Staphylococcus aureus Tụ cầu khuẩn

Bjorklind và Arvidson phát hiện ra phần lớn các protein ngoại bào được sản xuất vào cuối quá trình tăng trưởng.Fibronectin – binding proetin a Colagen Binding protein Nhân tố Clumping En

5) Nguyễn Thị Kim Cương 0918056

7) Trương Thị Thanh Hiền 0918149

8) Dương Minh Hoàng 0918161

9) Trần Phâm Tuệ Hưng 0918200

Micrococcaceae gồm 4 loài: Micrococcus, Stomatococus, Planococus, và Staphylococus

Thuộc tính khác biệt của cầu khuẩn Gram dương gồm sự sắp xếp của tế bào, hiếu khí bắt buộc, hiếu khí tùy ý hoặc vi hiếu khí, kị khí bắt buộc, phản ứng catalase, sự hiện diện của cytochrome, sản phẩm lên men kị khí chủ yếu từ carbohydrates, peptidoglycan, acid

teichois trên thành tế bào, menaquinones Sự phân loại của Staphylococus aures như sau:

nguồn gốc từ tiếng Hi Lạp, Staphylo có nghĩa là chùm nho và cossus có nghĩa là quả

trong chùm, do đó Staphylococcus có nghĩa là “quả trong chùm nho” Staphylococci là tế

bào hình cầu có đường kính từ 0.5 đến 1.5µm, nó có thể tồn tại như các tế bào đơn lẻ, thành cặp hoặc thành cụm Cụm hình thành chủ yếu khi tăng trưởng trên môi trường rắn

và là kết quả từ sự phân chia tế bào theo nhiều mặt phẳng, kết hợp với xu hướng các tế bào con gần nhau Sự hiển thị trong không gian 3 chiều thể hiện rõ sự gắn kết bao phủ lên nhau của các tế bào, tuy nhiên, các tế bào màu thường mang lại sự xuất hiện của các phiến bất thường của tế bào Staphylococci là vi khuẩn Gram dương, không di động và không sinh bào tử, nang có thể được hình thành trong nuôi cấy, nhưng nói chung là không xuất hiện trong pha tĩnh tế bào Sắc tố khuẩn lạc trên môi trường không chuyên biệt như tryptic soy agar có thể nằm trong khoảng từ màu trắng kem đến mà cam sáng Hầu hết các chủng của Staphylococci được xem là nhóm các tác nhân gây bệnh mức II

(potential hazard) Staphylococcicus hyicus được xếp vào nhóm các tác nhân gây bệnh

mức IV (potential danger, cực kì nguy hiểm)

Loài Staphylococal là các vi khuẩn hiếu khí hay yếm khí tùy ý và có cả hô hấp và lên men biến dưỡng Staphylococci thông qua chu trình glycolysis, nối hexose monophosphate, và chu trình tricarboxylic acid Chúng thì dương tính với catalase va có thể sử dụng một lượng lớn carbonhydrates

Staphylococcicus aureus là loài phổ biến nhất trong chi Staphylococcicus Nó cần sự có

mặt của amino acid và vitamin cho sự tăng trưởng hiếu khí, và ngoài ra : uracil, lên men

của amino acid và vitamin cần cho sự phát triển của sinh vật hiếu khí Trong khi S

aureus có khả năng tăng trưởng kị khí và tăng trưởng tốt nhất trong điều kiện hiếu khí

Nhiệt đọ tối ưu cho sự tăng trưởng kà 350C và giới hạn chịu đựng là từ 10 đến 450C Giới hạn chịu đựng của độ pH cần cho sự phát triển là từ 4.5 đến 9.3, pH tối ưu là khoảng giữa 7.0 đến 7.5 Khi điều kiện môi trường trở nên khắt nghiệt hơn, giới hạn chịu đựng của độ

pH giảm

Thành phần chủ yếu của thành tế bào S aureus là peptidoglycan, và nó chiếm 50%

trọng lượng tế bào và quy định hình dạng bền vững Peptidoglycan là một polymer polysaccharide không phân nhánh, gồm các liên kết β(1-4), chuỗi có chứa xen kẻ các đơn

vị N-acetylglucosamine, với khỏang 60% N-acetylmuramic acid residues o-acetylated Luợng lớn O-acetylation giúp cho tế bào kháng được sự thủy phân của lysozyme Pentapeptide liên kết bên với lượng dư acid muramic, và liên kết đồng hóa trị của pentaglycine với L-lysine của một chuỗi D-alanine khác Phức hợp peptidoglycan là một nhóm của chuỗi polymer phosphate với acid teichois Acid Teichoic (chiếm 40% trọng lượng vách tế bào) có thể liên kết cộng hóa trị với peptidoglycan hoặc màng tế bào Xương sống của thành tế bào teichoic acid là một chuỗi xen kẽ của ribitolphosphate liên kết với D-alanine bởi sự liên kết α hoặc β-glycosidic xuyên qua N-acetylglucosamine

Các thành phần chính của vỏ của S.aureus là acid N-acetylaminouromic và N-

acetylfucosamine Muời một kiểu nhóm huyết thanh đã được xác định, với các gen để sản xuất vỏ nang nằm trong 1 operon Kết nang vi khuẩn có khả năng chống thực bào Một

vài chủng S.aureus có kết nang, và chúng có nguy cơ gây nguy hiểm hơn cho động vật

Bao nang thường được phát hiện trong cơ thể sống nhưng lại không xuất hiện khi nuôi cấy Phạm vi màu sắc từ màu trắng xám, đến mà vàng cam và màu cam Sổ tay của Bergey nói rằng các sắc tố triterpenoid carotenoids hoặc các dẫn xuất của chúng nằm trong màng tế bào Sắc tố thường có sau 18-24 giờ của sự tăng trưởng ở 370C, nhưng có màu rõ rệt hơn khi mẻ nuôi cấy được cất giữ ở nhiệt độ phòng trong vòng 24-48 giờ Sắc

tố không được tạo thành trong quá trình tăng trưởng kị khí hoặc trong mẻ nuôi cấy lỏng

