BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THẾ VŨ MÃ SINH VIÊN: 1101608 BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG NHỰA MACROPOROUS D101 TRONG PHÂN LẬP ISOFLAVONOID TỪ SẮN DÂY KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ HÀ NỘI - 2016 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THẾ VŨ MÃ SINH VIÊN: 1101608 BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG NHỰA MACROPOROUS D101 TRONG PHÂN LẬP ISOFLAVONOID TỪ SẮN DÂY KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ Người hướng dẫn: Ds Vũ Văn Tuấn Ds Trần Trọng Biên Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp dược HÀ NỘI - 2016 LỜI CẢM ƠN! Lời xin tỏ lòng biết ơn chân thành đối với: TS Nguyễn Văn Hân Người thầy giàu kinh nghiệm đầy nhiệt huyết định hướng, giúp đỡ thực khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Ds Vũ Văn Tuấn, Ds Trần Trọng Biên, người thầy, người anh trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình giúp đỡ hoàn thành khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Đình Luyện toàn thể thầy cô giáo, anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Công nghiệp Dược tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ hoàn thành khóa luận Tôi xin phép cảm ơn Ban giám Hiệu nhà trường, phòng Đào tạo phòng ban khác, thầy cô cán nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội dạy dỗ, bảo tận tình suốt tháng năm học tập trường Cuối xin cám ơn gia đình, bạn bè động viên, giúp đỡ suốt thời gian qua Hà Nội, ngày 13 tháng 04 năm 2016 Sinh viên Nguyễn Thế Vũ MỤC LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Vài nét Sắn dây 1.1.1 Tên gọi 1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.3 Bộ phận dùng 1.1.4 Thành phần hóa học 1.1.5 Tác dụng dược lý 1.1.6 Tính vị, công 1.1.7 Công dụng 1.1.8 Một số nghiên cứu phân lập isoflavonoid từ Sắn dây 1.2 Nhựa Macroporous .11 1.2.1 Định nghĩa 11 1.2.2 Phân loại 11 1.2.3 Đặc tính 12 1.2.4 Sản xuất nhựa Macroporous 12 1.2.5 Ứng dụng phân lập hợp chất thiên nhiên 13 CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị .15 2.1.1 Nguyên vật liệu 15 2.1.2 Hóa chất 15 2.1.3 Dụng cụ 15 2.1.4 Thiết bị 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 16 2.2.1 Nghiên cứu trình hấp phụ isoflavonoid từ dịch chiết lên nhựa Macroporous D101 16 2.2.2 Nghiên cứu trình giải hấp phụ isoflavonoid từ nhựa Macroporous D101………………………………………………………………………………………16 2.2.3 Triển khai chiết xuất phân lập isoflavonoid từ mẻ 10kg Sắn dây tươi 17 2.3 Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1 Phương pháp định lượng isoflavonoid 17 2.3.2 Phương pháp định lượng puerarin 18 2.3.3 Phương pháp chiết xuất isoflavonoid từ rễ củ Sắn dây 20 2.3.4 Phương pháp xử lý nhựa Macroporous D101 20 2.3.5 Phương pháp xác định dung lượng hấp phụ isoflavonoid nhựa Macroporous D101 20 2.3.6 Phương pháp khảo sát điều kiện giải hấp phụ isoflavonoid từ nhựa Macroporous D101 21 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23 3.1 Khảo sát trình hấp phụ isoflavonoid từ dịch chiết lên nhựa Macroporous D101 23 3.2 Khảo sát trình giải hấp phụ isoflavonoid từ nhựa Macroporous D101 26 3.2.1 Lựa chọn dung môi giải hấp phụ isoflavonoid 26 3.2.2 Khảo sát trình giải hấp phụ isoflavonoid 27 3.3 Triển khai chiết xuất phân lập isoflavonoid mẻ 10kg Sắn dây tươi 30 BÀN LUẬN 35 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 PHỤ LỤC …………………………………………………………………… 46 DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT HSCCC : High Speed Counter Current Chromatography (Sắc ký ngược dòng tốc độ cao) HPLC : High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) BV : Bed volume ( Thể tích cột nhựa) GOT : Glutamic oxaloacetic transaminase UV : Ultraviolet (Tử ngoại) tt/tt : Thể tích/thể tích tt/kl : Thể tích/khối lượng kl/kl : Khối lượng/khối lượng DANH MỤC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1 Một số isoflavonoid Sắn dây Bảng1.2 Đặc tính nhựa Macroporous D101 12 Bảng 3.1 Ảnh hưởng tỷ lệ dịch nạp cột đến dung lượng 24 hấp phụ Bảng 3.2 Quá trình rửa tạp chất nước 28 Bảng 3.3 Kết chiết xuất phân lập isoflavonoid từ mẻ 32 10kg Sắn dây tươi Bảng 3.4 Hàm lượng isoflavonoid sau giai đoạn 32 DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Tên hình Trang Hình 1.1 Sắn dây Hình 1.2 Nhựa Macroporous D101 11 Hình 1.3 Quy trình sản xuất nhựa Macroporous 13 Hình 3.1 Cột sắc ký 23 Hình 3.2 Quá trình hấp phụ isoflavonoid nhựa 24 Macroporous D101 Hình 3.3 Ảnh hưởng tỷ lệ dịch nạp cột đến dung lượng 25 hấp phụ nhựa Macroporous D101 Hình 3.4 Khả giải hấp phụ ethanol nồng độ 27 khác Hình 3.5 Quá trình rửa tạp chất nước 29 Hình 3.6 Đường cong giải hấp phụ ethanol 70% 30 Hình 3.7 Cột sắc ký PVC(9x100cm) 31 Hình 3.8 Sắc ký đồ HPLC sản phẩm thô (A) sản phẩm sau tinh chế (B) 33 Hình 3.9 Sản phẩm isoflavonoid 34 Hình 3.10 Quá trình hấp phụ 36 ĐẶT VẤN ĐỀ Sắn dây trồng phổ biến Việt Nam, rễ củ Sắn dây sử dụng lâu đời y học cổ truyền với tên gọi Cát Nhiều nghiên cứu hoạt chất nhóm isoflavonoid (puerarin, daidzin, daidzein, ) thành phần có tác dụng sinh học Nó có nhiều tác dụng dụng quan trọng chống oxy hóa, chống lão hóa, tác dụng chống ung thư, tác dụng tim mạch, tuần hoàn não [7] Các phương pháp phân lập isoflavonoid kể đến sử dụng sắc ký ngược dòng tốc độ cao (HSCCC), dùng gel agarose, sử dụng hệ dung môi Tuy nhiên, phương pháp thu sản phẩm isoflavonoid có hàm lượng tương đối thấp khó thực quy mô lớn [5], [9], [17] Những năm gần đây, nhựa Macroporous ứng dụng rộng rãi lĩnh vực chiết xuất, phân lập tinh chế hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên Chúng có nhiều ưu điểm như: làm tăng đáng kể nồng độ thành phần hoạt chất, loại bỏ lượng lớn tạp chất, không cần sử dụng đến dung môi hữu độc hại, khả lặp lại ổn định tốt, chi phí thấp, phù hợp cho sản xuất công nghiệp Nhằm xây dựng phương pháp hiệu quả, kinh tế dễ ứng dụng vào sản xuất thực tế để phân lập isoflavonoid từ Sắn dây, đề tài “Bước đầu nghiên cứu ứng dụng nhựa Macroporous D101 phân lập isoflavonoid từ Sắn dây” thực với mục tiêu: Xác định số điều kiện hấp phụ giải hấp phụ isoflavonoid từ dịch chiết Sắn dây hạt nhựa Macroporous D101 Triển khai chiết xuất phân lập isoflavonoid từ Sắn dây tươi mẻ 10kg CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Vài nét Sắn dây 1.1.1 Tên gọi Tên khoa học: Pueraria thomsonii Benth Một số tài liệu Trung Quốc ghi loài P lobata (Will) Ohwi P pseudohirsuta Tang et Wang [6] Tên khác: Bạch cát, Khau cáu (Tày), Bẳn mắm kéo (Thái) Tên nước ngoài: Kudzu bean, Kudzu vine (Anh), Koudzou (Pháp) Họ: Đậu (Fabaceae) 1.1.2 Đặc điểm thực vật Sắn dây loài dây leo, dài đến 10m, kép gồm chét Cuống chét dài, cuống chét bên ngắn Lá chét phân thành 2-3 thùy Về mùa hạ trổ hoa màu xanh tím, mọc thành chùm kẽ Quả loại đậu có nhiều lông Củ dài to, nặng tới 20kg, nhiều xơ [7] Sắn dây phân bố rộng Trung Quốc, Ấn Hình1.1 1.1Sắn Sắndây dây Hình Độ, Lào Việt Nam Ở Việt Nam, Sắn dây mọc hoang khắp miền rừng núi [2], [3] trồng từ lâu đời từ miền núi đến đồng để lấy rễ củ ăn làm thuốc Nhiều nơi thường kết hợp để làm giàn lấy bóng mát, có vùng chuyên trồng để lấy tinh bột [6] Cây ưa sáng, có biên độ sinh thái rộng, sinh trưởng phát triển tốt nhiều loài đất vùng khí hậu khác [7] 1.1.3 Bộ phận dùng Rễ củ thu hoạch từ tháng 10 đến tháng 3-4 năm sau 32 Bảng 3.3 Kết chiết xuất phân lập isoflavonoid mẻ 10kg Sắn dây tươi Khối lượng nguyên liệu (kg) Khối Khối Hàm lượng Hiệu suất lượng tinh lượng sản isoflavonoid tính theo bột phẩm thô hoạt chất (kg) (g) (%) (%) 10 2,36 102 41,35 80,34 Hiệu suất tính theo nguyên liệu (%) 1,02  Nhận xét: Phương pháp vừa thu tinh bột Sắn dây, vừa thu sản phẩm có hàm lượng isoflavonoid cao Từ 10kg nguyên liệu sau trình chiết xuất phân lập thu 2,36kg tinh bột 102g sản phẩm có hàm lượng isoflavonoid 41,35% Hiệu suất đạt 80,34% tính theo lượng isoflavonoid có nguyên liệu c Tinh chế 100g isoflavonoid thô hòa tan hoàn toàn 200ml nước, lọc thu dịch lọc, để tủ lạnh 4oC 24 giờ, lọc thu tủa isoflavonoid Sau hai lần kết tủa nước, isoflavonoid thu có hàm lượng 84,53% Kết trình làm giàu isoflavonoid tóm tắt Bảng 3.4, sắc ký đồ HPLC sản phẩm thô sản phẩm sau tinh chế thể Hình 3.8 Bảng 3.4 Hàm lượng isoflavonoid sau giai đoạn Hàm lượng isoflavonoid (%) Nguyên liệu Cao thô Isoflavonoid thô Sản phẩm sau tinh chế 1,02 4,5 41,35 84,53 33 250nm,4nm (1.00) A 450 bar 11.738/9338654 mAU 500 95.0 90.0 85.0 80.0 400 75.0 70.0 350 65.0 60.0 300 55.0 50.0 250 45.0 40.0 2.011/720760 200 18.844/398033 15.611/262645 13.521/220136 50 30.0 10.920/237799 100 35.0 6.706/949864 150 25.0 20.0 15.0 10.0 5.0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 425 250nm4nm (1.00) 400 375 12.5 15.0 17.5 11.848/7579512 0.0 mAU B 350 bar 95.0 90.0 85.0 80.0 325 75.0 300 70.0 275 65.0 250 60.0 55.0 225 50.0 200 45.0 175 40.0 150 35.0 125 30.0 75 50 25 25.0 18.964/118548 6.768/177181 100 20.0 15.0 10.0 5.0 0.0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 Hình 3.8 Sắc ký đồ HPLC sản phẩm thô (A) sản phẩm sau tinh chế (B)  Nhận xét: Cao thô (cao chiết) sau sử dụng nhựa Macroporous D101 để phân lập isoflavonoid cho sản phẩm có hàm lượng isoflavonoid tăng lên gần 10 lần (4,5% lên 41,35%) Sản phẩm sau tinh chế có hàm lượng isoflavonoid cao (84,53%) 34 A B C Hình 3.9 Sản phẩm isoflavonoid: A-isoflavonoid thô 41,35%, B-isoflavonoid sau tinh chế lần 1:68,67%, C-isoflavonoid sau tinh chế lần 2:84,53% 35 BÀN LUẬN 1.Về phương pháp chiết dung môi chiết Đề tài sử dụng phương pháp chiết ngâm điều kiện thường, sử dụng dung môi nước Phương pháp chiết ngâm điều kiện thường có thời gian chiết kéo dài hiệu suất không cao số phương pháp chiết khác đơn giản, dễ nâng quy mô, chi phí trang thiết bị thấp, ổn định quy mô nghiên cứu nên ứng dụng thực tế lớn Lựa chọn nước làm dung môi chiết xuất có ưu