ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ MỸ LAN NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VÀ NÂNG CAO KHẢ NĂNG TỔNG HỢP LIPID CỦA VI TẢO LÀM CƠ SỞ ĐỂ SẢN XUẤT BIODIESEL LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  NGUYỄN THỊ MỸ LAN NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VÀ NÂNG CAO KHẢ NĂNG TỔNG HỢP LIPID CỦA VI TẢO LÀM CƠ SỞ ĐỂ SẢN XUẤT BIODIESEL Chun ngành: HĨA SINH Mã số: 62 42 30 15 Phản biện 1: PGS.TS Trương Vĩnh Phản biện 2: TS Nguyễn Thị Thanh Xn Phản biện 3: TS Nguyễn Hữu Phúc Phản biện độc lập 1: PGS.TS Trương Vĩnh Phản biện độc lập 2: TS Nguyễn Thị Thanh Xn LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS PHẠM THÀNH HỔ PGS.TS NGUYỄN TIẾN THẮNG Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2014 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi thực Các số liệu kết nghiên cứu luận án trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả Luận án NCS Nguyễn Thị Mỹ Lan LỜI CẢM ƠN Xin gởi lòng biết ơn sâu sắc đến hai Thầy PGS.TS Phạm Thành Hổ – PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng tận tình hướng dẫn, giúp đỡ nhiều suốt trình nghiên cứu, tạo điều kiện tốt cho hoàn thành tốt luận án Xin chân thành cám ơn cô PGS.TS Đồng Thò Thanh Thu, PGS.TS Phạm Thò Ánh Hồng, TS Lê Phi Nga động viên hỗ trợ nhiều mặt tinh thần học thuật Xin trân trọng cám ơn TS Trần Ngọc Đức, TS Lưu Thò Thanh Nhàn, Thầy TS Nguyễn Thanh Tùng cung cấp nhiều tài liệu có giá trò cho luận án hỗ trợ cho nhiều lónh vực nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn Th.S Lê Thò Mỹ Phước, TS Lương Thò Mỹ Ngân, GV Lê Thò Thanh Loan, Th.S Huỳnh Hiệp Hùng, Th.S Nguyễn Hoàng Ngọc Phương sát cánh trình thực luận án Chân thành cám ơn Quỹ khoa học công nghệ ĐHQG TP HCM cho đề tài trọng điểm (B2010-18-01-TĐ) Th.S Lê Thò Mỹ Phước làm chủ nhiệm đề tài Xin chân thành cám ơn quý Thầy Cô hội đồng dành nhiều thời gian đóng góp ý kiến quý báu để hoàn thành tốt luận án Xin chân thành cảm ơn Thầy Cô bạn Bộ môn Công nghệ sinh học Thực vật Chuyển hóa sinh học, Bộ môn Sinh hóa tạo điều kiện thuận lợi tốt cho hoàn thành tốt luận án Chân thành cảm ơn em Đoàn Thò Mộng Thắm, Lương Công Khôi, Trương Huy Hồng, Nguyễn Thanh Vũ em sinh viên CNSH khóa CS05, CS07, CS08, CS09 hỗ trợ hoàn tất nội dung nghiên cứu luận án Chân thành cảm ơn anh chò bạn làm công tác nghiên cứu giảng dạy Khoa sinh học giúp đỡ suốt thời gian qua Cuối cùng, bày tỏ lòng biết ơn cho xứng đáng với hy sinh, tận tụy gia đình, người thân, bạn bè… dành cho suốt năm qua NCS Nguyễn Thò Mỹ Lan i Mục lục MỤC LỤC TRANG PHỤ BÌA LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH ix MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 NHIÊN LIỆU SINH HỌC 1.1.1 Nhiên liệu sinh học 1.1.2 Những ưu điểm nhiên liệu sinh học: 1.1.3 Tình hình nghiên cứu nhiên liệu sinh học từ vi tảo Thế Giới Việt Nam 12 1.1.4 Sự phát triển Biodiesel Thế Giới Việt Nam 16 1.2 TẢO DẦU 18 1.2.1 Tảo dầu 18 1.2.2 Quy trình tạo biodiesel từ vi tảo dầu 20 1.3 THÀNH PHẦN VÀ Q TRÌNH SINH TỔNG HỢP LIPID Ở VI TẢO 21 1.3.1 Thành phần lipid vi tảo 21 1.3.2 Q trình sinh tổng hợp lipid vi tảo 23 1.4 CÁC KỸ THUẬT ĐIỀU KHIỂN CON ĐƯỜNG CHUYỂN HĨA LIPID TRONG VI TẢO 25 1.4.1 Kỹ thuật sinh hóa (BE) 26 1.4.1.1 Ảnh hưởng nồng độ chất dinh dưỡng đến lượng lipid tích lũy vi tảo dầu 27 1.4.1.2 Ảnh hưởng ánh sáng đến tích lũy lipid vi tảo dầu 29 1.4.1.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến tích lũy lipid vi tảo dầu 29 ii Mục lục 1.4.1.4 Ảnh hưởng nồng độ muối đến tích lũy lipid vi tảo dầu 29 1.4.1.5 Phương pháp ni cấy giai đoạn 30 1.4.2 Kỹ thuật di truyền (GE) 31 1.4.3 Kỹ thuật điều khiển yếu tố phiên mã (TFE) 32 1.5 MƠ HÌNH NHÂN SINH KHỐI VI TẢO 33 1.5.1 Mơ hình nhân sinh khối vi tảo phòng thí nghiệm 33 1.5.2 Mơ hình nhân sinh khối vi tảo quy mơ pilot 35 1.5.2.1 Hệ thống ni vi tảo ao mở ngồi trời (Race way) 35 1.5.2.2 Mơ hình nhân sinh khối vi tảo hệ thống kín (Photobioreactor) 37 CHƯƠNG 39 VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 39 2.1 NGUỒN PHÂN LẬP 39 2.2 DỤNG CỤ - HĨA CHẤT – VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM : 40 2.2.1 Dụng cụ 40 2.2.2 Hóa chất – vật liệu 40 2.3 MƠI TRƯỜNG PHÂN LẬP VÀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP 40 2.3.1 Mơi trường phân lập tảo nước [103] 40 2.3.2 Mơi trường phân lập tảo nước mặn [103] 41 2.3.3 Phương pháp phân lập 41 2.4 PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH LIPID TRONG TẾ BÀO VI TẢO 42 2.5 PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH VI TẢO 43 2.5.1 Định danh vi tảo theo phương pháp truyền thống 43 2.5.2 Định danh vi tảo theo phương pháp giải trình tự gen 18S rDNA tra cứu Blast Search (Thực Cơng ty Nam Khoa) 43 2.6 PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC NHANH CÁC CHỦNG VI TẢO CĨ CHỨA LIPID 45 2.7 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA SỰ THIẾU NITROGEN, PHOSPHOR ĐẾN KHẢ NĂNG TÍCH LŨY LIPID CỦA VI TẢO 47 2.8 PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG LIPID VÀ TAG TRONG VI TẢO 49 2.8.1 Định lượng lipid phương pháp Soxhlet [46], [58], [61], [81] 49 2.8.2 Định lượng lipid phương pháp Bligh Dyer [18] 50 iii 2.8.3 Mục lục Định lượng nhanh TAG phương pháp đo OD huỳnh quang với thuốc nhuộm Nile Red [31], [55] 50 2.9 PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN VÀ HÀM LƯỢNG CÁC ACID BÉO CĨ TRONG CÁC CHỦNG VI TẢO BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ (GC-FID) THEO TIÊU CHUẨN EN 14103:2003 52 2.10 PHÂN TÍCH MỘT SỐ TÍNH CHẤT LÝ HĨA CỦA DẦU TẢO 53 2.11 QUY TRÌNH NI CẤY, THU SINH KHỐI VI TẢO TRONG MƠI TRƯỜNG LỎNG 53 2.11.1 Ni cấy 53 2.11.2 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện ni cấy đến khả tích tũy lipid vi tảo 54 2.11.3 Xây dựng đường cong tăng trưởng Pediastrum theo mật độ tế bào 55 2.11.4 Xây dựng đường cong tăng trưởng Pediastrum theo mật độ sinh khối56 2.11.5 Phương pháp ni cấy vi tảo giai đoạn 56 QUY TRÌNH NI CẤY, THU SINH KHỐI Pediastrum duplex Meyen 2.12 TRÊN GIÁ ĐỠ CELLULOSE VI KHUẨN 57 2.12.1 Phương pháp hoạt hóa, nhân giống Acetobacter xylinum lên men thu sinh khối cellulose vi khuẩn (BC) [2] 58 2.12.2 Chuẩn bị miếng BC chứa mơi trường tạo stress 58 2.12.3 Phương pháp ni cấy giai đoạn giá đỡ BC 58 2.12.4 Đánh giá khả tái sử dụng giá đỡ BC 59 2.13 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 59 CHƯƠNG 60 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 60 3.1 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI TẢO CHỨA LIPID 60 3.1.1 Phân lập sơ tuyển 60 3.1.1.1 Vi tảo nước 60 3.1.1.2 Vi tảo nước mặn 60 3.1.2 Định tính lipid phẩm nhuộm huỳnh quang Nile Red định danh vi tảo hình thái 60 iv Mục lục 3.1.3 Định danh đại diện số chủng vi tảo phương pháp sinh học phân tử 70 3.1.4 Tuyển chọn chủng vi tảo có chứa lipid điều kiện ni cấy ngồi tự nhiên 71 3.1.4.1 Khảo sát khả tích lũy lipid nội bào chủng vi tảo nước điều kiện ni cấy ngồi tự nhiên 72 3.1.4.2 Khảo sát khả tích lũy lipid nội bào chủng vi tảo nước mặn điều kiện ni cấy ngồi tự nhiên 76 3.2 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA SỰ THIẾU NITROGEN, PHOSPHOR ĐẾN KHẢ NĂNG TÍCH LŨY LIPID CỦA CHỦNG VI TẢO TUYỂN CHỌN 80 3.2.1 Chủng N12: Pediastrum duplex Meyen 80 3.2.2 Chủng N17: Scenedesmus accuminatus (Lag.) Chodat 82 3.2.3 Chủng M5: Chlamydomonas sp 83 3.2.4 Chủng M16: Tetraselmis sp 84 3.3 XÁC ĐỊNH LIPID TỔNG, THÀNH PHẦN VÀ HÀM LƯỢNG CÁC ACID BÉO CĨ TRONG CÁC CHỦNG VI TẢO KHẢO SÁT 85 3.3.1 Định lượng lipid tổng 85 3.3.1.1 Khảo sát dung mơi ly trích lipid từ vi tảo 85 3.3.1.2 Định lượng lipid tổng vi tảo phương pháp Soxhlet – phương pháp Bligh and Dyer 87 3.3.2 Thành phần hàm lượng acid béo, lipid tổng có chủng vi tảo khảo sát 90 3.4 QUY TRÌNH NI CẤY, THU SINH KHỐI VI TẢO Pediastrum duplex Meyen TRONG MƠI TRƯỜNG LỎNG 93 3.4.1 Ảnh hưởng điều kiện ni cấy đến khả tích lũy lipid vi tảo Pediastrum duplex Meyen (N12) 93 3.4.1.1 Ảnh hưởng mơi trường ni cấy 93 3.4.1.2 Ảnh hưởng điều kiện ánh sáng - nhiệt độ 94 3.4.1.3 Ảnh hưởng pH mơi trường ni cấy 95 3.4.1.4 Ảnh hưởng nồng độ CO2 96 v 3.4.2 Mục lục Khảo sát động học tăng trưởng Pediastrum duplex Meyen cường độ chiếu sáng khác 97 3.4.3 Ni cấy Pediastrum duplex Meyen hai giai đoạn mơi trường lỏng100 3.4.3.1 Ảnh hưởng thiếu nitrogen phosphor lên tăng trưởng Pediastrum duplex Meyen 101 3.4.3.2 Ảnh hưởng thiếu nitrogen phosphor lên hàm lượng TAG lipid tổng Pediastrum duplex Meyen 103 3.5 QUY TRÌNH NI CẤY, THU SINH KHỐI VI TẢO Pediastrum duplex Meyen TRÊN GIÁ ĐỠ CELLULOSE VI KHUẨN (BC) 110 3.5.1 Hoạt hóa, nhân giống lên men Acetobacter xylinum: 111 3.5.2 Ứng dụng ni cấy Pediastrum duplex Meyen giá đỡ BC theo phương pháp giai đoạn 112 3.5.3 Đánh giá khả tái sử dụng giá thể BC 114 3.5.4 So sánh hiệu suất sinh khối vi tảo Pediastrum duplex Meyen mơi trường lỏng giá đỡ BC 115 3.5.5 Định lượng lipid tổng Pediastrum duplex Meyen ni cấy giai đoạn mơi trường lỏng giá đỡ BC 116 3.5.6 Thành phần hàm lượng acid béo có Pediastrum duplex Meyen ni cấy giai đoạn giá đỡ cellulose vi khuẩn (BC) 117 3.5.7 3.6 Tính chất lý hóa lipid vi tảo Pediastrum duplex Meyen 120 XÂY DỰNG QUY TRÌNH NI VI TẢO CĨ HÀM LƯỢNG LIPID CAO121 3.6.1 Xây dựng quy trình ni vi tảo giai đoạn mơi trường lỏng 121 3.6.2 Xây dựng quy trình ni vi tảo giai đoạn giá đỡ cellulose vi khuẩn123 3.6.3 Đánh giá ưu nhược điểm vi tảo Pediastrum duplex Meyen ni cấy mơi trường lỏng giá đỡ cellulose vi khuẩn 124 CHƯƠNG 125 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 125 4.1 KẾT LUẬN 125 4.2 KIẾN NGHỊ 126 DANH MỤC BÀI BÁO ĐÃ CƠNG BỐ 127 TÀI LIỆU THAM KHẢO 128 vi Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DMSO – Dimethyl sulfoxide MUFA – MonoUnsaturated Fatty Acid (Acid béo khơng bão hòa có nối đơi) NT – Nghiệm thức PUFA – PolyUnsaturated Fatty Acid (Acid béo khơng bão hòa có nhiều nối đơi) PC: Plant Cellulose (Cellulose thực vật) SFA – Saturated Fatty Acid (Acid béo bão hòa) USFA – Unsaturated Fatty Acid (Acid béo khơng bão hòa) TAG – Triacylglyceride 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 0,388 0,541 0,637 0,686 0,758 0,834 0,870 0,877 0,925 0,911 0,974 0,954 0,994 0,974 0,925 0,571 0,647 0,711 0,760 0,871 0,971 1,008 1,070 1,114 1,128 1,156 1,201 1,240 1,294 1,235 0,375 0,559 0,675 0,734 0,821 0,913 0,956 0,965 1,023 1,006 1,082 1,057 1,106 1,082 1,023 0,596 0,687 0,765 0,823 0,957 1,078 1,123 1,198 1,251 1,267 1,301 1,355 1,402 1,468 1,397 Parameter Table Analyzed Column A vs Column B Data PTN Vs Ngoai troi Unpaired t test P value P value summary Are means signif different? (P < 0.05) One- or two-tailed P value? t, df P[...]... cho năng lượng từ nhiên liệu hóa thạch đang dần cạn kiệt Đề tài Nghiên cứu tuyển chọn và nâng cao khả năng tổng hợp lipid của vi tảo, làm cơ sở để sản xuất biodiesel là một hướng nghiên cứu rất mới ở Vi t Nam và phù hợp với tình hình nghiên cứu chung của Thế Giới Từ những luận giải trên, vi c thực hiện hướng nghiên cứu của đề tài là cần thiết, có ý nghĩa về mặt khoa học và thực tiễn 2 Mục tiêu nghiên. .. tiêu nghiên cứu: Thu thập, tuyển chọn bộ giống vi tảo giàu lipid và xây dựng quy trình nuôi cấy vi tảo nhằm gia tăng hàm lượng lipid tảo 3 Nội dung nghiên cứu thực nghiệm của luận án:  Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi tảo có khả năng tạo lipid ở miền Nam Vi t Nam với hàm lượng ≥ 10% so với trọng lượng khô  Nghiên cứu điều kiện để nâng cao khả năng tổng hợp lipid của chủng vi tảo tuyển chọn ≥ 20%... từ dầu tảo thông qua các chỉ tiêu lý hóa  Xây dựng quy trình nuôi vi tảo có hàm lượng lipid cao ≥ 20% so với trọng lượng khô, làm cơ sở để sản xuất biodiesel 4 Đóng góp mới của luận án  Đã sàng lọc và tuyển chọn được 20 chủng vi tảo ở Vi t Nam có hàm lượng lipid cao, trong đó có 5 chủng đạt hiệu suất ly trích lipid ≥ 20%, là cơ sở tạo nguồn nguyên liệu bền vững cho vi c sản xuất biodiesel tại Vi t... quy trình nuôi vi tảo có hàm lượng lipid cao để sản suất biodiesel kinh phí 400 triệu (2010 – 2013) Nhằm góp phần phát triển hướng nghiên cứu biodiesel từ vi tảo ở Vi t Nam, chúng tôi đã tiến hành sưu tập bộ giống vi tảo có chứa lipid ở Vi t Nam và tiến hành một số phương pháp phân tích định tính, định lượng lipid có trong các chủng vi tảo Tuy nhiên, khả năng tích lũy lipid trong vi tảo còn ở mức giới... đoạn vi tảo Pediastrum duplex Meyen trên cellulose vi khuẩn ở điều kiện stress thiếu nitrogen và phosphor đạt hàm lượng lipid cao 36,43% so với trọng lượng khô với thành phần acid béo có C16 và C18:1 chiếm 46,08% và 21,69% tương ứng, và có các tính chất lý hóa phù hợp để sản xuất biodiesel 5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu – Tuyển chọn được bộ giống vi tảo (5 chủng) có hàm lượng lipid. .. đầu  Nghiên cứu nuôi cấy, thu sinh khối vi tảo trên giá đỡ cellulose vi khuẩn trong điều kiện ánh sáng tự nhiên  Nghiên cứu nuôi cấy ở quy mô sản xuất nhỏ (bình nhựa trong suốt 20L, hồ kiếng 200L)  Thu sinh khối và ly trích thu lipid từ sinh khối các loài vi tảo tuyển chọn  Xác định thành phần và hàm lượng các acid béo có trong lipid từ một số chủng vi tảo tuyển chọn  Đánh giá chất lượng lipid. .. hành nghiên cứu và trồng các loài cây nông, lâm nghiệp để cung cấp nguyên liệu cho sản xuất nhiên liệu sinh học Đến nay đã có khoảng 50 quốc gia sản xuất và sử dụng nhiên liệu sinh học ở mức độ khác nhau, trong đó có Vi t Nam 11 Chương 1: Tổng quan tài liệu Với ưu thế về diện tích canh tác, Mỹ sử dụng ngô để sản xuất ethanol và đậu nành để sản xuất biodiesel [38] Thống kê trong năm 2003, Mỹ đã sản xuất. .. sản xuất nhiên liệu sinh học từ vi tảo cũng rất được chú ý 1.1.3 Tình hình nghiên cứu nhiên liệu sinh học từ vi tảo trên Thế Giới và ở Vi t Nam  Thế Giới: Những năm gần đây, hướng nghiên cứu nhiên liệu sinh học từ sinh khối vi tảo đã thu hút được nhiều sự quan tâm và đầu tư của nhiều nhà nghiên cứu, các trường Đại học, các tổ chức và các công ty lớn của nhiều quốc gia trên thế giới Tổng đầu tư của. .. triệu USD thông qua văn phòng Nghiên cứu Khoa học Không quân (AFOSR) cho mục tiêu nghiên cứu và tăng cường cơ sở hạ tầng phục vụ nghiên cứu khai thác các chủng loại vi tảo dùng trong sản xuất nhiên liệu phản lực [96], [98] Năm 2009, Bộ Năng lượng Mỹ tuyên bố chọn 19 dự án nghiên cứu chế biến nhiên liệu sinh học từ vi tảo để giao 564 triệu USD kinh phí từ nguồn Tái đầu tư và Phục hồi (The American Recovery... tính của Bộ Năng Lượng Mỹ, nước này cần một diện tích đất đai lớn độ 38.849 km2 để trồng vi tảo thay thế tất cả nhu cầu dầu hỏa hiện nay trong nước [94] Hiện vi tảo đã được nghiên cứu rất nhiều để sản xuất hydrogen (H2), methane, dầu (các triglyceride và hydrocarbon để chuyển hóa thành biodiesel, năng lượng máy bay,…) và bioethanol [15]  Chi phí sản xuất biodiesel vẫn là một trở ngại lớn cho vi c ... TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  NGUYỄN THỊ MỸ LAN NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VÀ NÂNG CAO KHẢ NĂNG TỔNG HỢP LIPID CỦA VI TẢO LÀM CƠ SỞ ĐỂ SẢN XUẤT BIODIESEL Chun ngành: HĨA SINH Mã số: 62 42 30 15... liệu thích hợp để sản xuất nguồn “ lượng xanh”, thay cho lượng từ nhiên liệu hóa thạch dần cạn kiệt Đề tài Nghiên cứu tuyển chọn nâng cao khả tổng hợp lipid vi tảo, làm sở để sản xuất biodiesel ... trình tạo biodiesel từ vi tảo dầu 20 1.3 THÀNH PHẦN VÀ Q TRÌNH SINH TỔNG HỢP LIPID Ở VI TẢO 21 1.3.1 Thành phần lipid vi tảo 21 1.3.2 Q trình sinh tổng hợp lipid vi tảo