Nói chung S aureus tăng trưởng và cạnh tranh đàn áp các sinh vật hiện diện khác Mặc

dù giá trị D khác nhau với các loài và nhiệt độ của dung môi, nhưng một giá trị D giảm đi sau 3 phút tại 60oC cho thấy rằng S.aureus thì không chịu nhiệt Khả năng chịu nhiệt chịu ảnh hưởng của pH, Aw , và thời gian của mẻ nuôi cấy Đun nóng các sản phẩm thịt đến nhiệt độ khoảng 770C thường là đủ để giết hết S aureus S.aureus kháng với nhiệt độ

thấp Nhưng lại rất nhạy cảm với môi trường có tính acid và một loạt các hợp chất hóa học và thuốc kháng sinh

II BỆNH NGOÀI ĐƯỜNG RUỘT :

Staphylococci là một phần bình thường của hệ vi sinh của cơ thể động vật, chúng được

tìm thấy trên bề mặt da và tóc, trong mũi, miệng và cổ họng Staphylococcus epidermidi, xâm chiếm hầu như tất cả các bề mặt biểu bì, trong khi S aureus xâm chiếm chủ yếu

màng nhầy Các sinh vật này xâm chiếm vào trẻ sơ sinh trong 1 vài ngày sau khi sinh Polledo et al đã nghiên cứu xử lý trên 300 mẫu thực phẩm Họ phát hiện rằng có 83 (27.6%) là thể truyền bệnh có tụ cầu dương tính với coagulase (enzyme gây đông tụ) và

118 (39.3%) dương tính với coagulase – tụ cầu âm tính hốc mũi Thú vị hơn là nam giới được phát hiện có mang tụ cầu dương tính coagulase nhiều hơn so với nữ giới Ba mươi sáu cá thể được phát hiện có tụ cầu enterotoxigenic Tỷ lệ này trái ngược với tỷ lệ 40-50% theo báo cáo của Bergdoll Thể truyền bệnh không có triệu chứng của tụ cầu có thể được

chia làm nhiều kiểu: thể truyền bệnh mạn tính, người mang bệnh nuôi dưỡng một loại S

aureus trong thời gian kéo dài, thể truyền bệnh/ người mang bệnh cấp tính, họ không

thường xuyên mang Staphylococci gây bệnh, lúc có lúc không, họ mang một loại cho 1 thời gian nhất định, và sau đó mang 1 loại khác; người không mang mầm bệnh, là những

người hiếm khi hoặc không bao giờ mang mầm bệnh độc hại S aureus Người mang bệnh/ thể truyền bệnh có triệu chứng nhiễm S aureus là những người mang bệnh công khai Con người được coi là môi trường sống của S aureus trong tự nhiên

Staphylococci có thể gây bệnh ở hầu hết các mô trong cơ thể, S aureus.là nguyên nhân

phổ biến nhất gây bệnh nhiễm trùng suppurating ( như mụn nhọt, nổi mụn) và là một trong các vi khuẩn gây bệnh lâu nhất Một trong các báo cáo đầu tiên công bố về bệnh do

S aureus là vào năm 1871 với nhà bác học người Đức - Van Reclinhausen, người đã

quan sát khuẩn cầu, mà ông đã cô lập từ thận của 1 bệnh nhân đã chết sau một cơn sốt Các tụ cầu được coi là tác nhân gây bệnh cơ hội mà quá trình xâm nhiễm thường là qua

da hoặc qua màng nhày Các tổn thương thường gặp nhất là 1 áp xe trong da hoặc vết bỏng, mà vùng trọng tâm của nhiễm trùng thường có mũ một phần hoặc hoàn toàn, có vách bao quanh xuất phát từ các mô xung quanh Các vùng của sự hình thành áp xe thường là nang long và tuyến mồ hôi Nhọt là một loạt các áp xe kết nối với nhau Sự lây của nhiễm trùng trong cơ thể, các cơ quan chính và các mô có thể xảy ra bằng cách lây lan qua các mô tiếp giáp hoặc lây lan qua hệ bạch huyết và máu Tổn thương di căn được tạo ra trong một loạt các mô

Nhiễm trùng nghiêm trọng hơn có thể xảy ra ở những người nhạy cảm như: trẻ em, người bị bỏng hoặc chấn thương, và người rối suy nhược mạn tính (ung thư, xơ nang vv…) Bệnh tụ cầu nghiêm trọng thường được gây ra bởi tụ cầu khuẩn âm tính coagulase Chúng xâm nhập vào cơ thể qua các vết thương hở ở các mô biểu bì như: tiêm chích, ống thông, hoặc các dụng cụ y tế khác Một hệ thống bạch cầu bình thường giúp cơ thể có thể chống lại sự xâm nhập của các vi khuẩn này, sự bất thường của các miễn dịch dịch thể có thể góp phần làm cho cơ thể dễ mắc bệnh Bệnh tụ cầu có thể được lây lan bằng hai cách là thông qua hô hấp và do tiếp xúc với da và quần áo của người bệnh Bệnh tụ cầu thường có ở bệnh viện với 90% các biến thể có đặc tính kháng peniciline Các biến thể xuất hiện nhanh chóng trong một vài bệnh nhân sau khi được điều trị bằng liệu pháp kháng sinh Một số kháng sinh khác tới nơi một vài biến thể kháng được erythomycin, neomycin, streptomycin, gentamicin, tetracycline, và chloramphenicol Cả plasmics và nhiễm sắc thể ở staphylococus được tìm thấy mã hóa cho khả năng kháng kháng sinh Một số bệnh nghiêm trọng gây ra bởi chúng bao gồm: nhiễm trùng máu, viêm màng tim, viêm tủy

xương, viêm phổi Một số bệnh khác như: triệu chứng shock do độc, viêm ruột kết, và ngộ độc thực phẩm

III ĐẶC TÍNH

S.areus là một loài vi khuẩn được quan tâm trong công nghiệp thực phẩm Ngộ độc thực phẩm do Staphylcocus là nguyên nhân hàng đầu trong các vụ ngộ độc thực phẩm không chỉ riêng ở Hoa Kỳ, mà còn ở rất nhiều quốc gia khác Nó gần như có thể so sánh với Samonella như là một trong những tác nhân gây ngộ độc thực phẩm phổ biến nhất và được cho rằng là dẫn đầu các nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm Ngộ độc do Staphylcocus diễn ra là kết quả của việc tiêu thụ độc tố enterotoxin chịu nhiệt được sản xuất bởi các vi khuẩn trong suốt quá trình sinh trưởng

A Các hoạt động trong nước

Một lý do mà S.aureus được quan tâm nghiên cứu là do khả năng phát triển ở 0.83 aw

tức là rất thấp so với sự phát triển của các loài vi khuẩn Phần lớn các biến thể S.aureus thì có khả năng chịu đựng cao trong môi trường muối hoặc đường có thể phát triển trong điều kiện vượt quá 0.83 đến 0.99 aw S.areus phát triển mạnh nhất trong điều kiện khoảng lớn hơn 0.99 và sự sinh trưởng ở điều kiện aw thấp phụ thuộc vào các điều kiện tăng trưởng khác một cách thích hợp Chỉ số aw thấp nhất cho sự phát triển của chúng lớn hơn điều kiện kị khí (0.90) S.aureus có thể phát triển tốt trong điều kiện nước muối 16% (0.88aw) và đường 50% (0.97 aw)

B Enzymes ngoại bào

S.aureus sản xuất một lượng lớn enzyme ngoại bào Iandolo (8) cho rằng S.areus có khả năng sản xuất ít nhất 34 loại protein ngoại bào khác nhau, mặc dù không có dòng đơn nào sản xuất tất cả các loại protein Có ý kiến cho rằng sản xuất protein ngoại bào giúp cho các vi khuẩn có thể xâm nhập vào các mô khỏe mạnh và tránh khỏi bộ máy miễn dịch của

cơ thể Một vài dạng enzyme này có giá trị nhận diện vi khuẩn Bjorklind và Arvidson phát hiện ra phần lớn các protein ngoại bào được sản xuất vào cuối quá trình tăng trưởng.

Fibronectin – binding proetin a

Colagen Binding protein

Nhân tố Clumping

EndopeptidaseMetalloproteasePenicillinaseSerine ProteaseNucleasePyrogenic exotoxinStaphylokinaseAcid phosphataseAlkaline phosphataseotein Elastin binding proteinFibronectin binding BNhân tố Matrix Adhesin

FibronolysinĐộc tố gây hội chứng shock

Độc tố tróc da A và BStaphylococcal lysozyme Nhân tố Sucinic oxidaseLysostaphin

Thiol proteaseFibrinogen biding protein

Coagulase là một trong những enzyme quan trọng được sản xuất bởi S.aureus Hai loại của enzyme coagulase gồm một dạng tự do và một dạng nằm trong tế bào Hai loại khác nhau về đặc tính miễn dịch và một số hoạt động nhỏ Coalgulase ngoại bào có thể tồn tại trong tự nhiên và có nhiều kiểu đã được nhận dạng Có 93-100% tương hợp giữa sản phẩm của Coagulase và enterotoxin S.aureus dương tính với coagulase có khả năng hình thành các cục máu đông Enzyme này được sản xuất bởi các biến thể độc được biết đến

có khả năng gây bệnh do hình thành các cục máu đông Tuy nhiên, tầm quan trọng của hàng rào chống lại sự lây nhiễm thì không toàn vẹn, bởi vì những dòng S.aureus âm tính với coagulase cũng có thể là nguyên nhân gây bệnh Sự đóng cục của máu trong cơ thể liên quan đến số lượng của các thành phần Một cách vắn tắt, một cục máu đông được định hình bởi các yếu tố đông máu có trong huyết thanh và được chuyển hóa thành một

mạng lưới có tên là fibirn, Staphylococus aureus hoạt động bằng việc chuyển đổi fibrinogen thành fibrin.

Một trong những lí do cho việc sử dụng rộng rãi coagulase để xác nhận dương tính với S.aureus là kiểm tra thực hiện khá dễ dàng và dễ nhận biết Tế bào của loài sinh vật nghi ngờ được trộn với huyết tương của người hoặc của thỏ (được thêm vào citrate, oxalate, EDTA để khử ion Ca, yêu cầu đông máu invivo), hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm ống, hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm dựa trên bản mẫu trên kính hiển vi Slide hay ống xét nghiệm được ủ ở 370C trong 1 – 3 gi

Tuy nhiên, các phương thức hiện tại được mô tả trong Bacteriological Analytical Manual (10), yêu cầu một khối kết đông bền chắc hiện diện trong ống xét nghiệm trút ngược thì được xem là dương tính Kết quả của phương pháp bản mẫu, nơi nào tế bào kết thành khối thì được xem là dương tính Weer-Pothoff al.(11) so sánh bảy coagulase test của phương pháp nhận dạng staphylococus Nhìn chung, các thử nghiệm thương mại cho kết quả nhạy hơn các ống xét nghiệm thông thường hay xét nghiệm bản mẫu

2 Nuclease chịu nhiệt

Nuclease chịu nhiệt là một trong những chẩn đoán quan trọng của S.aureus Những Nuclease này được sản xuất trong quá trình tăng trưởng bình thường có khả năng tấn công cả ribonucleic và deoxyribonucleic S.aureus cũng có khả năng sản xuất nuclease ngoại bào có khả năng chịu nhiệt Sự hiện diện của hai loại nuclease (chịu nhiệt và nhạy nhiệt) có thể là nguyên nhân tạo nên sự khác biệt trong các chủng loại Gudding cho biết

đó là S.aureus S.intermedius and S.hylius Subsp Tất cả Hyicus đều sản xuất nuclease chịu nhiệt Như tên gọi của nó, neclease chịu nhiệt vô cùng bền vững trong điều kiện nhiệt độ cao và có thể bền vững trong nước sôi trong vòng 30 phút mà không có bất kì một biến đổi nghiêm trọng nào Một bài test đã diễn tả các hoạt động của nuclease chịu nhiệt Phương pháp dùng Toluidine blue deoxyribonucleic acid agar có thể dùng để nhận dạng Trên một khối agar (trên đó có khuẩn lạc S.aureus được cô lập phát triển) được lấy mẫu được cấy vào một môi trường ống mẫu được đun sôi trong 15phút Tiêu bản được

làm bởi việc lấy mẫu Toluidine blue deoxyribonucleic acid agar cộng với một chút agar tốt chứa khuẩn lạc Mẫu được đun sôi được thế chỗ và được ủ trong môi trường ẩm ướt trong 4 giờ ở 350C Kết quả dương tính cho thấy vùng màu hồng sáng của DNA được thủy phân Giống như coagulase, việc sản xuất nuclease chịu nhiệt và enteroxigenicity giống nhau đến 95 tới 100% Ratner và Strattion cho biết không có sự đối lập giữa một thử nghiệm giữa thermonuclease và coagulase trên 250 mẫu máu người Tuy nhiên, Adekeye cho biết thermonuclese không có hiệu quả nhận biết S.aureus được cô lập từ động vật (không phải người) Ngược lại với Staphylcococal ngoại bào, nuclease chịu nhiệt được sản xuất trong suốt quá trình tăng trưởng của tế bào

3 Các loại Enzyme khác.

S.aureus sản xuất nhiều loại enzyme ngoại bào khác nhau có giá trị chẩn đoán và giúp

đỡ thể sinh bệnh Staphylokinase gây ra sự tan khối khi một vài lipase có khả năng tạo ra những vòng tan trên thạch trứng đục Hyaluronidase được sản xuất bởi hầu hết các dòng của S.aureus, là một loại enzyme thúc đẩy sự lan tỏa trong mô bởi việc khử trùng hợp của hyaluronic acid Những loài enzyme khác được sản xuất bởi S.aureus bao gồm cả penicillinase, protease (collagenase, elastase, endopeptidase, metalloprotease, serine protease, thioprotease), lipase (phospholipase và phosphatase – acid và alkaline), fibrinolysin (biến đổi fibin thành các sản phẩm hòa tan), protein A (dạng phức hợp của lớp màng ngoài của thành tế bào làm suy yếu oposin hóa bởi huyết thanh, và lytic enzyme (staphylcococal lysozyme và lysostaphin)

C Toxins – Hemolysins và các loại khác

Hemolysin, cũng tương tự như staphylolysin, được sản xuất bởi S.aureus và được đặt tên là alpha, beta, gamma và delta; mỗi dòng đơn sẽ sản xuất một hay nhiều emolysins Những protein ngoại bào khác biệt bởi khả năng dung giải hồng cầu của chúng trên những loài động vật khác nhau Gamma hemolysin và Panton- Valentine leukocidin (phân giải leukocyte) được hợp thành từ hai cấu tử, một trong số đó có ở cả hai Tất cả ngoại trừ delta-hemolysins tạo ra vòng tan bao quanh khuẩn lạc S.aureus khi phát triển

quanh thạch máu Staphylococi sinh mủ phân giải hemoglobin đều phản ứng dương tính với coagulase Một số độc tố khác được sản xuất bởi S.aureus là exfoliatin, leukocidin, pyrogenic exotoxin (29,30) Sự tương phản với enterotoxins vi khuẩn gram âm ( được sản xuất bởi protein chuyên chở đặc biệt) là một phần của operon mã hóa độc tố.

SEs được xem là exotoxins kết hợp của protein với phần không có phi protein (31) SEs hoàn chỉnh kết hợp của chuỗi polypeptide đơn với 230 – 239 amino acid, sắp xếp thành phân tử nặng từ 26,360 tới 28,494 và có thắt nút (loop) disulfide gần giữa phân tử (Bảng 4) Phân tích amino acid của SEs cho thấy sự giàu lysine, asparatate và glutamic acid(6) (Bảng 5) Ngoài ra, sự tích điện dương của chúng có thể đóng vai trò quan trọng trong gây nôn mửa

1) Cấu trúc

Trình tự nucleotide của các gen mã hóa cho SEA, SEB, SEC1, SEC3, SSD, SEE ( sea,seb,sec 1 ,

SEs thuộc về một họ enterotoxins lớn gọi là pyrogenic toxins ( PTs), gồm có pyrogenic toxins A

và B, TSST-1 , và streptococal pyrogenic toxins A-C ( SPE A-C) (41-47) PTs tiết lộ những giá trị về mặt sinh học, bao gồm các tác nhân của sự nguyên phân tế bào lympho, sự chặn miễn dịch,

sự sốt, và làm tăng tính nhạy cảm với endotoxin So sánh giữa các PTs có thể nhận ra 43- 85 %

trình tự nucleotid đặc trưng( 33) Nucleotid đặc biệt và amino acid tương đồng giữa entC1, entB

và SPE A đã được nhận ra, trong khi entC1 và entB gióng nhau hơn với SPE A(36) Couch và

Betley (33) báo cáo rằng SEC3 có 98% trình tự nucleotide tương đồng với SEC1, trong khi SEC1

và SEB thể hiện 68% amino acid tương đồng Cả SEB và SEC1 có tương đồng cấu trúc cực kỳ cao, đặc biệt là vùng đầu amino và carboxy, với tính chất quyết định kháng nguyên của nó, trọng lượng phân tử tương đồng, cầu disulfile đơn và không có nhóm sulhydryl tự do (41,51,55,56) Vùng đầu amino ở SEB và SEC1 thể hiện tính kháng nguyên – chịu trách nhiệm cho phản ứng chéo với kháng thể huyết thanh (57), trong khi mức độ cao của sự không tương đồng ở đầu amino của SEA có thể giải thích lý do kháng huyết thanh SEA không có phản ứng chéo với SEB hay SEC1 (38)

IV CÁC ĐỘC TỐ TRONG RUỘT

a mỗi os 0.05mg/kg bởi IV phần (19)

Ngoài ra, Huang và cộng sự (38) đã có thể chứng minh sự tương đồng cấu trúc đặc biệt ở SEA bởi cystein bán phần tại vị trí 106 với SEB và SEC1 Huang at al (58) đặt ra giả thuyết rằng cystein bán phần này có thể gây nôn mửa và chịu trách nhiệm cho sự viêm dạ dày SEA hoàn chỉnh có 82, 72, 74 và 34 amino acid phổ biến giống với SEB, SEC1, SPEA và TSST-1 ( 37, 39, 59-61)

Bảng 5: Thành phần amino acid ( g/100 g protein) của Staphylococcal Enterotoxin

Betley và Mekalanos (34) đã có thể lai đầu dò DNA lấy từ dòng gene entA với các type

khác của SE, điều này gợi ý rằng tỉ lệ cao của các trình tự khác biệt có thể có giữa SEC1

và SEB ở vùng đầu carboxyl Trình tự nucleotid của SPE A tiết lộ sự tương đồng đặc biệt

với entB và entC1 (55,56), trong khi Bloomster- Hautamara và cộng sự (59) báo cáo

TSST-1 có sự tương đồng trong hoạt tính sinh học nhưng không có trình tự amino acid

nào tương đồng với SPE A , entB và entC1 Couch và Betley (33) cũng báo cáo sự so

sánh giống nhau giữa các gene entC3, entC1 và entB, điều này gợi ý rằng gen giống entC1

cổ được hình thành bằng sự tái tổ hợp giữa gene entC3 và entB Couch và cộng sự (35) báo cáo rằng gene entE có 84 % trình tự nucleotid tương đồng với gene entA Họ cũng

báo cáo rằng SEE có quan hệ gần với SEA hơn SEB, SEC1 hay SPE A

Nhìn chung, tỉ lệ phần trăm của trình tự tương đồng các amino acid giữa các dạng protein hoàn chỉnh của eterotoxins khác nhau từ 29% tới 82 % , với SEA và SEE là có quan hệ gần nhất (35) Bohach và Schlievert (36) đã gợi ý rằng sự tương đồng giữa các PTs yêu cầu những chức năng sinh học thông thường, trong khi ngược lại những vùng đa dạng khác nhau quy định tính độc đặc biệt Ngoài ra, Bohach và Schlievert (62) đã nhận

ra những sự tương đồng khi so sánh trong các nghiên cứu khác về trình tự amino acid của

PT thể hiện rằng: một vài đầu carboxyl và vùng trung tâm của trình tự sơ cấp được bảo tồn đồng đều trong họ PT Ví dụ, Họ có thể khám phá thêm bằng chứng về khu vực carboxyl của tụ cầu khuẩn và liên cầu độc tố gây sốt được dùng chung hoạt tính sinh học

và nhiều phản ứng chéo epitopes Hầu hết công việc đã được thực hiện vào việc xác định thành phần acid amin, gen ent, những thuộc tính hóa sinh giống nhau, sự giống nhau thông thường ,và các hoạt động của thuộc sinh hóa, công việc liên quan đến các phân tử trung gian ảnh hưởng của SEs vẫn còn tương đối chưa được biết đến Kể từ khi những cuộc triển lãm giống nhau của Sec đáng chú ý, Singh và Betley đã đề nghị rằng các trình

tự cần thiết để cụ thể cấu trúc lớn và dư lượng axit amin cần thiết cho chức năng sinh học thường được bảo tồn trong Sec

2) Tính chất

• Tính chịu nóng

Tính chịu nóng của SE là phụ thuộc vào sự tinh khiết của sự điều chế, các loại độc tố, số lượng ban đầu, độ pH, dung môi đốt nóng, và phương pháp của sự dò tìm Độc tố ruột non B đã được thể hiện bằng cách giữ lại hoạt động trên 16 giờ ở 60oC và pH 7.3 Làm

ấm cho SEB ngâm ở trong nước sôi 30 đến 40 phút không được phá hủy hoàn toàn khả

năng tạo ra nôn mửa ở mèo và khỉ Borja và Bergdoll chuẩn bị đốt nóng SEC trong 30 phút ở 60oC với không có sự thay đổi trong huyết thanh, trong khi đốt nóng SEA ở 80oC trong 30 phút hoặc ở 100oC trong 1 phút làm mất hoạt tính của nó để phản ứng serologically Nói chung, tính chịu nóng của SEA, SEB và SEC là SEC>SEB>SEA Tuy nhiên, điều cần lưu ý là nhiệt độ bất hoạt của nó nhanh hơn bộ đệm thời gian trong các

hệ thống phức tạp hơn trong các tín hiệu truyền đi của thực phẩm.Ví dụ, Denny và cộng

sự của mình đã phát hiện tính ổn định nhiệt tốt hơn của SEA trong nước dung thịt bò so với đệm phosphate, Fung và các cộng sự báo cáo rằng tại 60oC, SEC trong đệm phosphate đã được bất hoạt trong 60 phút so với 180 phút trong môi trường nuôi cấy D121 của SEB có phạm vi từ 9.9 đến 11.4 phút và một giá trị của Z là 25.8 tại 32oC Tibana và các cộng sự, và Bennett và Berry cung cấp bằng chứng cho thấy rằng SEA, SEB, SEC, và SED có thể tồn tại trở lại trong điều kiện đúng về nhiệt độ và thời gian

Các độc tố xuất hiện khả năng kháng phóng xạ gamma Read và Brashaw đã chứng minh nhiều hơn so với 2.7 và 9.7 là cần để giảm tác dụng phụ của SEb trong sữa và đệm tương ứng Gần đây Modi và các cộng sự đã kiểm tra ảnh hưởng của chiếu xạ trong SEA bằng cách sử dụng hệ thống elisa nhạy Trong đệm galatin phosphate, SEA hoàn toàn bất hoạt bởi phóng xạ ở 8.0 kGy Tuy nhiên, ở 15% (mince slurry) 27-37% của SEA vẫn ở 8.0kGy Thật thú vị, tác dụng bảo vệ của (the mince slurry) đã được nhìn thấy tập trung của 30%, trong khi tác dụng bảo vệ giảm khi (the slurry) tăng trên 30%

SES có khả năng chống lại hoạt động của enzyme thủy phân protein như trypsin, chymotrypsin, rennin, và papain (ph>2.0) Tuy nhiên, SE dễ bị ảnh hưởng với pepsin ở giá trị pH nhỏ hơn 2.0 Đây là khả năng chịu được sự tấn công của những sự thủy giải protein hỗ trợ khả năng của chúng vẫn hoạt động sau khi uống hoặc hoạt động duy trì thực phẩm trong nhiều năm

3) Sản xuất

Các tụ độc tố tụ cầu khuẩn được sản xuất trong nguồn giàu dinh dưỡng và các nơi truyền nguồn dinh dưỡng khó khăn Theo Smith và các cộng sự các yếu tố sau ảnh hưởng đến cả sự phát triển và sản xuất độc tố: kích cỡ của chủng, nồng độ oxy, nhiệt độ, pH, nồng độ natriclorua, Aw, các ion khoáng, và thành phần truyền tín hiệu Sự sản xuất của SEs là khác nhau thành hai nhóm dựa trên đặc điểm sản xuất Đầu tiên các nhóm bao gồm SEB và SECs, khi chúng được sản xuất với số lượng lớn và phụ thuộc vào điều kiện

ấp trứng hoặc điều kiện nuôi Điều kiện thứ hai bao gồm các nhóm của SEA, SED, và SEE, khi chúng được sản xuất với số lượng nhỏ hơn, quá trình sản xuất liên quan chặt chẽ đến sự tăng trưởng của sự căng thẳng chứ không phải điều kiện ủ bệnh Nói chung, một số yếu tố hiện diện trong thực phẩm xác định có hay không SE có thể được sản xuất Bất kỳ thực phẩm nào có môi trường thuận lợi và bị ô nhiễm với một loại enterotoxigenic của S.aureus là có khả năng gây ngộ độc thực phẩm do tụ cầu khuẩn Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và sản xuất của tụ cầu và độc tố ruột đã được xem xét và sẽ được đề cập vắn tắt ở đây Người đọc muốn tìm hiểu xa hơn nữa về sự phát triển của S.aureus và sản xuất của SEs điều đó vượt ra ngoài phạm vi của chương này

Mức độ ô nhiễm của việc sản xuất SE là đáng kể.Mức độ cấy cao hơn sẽ cho kết quả sản xuất SE cao hơn Ngoài ra mức độ cấy cao hơn sẽ giảm thiểu được áp lực với môi trường SEs đã được chứng minh được sản xuất ở giới hạn nhiệt độ 10oC-45oC mà tại đó S.aureus

có thể phát triển Nói chung nhiệt độ hỗ trợ kích thích sự phát triển độc tố trong thực phẩm Phạm vi pH sản xuất SE là hơi hạn chế so với sự tăng trưởng và đã được báo cáo

pH ở giữa 5.2-9.0 Ở trong giới hạn pH mà tại đó S.aureus không phát triển tốt, ít có khả năng sản xuất độc tố ruột non Phạm vi tối ưu cho việc sản xuất độc tố ruột non chịu ảnh hưởng bởi Aw SEA (0.90) được sản xuất ở giá trị Aw thấp hơn so với SEB(>0.90) Sự sản xuất của SEs có thẻ chịu ảnh hưởng bởi điều kiện tăng trưởng kỵ khí hay hiếu khí Staphylocci có thể phát triển dưới cả hai điều kiện Tuy nhiên phát triển dưới điều kiện

kỵ khí khí sẽ chậm hơn, và tế bào thường không đạt được những cái mà dưới điều kiện hiếu khí Mặc dù độc tố ruột non thỉnh thoảng được phát hiện được sản xuất dưới điều kiện hiếu khí, những sự quan sát này có thể thay đổi Hiện nay điều đó không thể chứng minh cho giả thuyết rằng độc tố ruột non có thể được sản xuất trong thực phẩm đóng gói

Sự xuất hiện của SEs trong thực phẩm đã được thông báo(94) Xấp xỉ 25% dòng S.aureus được phân lập ngẫu nhiên trong thực phẩm đã cho thấy sự sản xuất các chủng khác nhau của SEs(95) Gourama et al.(96) cho biết rằng sự phát triển của S.aureus đạt mức tối ưu trong số Chowder với số lượng tế bào đếm được lớn hơn 108 cfu/g sau 12 giờ

ở nhiệt độ 42oC Sự sản sinh của SEs và SED bắt đầu sau 3 tiếng Thêm vào đó, sự phát triển trong nước luộc nghêu sản sinh ra lượng SEA và SED với nồng độ lần lượt là 21.9

và 36.3ng/mL, sau 24 giờ ở 37oC Tuy nhiên, Daoud và Debevere tìm ra sự sản xuất của độc tố enteretoxin chỉ ở mức thấp mặc cho sự tăng trưởng tốt của S.aureus trong các loại rau quả được đun nóng

Độc tố enteretoxin là các protein ngoại bào được biểu hiện ở mức cao và có thể được sản xuất ở mức vượt ngưỡng 100ug/mL, trong lúc những độc tố khác được sản xuất ở ngưỡng thấp (thường vào khoảng một vài ug/mL)(2) Bất chấp điều đó, phần lớn các vụ bùng phát nhiễm độc thực phẩm xảy ra do các kiểu huyết thanh A và D Một nhân tố chính trong nhiễm độc thực phẩm bởi độc tố enteretoxin bởi tất cả các type của khuẩn cầu là do khả năng chịu nhiệt nội bào cao của chúng, thứ mà cho phép các độc tố tồn tại được qua các phương pháp xử lý nhiệt có thể giết chết sinh vật trong quy trình sản xuất Vậy nên, không hiếm thực phẩm độc hại được tìm thấy trong đó mà không có staphylococci có thể được phục hồi

Về mặt di truyền, các nội độc tố khá đa dạng Gene (sea) của nội độc tố A(SEA) được hình thành từ một nhóm các thực khuẩn thể ôn hòa, tái tổ hợp với nhiễm sắc thể trong các gen beta-độc tố (hlb) bất hoạt nó và chuyển đổi thụ thể thành một kiểu hình Hlb- SEA+ Một số bộ phận của nhóm thực khuẩn thể này cũng mang gene cho staphylokinase (sak)

và đồng thời chuyển đổi thụ thể thành kiểu hình Hlb- Sak+ SEA+ (98-100) Gene (seb) của nội độc tố B (SEB), ngược lại, là gene nhiễm sắc thể, là một phần của yếu tố riêng biệt lúc đầu được cho là thực khuẩn thể khiếm khuyết cao(101) nhưng nhiều những bằng chứng gần đây(102; R.P.Novick, personal communication) liên kết các gene thành nhóm gây bệnh di động Hơn nữa, các yếu tố của tst và sab nằm trên cùng một locus và loại trừ lẫn nhau Các gen của nội độc tố C(SEC), E(SEE), G(SEG) và H(SEH) đều được cho là

thuộc về nhiễm sắc thể(26), và dù có khả năng, người ta không biết nó liệu có phải là một phần của các nhân tố di truyền lớn hơn như là các gen nội độc tố A và B

Nội độc tố D (SED) được mã hóa bởi một gene nằm trên một staphycococal plasmid lớn (pIB485 là plasmid nguyên mẫu), thứ mà đồng thời cũng mang gene (sej) của nội độc tố J(SEJ) (103), thứ định vị trực tiếp ngay trên mạch trên của sed và được sao chép theo hướng ngược lại Không có gene nội độc tố nào là gene thiết yếu được đòi hỏi cho sự tăng trưởng của S.aureus Vì nguồn gốc của chúng có thể bắt nguồn từ các yếu tố di động, chúng thường được xem là vật liệu di truyền phụ Ngoại trừ SEA, biểu hiện của các gene nội độc tố được điều hòa dương bởi protein ngoại bào tổng thể tụ cầu kiểm soát mạch agr(gene điều hòa phụ) (102) Sự biểu hiện của bộ điều biến này được kích hoạt trong pha lôgarit muộn, và chức năng của nó thì đặc biệt cần thiết cho sự phiên mã của các gene của protein ngoại bào Chính vì vậy, sự hoạt hóa của agr trong pha lôgarit muộn giải thích vì sao các nội độc tố (ngoại trừ SEA) được sản xuất trong pha cân bằng của sự tăng trưởng SEA được sản xuất trong pha lôgarit của sự tăng trưởng, sự phiên mã của gene không nằm dưới sự ảnh hưởng của mạch điều khiển agr(8)

4) Dấu hiệu nhận biết

Việc phát hiện các nội độc tố trong thực phẩm vẫn luôn là một vấn đề Chỉ một vài động vật có thể thông qua phản ứng nôn để loại bỏ các chất độc đã được dùng, và đáng tin cậy nhất trong số này là loài khỉ(20) Mô hình nhiễm độc nội độc tố này thì tốn kém, phức tạp

và đòi hỏi việc xây dựng các trung tâm chăm sóc động vật Tuy nhiên, phương pháp chuẩn của việc dò tìm là có tính miễn dịch và dựa vào các phản ứng kết tủa được quan sát trong nhiều những thí nghiệm khuếch tán gel khác nhau Mặc dù nhiều các độc tố có phản ứng miễn dịch chéo, nhưng phương pháp xét nghiệm Ouchterlony định lượng và định chất chất độc tinh khiết chuẩn thường được sử dụng để nhận biết huyết thanh cụ thể hiện diện Nước chiết từ những món thực phẩm có nghi vấn được sử dụng trong xét nghiệm này, nhưng trong thực tế hiếm khi có đủ nguyên liệu còn sót lại sau một đợt bùng phát để có thể thực sự tiến hành được xét nghiệm này, và một chẩn đoán về nhiễm độc thực phẩm thường được thực hiện một cách truy lại

Khi một thực phẩm bị ngờ rằng gây nhiễm độc thực phẩm bởi tụ cầu phải được xét nghiệm để tìm kiếm sự hiện diện của S.aureus còn hoạt tính và sự hiện diện của SE Điều này là vì khả năng chịu nhiệt của SE tốt hơn nếu so sánh với S.aureus, nó có thể là thực phẩm đóng vai trò là nguồn gốc của một dịch ngộ độc do thực phẩm nhiễm staphycococal nhưng không có sự hiện diện của sinh vật hữu hiệu Để xác nhận một đợt bùng phát nhiễm độc thực phẩm do tụ cậu, điều cần thiết ở đây là chỉ ra sự hiện diện của SE trong món thực phẩm liên quan Các quy trình truyền thống để phát hiện SE thì tốn thời gian, vất vả và thiếu độ nhạy Thử nghiệm thành công lúc trước cho sự hiện diện của SE sử dụng mẫu nôn của khỉ vẫn còn được sử dụng đến ngày nay Một mẫu thực phẩm đồng chất với nghi vấn (thường là 50 mL) được đưa vào dạ dày của những con khỉ nâu trẻ (Macaca mulatta) Những con vật này sẽ được theo dõi liên tục trong năm giờ tiếp đó Những kết quả dương là sự ói mửa của các con vật Những con mèo ( Một mẫu kết quả tích cực trong nôn mửa của con vật Mèo con (đưa vào màng bụng hoặc tiêm tĩnh mạch)

đã được dùng để thay thế cho những chú khỉ trong dò tìm SE Những xét nghiệm trên các động vật chịu nhiều những rắc rối như kinh phí và nhân công tham gia trong việc duy trì một bầy động vật, sự thất thường, độ nhạy với những động vật khác nhau, và sự hiện diện của các chất gây nhiễu trong mẫu

Các phương pháp hiện được dùng để dò tìm SE thì khá nhạy nhưng bị ảnh hưởng bởi việc thu hồi độc tố không hiệu quả sau khi tách chiết từ thực phẩm, đặc biệt là khi nồng

độ độc tố trong thực phẩm thấp Nói chung, hầu hết các loại thực phẩm liên quan đến việc bùng phát nhiễm độc thực phẩm do staphycocal đều chứa lượng độc tố ở ngưỡng thấp (<1ug)(19) Lượng độc tố tối thiểu cần thiết cho các triệu chứng lâm sàng được cho

là vào khoảng 0.1ug/100g thực phẩm(64) Vì vậy, để xác định độ an toàn của thực phẩm được cung cấp, các phương pháp dò tìm phải phát hiện được ít nhất 1ngSE /g thực phẩm (104)

Các phương pháp sử dụng kiểm nghiệm huyết thanh trong ống nghiệm đã được phát triển để đáp ứng các tiêu chí về độ nhạy với SE Các xét nghiệm có liên quan đến những phương pháp với độ nhạy cao bao gồm các xét nghiệm thụ động và vón cục thụ động dự trữ (PHA và RPHA), xét nghiệm ngưng kết thụ động dự trữ (ELISA), và xét nghiệm

miễn dịch phát quang (LIA) Sự phát hiện SE trong các thực phẩm có truyền thống sử dụng các kháng thể hình thành trong cơ thể chống lại sự tiêm nhập của các kháng nguyên hòa tan, ví dụ như nội độc tố Những kháng thể này sau đó có thể phản ứng in vitro với kháng nguyên đó để tạo thành kết tủa Hệ thống dựa trên xét nghiệm Hệ thống dựa trên thử nghiệm liên quan đến huyết thanh học có thể được phân thành ba loại: (a) xét nghiệm gel khuếch tán miễn dịch, (b) xét nghiệm ngưng kết , (c) xét nghiệm đánh dấu miễn dịch.

TIÊU BẢN HIỂN VI

Phương pháp truyền thống như khảo nghiệm microslide, khảo nghiệm immunodiffusion gel được sử dụng cho phát hiện của SE Khảo nghiệm microslide là dựa trên sự hình thành kết tủa trên một ma trận thạch và các thủ tục đang được đề nghị cho phát hiện của

SE Thí nghiệm khuyếch tán microslide gel này được sử dụng để hình dung kết tủa và được mô tả chi tiết trong Tài liệu Phân tích Vi khuẩn học (10)

Như thể hiện trong hình 1, microslide được chuẩn bị với sự trợ giúp của một mẫu, chẳng hạn có năm giếng được hình thành trong agar Noble tinh khiết cao Kháng huyết thanh được thêm vào trung tâm, và độc tố tham chiếu được đặt trong giếng 3 và 5 (Hình 2)

Mẫu chuẩn bị được thêm vào các giếng 2 và 4 Các slide sau đó được ủ trong một căn phòng độ ẩm ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày Kháng nguyên (enterotoxin) và kháng huyết thanh khuếch tán từ các giếng, các hình thức kết tủa nơi tập trung của kháng nguyên và kháng thể có tỷ lệ tối ưu Slide sau đó được đọc bằng cách giữ nó trên một nguồn ánh sáng và chống lại một nền tối Những sự kết tủa được xác định xuyên qua sự kết tụ của

nó với tuyến cơ sở (của) sự kết tủa (Hình 2)

Ít nhất là 0,1 mg / ml hoặc ít hơn của SE có thể được phát hiện bằng cách sử dụng phương pháp này Tuy nhiên, mức độ nhạy cảm là khó để đạt được (21), trong khi những người khác đã báo cáo một số bất cập trong kỹ thuật này Ví dụ, Pereira et al (105) đã phát hiện ra rằng sự sinh ra ở mức độ thấp của SED (ng / mL) chủng S aureus cụ thể trên các phương tiện truyền thông phòng thí nghiệm, không phát hiện được bằng phương pháp khuếch tán gel, có thể sản xuất đủ SED (ng/g) trong thực phẩm gây ra ngộ độc thực