điểm dung môi rẻ tiền, sẵn có, không độc hại, có khả chiết xuất tốt isoflavonoid từ Sắn dây, thu tinh bột Ngoài ra, dung môi thích hợp cho trình hấp phụ isoflavonoid qua cột nhựa Macroporous D101 nước nên sử dụng dịch chiết để tiến hành trình hấp phụ Theo nghiên cứu Hai-Dong Guo[12], dung môi ethanol/nước cho hiệu suất chiết xuất isoflavonoid tốt nhất, nhiên nồng độ ethanol dịch chiết tăng khả hấp phụ isoflavonoid nhựa Macroporous giảm xuống, nồng độ ethanol 50% khả hấp phụ isoflavonoid nhựa Macroporous trở Do đó, theo Hai-Dong Guo sau chiết ethanol dịch chiết cô đặc loại ethanol sau hòa tan nước tiến hành hấp phụ lên nhựa Macroporous Quá trình tốn lượng để cô loại dung môi, khó áp dụng với quy mô công nghiệp Về phương pháp phân lập isoflavonoid nhựa Macroporous D101 Đã có nhiều phương pháp phân lập isoflavonoid từ Sắn dây như: sử dụng dung môi, sử dụng sắc ký ngược dòng tốc độ cao có số nhược điểm cần lượng lớn dung môi hữu cơ, quy mô nhỏ, tính kinh tế không cao Hướng sử dụng nhựa Macroporous D101 phân lập isoflavonoid từ Sắn dây có nhiều ưu điểm như: thực đơn giản, chi phí thấp, nhựa tái sử dụng nhiều lần Thực tế, nhựa Macroporous có nhiều 36 loại khác nhau, nhiên điều kiện sở có nhựa D101, nghiên cứu tiến hành loại nhựa Các giai đoạn quan trọng tiến hành phân lập isoflavonoid từ Sắn dây băng nhựa Macroporous D101: - Giai đoạn hấp phụ: Trong trình hấp phụ isoflavonoid lên nhựa Macroporous D101 trạng thái động, nồng độ isoflavonoid thay đổi theo phần cột nhựa Cột nhựa chia làm vùng từ xuống dưới: vùng cân – vùng chuyển khối – vùng chưa hấp phụ Trong vùng cân bằng, nhựa hấp phụ isoflavonoid nồng độ isoflavonoid vùng nồng độ isoflavonoid dịch đầu vào Vùng chưa hấp phụ nơi chất tan chưa đến nhựa trì trạng thái ban Hình 3.10 Quá trình hấp phụ (A- vùng cân bằng, B-vùng chuyển khối, C-vùng chưa hấp phụ) [8] đầu.Vùng chuyển khối phần từ vùng cân tới vùng chưa hấp phụ, diễn trình hấp phụ chất tan vào nhựa Cùng với tiếp tục trình hấp phụ, vùng cân tăng lên, vùng chuyển khối di chuyển theo trục dọc cột nhựa phía vùng chưa hấp phụ Khi vùng chuyển khối tiến đến phía cuối cột nhựa isoflavonoid bắt đầu xuất dịch sau cột Quá trình hấp phụ đạt trạng thái cân nồng độ isoflavonoid dịch sau cột nồng độ isoflavonoid dịch ban đầu Tuy nhiên, để trình hấp phụ đạt trạng thái cân lượng isoflavonoid không hấp phụ lớn Đề tài chọn điểm dừng cho trình hấp phụ tỷ lệ isoflavonoid không hấp phụ đạt 10%, mục đích để hạn chế tối đa lượng isoflavonoid không hấp phụ rút ngắn thời gian cần thiết cho trình hấp phụ Việc lựa chọn điểm dừng hấp phụ tùy thuộc vào chất lượng 37 nhựa chất cần tách lọc Hai-Dong Guo chọn điểm dừng hấp phụ tỷ lệ isoflavonoid không hấp phụ đạt 5%[12] Có nguyên nhân dẫn đến khác biệt này: Thứ nhất, Hai-Dong Guo sử dụng nhựa Macroporous H103 có dung lượng hấp phụ isoflavonoid 165,03 mg/g, cao nhiều so với dung lượng hấp phụ isoflavonoid nhựa Macroporous D101 mà đề tài sử dụng (25,8mg/g) Thứ 2, nồng độ isoflavonoid dịch nạp lên cột nhựa Hai Dong Guo cao nhiều (2mg/mL) so với nồng độ isoflavonoid dịch nạp lên cột nhựa mà đề tài sử dụng (0,5mg/mL) Thứ 3, Hai-Dong Guo sử dụng dịch nạp lên cột dung dịch chuẩn đề tài sử dụng dung dịch nạp lên cột dịch chiết, chất lượng so với HaiDong