LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC LÊN MEN ETHANOL: KHẢO SÁT SỰ SINH TRƯỞNG CỦA NẤM MEN CỐ ĐỊNH TRONG GEL ALGINATE Nhiệm vụ luận văn: • Tiến hành trình lên men cồn nấm men cố định theo phương pháp chu kì • Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên men, pH ban đầu môi trường nồng độ đường ban đầu đến sinh trưởng khả tạo cồn nấm men cố định SVTH : BÙI THANH HUYỀN GVHD : LÊ VĂN VIỆT MẪN NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Xin chân thành cảm ơn thầy cô, gia đình bạn bè giúp đỡ hoàn thành luận văn tốt nghiệp i MỤC LỤC NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN .1 MỤC LỤC ii MỤC LỤC CÁC HÌNH .v MỤC LỤC CÁC BẢNG xii LỜI MỞ ĐẦU xiv CHƯƠNG 1 SƠ LƯỢC VỀ KĨ THUẬT CỐ ĐỊNH TẾ BÀO .1 1.1 Định nghĩa 1.2 Ưu điểm tế bào cố định so với tế bào tự 1.3 Nhược điểm tế bào cố định so với tế bào tự 2 CÁC PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH TẾ BÀO 2.1 Phương pháp gắn tế bào lên bề mặt chất mang 2.2 Phương pháp kết nối tế bào .4 2.3 Phương pháp bẫy .4 CỐ ĐỊNH TẾ BÀO TRONG GEL ALGINATE 3.1 Cơ chế tạo gel alginate ii 3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất hạt gel ỨNG DỤNG NẤM MEN CỐ ĐỊNH TRONG SẢN XUẤT ETHANOL 11 LÊN MEN CỒN BẰNG NẤM MEN Saccharomyces cerevisiae CỐ ĐỊNH TRONG GEL ALGINATE .13 5.1 Đặc điểm nấm men Saccharomyces cerevisiae .13 5.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng nấm men .13 5.3 Sự sinh trưởng hoạt tính nấm men cố định 16 5.4 Khả sinh tổng hợp cồn nấm men cố định 18 5.5 Ảnh hưởng phương pháp thiết bị đến trình lên men ethanol nấm men cố định 18 5.6 Ảnh hưởng yếu tố khác .18 19 CHƯƠNG 20 NGUYÊN LIỆU 20 1.1 Nấm men 20 1.2 Chất mang alginate 20 1.3 Môi trường lên men .21 1.4 Các hóa chất khác 21 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Nội dung nghiên cứu 22 2.2 Cố định tế bào nấm men gel alginate phương pháp bẫy 22 2.3 Khảo sát trình lên men cồn nấm men cố định theo phương pháp chu kì 23 CHƯƠNG 26 ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA NẤM MEN CỐ ĐỊNH TRONG GEL ALGINATE 26 1.1 Bố trí thí nghiệm 26 1.2 Nhận xét sinh trưởng nấm men cố định gel alginate 27 1.3 So sánh sinh trưởng nấm men cố định nấm men tự (mẫu đối chứng) điều kiện nhiệt độ lên men 35 1.4 Hoạt tính nấm men cố định điều kiện nhiệt độ lên men khác .39 ẢNH HƯỞNG CỦA pH ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA NẤM MEN CỐ ĐỊNH TRONG GEL ALGINATE 47 iii 2.1 Bố trí thí nghiệm 47 2.2 Sự sinh trưởng nấm men cố định môi trường có giá trị pH ban đầu khác 47 2.3 So sánh sinh trưởng nấm men cố định nấm men tự (mẫu đối chứng) môi trường có pH ban đầu 54 2.4 Hoạt tính nấm men cố định môi trường có giá trị pH ban đầu khác 58 ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ CHẤT KHÔ BAN ĐẦU ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA NẤM MEN CỐ ĐỊNH TRONG GEL ALGINATE .64 3.1 Bố trí thí nghiệm 64 3.2 Sự sinh trưởng nấm men cố định môi trường có nồng độ chất khô ban đầu khác 65 3.3 So sánh sinh trưởng nấm men cố định nấm men tự (mẫu đối chứng) môi trường có nồng độ chất khô ban đầu 69 3.4 Hoạt tính nấm men cố định môi trường có nồng độ chất khô ban đầu