tiểu luận dịch công nghệ chỉnh sửa gen và liệu pháp gen

Liệu pháp gen trong lịch sử đã được định nghĩa là việc bổ sung các gen mới cho các tế bào của con người. Tuy nhiên, sự ra đời gần đây của công nghệ tái tạo gen đã cho phép một mô hình mới trong đó trình tự bộ gen của con người có thể được thao tác chính xác để đạt được một hiệu quả điều trị. Điều này bao gồm việc sửa đột biến gây bệnh, việc bổ sung các gen trị liệu vào trong trình tự bộ gen, và việc loại bỏ các gen bất lợi trong trình tự bộ gen. Báo cáo này trình bày cơ chế của phương pháp chỉnh sửa bộ gen khác nhau và mô tả các nền tảng nuclease phổ biến, bao gồm nucleases kẽm ngón tay, phiên mã kích hoạt giống như nucleases effector (Talens), meganucleases, và CRISPR / hệ thống Cas9. Sau đó chúng tôi tóm tắt những tiến bộ đạt được trong việc áp dụng chỉnh sửa gen tới các khu vực khác nhau của gen và liệu pháp tế bào, bao gồm cả chiến lược kháng virus, miễn dịch, và điều trị các rối loạn di truyền monogenic. Những thách thức hiện tại và triển vọng tương lai của chỉnh sửa gen và liệu pháp tế bào cũng được thảo luận.

CÔNG NGHỆ CHỈNH SỬA GEN VÀ LIỆU PHÁP TẾ BÀO

Morgan L Maeder 1 và Charles A Gersbach 2,3,4

1 Editas Y, Cambridge, Massachusetts, USA

2 Department of Biomedical Engineering, Đại học Duke, Durham, Bắc Carolina, Hoa Kỳ

3 Center cho Gen và Sinh Học Máy Tính, Đại học Duke, Durham, Bắc Carolina, Hoa Kỳ

4 Department phẫu thuật chỉnh hình, Trung tâm Y tế Đại học Duke, Durham, Bắc Carolina, Hoa

KỳCorrespondence: Morgan L Maeder, Editas Y, 300 Third Street, Tầng, Cambridge, Massachusetts

02142, USA E-mail: morgan.maeder@editasmed.com; Charles A Gersbach, Cục Kỹ thuật y sinh,Phòng 1427, FCIEMAS, 101 Khoa học Drive, Box 90.281, Đại học Duke, Durham, Bắc Carolina

27.708-0.281, Hoa Kỳ E-mail: charles.gersbach@duke.edu

Nhận ngày 06 Tháng 11 2015; Được chấp nhận ngày 07 tháng một năm 2016

bài viết xem trước được chấp nhận trực tuyến 12 Tháng một 2016; Tạm trực tuyến công

bố ngày 16 tháng 2 năm 2016

Liệu pháp gen trong lịch sử đã được định nghĩa là việc bổ sung các gen mới cho các

tế bào của con người Tuy nhiên, sự ra đời gần đây của công nghệ tái tạo gen đã cho phépmột mô hình mới trong đó trình tự bộ gen của con người có thể được thao tác chính xác đểđạt được một hiệu quả điều trị Điều này bao gồm việc sửa đột biến gây bệnh, việc bổ sungcác gen trị liệu vào trong trình tự bộ gen, và việc loại bỏ các gen bất lợi trong trình tự bộgen Báo cáo này trình bày cơ chế của phương pháp chỉnh sửa bộ gen khác nhau và mô tảcác nền tảng nuclease phổ biến, bao gồm nucleases kẽm ngón tay, phiên mã kích hoạtgiống như nucleases effector (Talens), meganucleases, và CRISPR / hệ thống Cas9 Sau đóchúng tôi tóm tắt những tiến bộ đạt được trong việc áp dụng chỉnh sửa gen tới các khu vựckhác nhau của gen và liệu pháp tế bào, bao gồm cả chiến lược kháng virus, miễn dịch, vàđiều trị các rối loạn di truyền monogenic Những thách thức hiện tại và triển vọng tương laicủa chỉnh sửa gen và liệu pháp tế bào cũng được thảo luận

Việc thực hiện các cơ sở di truyền của bệnh di truyền dẫn đến khái niệm ban đầucủa liệu pháp gen trong đó "ngoại sinh DNA 'tốt' được sử dụng để thay thế các DNA bị lỗi

ở những người bị khuyết tật về gen" [1] Hơn 40 năm nghiên cứu về chỉnh sửa gen và liệupháp gen đã cho thấy những ý tưởng đơn giản về thay thế gen có nhiều thách thức và phức

tạp về mặt kỹ thuật hơn để thực hiện cả hai một cách an toàn và hiệu quả hơn so với đánhgiá ban đầu Nhiều nhà nghiên cứu các thách thức đó tập trung vào những hạn chế cơ bảntrong khả năng kiểm soát chính xác vật liệu di truyền đã được giới thiệu đến các tế bào.Tuy nhiên, các công nghệ bổ sung của gen ngoại sinh đã đạt được tiến bộ đáng kể trongthời gian này và bây giờ đang cho các kết quả lâm sàng đầy hứa hẹn trên một loạt các chiếnlược và chỉ dẫn y tế [2] Tuy nhiên, một số thách thức vẫn còn Lồng ghép các gen điều trịvào bộ gen để duy trì ổn định trong các tế bào tái tạo có thể có tác động khó lường về biểuhiện gen và tác dụng ngoài ý muốn trên các gen bên cạnh [3] Hơn nữa, một số gen tácđộng quá lớn nên khó sử dụng các vector chuyển gen Cuối cùng, việc bổ sung các genngoại sinh có thể không luôn luôn trực tiếp giải quyết các đột biến chiếm ưu thế hoặc loại

bỏ các vật liệu di truyền không mong muốn như bộ gen của virus hoặc các thụ thể Để giảiquyết những hạn chế cơ bản của phương pháp thông thường để bổ sung gen, các lĩnh vựcchỉnh sửa gen đã nổi lên để làm cho chính xác, thay đổi nhắm mục tiêu vào chuỗi hệ gen

Ở đây chúng ta xem xét sự phát triển thú vị gần đây về việc dễ sử dụng, đặc hiệu, côngnghệ chỉnh sửa gen và ứng dụng để điều trị một loạt các bệnh và rối loạn

CƠ CHẾ CHỈNH SỬA GEN

Nền tảng cho lĩnh vực chỉnh sửa gen là những khám phá mục tiêu phá vỡ sợi đôiDNA (DSBs) có thể được sử dụng để kích thích bộ máy điều khiển sửa chữa tế bào nộisinh Phá vỡ trong ADN thường được sửa chữa thông qua 2 con đường : sửa chữa tươngđồng (HDR) hoặc kết thúc con đường không tương đồng (NHEJ) (Hình 1) HDR dựa trên 1mạch tương đồng bị hỏng và tiếp theo phá vỡ sự phụ thuộc của mạch đó [5] Báo cáo từphòng thí nghiệm của Maria Jasin chứng minh rằng hiệu quả của mục tiêu thông qua tái tổhợp tương đồng ở tế bào động vật có vú thì gen có thể được kích thích bởi một số tác độngcùng cường độ bằng cách giới thiệu một DSB tại nơi diễn ra mục tiêu [6,8] Ngoài ra, chứcnăng NHEJ để sửa chữa DSBs mà không có một mẫu trực tiếp của đoạn kết thúc [9] Conđường sửa chữa này là dễ bị lỗi và thường kết quả trong việc đặt hoặc xóa (indels) tại nơidiễn ra phá vỡ Sự kích thích của NHEJ bởi DSBs chương trình cụ thể đã được sử dụng đểphá vỡ các gen mục tiêu trong một loạt các loại tế bào và các sinh vật bằng cách tận dụngnhững indels chuyển khung đọc của gen[10,11,12,13,14] Với khả năng điều khiển sửachữa DNA nội sinh của tế bào, nó bây giờ có thể thiết kế một loạt các thay đổi gen trongtrình tự bộ gen một cách cụ thể

No donor template Donor template with point mutation Donor template with insertion

insertions and deletions (indels) These

often result in frameshifts generating

premature stop codons

*

*

*

GENE LOẠI TRỰC TIẾP/ ĐỘT BIẾN

Đây là hình thức đơn giản nhất của chỉnh sửa gen sử dụng các chất dễ bị lỗi củaNHEJ để giới thiệu indels nhỏ tại các nơi diễn ra mục tiêu Cổ điển NHEJ trực tiếpreligates chưa qua chế biến DNA đầu trong khi thay thế - NHEJ (còn được gọi làmicrohomology qua trung gian kết thúc tham gia, hoặc MMEJ) yêu cầu cuối cùng cắt bỏsau ủ của vùng ngắn mạch đơn của microhomology và DNA tiếp theo cuối thắt [15] Trongtất cả các giai đoạn của chu kỳ tế bào, cả hai con đường NHEJ sửa chữa DNA với một tần

số cao đột biến dẫn đến sự hình thành của indels tại nơi diễn ra của giờ nghỉ [15,16]

Khi nơi diễn ra mục tiêu nuclease được đặt trong vùng mã hóa của một gen, cácindels kết quả sẽ thường gây ra frameshifts Trong các bệnh như bệnh teo cơ Duchenne(DMD), nơi xóa gen dẫn đến frameshifts và mất sau đó của chức năng protein, mục tiêuindels NHEJ gây ra có thể được sử dụng để khôi phục lại các khung đọc chính xác của gen[17] Tuy nhiên, các ứng dụng phổ biến nhất của đột biến mục tiêu liên quan đến việc gâyđột biến khung đọc với mục đích loại trực tiếp gen Ngược lại với liệu pháp gen truyềnthống, đó là hạn chế việc bổ sung các chuỗi ngoại sinh vào hệ gen, khả năng knock out gennội sinh sẽ mở ra một con đường mới của liệu pháp điều trị, trong đó chức năng của gen cóthể bị phá vỡ vĩnh viễn Một ứng dụng của phương pháp này là nhằm mục tiêu tăng chiphối của các đột biến chức năng, chẳng hạn như những người tìm thấy trong bệnhHuntington Căn bệnh này được gây ra bởi một sự mở rộng lặp lại trên một alen của genhuntingtin (HTT), dẫn đến việc sản xuất một protein HTT đột biến độc Loại bỏ alen đột biến này bằng cách chỉnh sửa gen NHEJ dựa trên có thể cung cấp lợi ích lâm sàng chobệnh nhân Huntington [18,19] Trong các bệnh khác, đôi khi nó có thể được điều trị để loại

bỏ các chức năng bình thường của một gen Ví dụ nổi bật nhất của việc này là phương phápgien chỉnh sửa hiện trong các thử nghiệm lâm sàng để điều trị HIV, trong đó loại trực tiếpcủa CCR5, đồng thụ thể HIV lớn, cấm nhiễm virus của các tế bào T biến đổi [20,21,22].Cuối cùng, chứ không phải là trực tiếp nhắm vào hệ gen của con người, loại trực tiếp củacác gen quan trọng trong việc xâm nhập vi khuẩn hoặc virus dựa trên DNA có thể phục vụđiều trị chống vi khuẩn hiệu quả.

LOẠI BỎ GENE

Ngoài các indels tương đối nhỏ do NHEJ, nó có thể xóa phân đoạn lớn của DNAbằng chầu liên tục với hai DSBs Thật vậy, nó đã được chứng minh rằng giới thiệu đồngthời của hai lần nghỉ nhắm mục tiêu có thể làm phát sinh xóa gen lên đến vài megabaseskích thước [25 - 29] Phương pháp này rất hữu ích cho các chiến lược điều trị mà có thểyêu cầu loại bỏ toàn bộ một yếu tố di truyền, chẳng hạn như một khu vực tăng cường, như

đã được đề xuất để điều trị hemoglobin bởi việc xoá BCL11A hồng cầu khu vực cụ thểenhancer [30,31] Ngoài ra, trong các bệnh như DMD nơi xóa gen khác nhau nội bộ có thểchuyển gen ra khỏi khung , việc xoá bỏ chủ ý của một hay nhiều exon có thể sửa khungđọc và khôi phục các biểu hiện của cắt ngắn, nhưng một phần chức năng protein [32 - 37]

Trái ngược với những đột biến khó lường do NHEJ, nhắm mục tiêu DSBs có thểgây ra chỉnh sửa gen chính xác bằng cách kích thích HDR với một mẫu nhà tài trợ ngoạisinh được cung cấp Hoạt động chủ yếu trong S và G2 giai đoạn của chu kỳ tế bào, HDR tựnhiên sử dụng các nhiễm sắc chị như một khuôn mẫu để sửa chữa DNA [15,16,38] Tuynhiên, một chuỗi các nhà tài trợ ngoại sinh được cung cấp cũng có thể được sử dụng nhưmột mẫu sửa chữa [39] Như vậy codelivery của nucleases nhắm mục tiêu cùng với mộtvector nhắm mục tiêu có chứa tương đồng ADN đến trang web nghỉ phép chỉnh sửa genhiệu quả cao HDR-dựa [6,7,8] Bất kỳ sự khác biệt tự hiện diện trong các mẫu của nhà tàitrợ do đó có thể được đưa vào các locus nội sinh để sửa chữa bệnh gây đột biến, như đãđược chứng minh trong nhiều bằng chứng nghiên cứu khái niệm [40-50] Trong khiplasmid có truyền thống được các nguồn thông dụng nhất của DNA các nhà tài trợ, gần đâycác nghiên cứu đã chỉ ra rằng oligonucleotide mắc kẹt đơn (ssODNs), với ít nhất là 80 cặpbazơ tương đồng, có thể phục vụ các mẫu nhà tài trợ như hiệu quả cho HDR [51,52,53].Đối với các tế bào mà khó có thể transfect, vector virus như integrase lentivirus thiếu hoặcvirus adeno liên quan (AAV) cũng có thể được sử dụng như là một nguồn tài trợ DNA [54

- 57] Trong thực tế, bản chất tự nhiên của recombinogenic AAV, đặc biệt là khi kết hợpvới các chủng lai đặc biệt hiệu quả như AAV-DJ , làm cho các vector chuyển gen đến nơicần chuyển [54 - 62]

Mặc dù liệu pháp gen truyền thống đã sử dụng thành công vector virus để đưa cácgen ngoại lai vào hệ gen, không có khả năng kiểm soát các trang web của hội nhập của cácvirus này làm tăng mối lo ngại nghiêm trọng của đột biến ghép, như đã được nhấn mạnhtrong các thử nghiệm lâm sàng đầu mà sử dụng các vec tơ retrovirus chuột [63, 64,65].Việc sử dụng một mẫu của nhà tài trợ, trong đó chèn gen mong muốn hai bên là cánh taytương đồng bao gồm các trình tự giống với trang web cắt nuclease, cho phép trang webchèn DNA cụ thể thông qua DSB-induced HDR [66] Mục tiêu đưa các gen trị liệu vào cáctrang web được xác định trước trong bộ gen, chẳng hạn như "bến cảng an toàn" locus, làmgiảm bớt nguy cơ của đột biến ghép và cho phép mức độ cao của sự biểu hiện gen phổ biến[67,68,69] Để duy trì kiểm soát biểu hiện gen của yếu tố điều hòa tự nhiên, kiểu sao chép

tự nhiên các bệnh lên gen có thể được chèn vào các locus nội sinh tương ứng và do đó làdưới sự kiểm soát của promoter riêng [70,71] Một cơ chế thay thế cho chèn gen chuyểnmục tiêu là sử dụng DSBs nuclease gây ra để tạo nhô ra tương thích trên DNA của nhà tàitrợ và các trang web nội sinh , dẫn đến thắt NHEJ qua trung gian của các chuỗi DNA chèntrực tiếp vào mục tiêu locus [72]

NUCLEASES MỤC TIÊU

Bởi vì DSB chỉnh sửa gen gây ra dựa trên các cơ chế sửa chữa nội sinh của tế bào,

nó là phổ áp dụng cho bất kỳ loại tế bào hoặc sinh vật mà sử dụng các phương pháp để sửachữa DNA Các yếu tố quan trọng để thực hiện bất kỳ các phương pháp chỉnh sửa gen là sự

ra đời chính xác của một DSB mục tiêu Bốn nền tảng lớn hiện đang tồn tại gây nhữngDSBs trang web cụ thể: nucleases ngón tay kẽm (ZFNs), phiên mã kích hoạt giống nhưeffector (Tale) - nucleases (Talens), meganucleases, và gần đây nhất là CRISPR / hệ thốngCas (Hình 2)

NUCLEASES NGÓN TAY KẼM

Kẽm ngón tay (ZF) protein là những lớp học phong phú nhất của các yếu tố phiên

mã và miền ngón tay kẽm Cys2-His2 là một trong những lĩnh vực DNA phổ biến nhất mãhóa trong con người genome [73] Cấu trúc tinh thể của Zif268 đã phục vụ như là cơ sởcho sự hiểu biết nhận DNA bằng ngón tay kẽm [74,75,76] Trong sự hiện diện của mộtnguyên tử kẽm, miền ngón tay kẽm tạo thành một cấu trúc ββα nhỏ gọn với phần α-xoắncủa mỗi ngón tay tiếp xúc với 3 hoặc 4 bp trong rãnh chính của các ngón tay DNA[74,77,78] Tandem trong một mảng ngón tay kẽm quấn quanh DNA để ràng buộc trình tựmục tiêu mở rộng như vậy mà một protein ba ngón tay liên kết với một trang web mục tiêu

9 bp Cấu trúc mô-đun của Zif268 gợi ý rằng các protein này có thể cung cấp một khuônkhổ hấp dẫn cho kỹ thuật mô típ DNA mới [79] nỗ lực ban đầu để thiết kế ZFS với đặctrưng độc đáo dựa trên một tập hợp đơn giản các quy tắc đã có một số thành công [80,81]

Tuy nhiên, thư viện liên kết kết hợp với các phương pháp lựa chọn dựa trên chứng

tỏ là một cách tiếp cận mạnh mẽ hơn để tạo ra các ngón tay cá nhân với đặc thù gắn DNAmới [82 - 87] Sau thành công này, lĩnh vực này đã phải đối mặt với những thách thức của

kỹ thuật mảng đa ngón tay với các trang web mục tiêu mới đủ lâu để có thể duy nhất trong

CCCCAACTGNNNNNNGCCGTAGAG Fokl Zinc finger domains

hệ gen phức tạp Các "lắp ráp mô đun" phương pháp tiếp cận dựa trên bộ sưu tập của cácmodule dụng một ngón tay, hoặc xác định trong tự nhiên protein [88] hoặc chọn để ràngbuộc cụ thể ba địa điểm mục tiêu cặp base [89 - 92], sau đó được liên kết song song để tạo

ra protein mới [93 - 97] Ngoài ra, phương pháp lựa chọn trên, chẳng hạn như mở, có thểđược sử dụng để chọn các protein mới từ libraries [98] Ngẫu nhiên khi nhiều hơn đáng kểlao động, phương pháp này sẽ đưa vào tài khoản tương tác bối cảnh phụ thuộc giữa cácláng giềng ngón tay trong một mảng đa ngón tay [76,99,100,101] Một số phương pháp,bao gồm cả những người sử dụng bởi Sangamo Biosciences và nền tảng Sigma-AldrichCompoZr, kết hợp hai cách tiếp cận để lắp ráp các mảng tiểu thuyết sử dụng tài liệu lưu trữcủa đơn vị đa ngón tay đã được chọn trước đó để làm việc tốt cùng [13,102,103,104]

Các ngón tay kẽm nuclease (ZFN) công nghệ có thể được thực hiện bởi những khámphá phần miền DNA và lĩnh phân cắt của FokI chức năng hạn chế endonuclease độc lậpcủa mỗi 0,105 khác Bằng cách thay thế các tên miền ràng buộc FokI DNA với một miềnngón tay kẽm, nó có thể tạo ra nucleases khảm với đặc thù ràng buộc mới [106,107] Bởi vìcác chức năng nuclease FokI như một dimer, hai ZFNs ràng buộc sợi đối diện của DNAđược yêu cầu để khởi phát một DSB [108] Thí nghiệm ban đầu cho thấy DSBs ZFN gây ra

có thể được sử dụng để sửa đổi bộ gen thông qua hoặc NHEJ hoặc HDR [10,109,110] vàcông nghệ này sau đó đã được sử dụng để sửa đổi thành công gen soma nhân [40,66,98] vàcác tế bào gốc đa năng [42,44,111,112,113]

TALENs

Việc phát hiện ra một đơn giản mã số một - một mệnh lệnh đặc hiệu DNA-bindingprotein câu chuyện từ các mầm bệnh Xanthomonas một lần nữa dấy lên khả năng thú vịcho thiết kế mô-đun của các protein gắn DNA mới [114,115] Bảo tồn 33-35 amino axitcâu chuyện lặp đi lặp lại mỗi ràng buộc một cặp base đơn của DNA với độ đặc hiệu quyếtđịnh bởi hai dư hypervariable Cấu trúc tinh thể của những câu chuyện liên kết với DNAtiết lộ rằng mỗi lặp lại tạo thành một cấu trúc hai xoắn nối với nhau bằng một vòng lặptrong đó trình bày cặn hypervariable vào rãnh lớn như protein bọc xung quanh các DNAtrong một cấu trúc superhelical [116,117] Những lặp đi lặp lại câu chuyện mô - đun có thểđược liên kết với nhau để xây dựng một mảng dài với độ đặc hiệu DNA - ràng buộc tùychỉnh [118,119,120,121,122]

Nhiều nền tảng tồn tại đối với các mảng kỹ thuật Các phương pháp đơn giản nhất

sử dụng kỹ thuật nhân bản tiêu chuẩn để lắp ráp những câu chuyện từ kho lưu trữ củaplasmid, gồm câu chuyện duy nhất lặp đi lặp lại [123,124] Một số phương pháp vừa thôngdựa trên hệ thống nhân bản Golden Gate để lắp ráp nhiều phần cùng một lúc trong mộtphản ứng duy nhất [120,122,125,126,127,128,129] Các phương pháp phổ biến nhất lắp ráp[130,131,132] hoặc thắt độc lập kỹ thuật nhân bản [133]

Xây dựng ra nền tảng đặt bởi một thập kỷ chỉnh sửa gen ZFN gây ra, việc phát hiện

ra câu chuyện như một miền DNA có thể lập trình được nhanh chóng theo sau bởi các kỹthuật của Talens Giống như ZFNs, những câu chuyện đã được hợp nhất với lĩnh vực xúctác của endonuclease FokI và hiển thị với chức năng như dimer để tách mục tiêu trang webDNA dự định của họ [119,121,134,135] Cũng tương tự như ZFNs, Talens đã được chứngminh là gây ra hiệu quả cả NHEJ và HDR trong somatic nhân [119,132,134] và các tế bàogốc đa năng [53,136]

Talens có thể được thiết kế để nhắm mục tiêu hầu như bất kỳ trình tự cho rằng kiềmchế chỉ nhắm mục tiêu của họ là yêu cầu cho 5 'T, theo quy định của miền N-terminalkhông đổi, cho từng mảng Phạm vi nhắm mục tiêu không giới hạn này, ngoài sự dễ dàngcủa kỹ thuật protein mới, làm cho Talens một nền tảng hấp dẫn để chỉnh sửa gen mục tiêu.Ngược lại, kích thước lớn và tính chất lặp đi lặp lại của các mảng Tale trình bày một trởngại cho giao hàng trong cơ thể của các protein này Trái ngược với một 30 amino axitngón tay kẽm, mà liên kết với ba cơ sở của DNA, Talens yêu cầu 34 axit amin để xác địnhmột cặp cơ sở duy nhất và khác biệt kích thước này có thể ngăn cấm giao của cả haimonome Talen trong một vector virus duy nhất với dung lượng bao bì hạn chế Ngoài ra,bản chất không ổn định của lặp song song, chẳng hạn như những người có mặt trongTalens, làm cho nó khó khăn để đóng gói các trình tự lặp đi lặp lại trong các hệ thống củavirus Thật vậy, Talens giao bởi lentivirus đã được chứng minh là dễ bị sắp xếp lại, [137]mặc dù hiện tượng này có thể được giảm nhẹ bằng cách đa dạng hóa codon giữa lặp [138]

hệ thống adenovirus cũng đã được sử dụng để cung cấp thành công Talens [139]

MEGANUCLEASES

Công nghệ Meganuclease liên quan đến việc tái kỹ thuật đặc trưng gắn DNA của tựnhiên endonuclease homing Các lớp lớn nhất của endonuclease homing là gia đìnhLAGLIDADG, bao gồm nổi đặc trưng và thường được sử dụng I-CreI và I-SCEI enzyme

[140] Thông qua sự kết hợp của thiết kế hợp lý và lựa chọn, các endonuclease homing cóthể được tái thiết kế để nhắm mục tiêu mới trình tự [141 – 148] Trong khi nhiều nghiêncứu cho thấy hứa hẹn cho việc sử dụng trong chỉnh sửa meganucleases gen [149 – 152],các lĩnh vực DNA và phân tách của endonuclease homing rất khó để tách biệt, và nhữngkhó khăn tương đối của các protein đặc trưng kỹ thuật với cuốn tiểu thuyết có truyền thốnggiới hạn việc sử dụng này nền tảng Để giải quyết hạn chế này, các protein khảm bao gồm

sự hợp nhất của meganucleases, ZFS, và câu chuyện đã được thiết kế để tạo ra các enzymemonomeric cuốn tiểu thuyết mà tận dụng các mối quan hệ ràng buộc của ZFS và những câuchuyện và những đặc phân cắt của meganucleases [153- 156] Một lợi thế tiềm năng liênquan đến công nghệ meganuclease là DSB-hình thành bởi các enzym này kết quả trongmột 3' nhô ra, có thể là recombinogenic hơn cho HDR hơn 5' nhô ra tạo ra bởi FokI phâncắt Ngoài ra, meganucleases là những lớp học nhỏ nhất của nucleases thiết kế, làm chochúng có khả năng tuân theo tất cả các phương pháp chuyển gen tiêu chuẩn Trong thực tế,nhiều monome meganuclease có thể dễ dàng đóng gói thành vector virus đơn đồng thời tạo

ra nhiều DSBs

CRISPR / nucleases Cas

CRISPR-Cas nucleases RNA-hướng dẫn được bắt nguồn từ một hệ thống miễn dịchthích nghi tiến hóa của vi khuẩn để bảo vệ chống lại các plasmid xâm lược và virus Nhiềuthập kỷ của công việc điều tra hệ thống CRISPR ở loài vi sinh vật khác nhau đã làm sáng

tỏ một cơ chế mà chuỗi ngắn xâm nhập axit nucleic được đưa vào CRISPR loci [157] Sau

đó, họ được phiên mã và chế biến thành CRISPR RNA (crRNAs), cùng với một crRNAsxuyên kích hoạt (tracrRNAs), phức tạp với (Cas) protein CRISPR liên quan ra lệnh đặchiệu của sự phân cắt DNA bằng Cas nucleases qua Watson-Crick cơ sở ghép nối giữa axitnucleic [158,159,160,161] Xây dựng tắt của hai cuộc nghiên cứu cho thấy rằng ba thànhphần cần thiết cho các loại hình II CRISPR nuclease hệ thống là các protein Cas9, cáccrRNA trưởng thành và tracrRNA [162, 163] Doudna, Charpentier và các cộng sự đã chothấy thông qua trong thí nghiệm in vitro tách DNA rằng hệ thống này có thể được giảmxuống hai thành phần của sự hợp nhất của các crRNA và tracrRNA thành một đơn hướngdẫn RNA (gRNA) Hơn nữa, họ đã cho thấy rằng lại nhắm mục tiêu của phức Cas9 /gRNA đến các trang web mới này có thể được thực hiện bằng cách thay đổi trình tự củamột phần ngắn của gRNA [164] Sau đó, một loạt các ấn phẩm chứng minh rằng CRISPR /

hệ thống Cas9 có thể được thiết kế cho sửa đổi di truyền có hiệu quả trong các tế bào độngvật có vú [165 - 168] Nói chung các nghiên cứu này đã đẩy CRISPR / công nghệ Cas9thành tâm điểm chú ý của các lĩnh vực gen chỉnh sửa.

Giới hạn chuỗi duy nhất của hệ thống CRISPR / Cas xuất phát từ sự cần thiết củamột motif protospacer liền kề (PAM) nằm ngay 3 'để trang web mục tiêu Trình tự PAM làđặc trưng cho loài Cas9 Ví dụ, trình tự PAM 5'-NGG-3 'là cần thiết để ràng buộc và sựphân tách DNA bằng các Cas9 thường được sử dụng từ Streptococcus pyogenes[169,170,171] Tuy nhiên, Cas9 biến thể với PAMS cuốn tiểu thuyết có thể được thiết kếbởi sự phát triển đạo, do đó mở rộng đáng kể số lượng các mục tiêu tiềm năng chuỗi 172,173 Cas9 phức với crRNA và tracrRNA trải qua một sự thay đổi về hình dạng, liên kếtvới các họa tiết PAM toàn bộ gen xét hỏi các chuỗi trực tiếp ngược dòng để xác định bổsung liên tục với các gRNA [171,174,175,176,177] Sự hình thành của một DNA-RNAheteroduplex tại một lần xuất hiện trang web mục tiêu cho phép phân tách của các DNAmục tiêu của Cas9-RNA phức tạp [171]

Không giống như ba hệ thống nuclease thảo luận ở trên, CRISPR / Cas nucleaseskhông yêu cầu kỹ thuật của các protein mới cho mỗi trang web mục tiêu DNA Sự dễ dàng

so với các trang web mới có thể được nhắm mục tiêu, chỉ đơn giản bằng cách thay đổi khuvực ngắn của gRNA rằng mệnh lệnh đặc hiệu, làm cho hệ thống này là một phương pháprất hấp dẫn cho giới thiệu DSBs trang web cụ thể Ngoài ra, do các protein Cas9 khôngđược kết nối trực tiếp đến các gRNA, hệ thống này là rất cao tuân theo để ghép thông quaviệc sử dụng đồng thời nhiều gRNAs để gây DSBs ở nhiều locus Bởi vì sự đa dạng phongphú của hệ thống CRISPR tự nhiên đã được understudied phần lớn, nó là hợp lý để mongđợi nhiều công nghệ gen chỉnh sửa CRISPR mới dựa trên xuất hiện, bao gồm cả khôngCas9 dựa trên loại hệ thống II như được mô tả gần đây RNA-hướng dẫn endonucleaseCpf1 và những người khác [178,179]

ĐẶC TRƯNG CỦA NUCLEASES MỤC TIÊU

Hiệu quả của việc chỉnh sửa gen mục tiêu dựa trên bóc DNA một cách cụ thể trongkhi giảm thiểu, hoặc lý tưởng ngăn chặn, thiệt hại tài sản thế chấp để phần còn lại của bộgen Vì lý do này, các đặc trưng của nucleases nhắm mục tiêu là một trọng tâm chính củalĩnh vực gen chỉnh sửa Sửa đổi các miền dimerization FokI tăng mạnh đặc trưng của ZFNs

và Talens bằng cách yêu cầu hai heterodimers bắt buộc để ràng buộc các DNA mục tiêu

trong một định hướng và khoảng cách [180,181,182,183] Gợi nhớ về kiến trúc của ZFNs

và Talens cụ thể, sự bất hoạt của Cas9 lĩnh nuclease để tạo Cas9 nickases hoặc hợp nhấtCas9-FokI đã tăng đặc hiệu bằng cách yêu cầu hai phức gRNA / Cas9, mỗi bóc một sợiđơn của DNA, để đến với nhau ở khoảng cách chính xác và định hướng để tạo ra một DSB[184,185,186,187] Ngoài ra, giảm độ dài của bổ sung giữa các gRNA và các trang webmục tiêu 20-17 nucleotide làm tăng độ đặc của sự phân cắt DNA bằng Cas9 từ S pyogenes[188] Gần đây, cấu trúc hướng dẫn kỹ thuật protein đã được sử dụng để phát triển tiểuthuyết Cas9 biến thể với tăng tính đặc hiệu [189,190] Những cải thiện có ý nghĩa giảm bớtnhững lo ngại ban đầu về tính đặc hiệu của CRISPR / Cas nucleases [191,192,193] Tuynhiên, không phụ thuộc vào công nghệ nuclease, rất khó để xác định đầy đủ các định off-mục tiêu chia tách trong hệ gen phức tạp Cho đến gần đây, các nghiên cứu đặc hiệu đãđược phần lớn giới hạn một ưu tiên, trong việc xác định silic tiềm năng của các chươngtrình off - mục tiêu có thể được thông qua xét nghiệm thay thế với các protein tinh khiếthoặc tích hợp virus tại vỡ hai sợi [194,195,196] Tổng trình tự bộ gen của một số ít nhái cónguồn gốc từ các tế bào đơn đã xác nhận việc thiếu hiệu off - mục tiêu trong các quần thểlựa chọn, nhưng không thể xác định các trang web được cắt ở tần số thấp trong quần thể tếbào số lượng lớn [197,198,199] DNA bởi chIP-seq đã được rất nhiều thông tin cho sự hiểubiết mục tiêu công nhận, nhưng phần lớn các off-mục tiêu gắn kết không phải là tiên đoáncủa các hoạt động nuclease [200,201,202] Gần đây phát triển của các phương pháp, xétnghiệm gen toàn không thiên vị để xác định đặc đã đáng kể nâng cao các khả năng để mô

tả đặc nuclease với một mức độ nhạy cảm mà không phải là trước đây có thể[195,203,204,205,206] Những phương pháp mới có khả năng sẽ rất quan trọng để thúc đẩynucleases gen chỉnh sửa nhắm mục tiêu là phương pháp điều trị

CUNG CẤP CÔNG CỤ TÁI TẠO GEN

Phân phối hiệu quả và an toàn để nhắm mục tiêu các tế bào và các mô đã được tháchthức lâu dài với các chiến lược điều trị gen thành công (Hình 3) Thách thức này kéo dàiđến phương pháp tái tạo gen tốt, nơi nucleases, và trong trường hợp của CRISPR / hệ thốngCas9, một gRNA, phải được giao một cách hiệu quả Hơn nữa, hàm lượng của các nhà tàitrợ mẫu DNA là quan trọng để đảm bảo sự tái tổ hợp tương đồng hiệu quả Thời gian vàcường độ của biểu nuclease là một tham số quan trọng cho các cấp độ của cả hai trên mụctiêu và off-mục tiêu hoạt động nuclease Phát huy tối đa hiệu quả của giao hàng là đặc biệt

quan trọng vì chỉnh sửa gen là một sự kiện ngẫu nhiên vốn chỉ diễn ra ở một phần nhỏ củacác tế bào trong đó các nuclease được thể hiện.

Các phương pháp thông báo rộng rãi nhất để giới thiệu nucleases vào các tế bàotrong các nghiên cứu bằng chứng của nguyên tắc là thâm chuyển của DNA plasmid mangnuclease và biểu hiện gRNA cassette Mặc dù đơn giản và dễ hiểu, phương pháp này khôngphải là lý tưởng đối với hầu hết các liệu pháp gen và tế bào do hiệu quả thấp của thâmchuyển của tế bào sơ cấp, độc tế bào liên quan đến DNA, sự hiện diện của các chuỗi DNAcủa vi khuẩn trong xương sống plasmid, và khả năng tích hợp ngẫu nhiên của mảnhplasmid vào hệ gen Do đó, electroporation của mRNA mã hóa các nucleases và gRNAstạo ra thông qua phiên mã trong ống nghiệm đã trở thành một phương pháp ưa thích cho exvivo chỉnh sửa gen của tế bào sơ cấp có liên quan đến liệu pháp gen, chẳng hạn như các tếbào T và tế bào gốc tạo máu (bào gốc tạo máu)[168,207] Ngoài ra, trực tiếp cung cấp cácprotein nuclease tinh khiết hoặc phức Cas9 protein gRNA cũng đã rất thành công trongviệc đạt được mức độ cao của chỉnh sửa gen, hoặc bằng electroporation [208,209] hoặcnhiệt hạch để peptide tế bào thâm nhập, mà obviates electroporation qua trung gian[210,211,212] Sửa đổi gRNAs tiếp tục tăng cường sự vững mạnh của biên tập gen trong tếbào sơ cấp bằng cách tăng sự ổn định và / hoặc giảm phản ứng miễn dịch bẩm sinh [207]

Introduce modified cells back into patient Deliver targeted nucleases

to cells by physical, chemical,

DNA

RNA

Lipid nanoparticle Protein

Lentivirus

Extract stem or progenitor cells

Direct delivery to patient using viral or non-viral delivery vehicle

Những nghiên cứu đã chỉ ra rằng tập thể bằng cách hạn chế thời gian hoạt động nucleasevới ngắn ngủi mRNA hoặc protein, tác dụng off-mục tiêu có thể được giảm thiểu so vớigiao plasmid dựa trên nỗ lực trong tương lai có thể sẽ tận dụng lợi thế của các công thứchạt nano mới nổi cho hiệu quả và không cung cấp riêng lẽ [213]

Đối với nhiều ứng dụng, vector virus vẫn là phương tiện tối ưu để tối đa hóa hiệuquả của giao hàng trong khi giảm thiểu khả năng gây độc [214] Trong đó, vectorlentivirus đã được tối ưu hóa cho truyền cao hiệu quả của các tế bào T và bào gốc tạo máu;Tuy nhiên những vectơ cũng tích hợp vào hệ gen và ổn định thể hiện hàng hóa gen chuyểncủa họ Để tận dụng lợi thế của tính hiệu quả của truyền lentivirus trong khi hạn chế thờigian biểu hiện nuclease trong các tế bào mục tiêu, vector lentivirus integrase thiếu đã được

sử dụng để cung cấp các công cụ thoáng qua bộ gen chỉnh sửa để nhắm mục tiêu các tế bào[57,111] Tương tự như vậy, hệ thống adenovirus cũng có thể đạt cao mức độ dẫn truyềncủa một loạt các loại tế bào ex vivo trong khi cung cấp chỉ thoáng qua biểu hiện nuclease[20,137,139] Cả lentivirus và vec tơ adenovirus cũng có lợi thế về khả năng đóng gói đầy

đủ để thực hiện nhiều nucleases hoặc cassette biểu gRNA để chỉnh sửa multiplex nhiều loci[215]

Trong gen in vivo chỉnh sửa lại những thách thức bổ sung mục tiêu mô cụ thể, phân

bố của các vector, và miễn dịch và biocompatibility của người vận chuyển Mặc dù một số

ví dụ về các giao plasmid đến gan đã cho thấy bằng chứng của nguyên tắc quan trọng trongviệc biên tập gen in vivo trong các mô hình động vật [216, 217, 218], dịch các chiến lược

để điều trị con người không phải là chưa khả thi Tuy nhiên, trong cơ thể chuyển gen vớiAAV đến gan, mắt, hệ thần kinh và cơ xương và tim đã cho thấy hiệu quả ấn tượng trong

cả hai mô hình tiền lâm sàng và thử nghiệm lâm sàng [219] Do đó, AAV cũng là một hệthống đầy hứa hẹn cho giao nucleases gen chỉnh sửa để nhắm mục tiêu tissues [220] Hơnnữa, các đặc tính recombinogenic tự nhiên của AAV làm cho nó một vector mong muốngiao các mẫu sửa chữa DNA [56,61,62,221,222,223,224] Mặc dù một số nghiên cứu đãchỉ ra sự tái tổ hợp nhắm mục tiêu của locus gen với vec tơ AAV trong sự vắng mặt củanucleases [58 , 71], hiệu quả thấp hơn so với các báo cáo có nucleases đáng kể Thêmnhững nghiên cứu cần thiết để hiểu được các dấu hiệu bệnh có thể được mạnh mẽ giảiquyết ở hiệu quả thấp của biên tập gen