Guo Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến trình hấp phụ isoflavonoid nhựa Macroporous D101 nhiệt độ, pH dịch nạp cột, kích thước cột nhựa, tốc độ dịch hấp phụ Tỷ lệ chiều cao:đường kính cột lớn quãng đường di chuyển chất tan dài, thời gian tiếp xúc chất tan nhựa tăng lên, dung lượng hấp phụ tăng lên Theo tài liệu [12], chiều dài cột gấp 2-3 lần chiều dài vùng chuyển khối cho kết hấp phụ tốt Tốc độ dịch hấp phụ nhỏ thời gian tiếp xúc chất tan nhựa tăng lên thời gian hấp phụ tăng lên, trình hấp phụ kéo dài Theo khuyến cáo từ nhà sản xuất nhựa, tốc độ hấp phụ khoảng từ 24BV/giờ Đề tài chọn tốc độ hấp phụ 4BV/giờ dịch chiết có nồng độ isoflavonoid loãng (0,5mg/mL) để rút ngắn thời gian cần thiết cho trình hấp phụ - Giai đoạn giải hấp phụ: Sau rửa 3BV nước, lượng tạp 100mL dịch rửa Nguyên nhân tạp tan nước gần rửa hết 3BV nước rửa đầu tiên.Việc sử dụng nước để rửa tạp làm cho sản phẩm 38 sau trình rửa giải ethanol có hàm lượng cao hơn, nhiên đồng thời lượng isoflavonoid bị giải hấp phụ Càng tăng thể tích nước rửa lượng tạp rửa dần lượng isoflavonoid bị rửa theo gần không đổi Do đó, đề tài chọn 3BV nước để rửa sơ tạp Trong nồng độ ethanol khảo sát, ethanol 70% dung môi giải hấp phụ hiệu nhất: tỷ lệ giải hấp phụ isoflavonoid từ nhựa Macroporous D101 đạt 97,52% Kết lựa chọn ethanol 70% làm dung môi giải hấp phụ phù hợp với công bố [10], [12] Sử dụng ethanol nồng độ tăng từ 0% đến 70% tỷ lệ giải hấp phụ isoflavonoid tăng (18,54% lên 97,52%), tiếp tục tăng nồng độ ethanol tỷ lệ giải hấp phụ isoflavonoid lại có xu hướng giảm Có thể giải thích trình sau: Nồng độ ethanol ảnh hưởng đến độ tan isoflavonoid ảnh hưởng đến trình chuyển dịch cân nồng độ chất tan bên hạt nhựa bên dung môi Mặt khác, trình hấp phụ giải hấp phụ phụ thuộc vào chất dung môi Trong nồng độ ethanol khảo sát, ethanol 70% có lực liên kết Vander walls với chất tan lớn nhất, khả giải hấp phụ isoflavonoid cao so với nồng độ lại Về kết chiết xuất phân lập isoflavonoid mẻ 10kg Sắn dây tươi Phương pháp chiết xuất phân lập isoflavonoid từ Sắn dây tươi nhựa Macroporous cho hiệu kinh tế cao Nguyên liệu tận dụng tối đa để vừa thu tinh bột, vừa thu isoflavonoid Kết nghiên cứu cho thấy, việc làm giàu isoflavonoid với nhựa Macroporous D 101 khả quan Isoflavonoid thu có hàm lượng 41,35% cao 10 lần so với cao thô (4,5%), hiệu suất tính theo isoflavonoid toàn trình 80,34% Kết cao nhiều so với kết nghiên cứu phân lập isoflavonoid sử dụng dung môi Vũ Văn Tuấn Phạm Thị Phương Dung ( hàm lượng isoflavonoid cao tinh chế 10,41%)[5] Kết thấp kết 39 công bố Pengyue Li cs.[20] Có hai nguyên nhân dẫn đến khác biệt này, nguyên liệu Sắn dây dùng cho nghiên cứu có hàm lượng isoflavonoid thấp nhiều (1,05% trong nghiên cứu Pengyue Li cs 9,62%) Hai nhựa Macroporous sử dụng nghiên cứu mặc định D101 điều kiện sở hạn chế Tuy nhiên, hàm lượng isoflavonoid sản phẩm đạt 40% không so với sản phẩm bán thị trường quốc tế, ứng dụng sản xuất 40 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN Từ kết thu được, rút số kết luận sau: Đã khảo sát điều kiện hấp phụ giải hấp phụ isoflavonoid từ dịch chiết Sắn dây nhựa Macroporous D101 đưa thông số thích hợp: dịch nạp cột có tỷ lệ khối lượng dược liệu:thể tích dịch chiết 1:20 (g/mL) tương ứng với