khác 72 CHƯƠNG 78 KẾT LUẬN 78 KIẾN NGHỊ 79 TÀI LIỆU THAM KHẢO 80 iv MỤC LỤC CÁC HÌNH Hình 1: Đặc điểm cấu tạo phân tử alginate [11] Hình 2: Cơ chế tạo gel theo phương pháp khuếch tán [11] Hình 3: Cơ chế tạo gel theo phương pháp tạo gel bên [11] Hình 4: Quá trình lên men cồn 11 Hình 5: Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae tự 16 Hình 6: Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae mạng lưới gel alginate 16 Hình 7: Mật độ tế bào hạt (thí nghiệm 1, chu kì I) 28 Hình 8: Mật độ tế bào hạt (thí nghiệm 1, chu kì I) 28 Hình 9: Mật độ tế bào hạt (thí nghiệm 1, chu kì II) 29 Hình 10: Mật độ tế bào hạt (thí nghiệm 1, chu kì II) 29 Hình 11: Mật độ tế bào hạt (thí nghiệm 3, chu kì I) 30 v Hình 12: Mật độ tế bào hạt (thí nghiệm 3, chu kì I) 30 Hình 13: Mật độ tế bào hạt (thí nghiệm 3, chu kì II) 31 Hình 14: Mật độ tế bào hạt (thí nghiệm 3, chu kì II) 31 Hình 15: Mật độ tế bào hạt (thí nghiệm 5, chu kì I) 32 Hình 16: Mật độ tế bào hạt (thí nghiệm 5, chu kì I) 32 Hình 17: Mật độ tế bào hạt (thí nghiệm 5, chu kì II) 33 Hình 18: Mật độ tế bào hạt (thí nghiệm 5, chu kì II) 33 Hình 19: Mật độ tế bào mẫu kiểm chứng (thí nghiệm 2) 36 Hình 20: Sự thay đổi tổng mật độ tế bào bình lên men 30oC theo thời gian (thí nghiệm – 2) .36 Hình 21: Mật độ tế bào mẫu kiểm chứng (thí nghiệm 4) 37 Hình 22: Sự thay đổi tổng mật độ tế bào bình lên men 35oC theo thời gian (thí nghiệm – 4) .37 Hình 23: Mật độ tế bào mẫu kiểm chứng (thí nghiệm 6) 38 Hình 24: Sự thay đổi tổng mật độ tế bào bình lên men 40oC theo thời gian (thí nghiệm - 6) 38 vi Hình 25: Sự thay đổi nồng độ chất khô trình lên men 30oC (thí nghiệm - 2) .40 Hình 26: Sự thay đổi nồng độ đường khử trình lên men 30oC (thí nghiệm - 2) 40 Hình 27: Sự thay đổi nồng độ chất khô trình lên men 35oC (thí nghiệm - 4) 41 Hình 28: Sự thay đổi nồng độ đường khử trình lên men 35oC (thí nghiệm - 4) 41 Hình 29: Sự thay đổi nồng độ chất khô trình lên men 40oC (thí nghiệm - 6) 42 Hình 30: Sự thay đổi nồng độ đường khử trình lên men 40oC (thí nghiệm - 6) 42 Hình 31: Ảnh hưởng nhiệt độ lên men đến nồng độ cồn thu trình lên men kết thúc 43 Hình 32: Sự thay đổi pH trình lên men 30oC (thí nghiệm - 2) .45 Hình 33: Sự thay đổi pH trình lên men 35oC (thí nghiệm - 4) .45 vii Hình 34: Sự thay đổi pH trình lên men 40oC (thí nghiệm - 6) .46 Hình 35: Mật độ tế bào hạt (thí nghiệm 7, chu kì I) 48 Hình 36: Mật độ tế bào hạt (thí nghiệm 7, chu kì I) 48 Hình 37: Mật độ tế bào hạt (thí nghiệm 7, chu kì II) 49 Hình 38: Mật độ tế bào hạt (thí nghiệm 7, chu kì II) 49 Hình 39: Mật độ tế bào hạt (thí nghiệm 9, chu kì I) 50 Hình 40: Mật độ tế bào hạt (thí nghiệm 9, chu kì I) 50 Hình 41: Mật độ tế bào hạt (thí nghiệm 9, chu kì II) 51 Hình 42: Mật độ tế bào hạt (thí nghiệm 9, chu kì II) 51 Hình 43: Mật độ tế bào hạt (thí nghiệm 11, chu kì I) 52 Hình 44: Mật độ tế bào hạt (thí nghiệm 11, chu kì I) 52 Hình 45: Mật độ tế bào hạt (thí nghiệm 11, chu kì II) .53 Hình 46: Mật độ tế bào hạt (thí nghiệm 11, chu kì II) .53 Hình 47: Mật độ tế bào mẫu kiểm chứng (thí nghiệm 8) 55 Hình 48: Sự thay đổi tổng mật độ tế bào bình lên men theo thời gian (pH đầu 5,5 - thí nghiệm – 8) 55 Hình 49: Mật độ tế bào mẫu kiểm chứng (thí nghiệm 10) .56 viii Chương 3: Kết bàn luận Hình 73: Mật độ tế bào mẫu kiểm chứng (thí nghiệm 16) Hình 74: Sự thay đổi tổng mật độ tế bào bình lên men theo thời gian (nồng độ chất khô ban đầu 25oBx - thí nghiệm 15 – 16 ) Trên môi trường có nồng độ chất khô ban đầu, sinh trưởng nấm men cố định cao nấm men tự Đối với mẫu nấm men tự (Hình 71 Chương 3: Kết bàn luận 19, 71, 73), nồng độ chất khô ban đầu tăng, tỉ lệ tế bào chết canh trường tăng nhanh ngày lên men Cụ thể với nồng độ chất khô ban đầu môi trường 15, 20 25oBx, sau 24 lên men, tỉ lệ tế bào chết canh trường mẫu kiểm chứng lên đến 16,7%, 27% 39,7% tương ứng Đó áp suất thẩm thấu môi trường cao, nấm men dễ bị co tế bào chất rối loạn trao đổi chất Áp lực thẩm thấu môi trường cao tiêu diệt tế bào nấm men Kết cho thấy, so với nấm men tự do, sinh trưởng nấm men cố định gel alginate bị ảnh hưởng giá trị áp lực thẩm thấu môi trường 3.4 Hoạt tính nấm men cố định môi trường có nồng độ chất khô ban đầu khác 72 Chương 3: Kết bàn luận Hình 75: Sự thay đổi nồng độ chất khô trình lên men (nồng độ chất khô ban đầu 20oBx - thí nghiệm 13 - 14) Hình 76: Sự thay đổi nồng độ đường khử trình lên men (nồng độ chất khô ban đầu 20oBx - thí nghiệm 13 - 14) 73 Chương 3: Kết bàn luận Hình 77: Sự thay đổi nồng độ chất khô trình lên men (nồng độ chất khô ban đầu 25oBx - thí nghiệm 15 - 16) Hình 78: Sự thay đổi nồng độ đường khử trình lên men (nồng độ chất khô ban đầu 25oBx - thí nghiệm 15 - 16) 74 Chương 3: Kết bàn luận Hình 79: Ảnh hưởng nồng độ chất khô ban đầu đến nồng độ cồn thu trình lên men kết thúc Trong hầu hết thí nghiệm sử dụng nấm men cố định, nồng độ chất khô nồng độ đường khử canh trường giảm nhanh Khi nồng độ chất khô ban đầu tăng từ 15 đến 25oBx, nồng độ đường sót cuối chu kì I thí nghiệm với nấm men cố định 1,6; 1,33 3,9 g/l (Hình 26, 76, 78) Kết thúc chu kì II, nồng độ đường sót thí nghiệm với nồng độ chất khô 15 20 Bx 3,9 1,6 g/l (Hình 26, 76) Tuy nhiên, nồng độ chất khô ban đầu tăng lên 25oBx, nồng độ đường sót cuối chu kì II cao: 35,4 g/l (Hình 78) Dường thay đổi trạng thái sinh lí tuổi đời nấm men mà hoạt tính tế bào chu kì II bị ảnh hưởng giá trị áp lực thẩm thấu nhiều chu kì I o Bảng 11: Tốc độ lên men (g/l.h) nấm men môi trường có nồng độ chất khô ban đầu khác Nồng độ chất khô ban đầu (oBx) 15 20 25 Nấm men cố định chu kì I 2,097 1,507 1,199 Nấm men cố định chu kì II 2,039 0,978 0,615 Nấm men tự (mẫu kiểm chứng) 1,293 0,548 0,237 75 Chương 3: Kết bàn luận Khi nồng độ chất khô ban đầu tăng từ 15 – 25 oBx, tốc độ lên men nấm men cố định chu kì I II giảm với mức độ khác Ở chu kì I, tốc độ lên men nấm men cố định thí nghiệm 13 (20 oBx) 72% so với thí nghiệm (15oBx) Trong thí nghiệm 15 (25oBx), giá trị 57% Ở chu kì II, tốc độ lên men thí nghiệm 13 15 48% 30% so với thí nghiệm 1.Tuy vậy, hàm lượng cồn thu cuối chu kì I chu kì II tăng tăng nồng độ chất khô ban đầu môi trường Các kết thu cho phép khẳng định nấm men cố định sinh trưởng tốt tạo hàm lượng cồn cao (10 – 12%v) môi trường lên men Điều mở triển vọng to lớn việc ứng dụng nấm men cố định vào thực tiễn sản xuất với mục đích nâng cao suất hoạt động thiết bị lên men sẵn có Cũng kết từ thí nghiệm trên, giá trị pH môi trường giảm suốt trình lên men với nồng độ chất khô ban đầu 20 25oBx Sự thay đổi pH Hình 80: Sự thay đổi pH trình lên men (nồng độ chất khô ban đầu 20oBx - thí nghiệm 13 - 14) 76 Chương 3: Kết bàn luận Hình 81: Sự thay đổi pH trình lên men (nồng độ chất khô ban đầu 25oBx - thí nghiệm 15 - 16) 77 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Sau sử dụng nấm men cố định gel alginate để thực trình lên men ethanol, có số kết luận sinh trưởng hoạt tính nấm men cố định sau: Sự phát triển sinh khối nấm men cố định trình lên men ethanol chia làm giai đoạn: Mật độ tế bào hạt tăng vào đầu chu kì, sau đó, ổn định khoảng thời gian ngắn giảm xuống vào cuối chu kì Tỉ lệ tế bào chết mật độ tế bào hạt chu kì II tăng nhanh cao chu kì I So với chu kì I, nồng độ chất khô nồng độ đường khử chu kì II giảm chậm hơn, hàm lượng cồn thu thấp Với điều kiện lên men (nhiệt độ lên men, pH nồng độ ban đầu môi trường), sinh trưởng hoạt tính nấm men cố định cao nấm men tự Khi nhiệt độ tăng từ 30 – 40oC, sinh trưởng hoạt tính nấm men cố định giảm Nhiệt độ cao thay đổi rõ nét Ở 40 oC, khả sinh trưởng sinh tổng hợp cồn nấm men cố định giảm mạnh cao thí nghiệm với nấm men tự điều kiện Khi giá trị pH ban đầu môi trường nằm khoảng 3,5 – 5,5, sinh trưởng hoạt tính nấm men cố định không bị thay đổi đáng kể Tuy nhiên, nấm men cố định bị ức chế phần giá trị pH ban đầu giảm xuống đến 2,5 78 Nấm men cố định có khả sinh trưởng tốt tạo hàm lượng cồn cao môi trường có nồng độ chất khô cao (20 – 25oBx) Như vậy, sinh trưởng hoạt tính nấm men cố định gel alginate bị ảnh hưởng điều kiện lên men tương tự nấm men tự với mức độ thấp KIẾN NGHỊ Những hướng nghiên cứu cần thực tiếp theo: • Tiếp tục khảo sát ảnh hưởng yếu tố khác cường độ khuấy đảo, hàm lượng oxygen hòa tan môi trường, kích thước hạt gel đến sinh trưởng hoạt tính nấm men cố định • Khảo sát ảnh hưởng điều kiện lên men đến tạo thành sản phẩm phụ trình lên men ethanol nấm men cố định gel alginate • Khảo sát trình lên men ethanol nấm men cố định gel alginate với tỉ lệ giống cấy cao • Nghiên cứu phương pháp bảo quản hạt gel alginate - nấm men 79 TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, 2002 Phạm Trọng Khoa, Nghiên cứu trình lên men cồn nấm men cố định gel alginate, Luận án cao học, 2002 Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Chúc, Lê Văn Việt Mẫn, Thực tập Vi sinh vật, Trường ĐH Bách khoa TPHCM, 1998 Nguyễn Đức Lượng, Cao Cường, Thí nghiệm hóa sinh học, NXB Đại Học Quốc Gia TPHCM, 2003 Atsue Tanaka, Takuo Kawamoto, "Cell immobilization" in Encyclopedia of Bioprocess technology: Fermentation, Biocatalysis and Bioseparation, John Wiley & Sons, USA, 1999, 2855 p (504-513 pp.) E Bardi, A A Koutinas, M Kanellaki, Room and low temperature brewing with yeast immobilized on gluten pellets, Process Biochemistry, 1997, 32 (8), 691 696 pp D Brady, P Nigam, R Marchant, A P McHale, Ethanol production at 45oC by alginate-immobilized Kluyveromyces marxianus IMB3 during growth on lactose-containing media, Bioprocess and Biosystems Engineering, 1997, 16 (2), 101-104 pp B Caylak, F Vardar Sukan, Comparison of different production processes for bioethanol, Turk J Chem., 1998, 22, 351 - 359 pp 80 Peter S J Cheethem, Kevin W Blunt, Christopher Bocke, Physical studies on cell immobilization using calcium alginate gels, Biotechnology and Bioengineering, 1979, 21 (12), 2155-2168 pp 10 C Chen, M C Dale, M R Okos, Minimal nutritional requirements for immobilized yeast, Biotechnology and Bioengineering, 1990, 36 (10), 993-1001 pp 11 K I Draget, "Alginate" in Handbook of hydrocolloids, Woodhead Publishing Limited, England, 2000, 450 p (379-395 pp.) 12 M A Farid, Dr., H A El-Enshasy, A M Noor El-Deen, Alcohol production from starch by mixed cultures of Aspergillus awamori and immobilized Saccharomyces cerevisiae at different agitation speeds, Journal of Basic Microbiology, 2002, 42 (3), 162-171 pp 13 N Fujii, T Oki, A Sakurai, S Suye, M Sakakibara, Ethanol production from starch by immobilized Aspergillus awamori and Saccharomyces pastorianus using cellulose carriers, Journal of Industrial Microbiology and biotechnology, 2001, 27 (1), 52-57 pp 14 Christopher D Gilson, Adrian Thomas, Ethanol production by alginate immobilised yeast in a fluidised bed bioreactor, Journal of Chemical Technology & Biotechnology, 1995, 62 (1), 38-45 pp 15 Yekta Goksungur, Nese Zorlu, Production of ethanol from beet molasses by Ca-alginate immobilized yeast cells in a packed-bed bioreactor, Turk J Biol., 2001, 25, 265 - 275 pp 16 S Gough, A P McHale, Continuous ethanol production from molasses at o 45 C using alginate-immobilized Kluyveromyces marxianus IMB3 in a continuousflow bioreactor, Bioprocess and Biosystems Engineering, 1998, 19 (1), 33-36 pp 17 M E Guenette, Z Duynjak, Effect of oleic acid on production of ethanol and fructose from glucose/fructose mixtures in an immobilized cell reactor, Acta Biotechnologica, 1995, 15 (4), 381-386 pp 18 Jan Gutewik, Bernt Nilsson, Anders Axelsson, Mass transfer effects on reaction rate for heterogeneously distributed immobilized yeast cells, Biotechnology and Bioengineering, 2002, 79 (6), 664-673 pp 19 Abdulfatai Jimoh, Effect of immobilized materials on Saccharomyces cerevisiae, AU Journal of Technology, 2004, (2), 62 - 68 pp 81 20 Ines Joekes, Paulo J S Moran, J Augusto R Rodrigues, Characterization of Saccharomyces cerevisiae immobilized onto chrysotile for ethanol production, J Chem Technol Biotechnol., 1998, 73, 54-58 pp 21 Jorge L Galazzo, James E Bailey, Growing Saccharomyces cerevisiae in calcium-alginate beads induces cell alterations which accelerate glucose conversion to ethanol, Biotechnology and Bioengineering, 1998, 36 (4), 417-426 pp 22 G Julian, J E McGhee, R W Detroy, Continuous and static fermentation of glucose to ethanol by immobilized Saccharomyces cerevisiae cells of different ages, Appl Environ Microbiol., 1982, 44 (1), 19-22 pp 23 N Kiran Sree, M Sridhar, K Suresh, I M Banat, L Venkateswar Rao, High alcohol production by repeated batch fermentation using an immobilized osmotolerant Saccharomyces cerevisiae, Journal of Industrial Microbiology and Bioechnology, 2000, 24 (3), 222-226 pp 24 J Klein, B Kressdorf, Polymers for the immobilization of whole cells and their application in biotechnology, Angewandte Makromolekulare Chemie, 1989, 166 (1), 293-309 pp 25 Koutinass A A., Gourdoupis C., Psarianos C Kaliafas A., Kanellaki M., Continuous potable alcohol production by immobilized Saccharomyces cerevisiae on mineral kissiris, Appl Biochem Biotechnol., 1991, 30 (2), 203-216 pp 26 T Lebeau, T Jouenne, G A Junter, Continuous alcoholic fermentation of glucose/ xylose mixtures by co-immobilized Saccharomyces cerevisiae and Candida shehatae, Applied Microbiology and Biotechnology, 1998, 50 (3), 309-313 pp 27 P Mallios, Y Kourkoutas, M Iconomopoulou, A A Koutinas, Lowtemperature wine-making using yeast immobilized on pear pieces, Journal of the Science of Food and Agriculture, 2004, 84 (12), 1615-1623 pp 28 Mallouchos, P Reppa, G Aggelis, Grape skins as a natural support for yeast immobilization, Biotechnology Letters, 2002, 24 (16), 1331 - 1335 pp 29 Martisen, G Skjak-Brek, O Smidsrod, Alginate as immobilization material: I Correlation between chemical and physical properties of alginate gel beads, Biotechnology and Bioengineering, 1989, 33 (1), 79-89 pp 30 Martisen, G Skjak-Brek, I Storro, Alginate as immobilization material: III Diffusional properties, Biotechnology and Bioengineering, 1992, 39 (2), 196-194 pp 82 31 F J A Merchant, A Margaritis, J B Wallace, A Vardanis, A novel technique for measuring solute diffusivities in entrapment matrices used in immobilization, Biotechnology and Bioengineering 1987, 30 (8), 936-945 pp 32 Minoru Nagashima, Masaki Azuma, Sadao Noguchi, Keiichi Inuzuka, Hirotoshi Samejima, Continuous ethanol fermentation using immobilized yeast cells, Biotechnology and Bioengineering, 1984, 26 (8), 992-997 pp 33 Nigam J N., Continuous ethanol production from pineapple cannery waste using immobilized yeast cells, J Biotechnol., 2000, 80 (2), 189-193 pp 34 J Nigam, B K Gogoi, R L Bezbaruah, Alcoholic fermentation by agarimmobilized yeast cells, World Journal of Microbiology and Biotechnology, 1998, 14 (3), 457-459 pp 35 Parascandola P., de Alteriis E., Pattern of growth and respiratory activity of Saccharomyces cerevisiae (baker's yeast) cells growing entrapped in an insolubilized gelatin gel, Biotechnol Appl Biochem., 1996, 23 (1), 7-12 pp 36 Pauline M Doran, James E Bailey, Effects of immobilization on growth, fermentation properties, and macromolecular composition of Saccharomyces cerevisiae attached to gelatin, Biotechnology and Bioengineering, 1986, 28 (1), 7387 pp 37 Porro D., de Alteriis E., Romano V., Parascandola P., Relation between growth dynamics and diffusional limitations in Saccharomyces cerevisiae cells growing as entrapped in an insolubilized gelatin gel, FEMS Microbiol Lett., 2001, 195 (2), 245-251 pp 38 Roukas T., Ethanol production from nonsterilized carob pod extract by free and immobilized Saccharomyces cerevisiae cells using fed-batch culture, Biotechnology and Bioengineering, 1994, 43 (3), 189-194 pp 39 Roukas T., Kinetics of ethanol production from carob pods extract by immobilized Saccharomyces cerevisiae cells, Appl Biochem Biotechnol., 1994, 44 (1), 49-64 pp 40 Roukas T., Continuous ethanol production from nonsterilized carob pod extract by immobilized Saccharomyces cerevisiae on mineral kissiris using a tworeactor system, Appl Biochem Biotechnol., 1996, 59 (3), 299-307 pp 41 Ruhlemann, K Richter, R Berger, Ethanolic fermentation with Saccharomyces cerevisiae cells immobilized in pectate gel, Acta Biotechnologica, 1990, 10 (1), 55-61 pp 83 42 Sheoran, B S Yadav, P Nigam, D Singh, Continuous ethanol production from sugarcane molasses using a column reactor of immobilized Saccharomyces cerevisiae HAU-1, Journal of Basic Microbiology, 1998, 38 (2), 123 - 128 pp 43 G Skjak-Brek, Erminio Murano, Sergio Paoletti, Alginate as immobilization material: II Determination of polyphenol contaminants by flourescence spectroscopy, and evaluation of methods for their removal, Biotechnology and Bioengineering, 1989, 33 (1), 90-94 pp 44 Sunil Nath, Subhash Chand, Mass transfer and biochemical reaction in immobilized cell packed bed reactors: Correlation of experiment with theory, Journal of Chemical Technology & Biotechnology, 1996, 66 (3), 286-292 pp 45 Takamitsu, "Wastewater treatment, immobilized cells" in Encyclopedia of Bioprocess technology: Fermentation, Biocatalysis and bioseparation, John Wiley & Sons, USA, 1999, 2855 p (2666-2676 pp.) 46 Tanaka A., Nakajima H., Application of immobilized growing cells, Adv Biochem Eng Biotechnol., 1990, 42, 97 - 131 pp 47 Tortora G J., Funke R R., Case C L., Microbiology, Addison Wesley Longman, Inc, 1998 48 R D Tyagi, T K Ghose, Studies on immobilized Saccharomyces cerevisiae: I Analysis of continuous rapid ethanol fermentation in immobilized cell reactor, Biotechnology and Bioengineering, 1982, 24 (4), 781-795 pp 49 J N de Vasconcelos, C E Lopes, F P de Franca, Continuous ethanol production using yeast immobilized on sugar-cane stalks, Braz J Chem Eng., 2004, 21 (3) 50 Vivienne Baillie Gerritsen, Slime with a design, Protein Spotlight, 2003, 37 51 Willaert R., Baron G., Growth kinetics of gel-immobilized yeast cells studied by on-line microscopy, Appl Microbiol Biotechnol., 1993, 39 (3), 347-352 pp 52 David Williams, Douglas M Munnecke, The production of ethanol by immobilized yeast cells, Biotechnology and Bioengineering, 1981, 23 (8), 1813-1825 pp 53 Yadav B S., Rani U., Dhamija S S., Nigam P., Singh D., Process optimization for continuous ethanol fermentation by alginate-immobilized cells of Saccharomyces cerevisiae HAU-1, J Basic Microbiol., 1996, 36 (3), 205-210 pp 84 54 Yen-Peng Ting, Gang Sun, Use of polyvinyl alcohol as a cell immobilization matrix for copper biosorption by yeast cells, Journal of Chemical Technology & Biotechnology, 2000, 75 (7), 541-546 pp 55 Yiannis Kourkoutas, Maria Kanellaki, Athannasios A Koutinas, Storage of immobilized yeast cells for use in wine – making at ambient temperature, J Agric Food Chem, 2003, 51, 654-658 pp 56 Youssef K A., Ghareib M., Khalil A A., Production of ethanol by alginateentrapped Saccharomyces cereviciae strain "14-12", Indian J Exp Biol., 1989, 27 (2), 121-123 pp 85