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 75, pp 79–85 68 Luận văn tốt nghiệp Hoàng Thị Thảo 41 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press 42 Samoylov V.M., Tucker D.M., Thibaud-Nissen F., Parrott W.A (1998), “A liquid-medium-based protocol for rapid regeneration from embryogenic soybean cultures”, Plant Cell Reports, 18, pp 49–54 43 Satoh R, Nakashima K, Seki M., Shinozaki K., YamaguchiShinozaki K (2002) “ACTCAT, a novel cis-acting element for proline-and hypoosmolarity-responsive expression of the ProDH gene encoding proline dehydrogenase in Arabidopsis” Plant Physiology, 130, 709–719 44 Szabados L, AouldSavoure (2009) “Proline: a multifunctional amino acid” Trends in Plant Science 15 (2): 89-97 45 Szekely G, Abraham E, Cseplo A, Rigo G, Zsigmond L, Csiszar J, Ayaydin F, Strizhov N, Jasik J, Schmelzer E (2008): “Duplicated P5CS genes of Arabidopsis play distinct roles in stress regulation and developmental control of proline biosynthesis” Plant Journal, 53(1):11-28 46 Tae-Seok K and Korban S.S (2004), “Enhancing the frequency of somatic embryogenesis following Agrobacterium-mediated transformation of immature cotyledons of soybean [ Glycine max(L.) Merrill.]”, In Vitro Cell Dev Biol.—Plant, 40, pp 552–558 47 Taji T, Seki M, Satou M, Sakurai T, Kobayashi M, Ishiyama K, Narusaka Y, Narusaka M, Zhu JK, Shinozaki K (2004) “Comparative genomics in salt tolerance between Arabidopsis and Arabidopsis-related halophyte salt cress microarray” Plant Physiology, 135:1697–1709 69 using Arabidopsis Luận văn tốt nghiệp Hoàng Thị Thảo 48 Topping JF (1988), Tobacco transformation Methods of Molecular Biology, 81: 365A 49 Xinping YI and Deyue YU (2006), “Transformation of multiple soybean cultivars by infecting cotyledonary-node with Agrobacterium tumefaciens”, African Journal of Biotechnology Vol, (20), pp 1989-1993 50 Zhang CS, Lu Q, Verma DPS (1995) “Removal of feedback inhibition of D1-pyrroline-5-carboxylate synthetase, a bifunctional enzymee catalyzing the first two steps of proline biosynthesis in plants” Journal of Biological Chemistry, 270: 20491–20496 CÁC TRANG WEB 51 http://faostat.fao.org/ 52 http://www.gso.gov.vn 53 http://www.vietrade.gov.vn/ 54 http://www.vi.wikipedia.org/ 70 Luận văn tốt nghiệp Hoàng Thị Thảo PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần môi trường nuôi cấy dùng cho tái sinh đậu tương Loại môi trường Nảy mầm hạt (Germination medium) Cảm ứng tạo đa chồi (Shoot induction medium) Kí hiệu Thành phần 3,052 g/l muối B5 + 20 g/l sucrose + g/l GM agar, pH = 5,8 Bổ sung: mg/l vitamin B5 3,052 g/l muối B5 + 0,59 g/l MES + 30 SIM g/l sucrose, pH = 5,6 Bổ sung: mg/l vitamin B5 + BAP 4,3 g/l MS + 0,59 g/l MES + 30 g/l Kéo dài chồi (Shoot elongation medium) sucrose + g/l agar, pH = 5,6 SEM Bổ sung: mg/l vitamin B5 + 50 mg/l Lasparagine + 100 mg/l L-pyron glutamic acid + IAA + GA3 1,58 g/l MS + 0,59 g/l MES + 20 g/l Ra rễ (Rooting medium) RM sucrose + g/l agar, pH = 5,6 Bổ sung: IBA + mg/l vitamin B5 71 Luận văn tốt nghiệp Hoàng Thị Thảo Phụ lục Thành phần môi trường nuôi tạo dịch huyền phù khuẩn Môi trường Thành phần 10 g/l yeast extract + g/l NaCl + 10 g/l tryptone + 15 g/l YEP đặc bactor agar, pH = 10 g/l yeast extract + g/l NaCl + 10 g/l tryptone, pH = YEP lỏng LB đặc LB lỏng g/l yeast extract + 10 g/l NaCl + 10 g/l tryptone + 15 g/l agar, pH = g/l yeast extract + 10 g/l NaCl + 10 g/l try;ptone, pH = 0,316 g/l muối B5 + 3,9 g/l MES + 30 g/l sucrose + g/l CCM lỏng agar, pH = 5,4 Bổ sung: mg/l vitamin B5 + 200 mg/l AS 72 Luận văn tốt nghiệp Hoàng Thị Thảo Phụ lục 3: Thành phần loại môi trường dùng cho chuyển gen thuốc Môi trường MS đặc Thành phần 20ml/L MS I + 10ml/L MS II + 10 ml/L MS III + 10 ml/L MS IV + 10 ml/L MS V + 30 g đường + g thạch, pH = 5,8 20ml/L MS I + 10ml/L MS II + 10 ml/L MS III + 10 ml/L MS IV + 10 MS lỏng ½ MS GM ml/L MS V + 30 g đường, pH = 5,8 10 ml/L MS I + ml/L MS II + ml/L MS III + ml/L MS IV + ml/L MS V, pH = 5,8 20ml/L MS I + 10ml/L MS II + 10 ml/L MS III + 10 ml/L MS IV + 10 ml/L MS V + mg/l BAP+ 30 g đường + g thạch, pH = 5,8 20ml/L MS I + 10ml/L MS II + 10 ml/L MS III + 10 ml/L MS IV + 10 RM ml/L MS V + 0,1 mg/l IBA + 30 g đường + g thạch, pH = 5,8 WPM WPM I (20ml/L) + WPM II (10ml/L) + WPM III (10ml/L) + WPM IV đặc (10ml/L) + WPM V (10ml/L) + 30 g đường + g thạch, pH = 5,8 WPM WPM I (20ml/L) + WPM II (10ml/L) + WPM III (10ml/L) + WPM IV lỏng (10ml/L) + WPM V (10ml/L) + 30 g đường, pH = 5,8 YMP 0,4 g/l Yeast extract + 0,5 g/l K2HPO4.3H2O + 10 g/l mannitol + đặc g/l MgSO4.7H2O + 0,1 g/l NaCl + 15 g/l bacto agar, pH = YMP 0,4 g/l Yeast extract + 0,5 g/l K2HPO4.3H2O + 10 g/l mannitol + lỏng g/l MgSO4.7H2O + 0,1 g/l NaCl, pH = 73 Luận văn tốt nghiệp Hoàng Thị Thảo Phụ lục 4: Sơ đồ vector chuyển gen dùng thí nghiệm - Cấu trúc vector pBT - Cấu trúc vector pBI121 74 Luận văn tốt nghiệp Hoàng Thị Thảo MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục đích đề tài Nội dung đề tài Đối tượng nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Giả thuyết khoa học Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX L MERRILL), GIÁ TRỊ KINH TẾ VÀ GIÁ TRỊ SỬ DỤNG 1.1.1 Nguồn gốc phân loại 1.1.2 Đặc điểm sinh học 1.1.3 Giá trị kinh tế giá trị sử dụng đậu tương 1.1.4 Tình hình sản xuất đậu tương giới Việt Nam 1.2 CƠ CHẾ SINH LÝ, HÓA SINH VÀ PHÂN TỬ CỦA ĐẬU TƯƠNG TRONG ĐIỀU KIỆN HẠN 1.2.1 Sự biến đổi rễ 1.2.2 Khả cố định đạm điều kiện hạn 1.2.3 Sự biến đổi hình thái 10 1.2.4 Sự biến đổi đặc điểm sinh lý thân 10 1.2.5 Áp suất thẩm thấu điều kiện hạn 11 1.2.6 Các nhóm gen liên quan đến tính chịu hạn 12 1.3 PROLINE VÀ VAI TRÒ CỦA ENZYME P5CS TRONG CON ĐƯỜNG SINH TỔNG HỢP PROLINE 13 1.3.1 Quá trình sinh tổng hợp proline 13 1.3.2 Điều hòa trình trao đổi proline thực vật 15 1.3.3 Vai trò tích lũy proline tính chống chịu 17 75 Luận văn tốt nghiệp Hoàng Thị Thảo 1.3.4 Vai trò enzyme pyrroline-5-carboxylate synthetase tính chống chịu trồng 19 1.4 CHUYỂN GEN VÀ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG NÂNG CAO TÍNH CHỐNG CHỊU HẠN 22 1.4.1 Tạo chuyển gen 23 1.4.1.1 Chuyển gen trực tiếp 23 1.4.1.2 Chuyển gen thông qua Agrobacterium 24 1.4.1.3 Gen chuyển 24 1.4.1.4 Vector chuyển gen 25 1.4.1.5 Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 26 1.4.2 Một số thành tựu công nghệ gen tạo đậu tương chịu hạn 27 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ 28 2.1.1 Vật liệu 28 2.1.2 Hóa chất, thiết bị 28 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.2.1 Đậu tương 30 2.2.1.1 Tối ưu quy trình tái sinh đậu tương DT84 qua đa chồi 30 2.2.1.2 Phương pháp chuyển gen vào đậu tương qua nách mầm hạt chín 32 2.2.2 Phương pháp chuyển gen vào thuốc thông qua Agrobacterium 33 2.2.3 Phương pháp phân tích chuyển gen 34 2.2.3.1 Phương pháp PCR 34 2.2.3.2 Phương pháp gây hạn nhân tạo 34 2.2.3.3 Đánh giá khả chịu nước dòng thuốc chuyển gen 34 2.2.3.4 Phương pháp hóa sinh 35 2.2.4 Phương pháp tính toán xử lý số liệu 35 2.2.5 Phương pháp sinh học phân tử 35 2.2.5.1 Phương pháp tách chiết, tinh DNA 35 76 Luận văn tốt nghiệp Hoàng Thị Thảo 2.2.5.2 Phản ứng PCR 36 2.2.5.3 Phương pháp tách dòng gen 36 2.2.5.4 Thiết kế cấu trúc pBI121/P5CSM 38 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 3.1 TỐI ƯU QUY TRÌNH TÁI SINH CÂY ĐẬU TƯƠNG DT84 THÔNG QUA ĐA CHỒI 41 3.1.1 Ảnh hưởng BAP đến khả tạo đa chồi từ mầm hạt chín 41 3.1.2 Ảnh hưởng GA3 IAA tới khả kéo dài chồi 43 3.1.3 Ảnh hưởng IBA đến hiệu tạo rễ 47 3.1.4 Kết bước đầu chuyển gen gus vào đậu tương DT84 49 3.2 THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN P5CSM 51 3.3 ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ CHỊU HẠN NHÂN TẠO Ở CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN 55 3.3.1 Kết chuyển gen P5CSM vào thuốc 55 3.3.2 Kết kiểm tra thuốc chuyển gen kỹ thuật PCR 57 3.3.3 Đánh giá thuốc chuyển gen điều kiện gây hạn nhân tạo 58 3.3.4 Đánh giá khả chịu nước thuốc chuyển gen 59 3.4 KẾT QUẢ BƯỚC ĐẦU CHUYỂN GEN P5CSM VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG DT84 60 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 PHỤ LỤC 77