nồng độ isoflavonoid khoảng 0,5mg/mL, thể tích dịch nạp cột 30BV, tốc độ nạp 4BV/giờ Rửa tạp chất với 3BV nước giải hấp phụ với 2BV ethanol 70%, tốc độ 2BV/giờ Đã triển khai chiết xuất phân lập isoflavonoid từ Sắn dây tươi mẻ 10kg thu kết quả: Thu 2,36kg tinh bột 102g isoflavonoid có hàm lượng 41,35%, hiệu suất đạt 80,34% tính theo lượng isoflavonoid có nguyên liệu ĐỀ XUẤT Trên kết nghiên cứu bước đầu, làm sở cho nghiên cứu Chúng xin đề xuất: - Tiếp tục khảo sát điều kiện tối ưu cho trình hấp phụ giải hấp phụ isoflavonoid từ nhựa Macroporous D101 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, pp 880-881, PL9 Võ Văn Chi (1996), Từ điển thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr 1023-1024 Đỗ Tất Lợi (1999), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr 635-636 Ngô Văn Thu (2004), Bài giảng Dược liệu, NXB Y học, pp 38, 259, 273-281 Vũ Văn Tuấn (2014), Nghiên cứu bào chế cao khô phân lập puerarin từ sắn dây, Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Dược Hà Nội,Hà Nội Trường Đại học Dược Hà Nội, Bộ môn Dược Liệu (2006), Bài giảng dược liệu, tập 1, tr 38-40,259-289 Viện Dược liệu (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc, tập 2, NXB Khoa học & Kỹ thuật, pp 680-686 TIẾNG ANH Bo Mattiasson, Ashok Kumar, Igor Yu Galaev (2010), macroporous polymers, production propertise and biotechnological/biomedical applications, pp.211-267, CRC Press,UK Cao Xueli, Tian Yu, Zhang Tianyou, Li Xin, Ito Yoichiro (1999), "Separation and purification of isoflavones from Pueraria lobata by high-speed counter-current chromatography", Chromatography A, 855, pp 709–713 Journal of 42 10 CUI Yun-hui, WANG Zhi-ping, FAN Hua, YANG Ke (2013), "Adsorption and Isolation of Macroporous Ｒesin for Three Isoflavonoids from Puerariae Lobatae Radix", Journal of Chinese Medicinal Materials, 36,pp.650 11 Ding Zhou Hui (2000), "Macroporous resin in the application of traditional chinese medicines in the research", medical theory and practice, 13(12), pp.730 12 Hai-Dong Guo Qing-Feng Zhang, Ji-Guang Chen, Xin-Cheng Shangguang,Yu-Xian Guo (2015), "Large scale purification of puerarin from Puerariae Lobatae Radixthrough resins adsorption and acid hydrolysis", Journal of Chromatography B, 980, pp 8-15 13 Hua-Neng Xu, Chao-Hong He (2007), "Extraction of isoflavones from stem of Pueraria lobata (Willd.) Ohwi using n-butanol/water two-phase solvent system and separation of daidzein", Separation and Purification Technology, 56, pp 85-89 14 Hua-Neng Xu, Chao-Hong He (2007), "Separation and purification of puerarin with solvent extraction", Separation and Purification Technology, 56, pp 397–400 15 Jing Li, Howard A Chase (2010), "Development of adsorptive (nonionic) macroporous resins and their uses in the purification of pharmacologically-active natural products from plant sources", Natural Product Reports, 27, 1493–1510 16 L Yang Y Zhu, T Tan, J.C Janson (2007), "Coupling oligo-cyclodextrin on polyacrylatebeads media for separation of puerarin", Process Biochem, 42, pp 1075 43 17 L.Z Wang B Yang, X.Q Du (2009), "Investigation of supercritical fluid extraction ofpuerarin from Pueraria lobata", J Food Process Eng, 32, pp 682 18 Man Chen, Gan Xiaoying (2008), "Determination of Puerarin in Radix Puerariae by HPLC", China Feed, 10, pp 19 P.Y Bi, H.R Dong, Y.C Yuan (2010), "Application of aqueous twophase flotation in theseparation and concentration of puerarin from Puerariae extract", Sep Purif.Technol, 75, pp 402 20 Pengyue Li Yang Lu*, Shouying Du*, Jie Bai, Huimin Liu, Qingli Guo and Yiwang Guo (2013), "Extraction and Purification of Flavonoids from Radix Puerariae", Trop J Pharm Res, 12(6), pp 919-927 21 SIBAO CHEN, DAJIAN YANG, SHILIN CHEN, HONGXI XU, CHAN ALBERT S C (2007), "Seasonal Variations in the Isoflavonoids of Radix Puerariae", Phytochemical Analysis, 18, pp 245–250 22 X He T Tan, B Xu, J.C Janson (2004), "Separation and purification of puerarin using-cyclodextrin-coupled agarose gel media", J Chromatogr A, 1022, pp 77 23 X.L He T.W Tan, J.C Janson (2004), "Purification of the isoflavonoid puerarin by adsorption chromatography on cross linked 12% agarose", J Chromatogr A, 1057, pp 95 24 ZHANG Hong , LI Zhang Liang, WANG Hong Quan (2001), "macroporous resin in the pharmaceutical field applications", Chinese Journal of Pharmaceutical industry, 32(1), pp.40 25 Yang Hua, Tao Wanga, Mingxiao Wang, Sufang Hana, Pingyu Wana, Maohong Fanc (2008), "Extraction of isoflavonoids from Pueraria by 44 combining ultrasound with microwave vacuum", Chemical Engineering and Processing: Process Intensification, 47, pp 2256– 2261 26 Yang Li, Tan Tianwei (2008), "Enhancement of the isolation selectivity of isoflavonoid puerarin using oligo-cyclodextrin coupled polystyrenebased media", Biochemical Engineering Journal, 40, pp 189–198 45 PHỤ LỤC PHỤ LỤC PHỔ UV-VIS CỦA DUNG DỊCH CHẤT ĐỐI CHIẾU PHỤ LỤC MẬT ĐỘ QUANG CỦA DÃY DUNG DỊCH CHẤT ĐỐI CHIẾU TẠI BƯỚC SÓNG 250nm PHỤ LỤC ĐƯỜNG CHUẨN BIỂU THỊ MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA NỒNG ĐỘ ISOFLAVONOID VÀ MẬT ĐỘ QUANG 46 PHỤ LỤC PHỔ UV-VIS CỦA DUNG DỊCH CHẤT ĐỐI CHIẾU PHỤ LỤC MẬT ĐỘ QUANG CỦA DÃY DUNG DỊCH CHẤT ĐỐI CHIẾU TẠI BƯỚC SÓNG 250nm Nồng độ puerarin (µg/ml) 1,6 3,2 4,8 6,4 8,0 Mật độ quang 0,133 0,289 0,427 0,566 0,715 PHỤ LỤC ĐƯỜNG CHUẨN BIỂU THỊ MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA NỒNG ĐỘ ISOFLAVONOID VÀ MẬT ĐỘ QUANG Mật độ quang 0,9 y = 0,0901x - 0,0063 R² = 0,9996 0,7 0,5 0,3 0,1 Nồng độ (µg/l) 10 [...]... isoflavonoid từ dịch chiết lên nhựa Macroporous D101 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ isoflavonoid trong dịch chiết lên quá trình hấp phụ isoflavonoid của nhựa Macroporous D101 Xác định dung lượng hấp phụ isoflavonoid của nhựa Macroporous D101 2.2.2 Nghiên cứu quá trình giải hấp phụ isoflavonoid từ nhựa Macroporous D101 Đánh giá khả năng giải hấp phụ isoflavonoid từ nhựa Macroporous D101 của các dung môi: nước,... pháp phân lập isoflavonoid Sắn dây sử dụng nhựa macroporous D101 đã được phát triển Nhựa macroporous – một loại polyme có nhiều lỗ xốp đường kính trên 50Å là vật liệu mới, được sản xuất và ứng dụng phổ biến trong phân lập các hoạt chất thiên nhiên như flavonoids, glycosides, carotenoids [15] Năm 2013, Pengyue Li và cộng sự đã tiến hành chiết xuất và tinh chế isoflavonoid từ Sắn dây như sau: chiết isoflavonoid. .. xử lý nhựa Macroporous D101 Ngâm nhựa Macroporous D101 trong ethanol 96% trong 24giờ, sau đó ngâm nhựa lần lượt trong dung dịch HCl 5% và dung dịch NaOH 5% trong 4giờ để loại bỏ tạp chất Tiếp theo, rửa sạch nhựa đến pH trung tính bằng nước cất và ngâm nhựa trong nước cất [12] 2.3.5 Phương pháp xác định dung lượng hấp phụ isoflavonoid của nhựa Macroporous D101 Cột thủy tinh được nạp 100g nhựa Macroporous. .. Công dụng Trong y học cổ truyền, rễ Sắn dây dùng chữa các bệnh cảm sốt phong nhiệt, cổ gáy cứng đau, sởi mọc không đều, viêm ruột, kiết lị kèm theo sốt, khát nước Bột Sắn dây được dùng để pha với nước có đường uống vào mùa hè, có tác dụng giải nhiệt, làm mát cơ thể Ngoài ra, bột Sắn dây còn được dùng làm tá dược dính trong bào chế thuốc [7] 1.1.8 Một số nghiên cứu phân lập isoflavonoid từ Sắn dây Nhóm... dịch ban đầu (mL)  Dung lượng hấp phụ isoflavonoid của nhựa Macroporous D101 (C) được xác định: ( Trong đó: )= mhp : khối lượng isoflavonoid hấp phụ (mg) mn : khối lượng nhựa Macroporous D101 (g) 2.3.6 Phương pháp khảo sát điều kiện giải hấp phụ isoflavonoid từ nhựa Macroporous D101 - Khảo sát dung môi giải hấp phụ Tham khảo tài liệu [12] tiến hành thí nghiệm như sau: Cân 10g nhựa Macroporous D101 cho... cần sử dụng đến các dung môi hữu cơ độc hại; trong khi khả năng lặp lại và ổn định tốt, chi phí thấp, phù hợp cho sản xuất công nghiệp [15] 14 Nhựa Macroporous D101 đã được Dược Điển Trung Quốc 2010 quy định sử dụng trong phân lập saponin từ Tam thất và flavonoid từ lá Bạch quả Tuy nhiên, khả năng phân lập của nhựa Macroporous phụ thuộc rất nhiều vào các điều kiện tiến hành, vì vậy, việc nghiên cứu xác... 1.2 Nhựa Macroporous D101 Nhựa Macroporous hay nhựa hấp phụ Macroporous là hạt polyme hình cầu, có cấu trúc xốp với các lỗ lớn trên bề mặt, có cấu trúc mạng và diện tích bề mặt tiếp xúc lớn, được ứng dụng chủ yếu để tách các nhóm chất khác nhau [24] 1.2.2 Phân loại Dựa vào tính phân cực, nhựa Macroporous có thể được chia làm 2 loại chính: không phân cực và phân cực Theo độ phân cực được chia thành phân. .. được cho chảy qua cột nhựa Thể tích dịch cho chảy qua cột nhựa bằng 2 lần thể tích cột nhựa (BV) , giải hấp phụ với 2BV nước, giải hấp phụ với 4BV ethanol 30% Sản 10 phẩm thu được có hàm lượng puerarin và isoflavonoid tương ứng là 32% và 75% [20] Cũng trong năm 2013, CUI Yun-hui và cộng sự đã phân lập isoflavonoid từ Sắn dây bằng nhựa Macroporous XDA-5 tiến hành như sau: 10g nhựa Macroporous XDA-5 được... hơi ở những 13 điều kiện nhất định sau khi kết thúc quá trình polyme hoá để lại những lỗ hổng trong cấu trúc polyme [8] Hình 1.3 Quy trình sản xuất nhựa Macroporous [8] 1.2.5 Ứng dụng trong phân lập hợp chất thiên nhiên Những năm gần đây, nhựa Macroporous được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực chiết xuất, phân lập và tinh chế các hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên như flavonoid, glycosid, saponin, carotenoid,... chiết xuất isoflavonoid từ Sắn dây bằng ethanol 60%, hiệu suất chiết isoflavonoid đạt 90,61%, tinh chế dịch bằng phương pháp sử dụng nhiệt, hàm lượng isoflavonoid trong sản phẩm đạt 10,78% [5] Phương pháp này cho hiệu suất chiết cao, tuy nhiên hàm lượng isoflavonoid trong sản phẩm còn thấp Nhóm phương pháp sắc ký: Phương pháp sắc ký được sử dụng rất nhiều và đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu các