ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM LÊ DUY TOÀN Tên đề tài: NGHIÊN CỨU KẾT QUẢ BIẾN NẠP GEN CHỊU HẠN ZmNF-YB2 VÀO MỘT SỐ DÒNG NGÔ VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : Công nghệ Sinh học - Công nghệ Thực phẩm Khóa học : 2010 - 2014 Thái Nguyên, năm 2014 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM LÊ DUY TOÀN Tên đề tài: NGHIÊN CỨU KẾT QUẢ BIẾN NẠP GEN CHỊU HẠN ZmNF-YB2 VÀO MỘT SỐ DÒNG NGÔ VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : Công nghệ Sinh học - Công nghệ Thực phẩm Khóa học : 2010 - 2014 Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Văn Đồng (Viện Di truyền Nông nghiệp) Th.S Lương Thị Thu Hường (Khoa CNSH&CNTP - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên) Thái Nguyên, năm 2014 LỜI CẢM ƠN Được quan tâm, tận tình giảng dạy thầy giáo, cô giáo khoa CNSH&CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên trang bị vốn kiến thức khoa học định để tham gia nghiên cứu thực đồ án tốt nghiệp Thời gian thực tập để thực đồ án tốt nghiệp thời gian vô quý giá để trau dồi thêm kiến thức thực tế, củng cố lý thuyết học ghế nhà trường, tiếp cận với công nghệ tiên tiến ngành theo học Xuất phát từ kính trọng, cho phép gửi lời biết ơn sâu sắc đến thầy giáo PGS.TS Nguyễn Văn Đồng – Phó Giám đốc Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam Thầy tận tình bảo, dìu dắt suốt trình thực đề tài Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến cô giáo ThS Lương Thị Thu Hường công tác Khoa CNSH&CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên quan tâm, động viên, tận tình giảng dạy, củng cố kiến thức giúp hoàn thành khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến KS Nguyễn Hữu Kiên người dành nhiều thời gian quý báu để trực tiếp hướng dẫn thực nghiên cứu đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể giáo viên Khoa CNSH&CNTP, Trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên dạy bảo suốt trình học tập Cuối cho phép gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè quan tâm, động viên, giúp đỡ suốt thời gian qua Thái Nguyên, ngày 24 tháng năm 2014 Sinh viên Lê Duy Toàn DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT cDNA : Complementary DNA Cs : Cộng CTAB : Cetyl trimethyl ammonium bromide DNA : Deoxyribonucleic Acid EDTA : Ethylene diamine tetraacetate EtBr : Ethydium Bromide FAO : Food and Agriculture Organization NN&PTNT : Nông nghiệp phát triển nông thôn NTCB : Ngô tẻ Cao Bằng PEG : Polyethylene Glycol PCR : Polymerase Chain Reaction RNA : Axit ribonucleic RT-PCR Kĩ thuật Real Time PCR SPAD : Chỉ số đánh giá hàm lượng diệp lục SSC : Saline-sodium citrate TAE : Tris-acetate-EDTA TE : Tris-EDTA CCTB : Chiều cao trung bình MỤC LỤC Trang PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích đề tài 1.3 Yêu cầu đề tài 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược ngô 2.1.1 Nguồn gốc lan truyền ngô 2.1.2 Đặc điểm nông sinh học ngô 2.1.3 Giá trị dinh dưỡng hạt ngô 10 2.1.4 Vai trò ngô 10 2.2 Tình hình sản xuất ngô giới Việt Nam 11 2.2.1 Tình hình sản xuất ngô giới 11 2.2.2 Tình hình sản xuất ngô Việt Nam 12 2.3 Các phương pháp chuyển gen thực vật 13 2.3.1 Phương pháp chuyển gen trực tiếp 13 2.3.2 Phương pháp chuyển gen gián tiếp 13 2.4 Tổng quan gen ZmNF-YB2 14 2.4.1 Tình hình nghiên cứu gen ZmNF-YB2 giới 14 2.4.2 Tình hình nghiên cứu gen ZmNF-YB2 nước 16 PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1 Vật liệu nghiên cứu 18 3.1.1 Vật liệu thực vật 18 3.1.2 Hóa chất dụng cụ thí nghiệm 18 3.2 Phạm vi, địa điểm thời gian nghiên cứu 19 3.2.1 Phạm vi nghiên cứu 19 3.2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 19 3.3 Nội dung nghiên cứu 19 3.4 Phương pháp nghiên cứu 19 3.4.1 Kiểm tra có mặt gen ZmNF-YB2 ngô chuyển gen phương pháp PCR 19 3.4.2 Đánh giá khả chịu hạn ngô chuyển gen ZmNF-YB2 giai đoạn non hệ T1 22 3.4.3 Kiểm tra có mặt gen ZmNF-YB2 ngô chuyển gen hệ T1 phương pháp Southern Blot 24 3.5 Phương pháp xử lý số liệu 26 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 4.1 Kết xác định có mặt gen chuyển ZmNF-YB2 dòng ngô chuyển gen hệ T0 phương pháp PCR 27 4.1.1 Kết tách chiết DNA tổng số 27 4.1.2 Kết phân tích PCR 28 4.2 Đánh giá khả chịu hạn dòng ngô chuyển gen hệ T1 giai đoạn non 30 4.2.1 Kết đánh giá khả chịu hạn hệ T1 thông qua tiêu đo chiều cao 30 4.2.2 Kết PCR kiểm tra có mặt gen chuyển ZmNF-YB2 dòng ngô hệ T1 35 4.3 Kết phân tích, xác định có mặt gen ZmNF-YB2 dòng ngô chuyển gen hệ T1 phương pháp lai Southern Blot 37 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 5.1 Kết luận 40 5.2 Kiến nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU Trang Bảng 2.1: Tình hình sản xuất ngô giới từ năm 2009 – 2012 11 Bảng 2.2:Tình hình sản xuất ngô Việt Nam từ năm 2009 – 2012 12 Bảng 3.1: Danh sách dòng ngô hệ T0 sử dụng để đánh giá khả chịu hạn hệ T1 18 Bảng 3.2: Trình tự mồi phân tích PCR 21 Bảng 4.1: Kết đo chiều cao trung bình dòng ngô chuyển gen hệ T1 trước xử lý hạn đợt 30 Bảng 4.2: Kết đo chiều cao trung bình dòng sau đợt xử lý hạn 31 Bảng 4.3: Chiều cao trung bình dòng ngô lô tưới nước đầy đủ (lô số 1) 34 Bảng 4.4: Các lựa chọn dòng để tiến hành phân tích Southern Blot 37 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1: Hình ảnh ngô Hình 2.2: Hình ảnh rễ mầm, rễ đốt, rễ chân kiềng ngô Hình 2.3: Hình ảnh ngô Hình 2.4: Cấu trúc vector biểu gen NTCB ZmNFY-B2 17 Hình 4.1: Kết điện di kiểm tra DNA tổng số gel agarose 1% 27 Hình 4.2: Kết điện di sản phẩm PCR kiểm tra có mặt gen ZmNF-YB2 hệ T0 28 Hình 4.3: A) Kết điện di sản phẩm PCR kiểm tra có mặt gen ZmNF-YB2 hệ T0; B) Marker 1kb plus 29 Hình 4.4: Biểu đồ so sánh chiều cao trung bình dòng ngô chuyển gen 21NF.2 dòng đối chứng Vh1.2 32 Hình 4.5: Biểu đồ so sánh chiều cao trung bình dòng ngô chuyển gen 3NF.2, 13NF.2, 15NF.2, 22NF.2 với dòng đối chứng C8H9.2 33 Hình 4.6: Kết điện di kiểm tra DNA tổng số gel agarose 1% 35 Hình 4.7: Kết điện di sản phẩm PCR kiểm tra có mặt gen chuyển ZmNF-YB2 hệ T1 36 Hình 4.8: Kết lai Southern Blot sản phẩm cắt gen ZmNF-YB2 với mẫu dò tương ứng từ dòng ngô chuyển gen hệ T1 38 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cây ngô có tên khoa học Zea mays L., thuộc chi Maydeae, họ Graminaae Ngô ngũ cốc quan trọng cung cấp lương thực cho người, cung cấp nguyên liệu chế biến thức ăn chăn nuôi Ngô năm loại lương thực giới (ngô, lúa nước, lúa mì, sắn khoai tây) [3] Năm 2010 tổng sản lượng ngô toàn giới đạt 851173441 thu hoạch từ 164305102 (FAO,2014) [15] Ở Việt Nam ngô loại lương thực quan trọng thứ hai sau lúa, có phát triển rộng khắp, liên tục Hiện việc chọn tạo giống ngô tốt, bệnh, chất lượng cao, phẩm chất tốt, chống chịu điều kiện ngoại cảnh khắc nghiệt vấn đề quan tâm đặt hàng đầu Bên cạnh phương pháp chọn lọc truyền thống, với phát triển vượt bậc công nghệ sinh học đại tạo thực vật chuyển gen nói chung, dòng ngô chuyển gen nói riêng mang đặc tính quý mà phương pháp truyền thống thường tốn nhiều thời gian thực Kĩ thuật chuyển gen vào ngô nghiên cứu trở thành công cụ quan trọng từ năm 1990 Hai phương pháp thường áp dụng vào chuyển gen ngô chuyển gen trực tiếp súng bắn gen chuyển gen gián tiếp vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Một số tính trạng tập trung nghiên cứu chuyển gen vào ngô năm qua nâng cao tính chịu mặn hay tính chịu hạn [1] Ở Việt Nam nguồn gen ngô bảo tồn Viện nghiên cứu ngô với khoảng 400 mẫu giống thụ phấn tự 3.000 dòng [9] Hạn hán yếu tố bất thuận làm giảm sinh khối thân, suất ngô giới Việt Nam, vùng trồng ngô dựa vào nguồn nước tự nhiên Theo Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam diện tích trồng ngô phụ thuộc vào nước mưa chiếm khoảng 70%, diện tích chủ động nước tưới chiếm khoảng gần 30% Ở nước ta lượng mưa hàng năm phổ biến từ 1700 – 2000 mm đủ cho nhu cầu phát triển ngô, nhiên lượng mưa tập trung theo mùa nên mùa khô ngô không đủ nước để phát triển Để cải thiện suất điều kiện hạn hán trồng nông nghiệp nói chung ngô nói riêng gặp phải nhiều khó khăn hiểu biết chế sinh học xảy điều kiện hạn hán hạn chế [12], [29] Hệ số di truyền tính trạng thấp, tính chất đoán trước thời gian xảy hạn hán, mức độ hạn hán [11], [13], [18], [27] Do cần tiếp cận phát triển phương pháp nghiên cứu để cải thiện suất trồng điều kiện hạn hán Kỹ thuật chuyển gen vào ngô đạt thành công ban đầu trình phát triển giống ngô chuyển gen chịu hạn Năm 2008, công ty Mosanto, công ty đầu tư mạnh công nghệ chuyển gen giới, chuyển gen chịu hạn vào ngô thành công [1] Ở Việt Nam vấn đề chuyển gen chịu hạn vào dòng ngô tập trung tiến hành nghiên cứu [1] Tuy nhiên kết nghiên cứu kiêm tốn chưa có công bố thức [1] Với tiến khoa học kĩ thuật, Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công Nghệ Tế Bào Thực Vật – Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam tạo số dòng ngô chuyển gen chịu hạn ZmNF-YB2 phương pháp biến nạp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens bước đầu thu kết Việc chuyển gen vào dòng ngô thành công bước đầu, có ý nghĩa quan trọng việc chọn, tạo giống ngô biến đổi gen nước ta Các dòng ngô chuyển gen tạo cần xác định có mặt xác định biểu gen chuyển với mục đích khẳng định khả chịu hạn so với giống ngô gốc Do nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu kết biến nạp gen chịu hạn ZmNF-YB2 vào số dòng ngô Việt Nam“ 1.2 Mục đích đề tài Xác định có mặt biểu gen chuyển ZmNF-YB2 số dòng ngô chuyển gen 1.3 Yêu cầu đề tài - Xác định có mặt hay không gen chịu hạn ZmNF-YB2 số dòng ngô chuyển gen hệ T0 T1 kĩ thuật PCR 30 dòng cho kết dương tính với gen chuyển ZmNF-YB2 Mẫu đối chứng âm không lên băng sản phẩm chứng tỏ kết PCR công nhận 4.2 Đánh giá khả chịu hạn dòng ngô chuyển gen hệ T1 giai đoạn non 4.2.1 Kết đánh giá khả chịu hạn hệ T thông qua tiêu đo chiều cao Chúng tiến hành gieo trồng dòng ngô T1 từ hạt T0 thực đánh giá khả sinh trưởng, phát triển thông qua đo chiều cao Khi dòng ngô hệ T1 có từ 4-6 thật tiến hành đo chiều cao lần thứ trước xử lý hạn đợt Kết lần đo thứ trình bày bảng 4.1 Bảng 4.1: Kết đo chiều cao trung bình dòng ngô chuyển gen hệ T1 trước xử lý hạn đợt (Đơn vị: Cm) Lô TT Tên dòng Vh1.1 3NF.1 13NF.1 15NF.1 21NF,1 22NF.1 C8H9.1 Lô Chiều cao TB lần đo thứ 13 13 12,75 12,1 12,45 11,85 12,1 TT Tên dòng 10 11 12 13 14 Vh1.2 3NF.2 13NF.2 15NF.2 21NF.2 22NF.2 C8H9.2 Chiều cao TB lần đo thứ 12,2 12,3 12,5 12,5 12 12,5 11,7 Từ kết bảng 4.1 cho thấy chiều cao trung bình dòng thấp 11,7cm (C8H9) dòng có chiều cao trung bình lớn nhất 13cm (Vh1.1; 3NF.1) Chứng tỏ điều kiện tưới nước đầy đủ tất dòng ngô hệ T1 phát triển tương tối đồng đủ điều kiện để tiến hành xử lý hạn lần 31 Chúng tiến hành đo chiều cao trung bình dòng ngô sau xử lý hạn đợt xử lý hạn đợt 2, thu kết trình bày bảng 4.2 Bảng 4.2: Kết đo chiều cao trung bình dòng sau đợt xử lý hạn (Đơn vị:Cm) Chiều cao TB Chiều cao TB dòng sau xử lý hạn đợt dòng sau xử lý hạn đợt TT Tên dòng Vh1.1 16,3 18,3 Vh1.2 14 15,1 3NF.1 15,8 18,7 3NF.2 14,75 16 13NF.1 15,7 18,7 13NF.2 14,6 16,2 15NF.1 14,85 17,95 15NF.2 14,2 15,8 21NF.1 15,65 18,35 10 21NF.2 14,4 15,8 11 22NF.1 15,4 18,16 12 22NF.2 14,4 15,95 13 C8H9.1 15,2 17,65 14 C8H9.2 13,7 14,8 Dựa vào kết bảng 4.2 đưa biểu đồ so sánh chiều cao trung bình dòng chuyển gen dòng gốc tạo chúng (dòng đối chứng) để đánh giá khả sinh trưởng dòng chuyển gen điều kiện xử lý hạn hán (lô số 2) 32 Dòng ngô chuyển gen 21NF tạo từ dòng ngô gốc ban đầu Vh1 nên lựa chọn dòng 21NF.2 (dòng 21NF thuộc lô số 2, kí kiệu 21NF.2) dòng Vh1.2 để so sánh chiều cao với (hình 4.4) Biể u đồ so s ánh chiề u cao trung bình dòng ngô chuyể n gen 21NF.2 dòng đối chứng Vh1.2 18 16 14 Cm 12 Vh1.2 10 21NF.2 2 Các giai đoạn xử lý hạn Hình 4.4: Biểu đồ so sánh chiều cao trung bình dòng ngô chuyển gen 21NF.2 dòng đối chứng Vh1.2 Ghi chú: 1: Chiều cao trung bình trước xử lý hạn; 2: Chiều cao trung bình sau xử lý hạn đợt 1; 3: Chiều cao trung bình sau đợt xử lý hạn đợt Từ hình 4.4 cho thấy: - Giai đoạn trước xử lý hạn đợt 1, chiều cao trung bình dòng 21NF.2 12cm, dòng Vh1.2 12,2cm Ở giai đoạn dòng có phát triển tương đối đồng - Giai đoạn sau xử lý hạn đợt 1, chiều cao trung bình dòng 21NF.2 14.35cm cao 0,35cm so với dòng đối chứng Vh1.2 (14cm) - Giai đoạn sau xử lý hạn đợt 2, chiều cao trung bình dòng 21NF.2 15,8cm cao 0,7cm so với dòng đối chứng Vh1 (15,1cm) Kết phân tích cho thấy, trước xử lý hạn dòng chuyển gen 21NF.2 dòng đối chứng Vh1.2 có phát triển tương đối đồng Nhưng sau đợt xử lý hạn dòng 21NF.2 tỏ có khả phát triển tốt so với dòng đối chứng 33 Các dòng ngô chuyển gen 3NF, 13NF, 15NF, 22NF tạo từ dòng ngô gốc ban đầu C8H9, nên lựa chọn dòng gốc ban đầu C8H9.2 (lô số 2) để so sánh chiều cao trung bình với dòng 3NF.2, 13NF.2, 15NF.2, 22NF.2 (lô số 2) So sánh trình bày hình 4.5 Cm Biểu đồ so sánh dòng ngô chuyển gen dòng đối chứng 18 16 14 12 10 3NF.2 13NF.2 15NF.2 22NF.2 C8H9.2 Các giai đoạn xử lý hạn Hình 4.5: Biểu đồ so sánh chiều cao trung bình dòng ngô chuyển gen 3NF.2, 13NF.2, 15NF.2, 22NF.2 với dòng đối chứng C8H9.2 Ghi chú: 1: Chiều cao trung bình trước xử lý hạn; 2: Chiều cao trung bình sau xử lý hạn đợt 1; 3: Chiều cao trung bình sau đợt xử lý hạn đợt Từ hình 4.5 cho thấy: - Giai đoạn trước xử lý hạn đợt 1, dòng ngô chuyển gen có chiều cao trung bình từ 12,3-12,5cm chiều cao trung bình dòng đối chứng 12,85cm - Giai đoạn sau xử lý hạn đợt 1, dòng 15NF.2 có chiều cao 14,2cm dòng có chiều cao trung bình thấp số dòng chuyển gen Dòng 3NF.2 có chiều cao trung bình 14,75 cm dòng cao số dòng chuyển gen Chiều cao trung bình dòng chuyển gen 3NF.2, 13NF.2, 15NF.2 22NF.2 14,5cm cao 0,78cm so với chiều cao trung bình dòng đối chứng C8H9 (13,72cm) Sau đợt xử lý hạn cho thấy, điều kiện hạn hán dòng chuyển gen có phát triển tốt so với dòng đối chứng 34 - Giai đoạn sau xử lý hạn đợt 2, dòng 15NF.2 có chiều cao 15,8cm dòng có chiều cao trung bình thấp số dòng chuyển gen Dòng 13NF.2 có chiều cao trung bình 16,27cm dòng cao số dòng chuyển gen Chiều cao trung bình dòng chuyển gen 3NF.2, 13NF.2, 15NF.2 22NF.2 16,02cm cao 1,19cm so với chiều cao trung bình dòng đối chứng C8H9.2 (14,83cm) Sau đợt xử lý hạn thứ hai cho thấy, điều kiện hạn hán dòng chuyển gen có phát triển tốt so với dòng đối chứng Kết thút đợt xử lý hạn thứ 2, tiến hành đo chiều cao tất dòng ngô lô tưới nước đầy đủ (lô số 1) để kiểm tra có khác hay không dòng chuyển gen dòng đối chứng điều kiện tưới nước đầy đủ (bảng 4.3) Bảng 4.3: Chiều cao trung bình dòng ngô lô tưới nước đầy đủ (lô số 1) TT Tên dòng (Đơn vị: Cm) Chiều cao TB dòng lô tưới nước đầy đủ Vh1.1 (đối chứng) 18,3 C8H9.1 (đối chứng) 17,65 3NF.1 18,7 13NF.1 18,7 15NF.1 17,95 21NF.1 18,35 22NF.1 18,16 Từ bảng 4.3 cho thấy sau kết thúc đợt xử lý hạn lần 2: - Dòng Vh1.1 có chiều cao trung bình 18,3cm tương đương so với chiều cao trung bình dòng chuyển gen 21NF.1 - Dòng 15NF.1 có chiều cao 17,95cm dòng có chiều cao trung bình thấp số dòng chuyển gen Dòng 3NF.1 dòng 13NF.1 có chiều cao trung bình 18,7cm dòng cao số dòng chuyển gen Chiều cao trung bình dòng chuyển gen 3NF.1, 13NF.1, 15NF.1 22NF.1 35 18,3cm cao 0,65cm so với chiều cao trung bình dòng đối chứng C8H9.1 (17,65cm) Sau đợt xử lý hạn thứ cho thấy, điều kiện tưới nước đầy đủ dòng chuyển gen có phát triển tốt so với dòng đối chứng Do dòng chuyển gen hệ T0 có số lượng hạt ít, không đủ để tiến hành lặp lại thí nghiệm lần nên chưa thể đưa kết luận chắn dòng ngô chuyển gen có khả sinh trưởng, phát triển tốt dòng đối chứng (dòng gốc) ban đầu 4.2.2 Kết PCR kiểm tra có mặt gen chuyển ZmNF-YB2 dòng ngô hệ T Khi T1 có từ 4-6 thật tiến hành thu mẫu tách chiết DNA tất dòng thuộc lô số (lô xử lý hạn) để xác định mang gen chuyển dòng trước xử lý hạn đợt Mẫu DNA thu sau tách chiết kiểm tra chất lượng cách lấy ngẫu nhiên mẫu dòng điện di agarose 1% Lượng DNA tổng số dùng điện di 4µl 1µl loadingdye, điện di 120V 30 phút (hình 4.6) Hình 4.6: Kết điện di kiểm tra DNA tổng số gel agarose 1% Ghi chú: 1: 3NF.2.2 4: 13NF.2.6 7: 21NF.2.4 10 22NF.2.9 13: C8H9.2.7 2: 3NF.2.3 5: 15NF.2.1 8: 21NF.2.6 11: Vh1.2.1 14: C8H9.2.8 3: 13NF.2.3 6: 15NF.2.2 9: 22NF.2.1 12: Vh1.2.2 M: Marker Kết điện di hình 4.6 cho thấy DNA tổng số sau tách chiết bị đứt gãy, băng điện di rõ nét, RNase loại bỏ gần hoàn toàn, nồng độ DNA cao đủ điều kiện để sử dụng tiến hành thí nghiệm Sau tách chiết, DNA sử dụng để tiến hành PCR kiểm tra có mặt gen chuyển ZmNF-YB2 dòng ngô chuyển gen hệ T1 36 Trong thí nghiệm chọn ngẫu nhiên DNA dòng để tiến hành phân tích PCR Riêng dòng đối chứng Vh1 C8H9 dòng sử dụng mẫu để phân tích PCR làm đối chứng Kết phân tích PCR xác định có mặt gen chuyển ZmNF-YB2 hệ T1 trình bày hình 4.7 Hình 4.7: Kết điện di sản phẩm PCR kiểm tra có mặt gen chuyển ZmNF-YB2 hệ T1 Ghi chú: 1: 3NF.2.1 6: 13NF.2.2 11: 15NF.2.1 16: 21NF.2.1 21: 22NF.2.3 M: Marker 2: 3NF.2.2 7: 13NF.2.5 12: 15NF.2.3 17: 21NF.2.2 22: 22NF.2.4 (+: Plasmid 3: 3NF.2.3 8: 13NF.2.6 13: 15NF.2.6 18: 21NF.2.5 23: 22NF.2.6 (-): H2O 4: 3NF.2.4 9: 13NF.2.7 14: 15NF.2.8 19: 21NF.2.7 24: 22NF.2.7 N2:: Vh1.2.2 5: 3NF.2.5 10: 13NF.2.9 15: 15NF.2.9 20: 21NF.2.8 25: 22NF.2.10 N2: C8H9.2.1 Mỗi dòng ngô lô thứ (lô xử lý hạn) tiến hành thí nghiệm phân tích PCR với Các kí hiệu theo thứ tự tên dòng, tên lô số thứ tự lô Ví dụ: kí hiệu 3NF.2.1 hiểu dòng 3NF, lô số 2, số Kết điện di hình 4.7 cho thấy trừ 3NF.2.3 (giếng điện di số 3), tất giếng điện di lại hiển thị băng rõ nét, có kích thước 238bp tương ứng với kích thước sản phẩm PCR DNA plasmid mang gen 37 ZmNF-YB2 Sản phẩm PCR không hình thành sử dụng DNA khuôn từ đối chứng không chuyển gen (giếng kí hiệu N1 N2) Như kết phân tích PCR hệ T1 cho thấy dòng ngô chuyển gen có dòng cho kết dương tính với gen chuyển ZmNF-YB2 sở để tiến hành phân tích để khẳng định có mặt gen dòng ngô chuyển gen 4.3 Kết phân tích, xác định có mặt gen ZmNF-YB2 dòng ngô chuyển gen hệ T1 phương pháp lai Southern Blot Để tiếp tục khẳng định có mặt gen chuyển ZmNF-YB2 dòng ngô chuyển gen 3NF, 13NF, 15NF, 21NF, 22NF mẫu DNA tổng số tách chiết từ dòng lô số tiếp tục phân tích kĩ thuật lai Southern Blot với mẫu dò đánh dấu DIG có độ dài 720 bp Do dòng nhận số đoạn chèn nên lựa chọn 1-2 mẫu dòng T1 (các kí hiệu theo thứ tự tên dòng, lên lô số thứ tự Ví dụ: Kí hiệu 3NF.2.2 dòng 3NF, lô số 2, thứ 2) cho kết PCR dương tính với gen ZmNF-YB2 để tiến hành thí nghiệm lai Southern Blot (bảng 4.4) Bảng 4.4: Các lựa chọn dòng để tiến hành phân tích Southern Blot TT Tên Âm tính Dương tính Vh1.2.1 (N) - 3NF.2.2 + 13NF.2.5 + 13NF.2.6 + 15NF.2.6 + 15NF.2.9 + 21NF.2.7 + 22NF.2.4 + 22NF.2.6 + Ghi chú: (N): Cây đối chứng; (-): Kết âm tính với PCR; (+): Kết dương tính với PCR 38 DNA tổng số bảng 4.4 cắt enzyme giới hạn EcoRI Trong thiết kế vector chuyển gen, vector pZY10135S mang gen ZmNF-YB2 có vị trí cắt enzyme cắt giới hạn EcoRI trình tự gen ZmNF-YB2 vị trí nhận biết enzyme nên plasmid có băng lai Southern Blot Do đề tài nghiên cứu sử dụng enzyme EcoRI để cắt đoạn DNA mang gen ZmNF-YB2 từ DNA tổng số ngô Kết lai Southern Blot trình bày hình 4.8 Hình 4.8: Kết lai Southern Blot sản phẩm cắt gen ZmNF-YB2 với mẫu dò tương ứng từ dòng ngô chuyển gen hệ T1 Ghi chú: 1: 3NF.2.2 4: 15NF.2.6 7: 22NF.2.4 (+): plasmid 2: 13NF.2.5 5: 15NF.2.9 8: 22NF.2.6 N: Vh1.2.1 3: 13NF.2.6 6: 21NF.2.7 M: Marker kb plus Kết lai Southern Blot (hình 4.8) cho thấy, tất chuyển gen phân tích xuất tín hiệu lai gen ZmNF-YB2 mẫu dò tương ứng nhìn thấy mắt thường, băng lai có kích thước khoảng 800bp Chứng tỏ tất mang gen chịu hạn ZmNF-YB2 Tuy nhiên trình lai chưa tối ưu nên làm phần băng có kích thước lớn 1000 bp không rõ ràng kết luận có 39 đoạn T-DNA mang gen chuyển chèn vào hệ gen Kết nghiên cứu hoàn toàn phù hợp với kết phân tích kĩ thuật PCR Như vậy, từ kết phân tích PCR dòng ngô chuyển gen hệ T0 với kết phân tích PCR Southern Blot hệ T1, cho thấy dòng ngô mang gen chuyển ZmNF-YB2 Khi phân tích chiều cao dòng ngô trước sau xử lý hạn đợt đợt cho thấy ngô chuyển gen hệ T1 phát triển tốt so với dòng đối chứng điều kiện hạn hán Điều chứng tỏ gen chịu hạn ZmNF-YB2 biểu thể khả chịu hạn dòng ngô chuyển gen hệ T1 40 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu thu được, đưa kết luận sau: Phân tích 20 dòng ngô chuyển gen 1NF, 2NF, 3NF, 4NF, 5NF, 6NF, 7NF, 6NFa, 6NFb, 11NF, 13NF, 14NF, 15NF, 16NF, 17NF, 18NF, 19NF, 21NF, 22NF, 35bNF hệ T0 phương pháp PCR cho thấy 10/20 dòng ngô chuyển gen cho kết dương tính với gen chuyển ZmNF-YB2 Chứng tỏ 10 dòng ngô chuyển gen cho kết PCR dương tính mang gen chuyển ZmNF-YB2 Chúng đánh giá đặc tính nông sinh học dòng ngô chuyển gen chịu hạn ZmNF-YB2 hệ T1 cách đo chiều cao Kết cho thấy dòng ngô chuyển gen ZmNF-YB2 điều kiện hạn hán có khả phát triển tốt dòng đối chứng Kiểm tra có mặt gen chuyển ZmNF-YB2 dòng ngô hệ T1 phương pháp PCR cho thấy tất các dòng đem phân tích cho kết dương tính Tiến hành phân tích lai Southern Blot để khẳng định có mặt gen chuyển ZmNF-YB2 dòng ngô chuyển gen hệ T1 Kết cho thấy dòng ngô chuyển gen xuất tín hiệu lai gen ZmNF-YB2 mẫu dò Tuy nhiên quy trình Southern Blot chưa tối ưu nên xác định số đoạn T-DNA chèn vào hệ gen dòng ngô phân tích 5.2 Kiến nghị Tiếp tục đánh giá lại dòng T1 chưa đánh giá có mặt gen ZmNF-YB2 phương pháp PCR để làm sở cho phân tích chuyển gen sau Không dừng lại đánh giá sinh trưởng phát triển dòng ngô chuyển gen thông qua tiêu đo chiều cao Cần mở rộng thêm phương pháp đánh giá đồng ruộng, phòng thí nghiệm để đánh giá khả sinh trưởng phát triển dòng ngô chuyển gen Tiếp tục tiến hành tối ưu phương pháp phân tích Southern Blot để khẳng định mang gen ZmNF-YB2 xác định số đoạn chèn gen vào hệ gen dòng ngô chuyển gen 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tiếng Việt Báo cáo khoa học “Hội nghị khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc (2013).Quyển hai Công nghệ sinh học Vi sinh, Công nghệ sinh học Thực vật” NXB Khoa học tự nhiên Công nghệ Bùi Mạnh Cường (2007), Công nghệ sinh học chọn tạo giống Ngô NXB Nông Nghiệp Đường Hồng Dật (2001), Cây ngô: kỹ thuật thâm canh tăng suất, Nxb Lao động – Xã hội Nguyễn Văn Đồng Nguyễn Hữu Kiên (2013), Thiết kế vector biểu gen chịu hạn NTCB ZmNF-YB2 ngô Tạp chí Nông nghiệp Phát triển Nông thôn No.7.2013.pp 31-37 Trương Văn Đích (2005), Kĩ Thuật trồng giống ngô xuất cao, Nxb Nông nghiệp Hà Nội, tr.26 Nguyễn Hữu Hoàng (2009) “Giá trị dinh dưỡng ngô”, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Lê Thị Ánh Hồng (2000) Cơ sở khoa học công nghệ chuyển gen thực vật, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Đức Lương, Dương Văn Sơn, Lương Văn Hinh (2000), Giáo trình ngô, Nxb Nông nghiệp Ngô Hữu Tình, Trần Hồng Uy, Bùi Mạnh Cường, Võ Đình Long, Lê Quý Kha, Nguyễn Thế Hùng (1997) Cây ngô, nguồn gốc, đa dạng di truyền trình phát triển NXB Nông nghiệp 10 Ngô Hữu Tình (2003), Giáo trình ngô, Nxb Nghệ An 11 Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành (2007), Công nghệ sinh học tập công nghệ vi sinh môi trường, Nxb Giáo dục II Tiếng Anh 11 Bressan RA, Zhang C, Zhang H, Hasegawa PM, Bohnert HJ, Zhu JK (2001), “Learning from the Arabidopsis experience The next gene search paradigm” Plant Physiol 2001;127:1354–1360 42 12 Bruce WB, Edmeades GO, Barker TC (2002), “Molecular and physiological approaches to maize improvement for drought tolerance” 53:13–25 13 Cushman JC, Bohnert HJ (2000), “Genomic approaches to plant stress tolerance” Curr Opin Plant Biol;3:117–124 14 Edwards D, Murray JA, Smith AG (1998), “Multiple Genes Encoding the Conserved CCAAT-Box Transcription Factor Complex Are Expressed in Arabidopsis” Plant Physiol 1998;117:1015–1022 15 FAOSTAT (2014) http://faostat.fao.org/ 16 Gusmaroli G, Tonelli C, Mantovani R (2001), “Regulation of the CCAATBinding NF-Y subunits in Arabidopsis thaliana” Gene 2001;264:173– 185 17 Gusmaroli G, Tonelli C, Mantovani R (2002), “Regulation of novel members of the Arabidopsis thaliana CCAAT-binding nuclear factor Y subunits” Gen 283:41–48 18 Gutterson N, Zhang JZ (2004), “Genomics applications to biotech traits: a revolution in progress?” 55:2343–2351 19 Kazuo N., Kazuko Y.S (2005), Molecular studies on stress-responsive gene expression in Arabidopsis and improvement of stress tolerance in crop plants by regulon biotechnology 20 Lance Gibson, Garren Benson (2014), “Origin, history, and Uses of Corn”, Lowa State University, Department of Agronomy 21 Li W.X, Oono Y, Zhu J, He X.J, Wu J.M, Iida K, Lu X.Y, Cui X, Jin H, Zhu J.K (2008), The arabidopsis NFYA5 transcription factor is regulated transcriptionally and posttrancriptionally to promote drought resistance, The plant cell 22 Mantovani R (1999), “The molecular biology of the CCAAT-binding factor NF-Y”.239(1):15-27 23 Manuela M.C., João P.M., João S.P (2003) “Understanding plant response to drought from genes to the whole plant” Functional Plant Biology.30:239-264 24 Nelson D.E., Repetti P.P., Adams T.R., Creelman R.A., Wu J., Warney D.C., Anstrom D.C., Bensen R.J., Castiglioni P.P., Donnarummo M.G., HinChey B.S., Kumimoto R.W., Maszle D.R., Canales R.D., 43 25 26 27 28 Krolikowski K.A., Dotson S.B., Gutterson N., Ratcliffe O.J., Heard J.E., (2007) Plant nucleare factor Y (NF-Y) B subunits confer drought tolerance and lead to improved corn yields on water-limted acres Saghai Maroof M,A,, et al (1984), “Ribosomal DNA spacer leght polymorphism in barley, Mendelian inheritance, chromosomal location DNA population dynamics”, proc Natl Acad, Sic, USA 81 Sharp RE, Poroyko V, Hejlek LG, Spollen WG, Springer GK, Bohnert HJ, Nguyen HT (2004), “Root growth maintenance during water deficits: physiology to functional genomics” Curr Opin Plant Biol 2004;7:226–230 Tuberosa R, Salvi S, Sanguineti MC, Landi P, Maccaferri M, Conti S (2002), “Mapping QTLs regulating morpho-physiological traits and yield: case studies, shortcomings and perspectives in drought-stressed maize” Vavilov N.I (1926), “Studies on the Conbining Ability of CIMMYT Germplasm” CIMMYT Research Highlights Pp 24-33 PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA THẾ HỆ T1 Ở GIAI ĐOẠN CÂY NON SAU ĐỢT XỬ LÝ HẠN A Dòng đối chứng Vh1.2 B Dòng chuyển gen 21NF.2 C Dòng đối chứng C8H9.2 D Dòng chuyển gen 15NF.2 E Dòng chuyển gen 22NF.2 [...]... tiễn Qua kết quả nghiên cứu đề tài có thể đánh giá được sự có mặt và biểu hiện của gen ZmNF- YB2 sau khi biến nạp vào một số dòng ngô Việt Nam Có được những đánh giá ban đầu về quá trình chuyển gen chịu hạn vào cây ngô, góp phần giải quyết vấn đề thực tế đặt ra là tạo các dòng ngô có khả năng chịu hạn 4 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về cây ngô 2.1.1 Nguồn gốc và sự lan truyền của ngô Hầu hết... ra rằng: cây ngô được biến nạp gen mã hóa yếu tố phiên mã ZmNF- YB2 có khả năng kháng hạn cao [4] Chính vì vậy Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp đã phân lập gen ZmNF- YB2 từ thư viện cDNA chịu hạn của giống ngô tẻ Cao bằng-NTCB của Việt Nam (NTCB -ZmNF- YB2) Kết quả cho thấy 95% nucleotit của gen NTCB ZmNF- YB2 tương đồng với gen ZmNF- YB2 đã công bố... tích kết quả thu được 3.5 Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu đo chiều cao cây thế hệ T1 được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 27 PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả xác định sự có mặt của gen chuyển ZmNF- YB2 trong các dòng ngô chuyển gen thế hệ T0 bằng phương pháp PCR 4.1.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số Chúng tôi tiến hành thu mẫu lá của cây trong mỗi dòng ngô mang gen chịu hạn ZmNF- YB2. .. dung nghiên cứu Nội dung 1: Xác định sự có mặt của gen chuyển ZmNF- YB2 trong các dòng ngô chuyển gen ở thế hệ T0 bằng phương pháp PCR Nội dung 2: - Đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng ngô chuyển gen thế hệ T1 ở giai đoạn cây non - Xác định sự có mặt của gen chuyển ZmNF- YB2 trong các dòng ngô chuyển gen thế hệ T1 bằng phương pháp PCR Nội dung 3: Xác định sự có mặt của gen chuyển ZmNF- YB2 trong các dòng. .. Các kết quả nghiên cứu trên của Nelson và cộng sự đã chứng tỏ sự gia tăng hoạt động của gen ZmNF- YB2 trên cây ngô và đồng đẳng AtNF-YB1 trên cây Arabidpsis thaliana làm tăng khả năng chịu hạn cho cây Kết quả nghiên cứu này mở ra một con đường đầy tiềm năng trong việc cải tạo cây trồng thương mại nói chung và cây ngô nói riêng trong điều kiện hạn hán [24] 2.4.2 Tình hình nghiên cứu về gen ZmNF- YB2 ở... hàng gen (gb/DQ333304.1/) Tổ hợp vector biểu hiện pZY10135S::NTCB ZmNFY-B2 đã được thiết kế và biến nạp vào chủng vi khuẩn Agrobacterium EHA101 đây là kết quả ban đầu để nghiên 17 cứu biểu hiện của gen NTCB ZmNFY-B2 trong cây ngô chuyển gen, hướng tới việc tạo thành các dòng ngô kháng hạn của Việt Nam [4] Promoter 35S và TEV enhancer trước vùng MSC cho phép điều hòa biểu hiện của gen lạ được chèn vào. .. từ 2 dòng ngô gốc ban đầu là C8H9 và Vh1 đã được biến nạp gen chịu hạn ZmNF- YB2 bởi phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế Bào Thực vật- Viện Di truyền Nông nghiệp Cụ thể, từ dòng Vh1 tạo ra các dòng sau 1NF, 2NF, 4NF, 5NF, 6NF, 6NFa, 6NFb, 21NF Các dòng chuyển gen còn lại được tạo ra từ dòng gốc C8H9 Các dòng ngô chuyển gen được lựa chọn để tiến hành đánh giá khả năng chịu hạn của các cây ngô chuyển... trúc này biểu hiện của gen NTCB -ZmNF- YB2 trong vector biểu hiện sử dụng cho chuyển gen được điều khiển bởi promoter 35S Hình 2.4: Cấu trúc vector biểu hiện của gen NTCB ZmNFY-B2 Với sự tiến bộ về khoa học kĩ thuật, Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật – Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam đã tạo ra một số dòng ngô chuyển gen chịu hạn ZmNF- YB2 bằng phương pháp biến nạp thông qua vi khuẩn... hành biến nạp gen ZmNF- YB2 vào cây ngô Kết quả cho 16 thấy trong điều kiện hạn hán lá của dòng ngô chuyển gen ít bị héo hơn so với dòng đối chứng chứng tỏ tế bào ít bị lão hóa hơn Khi tưới nước đầy đủ trở lại sau khi dừng xử lý hạn, dòng chuyển gen có khả năng phục hồi nhanh hơn đáng kể so với dòng đối chứng [24] Ngoài đánh giá bằng sự khác biệt giữa đặc điểm nông sinh học giữa hai dòng, một số chỉ tiêu... chuyển ZmNF- YB2 trong các dòng ngô chuyển gen ở thế hệ T1 bằng phương pháp Southern Blot 3.4 Phương pháp nghiên cứu 3.4.1 Kiểm tra sự có mặt của gen ZmNF- YB2 trong cây ngô chuyển gen bằng phương pháp PCR Sử dụng 20 dòng ngô 1NF, 2NF, 3NF, 4NF, 5NF, 6NF, 7NF, 6NFa, 6NFb, 11NF, 13NF, 14NF, 15NF, 16NF, 17NF, 18NF, 19NF, 21NF, 22NF, 35bNF đã được biến nạp gen chịu hạn ZmNF- YB2, tiến hành thu mô lá để phục ... công nghệ chuyển gen giới, chuyển gen chịu hạn vào ngô thành công [1] Ở Việt Nam vấn đề chuyển gen chịu hạn vào dòng ngô tập trung tiến hành nghiên cứu [1] Tuy nhiên kết nghiên cứu kiêm tốn chưa... kết biến nạp gen chịu hạn ZmNF-YB2 vào số dòng ngô Việt Nam 1.2 Mục đích đề tài Xác định có mặt biểu gen chuyển ZmNF-YB2 số dòng ngô chuyển gen 1.3 Yêu cầu đề tài - Xác định có mặt hay không gen. .. THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM LÊ DUY TOÀN Tên đề tài: NGHIÊN CỨU KẾT QUẢ BIẾN NẠP GEN CHỊU HẠN ZmNF-YB2 VÀO MỘT SỐ DÒNG NGÔ VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên