Xây dựng phương pháp định tính, định lượng đồng thời adenosin và cordycepin trong chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ QUẾ MAI XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI ADENOSIN VÀ CORDYCEPIN TRONG CHẾ PHẨM CHỨA ĐÔNG TRÙNG

TỔNG QUAN

Tổng quan về đông trùng hạ thảo

1.1.1 Đặc điểm của đông trùng hạ thảo Đông trùng hạ thảo (Cordyceps) là một loại đông dược quý có bản chất là dạng ký sinh của loài nấm Ophiocordyceps sinensis thuộc nhóm nấm

Ascomycetes trên cơ thể ấu trùng của một vài loài bướm trong chi Thitarodes trước đây phân loại trong chi Hepialus

Đông trùng hạ thảo, hay còn gọi là Ophiocordyceps sinensis, là một loại dược liệu đặc biệt, có nguồn gốc từ sự kết hợp giữa nấm và sâu Vào mùa hè, nấm mọc chồi từ đầu con sâu, trong khi mùa đông, chúng trông giống như sâu côn trùng Dược liệu này bao gồm phần sâu non dài từ 2,5 – 3 cm và có đường kính từ 3 – 5 mm, với màu sắc vàng nâu hoặc xám nâu Nấm phát triển từ đầu sâu, tiêu thụ gần như toàn bộ chất dinh dưỡng, khiến sâu chết khô Cơ chế nhiễm nấm vào sâu vẫn chưa được hiểu rõ, nhưng có thể xảy ra qua việc ăn phải bào tử hoặc hít phải Quá trình phát triển của nấm từ sâu kéo dài từ mùa đông đến cuối xuân đầu hè, và tại Trung Quốc, đông trùng hạ thảo thường xuất hiện ở các vùng rừng ẩm ướt như Tứ Xuyên, Vân Nam, Tây Khang và Tây Tạng.

1.1.2 Phân loại đông trùng hạ thảo

Nấm Cordyceps có hơn 350 loài, trong đó Trung Quốc đã phát hiện 60 loài Tuy nhiên, hai loài được nghiên cứu và nuôi trồng nhiều nhất là Cordyceps sinensis (Berk) Sacc và Cordyceps militaris.

1.1.3 Thành phần hóa học trong đông trùng hạ thảo Đông trùng hạ thảo chứa nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học như: các ribonucleotid, mannitol, sterol, các acid hữu cơ, các loại đường mono- , di-, oligosaccharid và polysaccharid, các protein, polyamin, vitamin (E, K, B1, B2, B12…) và rất nhiều khoáng chất (K, Na, Ca, Mg, Cu, Mn, Zn, Se, Si…) trong đó nhóm hoạt chất có tác dụng quan trọng là HEAA (hydroxyl ethyl adenosin analogs) a Các nucleotid:

Nucleotid là thành phần hoạt tính quan trọng trong đông trùng hạ thảo, với adenosin và cordycepin là các chỉ số chính để đánh giá chất lượng Ngoài ra, đông trùng hạ thảo còn chứa nhiều loại nucleotid khác như uridin và 2’-3’ – dideoxyadenosin, các hợp chất này có khả năng hỗ trợ điều trị HIV thông qua các hoạt chất như didanosin và hydroxyethyladenosin, không có trong các dược liệu tự nhiên khác Bên cạnh đó, polysaccharid cũng đóng vai trò quan trọng trong tác dụng sinh học của đông trùng hạ thảo, với bản đồ saccharid giúp đánh giá chất lượng, bao gồm các monosaccharid như rhamnose, ribose, arabinose, glucose, mannitol và fructose Cuối cùng, các sterol cũng là thành phần chính góp phần vào giá trị dinh dưỡng và tác dụng của đông trùng hạ thảo.

Các phytosterol trong đông trùng hạ thảo như cholesterol, campesterol và β-sitosterol có vai trò quan trọng trong việc điều trị ung thư vú, tuyến tiền liệt và ung thư trực tràng Ngoài ra, đông trùng hạ thảo còn chứa các acid amin thiết yếu như acid glutamic, acid aspartic và arginin, cùng với các hợp chất polyamin như cadaverin, spermidin, spermin và cyclodipeptid như cordycedipeptid A Những hợp chất này mang lại hoạt tính chống viêm, kháng khuẩn và kháng virus hiệu quả.

Hình 1.1 Cấu tạo một số nucleotid trong đông trùng hạ thảo [28]

1.1.4 Tác dụng của đông trùng hạ thảo Đông trùng hạ thảo là một vị thuốc được ghi vào tài liệu thuốc đông y từ giữa thế kỷ 18 trong bộ “bản thảo cương mục thập di” (1765) Theo tài liệu cổ, đông trùng hạ thảo có vị ngọt, tính ôn, quy vào 2 kinh phế và thận, tác dụng ích phế, thận, bổ tinh tủy, cầm máu, hóa đờm, dùng chữa hư lao sinh ho, ho ra máu, liệt dương, lưng gối đau mỏi, di tinh a Tác dụng tăng cường sức khỏe

Nghiên cứu chỉ ra rằng dịch chiết cao đông trùng hạ thảo có khả năng tăng cường hoạt động của các enzym như superoxid dismutase, glutathion peroxidase và catalase, giúp loại bỏ gốc tự do trong cơ thể Điều này không chỉ làm giảm quá trình peroxide lipid mà còn có tác dụng bảo vệ cơ thể khỏi các yếu tố có hại như căng thẳng và lão hóa Bên cạnh đó, đông trùng hạ thảo còn hỗ trợ tăng cường hệ miễn dịch, mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe.

Nghiên cứu thực nghiệm đã chỉ ra rằng đông trùng hạ thảo có khả năng nâng cao hoạt động miễn dịch tế bào và miễn dịch dịch thể, bao gồm việc tăng cường hoạt tính của đại thực bào và tế bào miễn dịch tự nhiên (natural killer cell) Ngoài ra, đông trùng hạ thảo còn điều tiết phản ứng của tế bào lympho B, tăng cường một cách có chọn lọc hoạt tính của tế bào T ức chế và làm tăng nồng độ các kháng thể IgG, IgM trong huyết thanh Bên cạnh đó, đông trùng hạ thảo cũng có tác dụng chống oxy hóa hiệu quả.

Dịch chiết cao đông trùng hạ thảo cho tác dụng chống oxy hóa tương tự như quá trình peroxide chất béo, men xanthin oxidase d Tác dụng chống ung thư

Nấm đông trùng hạ thảo chứa polysaccharides như cordyglucan (1 3)-β-glucan, được cho là có khả năng ức chế khối u thông qua hai cơ chế chính: trực tiếp tiêu diệt tế bào ung thư và gián tiếp kích thích hệ miễn dịch Ngoài ra, nấm này còn có tác dụng chống viêm bằng cách ức chế sản sinh các tác nhân gây viêm như gốc tự do NO, cytokine TNF α và IL 12, đồng thời ngăn chặn sự phát triển của bạch cầu Nấm đông trùng hạ thảo cũng hỗ trợ bảo vệ thận, phổi và gan, giúp phục hồi nhanh chóng và giảm triệu chứng của các bệnh lý như viêm thận mãn tính, suy thận, cũng như các vấn đề về hô hấp như ho, hen phế quản và lao phổi Hơn nữa, nấm còn tăng cường hoạt tính của các men gan như AST, ALT, γ GTP, ALP và LDH.

1.1.5 Một số chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo

Hiện nay, thị trường có rất nhiều chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo, nhưng không thể thống kê chính xác số lượng Đông trùng hạ thảo thường được kết hợp với các dược liệu quý hiếm khác như nhân sâm, tam thất, và tổ yến Các dạng bào chế phổ biến bao gồm dạng rắn như viên nang, viên hoàn, gói bột, và dạng lỏng như nước uống, cao lỏng Một số chế phẩm tiêu biểu chứa đông trùng hạ thảo có thể kể đến.

- Dạng rắn: viên nang Pure cordyceps capsule, viên Đông trùng hạ thảo Tenken, bột Cordyceps extract…

Cao lỏng đông trùng hạ thảo tam thất, nước Yến Đông trùng hạ thảo, nước uống Đông trùng hạ thảo He Yuan Tang – King of cordyceps, và nước cốt gà Đông trùng hạ thảo là những sản phẩm nổi bật trong dòng sản phẩm dinh dưỡng từ đông trùng hạ thảo, mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe.

Tổng quan về adenosin, cordycepin…………………………… 7 1 Công thức cấu tạo, đặc điểm vật lý hóa học

1.2.1 Công thức cấu tạo, đặc điểm vật lý hóa học

Cordycepin và adenosin đều được cấu tạo bởi nhân purin liên kết với đường ribose (ribofuranose) bằng liên kết β –N9 – glucosid [14], [33]

Hình 1.2 Công thức cấu tạo cordycepin [14] Tên khoa học: 9-(3-deoxy-β-D-ribofuranosyl) adenin

Phân tử cordycepin tính kiềm, dạng bột hoặc tinh thể bông tuyết Điểm chảy: 228 – 231 o C Độ tan: tan trong DMSO, methanol, ethanol

Bước sóng hấp thụ cực đại 259,0 nm [14]

Hình 1.3 Công thức cấu tạo adenosin [8] Tên khoa học: 9 - β-D-ribofuranosyl adenin

Adenosin dạng bột tinh thể màu trắng

Nhiệt độ nóng chảy: 234 – 235 o C Độ tan:

Bảng 1.1 Độ tan của adenosin trong một số dung môi [8]

Dung môi Độ tan (mg/ml)

Trong dung dịch nước, HCl 0,1N, NaOH 0,1N adenosin có phổ hấp thụ UV tương tự nhau, bước sóng hấp thụ cực đại 259 nm với ε = 15185 [8]

1.2.2 Dược động học cordycepin và adenosin

Cordycepin, một chất tương tự adenosin, có con đường chuyển hóa giống như adenosin Khi adenosin được nghiên cứu trên động vật có vú, nó nhanh chóng bị loại nhóm amin bởi men adenosin deaminase trong huyết tương, tạo thành hypoxanthinosin Sau khi vào tế bào, adenosin được phosphoryl hóa bởi adenosin kinase để tạo thành ATP Nếu tế bào không cần adenosin, nó sẽ tiếp tục bị loại nhóm amin trong tế bào, dẫn đến việc hình thành hypoxanthinosin không hoạt tính, sau đó chuyển hóa thành acid uric và thải trừ qua thận Tương tự, cordycepin cũng bị men adenosin deaminase loại nhóm amin nhanh chóng, tạo ra hypoxanthinosin.

Hình 1.4 Con đường chuyển hóa của adenosin ở động vật có vú [28]

1.2.3 Tác dụng của cordycepin, adenosin a Tác dụng của cordycepin

* Ức chế sinh tổng hợp purin, ADN/ARN và tín hiệu mTOR

Khi vào trong tế bào, cordycepin chuyển hóa thành dạng 5’ mono, di và tri phosphate ức chế các enzyme như ribose phosphate pyrophosphokinase và

5 – phosphoribosyl – 1 – pyrophosphate amidotransferase trong tổng hợp purin

Cordycepin, do có cấu trúc tương tự adenosin, gây rối loạn quá trình tổng hợp ARN khi enzyme kết hợp với nó trong quá trình phiên mã Nghiên cứu cũng cho thấy cordycepin có khả năng kích hoạt AMP activated kinase, từ đó ức chế sự phát triển và sinh trưởng của tế bào.

* Tác dụng chống sự di căn

Sự di căn ung thư xảy ra khi tế bào ung thư tách rời khỏi vị trí ban đầu và xâm nhập vào các mô khác Nghiên cứu cho thấy cordycepin có khả năng ức chế các enzyme metalloproteinase, là những endopeptidase phụ thuộc vào kẽm và canxi, đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân hủy tổ chức ngoại bào.

Phản ứng viêm có vai trò quan trọng trong quá trình ung thư, khi các tế bào ung thư sản sinh ra nhiều cytokine, chemokine và các receptor liên quan, dẫn đến tình trạng viêm Nghiên cứu cho thấy cordycepin có khả năng giảm thiểu các yếu tố gây viêm như NO, PGE2, TNF α và IL 1β, từ đó góp phần điều chỉnh phản ứng viêm trong cơ thể.

* Tác dụng giảm đường huyết:

Nghiên cứu của Li Ma và cộng sự cho thấy cordycepin có tác dụng tích cực trên chuột bị tiểu đường do alloxan gây ra Mặc dù cordycepin không làm tăng nồng độ insulin trong máu, nhưng nó giúp giảm lượng glucose trong máu bằng cách tăng cường nồng độ glycogen tại gan Ngoài ra, cordycepin còn có khả năng bảo vệ thận và giảm tổn thương ở lách do tiểu đường.

Adenosin được chứng minh là một chất có khả năng kháng viêm tại thụ thể của adenosin A2A Nồng độ adenosin ngoại bào ở tế bào bình thường khoảng

300 nM Tuy nhiên khi tế bào bị tổn thương nồng độ này nhanh chóng nâng lên

Adenosin đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh chức năng của mô tim, bao gồm tác dụng giãn mạch vành và ngoại biên, giảm lực co bóp của cơ tim, cũng như ức chế hoạt động của nút xoang và dẫn truyền qua nút nhĩ thất Nhờ vào những đặc tính này, adenosin được sử dụng như một loại thuốc hiệu quả trong điều trị rối loạn nhịp tim.

* Tác dụng trên phổi, thần kinh trung ương

Adenosin có khả năng điều chỉnh chức năng của các tế bào liên quan đến bệnh viêm đường hô hấp, bao gồm bạch cầu và tế bào lympho Ngoài ra, adenosin còn mang lại tác dụng tích cực đối với một số bệnh rối loạn thần kinh như thiếu máu cục bộ và thoái hóa thần kinh.

Phương pháp xác định cordycepin và adenosin

1.3.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng

MA King Wah và các cộng sự đã xác định cordycepin cùng 7 nucleoside khác trong Cordycepin sinensis bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng với kỹ thuật rửa giải gradient Dịch chiết nước từ 11 sản phẩm đông trùng hạ thảo được phân tích trên bản mỏng silicagel GF254, đã được xử lý bằng hỗn hợp Na2HPO4 0,05M và carboxymethyl cellulose (4:1) và sấy khô ở 60°C trong 8 phút để kích hoạt Dung môi triển khai là hỗn hợp cloroform, ethylacetat, isopropanol và nước (tỷ lệ 8:2:6:0,6), với 2 giọt amoniac cho mỗi 10 ml hỗn hợp, và quãng đường triển khai dung môi là 18 cm, thực hiện chạy lượt hai.

Hỗn hợp dung môi gồm cloroform, ethylacetat, isopropanol, nước và dimethylformamid (tỉ lệ 10:2:8:0,5:2 theo thể tích) được sử dụng để phát hiện chất phân tích tại bước sóng 254 nm Phương pháp này đạt được độ thu hồi cordycepin là 98,09% và adenosin là 97,88% [21].

Nicholas M Kredich and Armand J Guarino conducted research demonstrating a quantitative colorimetric method for measuring cordycepin using anthrone reagent, which produces a cherry red compound This method involves the use of 5.0 ml of anthrone reagent, prepared by dissolving 0.2 g of anthrone in 100 ml of sulfuric acid (H2SO4).

Trong nghiên cứu, 90% phản ứng được thực hiện với 1,0 ml dung dịch thử chứa cordycepin từ 1 – 135 μg/ml, sau đó trộn đều và để trong nước đá Mẫu trắng được xử lý tương tự, thay 1,0 ml dung dịch thử bằng 1,0 ml nước Các ống nghiệm sau đó được đặt trong cách thủy ở 100 o C trong 10 phút, làm nguội và đo màu bằng thiết bị đo màu với kính lọc số 52 Hỗn hợp màu tạo thành có độ bền sau vài giờ phản ứng.

Hình 1.5 Phổ hấp thụ hỗn hợp màu được tạo thành với thuốc thử anthron của cordycepin, adenosin, glucose và deoxyadenosin [15]

1.3.3 Phương pháp điện di mao quản

Yerra Koteswara Rao và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu để định tính và định lượng cordycepin trong Cordyceps militaris bằng phương pháp điện di mao quản Điều kiện thí nghiệm bao gồm dung dịch đệm borat 0,02 M với 28,6% methanol, pH 9,5, điện thế 20 kV, nhiệt độ 25°C và bước sóng 254 nm Đường chuẩn được xây dựng trong khoảng từ 20 đến 100 μg/ml với độ thu hồi đạt từ 82% đến 107%.

1.3.4 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR

Seul Gi Lee và các đồng nghiệp đã sử dụng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân để định lượng cordycepin trong Cordyceps militaris, với chất chuẩn nội là natri của acid 3 – (trimethylsilyl) – propionic – 2,2,3,3 – d4 Kết quả nghiên cứu cho thấy không có sự khác biệt đáng kể trong việc định lượng cordycepin khi so sánh với phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.

1.3.5 Phương pháp sắc ký lỏng

Bảng 1.2 Một số phương pháp sắc ký lỏng phân tích adenosin, cordycepin

Cột Pha động Tốc độ dòng Detector TLTK

4,6 mm) Đệm phosphat pH 6,5 : methanol (17 :3)

A: dung dịch amoni acetat 0,04M pH 5,2

Methanol : H2O (20 : 80) 1,0 ml/phút UV 254 nm

Methanol : H2O (8 : 92) 1,0 ml/phút UV 254 nm

Methanol : H2O (30 : 70) 0,5 ml/phút UV 260 nm

Theo dược điển Trung Quốc 2010, đông trùng hạ thảo được kiểm tra hàm lượng adenosin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Dược liệu này được chiết tách bằng cách đun hồi lưu trong dung môi methanol 90% trong 30 phút Chuyên luận yêu cầu hàm lượng adenosin tối thiểu là 0,01% đối với dược liệu khô kiệt.

Jian – Ping Yuan và cộng sự đã tiến hành định lượng 7 nucleosid và 7 nucleobase trong một số loài nấm bằng phương pháp sắc ký lỏng detector PAD

Phương pháp sử dụng pha động gradient với hai thành phần A (methanol) và B (đệm phosphat: natri dihydro phosphat 0,02M và dinatri hydro phosphat 0,02M) cho phép xây dựng đường chuẩn trong khoảng 5 – 300 μg/ml Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của cordycepin và adenosin lần lượt là 0,01 μg/ml và 0,03 μg/ml Độ thu hồi của phương pháp đạt 98,3% cho cordycepin và 100,6% cho adenosin Nghiên cứu của Jian – Wei Xie và cộng sự đã tiến hành định lượng các nucleosid chính.

Nghiên cứu về Cordyceps sinensis đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/ESI – MS để phân tích các hợp chất như thymin, adenine, adenosin và cordycepin Pha động A được sử dụng là amoni acetat 0,04M với pH 5,2, trong khi pha động B là methanol Đường chuẩn cho cordycepin được xây dựng từ 0,5 – 107,5 μg/ml và adenosin từ 0,6 – 114,0 μg/ml Kết quả cho thấy độ thu hồi của cordycepin đạt từ 99,3 – 104,0% và adenosin từ 98,0 – 101,5%.

Nghiên cứu của Lei Huang và các cộng sự đã tối ưu hóa điều kiện phân tích adenosin và cordycepin trong dược liệu ĐTHT từ C sinensis và C militaris Kết quả cho thấy phương pháp phân tích sử dụng pha động tối ưu là methanol và nước với tỷ lệ 92:8, cùng bước sóng phát hiện 254 nm Đường chuẩn của cordycepin được xác định trong khoảng 2,85 đến 130 μg/ml, trong khi adenosin nằm trong khoảng 2,50 – 120 μg/ml Giới hạn phát hiện của cordycepin là 0,25 μg/ml và của adenosin là 0,30 μg/ml.

Jiang – Feng Song và các đồng nghiệp đã tối ưu hóa quy trình chiết xuất cordycepin từ Cordyceps militaris bằng phần mềm phân tích và phương pháp sắc ký lỏng Họ sử dụng pha động A (nước có 0,1% acid acetic) và B (acetonitril có 0,1% acid acetic) theo tỷ lệ gradient Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng điều kiện tối ưu cho quá trình chiết xuất là dung môi ethanol 20,21%, thời gian chiết 101,88 phút, và tỷ lệ dung môi chiết/dược liệu là 33,13 ml/g.

Li Yu và các đồng nghiệp đã tiến hành nghiên cứu định lượng 11 nucleosid trong dược liệu ĐTHT thu hái tại Trung Quốc Họ sử dụng pha động gồm methanol và nước theo chương trình gradient Mẫu dược liệu được chiết tách bằng dung môi methanol 70% thông qua phương pháp siêu âm trong 15 phút ở nhiệt độ phòng Phương pháp nghiên cứu đạt giới hạn phát hiện cho adenosin và cordycepin lần lượt là 0,057 và 0,099 àg/ml.

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.4.1 Nguyên lý chung của sắc ký lỏng

Sắc ký lỏng là quá trình tách chất diễn ra trên cột với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng Mẫu phân tích được đưa lên cột tách dưới dạng dung dịch Cơ chế của sắc ký lỏng bao gồm các hiện tượng hấp phụ, phân bố, trao đổi ion và loại trừ theo kích cỡ.

Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), mẫu phân tích được tiêm vào buồng tiêm và di chuyển vào cột nhờ pha động Các thành phần trong mẫu được tách ra trên pha tĩnh trong cột, sau đó đi qua detector để phát hiện, tạo ra các tín hiệu được ghi lại trên sắc đồ Pha tĩnh đóng vai trò quan trọng trong quá trình tách biệt các thành phần của mẫu phân tích.

Pha tĩnh phổ biến trong sắc ký lỏng hiệu năng cao là pha tĩnh có chứa các nhóm silanol trên bề mặt hạt silicagel, được liên kết với các nhóm hóa học khác nhau Sự kết hợp này tạo ra các hợp chất siloxan với độ phân cực biến đổi tùy thuộc vào loại nhóm liên kết.

- Si-O-Si -R   Khi R là các nhóm ít phân cực như octyl (C8), octadecyl (C18), phenyl và pha động phân cực, ta có sắc ký pha đảo (RP-HPLC)

Trong sắc ký lỏng, khi nhóm R là alkylamin hoặc alkylnitril, pha động thường là dung môi ít phân cực, dẫn đến việc sử dụng sắc ký pha thuận (NP-HPLC) Kỹ thuật RP-HPLC hiện nay rất phổ biến nhờ khả năng tách biệt nhiều hợp chất khác nhau, với thành phần chính của pha động là nước, giúp tiết kiệm chi phí Cột thông dụng trong RP-HPLC là cột ODS (RP18) hoặc C8 với kích thước hạt 5 hoặc 10μm Để nâng cao hiệu quả tách, tiết kiệm dung môi và thời gian, sắc ký lỏng nhanh (UPLC) đã được áp dụng rộng rãi, sử dụng hạt chất mang nhỏ (1,7 – 2,2μm) và cột ngắn hơn (5-10cm).

Pha động đóng vai trò quan trọng trong việc tách các chất phân tích trong sắc ký, với mỗi loại sắc ký yêu cầu pha động rửa giải riêng để đạt hiệu quả tối ưu Pha động có hai loại chính là phân cực và ít phân cực, thường được sử dụng trong sắc ký pha đảo và pha thuận Tuy nhiên, để đáp ứng tốt hơn khả năng rửa giải, người ta thường phối hợp từ 2 đến 3 dung môi nhằm tạo ra dung môi có độ phân cực phù hợp với phép phân tích Sự thay đổi thành phần pha động theo thời gian được gọi là rửa giải gradient nồng độ.

Có nhiều loại detector khác nhau, tùy thuộc bản chất lý hóa của chất phân tích mà lựa chọn detector cho phù hợp:

- Detector quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS: áp dụng cho các chất có khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại hoặc khả kiến

Detector huỳnh quang là thiết bị dùng để phát hiện các chất có khả năng phát huỳnh quang Đối với những chất không tự phát huỳnh quang, cần thực hiện dẫn xuất hóa học để tạo ra sản phẩm có khả năng phát huỳnh quang.

- Detector khúc xạ: thường dùng định lượng hợp chất đường

- Detector độ dẫn: phù hợp các chất có hoạt tính điện hóa

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng nhiều loại detector như tán xạ ánh sáng bay hơi (ELSD), khúc xạ (RI), điện hóa và phổ khối (MS) Đặc biệt, detector chuỗi diode (PDA) cho phép thay đổi bước sóng theo chương trình đã được thiết lập, nâng cao hiệu quả trong quá trình phân tích sắc ký.

Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao gồm 3 phần chính:

- Phần đầu vào gồm pha động, bơm, hệ thống tiêm mẫu

- Phần tách: gồm cột tách, lò cột, có thể có cột phụ trợ

- Phần phát hiện và xử lý số liệu: gồm detector, bộ phận ghi tín hiệu (máy tính)

Hình 1.6 Sơ đồ cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.4.2 Một số thông số đặc trưng

Hiệu lực của cột sắc ký được biểu thị thông qua số đĩa lý thuyết trên cột (N) Số đĩa lý thuyết được tính theo công thức:

𝑊 1/2 ) 2 Trong đó: tR: thời gian lưu chất phân tích

Độ rộng của pic trong chiều cao pic được sử dụng để đặc trưng cho mức độ tách biệt của hai chất trên một cột sắc ký Để đánh giá độ phân giải giữa hai pic cạnh nhau, người ta thường sử dụng chỉ số R Độ phân giải giữa pic số 1 và pic số 2 được tính theo một công thức cụ thể.

Trong đó: tR: Thời gian lưu

W1/2: Độ rộng đỏy pic ở ẵ chiều cao pic

Khi: R = 0,75 hai píc không tách tốt, còn xen phủ nhau nhiều

R = 1,0 hai píc tách khá tốt, còn xen phủ nhau 4%

R = 1,5 hai píc tách gần hoàn toàn, chỉ xen phủ 0,3%

Hệ số bất đối AF (assymetry factor)

W1/20 là độ rộng pic ở chiều cao 1/20 a là khoảng cách từ đường cao hạ từ đỉnh pic tới đường cong phía trước của pic ở 1/20 chiều cao pic [3]

Thời gian lưu của chất phân tích trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn và dung dịch thử là yếu tố quan trọng trong phép thử định tính Hệ số Match từ detector PDA khi so sánh hai phổ của chuẩn và thử cũng đóng vai trò quan trọng trong việc định tính chất phân tích.

So sánh độ lớn tín hiệu của chất phân tích trong sắc ký đồ giữa dung dịch chuẩn và dung dịch thử, thông qua diện tích hoặc chiều cao pic, là cơ sở quan trọng cho phép định lượng trong cùng một điều kiện sắc ký xác định.

Các phương pháp định lượng có thể áp dụng:

- Phương pháp dùng chuẩn ngoại

- Phương pháp dùng chuẩn nội

- Phương pháp chuẩn hóa diện tích [3].

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU… 20 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Hóa chất, dung môi

Bảng 2.5 Các hóa chất dung môi sử dụng trong quá trình thí nghiệm

TT Tên hóa chất Nguồn gốc Tiêu chuẩn

1 Ethanol Trung Quốc Tinh khiết phân tích

2 Methanol Merck, Đức Dùng cho HPLC

3 Methanol Trung Quốc Tinh khiết phân tích

4 Acetonitril Merck, Đức Dùng cho HPLC

5 Nước cất 2 lần Việt Nam Dùng cho HPLC

Phương tiện, thiết bị nghiên cứu

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Hitachi L5000 (Nhật) với detector PDA, phần mềm điều khiển EZChromlite

- Cân phân tích Sartorius (Đức)

- Cân kỹ thuật Shimadzu (Nhật)

- Bể lắc siêu âm Helma S60H (Đức)

- Nồi cách thủy Memmert WNB14 (Đức)

- Máy ly tâm Hettich EBA 20 (Đức)

- Bộ lọc hút chân không

- Dụng cụ: các loại pipet, bình định mức, màng lọc mẫu (syringe filter), sinh hàn hồi lưu…

Phương pháp nghiên cứu

Nguyên lý phân tích bao gồm việc chiết mẫu bằng phương pháp phù hợp, định mức dịch chiết, sau đó lọc qua màng lọc 0,45 μm trước khi tiêm vào hệ thống HPLC để ghi lại sắc ký đồ.

Các số liệu đề tài thu thập từ kết quả thực nghiệm ứng dụng phương pháp HPLC

2.4.1 Nghiên cứu chiết adenosin và cordycepin trong mẫu

Quy trình xử lý mẫu:

- Cân chính xác lượng mẫu thích hợp vào ống ly tâm (đối với mẫu dạng rắn) hoặc bình định mức (đối với mẫu dạng lỏng), thêm dung môi chiết

- Chiết mẫu theo cách thích hợp

Đối với mẫu dạng rắn, thực hiện ly tâm để thu lấy dung dịch chiết, sau đó lặp lại quá trình chiết với dung môi Gộp các dịch chiết lại và thêm dung môi cho đến khi đạt vạch quy định, lắc đều Đối với mẫu dạng lỏng, chỉ cần thêm dung môi đến vạch quy định và lắc đều.

- Lọc mẫu qua màng lọc 0,45 μm

- Tiêm vào hệ thống sắc ký a Khảo sát các phương pháp chiết:

Khảo sát hai phương pháp chiết: chiết bằng siêu âm và đun hồi lưu cách thủy b Khảo sát điều kiện chiết:

Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát các dung môi chiết bao gồm hỗn hợp nước – ethanol và nước – methanol với các tỷ lệ khác nhau nhằm tìm ra dung môi chiết tối ưu Trên cùng một nền mẫu, quy trình chiết được thực hiện với các loại dung môi ở tỷ lệ khác nhau, mỗi loại được tiến hành 3 lần để lấy kết quả trung bình Bên cạnh đó, thời gian chiết cũng được khảo sát với các khoảng thời gian là 15 phút, 30 phút, 60 phút và 90 phút.

- Khảo sát số lần chiết: cùng một nền mẫu chiết lặp lại 1, 2, 3 lần, so sánh kết quả giữa các mẫu

- Khảo sát nhiệt độ chiết: cùng một nền mẫu, chiết theo một phương pháp siêu âm, khảo sát nhiệt độ thường, 40 o C, 50 o C, 75 o C, 100 o C Mỗi mức nhiệt độ làm

3 lần, lấy kết quả trung bình để đánh giá

2.4.2 Khảo sát chọn điều kiện sắc ký thích hợp:

Tiến hành trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Hitachi L5000 detector PDA để khảo sát điều kiện sắc ký mẫu chuẩn hỗn hợp adenosin và cordycepin:

- Khảo sát thành phần pha động: nước và methanol, nước và acetonitril

- Khảo sát tỷ lệ pha động

- Quan sát phổ đồ, lựa chọn bước sóng phát hiện

- Khảo sát lựa chọn thể tích tiêm mẫu

- Khảo sát nhiệt độ cột

Các số liệu được tính toán và xử lý thống kê

Thông số đánh giá: thời gian lưu, độ cân đối của pic sắc ký, hệ số phân giải của

Yêu cầu: pic sắc ký gọn, cân đối, 2 pic adenosin và cordycepin tách nhau hoàn toàn, hệ số phân giải Rs > 2

2.4.3 Đánh giá phương pháp phân tích

Chiết mẫu nghiên cứu theo phương pháp đã chọn, tiến hành chạy sắc ký các dung dịch thu được theo điều kiện đã khảo sát Việc thẩm định phương pháp được thực hiện dựa trên các tiêu chí như tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ đúng, độ chính xác, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng.

Để đánh giá tính thích hợp của hệ thống, cần kiểm tra độ ổn định của hệ thống thông qua việc ghi nhận thời gian lưu và diện tích pic sau khi tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp Các giá trị thời gian lưu và diện tích pic sẽ được ghi lại để xác định sự ổn định của hệ thống.

Yêu cấu: độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của các đáp ứng phân tích ≤ 2,0%, hệ số phân giải Rs >2

Để đảm bảo độ đặc hiệu của phương pháp, cần tiêm lần lượt mẫu placebo, mẫu thử, mẫu chuẩn hỗn hợp và chuẩn đơn vào hệ thống sắc ký Kết quả sắc ký đồ phải cho thấy rằng mẫu placebo không xuất hiện đỉnh (pic) tại thời gian lưu tương ứng với hai chất chuẩn đã được sử dụng.

Tính tuyến tính trong quy trình phân tích thể hiện mối quan hệ tuyến tính giữa đại lượng đo được Y và nồng độ chất phân tích X trong khoảng xác định Điều này đảm bảo rằng sự phụ thuộc tuyến tính giữa hai yếu tố này được duy trì trong khoảng nồng độ nhất định.

Xây dựng đường chuẩn với 6 điểm từ X1 đến X6 cho dung dịch chứa adenosin và cordycepin trong nồng độ phù hợp Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã được lựa chọn Xác định phương trình hồi quy tuyến tính giữa nồng độ của từng chất và diện tích pic tương ứng.

Yêu cầu: hệ số tương quan r ≥ 0,995

Độ chính xác được khảo sát thông qua việc đánh giá mức độ phân tán của kết quả từ nhiều lần phân tích trên cùng một mẫu thử đồng nhất trong các điều kiện xác định.

Độ lặp lại của phương pháp phân tích là chỉ số thể hiện độ chính xác trong cùng điều kiện thí nghiệm trong thời gian ngắn Để xác định độ lặp lại, cần chuẩn bị 6 mẫu thử theo quy trình đã được xây dựng, sau đó tiêm vào hệ thống sắc ký và ghi lại sắc ký đồ Cuối cùng, tính toán độ lệch tương đối (RSD%) của hàm lượng từng hoạt chất để đánh giá độ lặp lại của phương pháp.

Độ chính xác trung gian được xác định thông qua việc bố trí thí nghiệm tương tự như phần độ lặp lại của phương pháp, nhưng thực hiện vào các ngày khác nhau Yêu cầu đặt ra là RSD cho mỗi hoạt chất không vượt quá 5,3% khi tiến hành 18 mẫu trong 3 ngày khác nhau.

* Khảo sát độ đúng: Độ đúng phản ánh sự phù hợp giữa kết quả thực nghiệm thu được với giá trị thực của kết quả

Để tiến hành phân tích mẫu, cần cân chính xác lượng mẫu thử vào ống ly tâm cho mẫu rắn và bình định mức cho mẫu lỏng Sau đó, thêm lượng chuẩn hỗn hợp thích hợp để đảm bảo tổng hàm lượng mỗi chất trong dung dịch nằm trong khoảng tuyến tính, kèm theo dung môi và thực hiện quy trình chiết mẫu theo chuẩn đã xây dựng Thực hiện thí nghiệm ở ba mức nồng độ, mỗi nồng độ lặp lại ba lần Cuối cùng, tiêm dung dịch thử đã thêm chuẩn vào hệ thống sắc ký để xác định hàm lượng mỗi hoạt chất, trong đó độ đúng được xác định qua hệ số thu hồi giữa lượng chuẩn tìm được và lượng chuẩn đã thêm vào.

Yêu cầu: độ thu hồi nằm trong khoảng 90 – 107% đối với mẫu hàm lượng hoạt chất ≥ 0,01% [6]

* Giới hạn phát hiện (LOD):

Giới hạn phát hiện là hàm lượng thấp nhất của chất phân tích có thể phát hiện về mặt định tính

Để xác định nồng độ, cần chuẩn bị các dung dịch placebo 1 và placebo 2, sau đó pha loãng các dung dịch chuẩn vào các mẫu placebo với hàm lượng khoảng 0,5, 0,25, 0,2, và 0,1 àg/ml cho mỗi chất Tiến hành sắc ký để xác định tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu nền (S/N), trong đó S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích và N là nhiễu đường nền, được tính toán từ hai phía của đường nền với bề rộng mỗi bên tối thiểu gấp 10 lần chiều rộng của pic tại chiều cao LOD được xác định tại nồng độ có tỷ lệ S/N bằng 3.

* Giới hạn định lượng (LOQ): được tính bằng 3,3 lần giới hạn phát hiện [5]

2.4.4 Áp dụng trên một số chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo

- Thu thập một số chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo dạng lỏng và rắn

- Tiến hành phân tích thành phần adenosin và cordycepin trong chế phẩm theo quy trình đã xây dựng

2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu

* Một số đặc trưng thống kê: Các đặc trưng thống kê được tính dựa vào các hàm số trong Microsoft Excel

Giá trị trung bình (X): Hàm AVERAGE Độ lệch chuẩn (SD): Hàm STDEV Độ lệch chuẩn tương đối (RSD): 100 𝑥 𝑆𝐷

* Tương quan hồi quy tuyến tính:

Phương trình hồi quy tuyến tính thể hiện quan hệ giữa diện tích pic sắc ký và nồng độ chất phân tích:

Hệ số góc a: Hàm SLOPE

Hệ số chắn b: Hàm INTERCEPT

Hệ số tương quan r: Hàm CORREL.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký

3.1.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn

Dung dịch chuẩn gốc adenosin được chuẩn bị bằng cách cân chính xác khoảng 50,0 mg adenosin vào bình định mức 50,0 ml Tiếp theo, thêm khoảng 30 ml MeOH và siêu âm trong 5 phút Sau đó, bổ sung MeOH đến vạch định mức và lắc kỹ để tạo thành dung dịch 1 Dung dịch này cần được bảo quản ở nhiệt độ 2-8 °C và có thể sử dụng trong vòng 1 tháng.

Dung dịch chuẩn adenosin được chuẩn bị bằng cách hút chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc adenosin và pha loãng với MeOH trong bình định mức 50,0 ml, tạo ra dung dịch chuẩn adenosin có nồng độ 20 µg/ml Nghiên cứu sẽ được tiến hành tại nồng độ 20 µg/ml này.

Dung dịch chuẩn gốc cordycepin được chuẩn bị bằng cách cân chính xác 50,0 mg cordycepin vào bình định mức 50 ml Sau đó, thêm khoảng 30 ml MeOH và lắc siêu âm trong 5 phút Tiếp theo, bổ sung MeOH vừa đủ đến vạch định mức và lắc kỹ để hoàn thiện dung dịch (dung dịch 2) Dung dịch này cần được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 đến 8 độ C và sử dụng trong vòng 1 tháng.

Dung dịch chuẩn cordycepin được tạo ra bằng cách hút chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc cordycepin và pha loãng bằng MeOH trong bình định mức 50 ml, từ đó thu được dung dịch chuẩn cordycepin có nồng độ 20 µg/ml Nghiên cứu được tiến hành tại nồng độ 20 µg/ml.

Để chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp, cần hút chính xác 1,0 ml dung dịch gốc cordycepin và 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc adenosin vào bình định mức 50,0 ml Sau đó, thêm MeOH cho đủ thể tích để thu được dung dịch chuẩn hỗn hợp với hàm lượng mỗi chất khoảng 20 µg/ml.

3.1.2 Khảo sát lựa chọn bước sóng phát hiện:

Chúng tôi đã tiến hành phân tích dung dịch chuẩn adenosin và cordycepin với nồng độ khoảng 20 µg/ml trên hệ thống HPLC, sử dụng detector PDA, dựa trên các điều kiện phòng thí nghiệm và thực nghiệm đã tham khảo.

- Cột sắc ký: cột InertSustain C18 (250 x 4,6 mm, 5 àm)

- Detector PDA bước sóng 190 – 400 nm

- Pha động: MeOH : H2O (1:1 tt/tt)

- Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút

- Thể tớch tiờm mẫu: 10 àl

Tiến hành quét phổ của pic adenosin và cordycepin trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn adenosin và dung dịch chuẩn cordycepin cho kết quả như hình 3.8

Từ phổ đồ thu được, chúng tôi quyết định lựa chọn bước sóng đo là 260 nm

Hình 3.7 Phổ hấp thụ tử ngoại của adenosin (a) và cordycepin (b)

3.1.3 Khảo sát lựa chọn pha động

Pha động đóng vai trò quan trọng trong quá trình tách sắc ký, ảnh hưởng đến độ chọn lọc, thời gian lưu giữ, hiệu lực của cột tách, độ phân giải và độ rộng của pic sắc ký.

- Tiến hành với các thành phần pha động khác nhau gồm: Kênh A là H2O, kênh

B là dung môi ACN hay MeOH, cố định các điều kiện phân tích khác Quá trình khảo sát cho kết quả như sau:

Bảng 3.6 Khảo sát thành phần pha động

Thành phần pha động (92: 8) Thời gian lưu (phút)

Mặc dù chương trình chạy với H2O và ACN cho kết quả pic đẹp và gọn, thời gian lưu ngắn dưới 7 phút có thể ảnh hưởng bởi các hoạt chất khác trong mẫu thử Hệ số phân giải của pha động với ACN là 2,5, thấp hơn so với pha động sử dụng MeOH và H2O, trong khi ACN cũng tốn kém hơn Do đó, chúng tôi quyết định sử dụng methanol và nước làm thành phần pha động và tiến hành khảo sát chương trình gradient với tỷ lệ thành phần pha động.

- Tiến hành chạy 3 chương trình gradient, kết quả thu được như sau:

Bảng 3.7 Khảo sát chương trình gradient nồng độ

Chương trình gradient 1 và 2 cho kết quả hình ảnh của hai chất gọn nhưng chưa tách biệt hoàn toàn Trong khi đó, chương trình gradient 3 mang lại hình ảnh adenosin và cordycepin rất gọn gàng, cân đối với thời gian lưu ổn định và khả năng lặp lại hợp lý Do đó, chúng tôi quyết định chọn chương trình gradient 3 để tách và định lượng các chất phân tích.

3.1.4 Khảo sát thể tích tiêm mẫu

Tiến hành khảo sát trên dung dịch chuẩn hỗn hợp với các điều kiện sắc ký, thay đổi thể tích tiêm mẫu với các giá trị lần lượt là 5 µl, 10 µl, 20 µl và 40 µl.

- Cột sắc ký: cột InertSustain C18 (250 x 4,6 mm, 5 àm)

- Detector PDA bước sóng 260nm

- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng với thể tích tiêm mẫu 5 hoặc 10 µl, pic adenosin và cordycepin đều cho kết quả tốt, trong khi thể tích tiêm mẫu 20 µl không đạt hiệu quả như mong đợi.

40 àl pic hai chất đều bị chẻ đụi Do đú chỳng tụi lựa chọn thể tớch tiờm mẫu

10 àl đảm bảo pic sắc ký cõn đối, đảm bảo độ chớnh xỏc buồng tiờm mẫu

Hỡnh 3.8 Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp tiờm mẫu 5 àl (a), 10 àl (b), 20 àl (c), 40 àl (d)

3.1.5 Khảo sát nhiệt độ cột

Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ cột đến khả năng tách pic sắc ký được thực hiện với điều kiện sắc ký theo mục 3.1.4, sử dụng thể tích tiêm mẫu 10 µl Nhiệt độ cột được khảo sát ở hai mức: 25 oC (tương ứng với nhiệt độ phòng) và 40 oC Đối tượng khảo sát trong nghiên cứu này sẽ được phân tích để đánh giá hiệu quả tách pic sắc ký.

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp adenosin và cordycepin hàm lượng 20 àg/ml

Để chuẩn bị dung dịch thử, cân chính xác khoảng 0,50 g bột mẫu R1 vào ống ly tâm, sau đó thêm khoảng 15 ml MeOH Tiến hành siêu âm trong 30 phút và ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút trong 5 phút Cuối cùng, lọc dịch chiết qua giấy lọc thô và tập trung dịch lọc vào bình định mức.

Rửa giấy lọc bằng 7 – 8 ml MeOH và tập trung dịch rửa vào bình định mức Thêm MeOH cho đủ đến vạch, lắc đều và lọc qua màng lọc 0,45 µm để thu được kết quả.

Sắc ký đồ cho thấy rằng ở nhiệt độ cột 40 o C, các chất trong mẫu chuẩn hỗn hợp rửa giải nhanh hơn (16,5 và 18,5 phút) so với nhiệt độ 25 o C (20,0 và 22,1 phút), với hệ số phân giải Rs đều lớn hơn 5 Tuy nhiên, mẫu thử cho thấy adenosin chưa được tách ra khỏi nền mẫu ở nhiệt độ 40 o C, trong khi ở 25 o C, pic tách rõ ràng Do đó, chúng tôi quyết định sử dụng nhiệt độ cột 25 o C để đảm bảo tách biệt hai chất khỏi nền mẫu.

Khảo sát và lựa chọn quy trình xử lý mẫu

- Yếu tố khảo sát: dung môi chiết, nhiệt độ chiết, thời gian chiết, số lần chiết, phương pháp chiết

Mẫu dạng rắn: mẫu bột Pure Cordyceps do công ty Medinam cung cấp (mẫu

Mẫu dạng lỏng: mẫu rượu đông trùng hạ thảo do công ty Văn Duy Phương cung cấp (mẫu L1)

- Thông số đánh giá: hàm lượng adenosin và cordycepin trong mẫu chiết được

3.2.1 Khảo sát dung môi chiết

Adenosin và cordycepin có khả năng tan trong H2O, MeOH và EtOH, vì vậy chúng tôi đã sử dụng các dung môi này để chiết xuất và khảo sát thành phần cũng như tỷ lệ dung môi chiết Để đánh giá kết quả, chúng tôi tập trung vào hàm lượng adenosin và cordycepin trong mẫu Các điều kiện chiết được cố định bao gồm phương pháp chiết siêu âm và thời gian chiết.

30 phút, nhiệt độ chiết: không kiểm soát, số lần chiết: 1 lần Mỗi điều kiện khảo sát lặp lại 3 lần, lấy kết qủa trung bình

Kết quả phân tích được chỉ ra trong hình sau

Hình 3.10 Kết quả khảo sát dung môi chiết đối với mẫu R1 (n = 3)

Bảng 3.11 Kết quả khảo sát dung môi chiết đối với mẫu L1 (n = 3)

Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng, đối với mẫu R1 dạng rắn, việc sử dụng dung môi chiết như H2O hoặc hỗn hợp MeOH : H2O với tỷ lệ 1 : 9 hoặc 1 : 1 cho phép thu được lượng adenosin và cordycepin cao hơn so với các dung môi khác Đặc biệt, H2O cho thấy khả năng chiết xuất cả hai chất cần phân tích ở mức cao nhất.

Chúng tôi lựa chọn nước (H2O) làm dung môi chiết cho mẫu dạng rắn do tính không độc hại, không gây ô nhiễm môi trường, an toàn và tiết kiệm hơn so với các dung môi khác Đối với mẫu L1, việc sử dụng dung môi MeOH và EtOH cho thấy hàm lượng adenosin và cordycepin cao hơn rõ rệt so với các dung môi khác, trong đó MeOH cho hàm lượng tối ưu nhất Tuy nhiên, dung môi EtOH lại gây ra nền mẫu kém do hòa tan nhiều tạp chất Do đó, chúng tôi quyết định sử dụng MeOH làm dung môi chiết cho mẫu dạng lỏng nhằm đảm bảo hiệu suất chiết cao nhất.

3.2.2 Khảo sát số lần chiết

Khảo sát số lần chiết được thực hiện trên mẫu dạng rắn với ba lần chiết lặp lại để đánh giá khả năng chiết Các thông số cố định bao gồm dung môi chiết là H2O, phương pháp siêu âm, thời gian chiết 30 phút và nhiệt độ 40⁰C Mỗi lần chiết được thực hiện ba lần song song và kết quả trung bình được ghi nhận Kết quả thu được sẽ được trình bày trong bảng.

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát số lần chiết (n=3)

Số lần chiết HL Adenosin

HL cordycepin (mg/100 g) (TB ± sd)

Hàm lượng adenosin và cordycepin trong mẫu không thay đổi đáng kể khi tăng số lần chiết Do đó, chúng tôi quyết định thực hiện chiết một lần để đảm bảo hiệu suất và tiết kiệm thời gian.

3.2.3 Khảo sát phương pháp chiết

Chúng tôi đã thực hiện khảo sát hai phương pháp chiết là siêu âm và đun hồi lưu cách thủy, trong đó giữ nguyên các thông số chiết như thời gian chiết 30 phút và số lần chiết.

Trong nghiên cứu này, quá trình chiết được thực hiện với dung môi H2O cho mẫu R1 và MeOH cho mẫu L1 Mỗi phương pháp chiết được lặp lại ba lần để lấy kết quả trung bình, và các kết quả này được trình bày trong hình dưới đây.

Hình 3.12 Kết quả khảo sát phương pháp chiết đối với mẫu R1 (n = 3)

Hình 3.13 Kết quả khảo sát phương pháp chiết đối với mẫu L1 (n = 3)

Kết quả nghiên cứu cho thấy, phương pháp siêu âm cho phép chiết xuất adenosin và cordycepin hiệu quả hơn so với phương pháp hồi lưu, nhờ vào khả năng khuếch tán mạnh mẽ của sóng siêu âm Sóng siêu âm giúp tăng diện tích tiếp xúc giữa các pha bằng cách phân tán mẫu thành các hạt nhỏ, đồng thời tăng cường sự xáo trộn và tạo nhiệt tại chỗ Vì vậy, chúng tôi đã chọn phương pháp siêu âm để chiết xuất các chất cần phân tích từ nền mẫu.

Phương pháp chiết Đun hồi lưu Siêu âm

Phương pháp chiết Đun hồi lưu Siêu âm

3.2.4 Khảo sát nhiệt độ chiết

Tiến hành khảo sát chiết mẫu với các thông số cố định, bao gồm phương pháp chiết siêu âm trong 30 phút, sử dụng H2O cho mẫu R1 và MeOH cho mẫu L1, với số lần chiết là 01 Các thông số khảo sát bao gồm nhiệt độ chiết ở các mức: nhiệt độ phòng, 40 °C, 50 °C, 75 °C và 100 °C Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần để lấy kết quả trung bình, và kết quả được trình bày trong hình ảnh kèm theo.

Hình 3.14 Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết đối với mẫu R1 (n = 3)

Hình 3.15 Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết đối với mẫu L1 (n = 3)

Trong nghiên cứu về mẫu dạng rắn R1, hàm lượng cordycepin không thay đổi nhiều giữa các mức nhiệt độ chiết, trong khi hàm lượng adenosin tăng lên khi nhiệt độ chiết đạt 40 o C (25,04 mg/100 g) và sau đó giảm dần, thấp nhất ở 100 o C (19,30 mg/100 g) Do đó, nhiệt độ 40ºC được chọn để chiết adenosin và cordycepin từ mẫu rắn Đối với mẫu dạng lỏng L1, khi nhiệt độ tăng từ 25 o C lên 75 o C, hàm lượng adenosin và cordycepin đều tăng, nhưng ở 100 o C, hàm lượng hai chất này giảm nhẹ so với khi chiết ở 75 o C Vì vậy, nhiệt độ chiết mẫu lỏng được lựa chọn là 75 o C.

3.2.5 Khảo sát thời gian chiết

Tiến hành chiết mẫu theo quy trình dự kiến với phương pháp chiết siêu âm, sử dụng nhiệt độ chiết 40°C cho mẫu rắn R1 và 75°C cho mẫu lỏng L1 Dung môi chiết sử dụng là H2O cho mẫu rắn R1 và MeOH cho mẫu lỏng L1, thực hiện chiết 01 lần Thời gian chiết được khảo sát ở các mức 15 phút, 30 phút, 60 phút, 90 phút và 120 phút, mỗi mức thời gian được lặp lại 3 lần để lấy kết quả trung bình Kết quả khảo sát được thể hiện trong hình sau.

Hình 3.16 Kết quả khảo sát thời gian chiết đối với mẫu R1 (n = 3)

Hình 3.17 Kết quả khảo sát thời gian chiết đối với mẫu L1 (n = 3)

Nhận xét cho thấy rằng, trong cả hai mẫu rắn và lỏng, việc tăng thời gian chiết từ 15 phút đến 120 phút không làm thay đổi đáng kể hàm lượng cordycepin, trong khi hàm lượng adenosin tăng từ 15 phút đến 30 phút (2,69 mg/100g đến 3,05 mg/100g đối với mẫu L1; 21,17 mg/100g đến 22,56 mg/100g đối với mẫu R1) Tuy nhiên, sau 30 phút, sự thay đổi hàm lượng adenosin không còn đáng kể khi thời gian chiết tiếp tục kéo dài đến 120 phút Do đó, thời gian 30 phút được chọn để chiết adenosin và cordycepin nhằm tránh tình trạng dịch chiết lẫn nhiều tạp chất, ảnh hưởng đến kết quả phân tích.

Quy trình phân tích

Chúng tôi đã khảo sát quy trình phân tích và điều kiện sắc ký để phát triển quy trình định lượng đồng thời adenosin và cordycepin trong các chế phẩm đông trùng hạ thảo dạng lỏng và rắn.

3.3.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử

Để chuẩn bị dung dịch chuẩn, cần cân và pha adenosin cùng với cordycepin trong methanol, nhằm tạo ra dung dịch hỗn hợp có nồng độ chính xác khoảng 20 µg/ml cho mỗi chất Sau đó, dung dịch này cần được lọc qua màng lọc 0,45 µm.

Để chuẩn bị mẫu thử dạng rắn, cần cân chính xác lượng mẫu thích hợp (tương ứng với 0,30 – 0,50 g ĐTHT) vào ống ly tâm, sau đó thêm khoảng 15 ml H2O và lắc đều Tiếp theo, mẫu được siêu âm ở 40 o C trong 30 phút, lọc qua giấy lọc thô và dịch lọc được chuyển vào bình định mức 25 ml Phần cắn trên giấy lọc sẽ được rửa bằng H2O và dịch rửa tập trung vào bình định mức 25 ml trên Cuối cùng, thêm H2O vừa đủ thể tích, lắc đều và lọc qua màng lọc 0,45 μm để có mẫu thử dạng rắn hoàn chỉnh.

Để chuẩn bị mẫu thử dạng lỏng, cần cân chính xác lượng mẫu lỏng khoảng 0,30 – 0,50 g ĐTHT vào bình định mức 25 ml Tiếp theo, thêm khoảng 15 ml MeOH, lắc đều và siêu âm ở 75 o C trong 30 phút Sau khi dung dịch đạt nhiệt độ phòng, bổ sung MeOH đến đủ thể tích và lắc đều Cuối cùng, lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 µm.

- Cột sắc ký: cột sắc ký pha đảo C18 (250 x 4,6 mm, 5 àm)

- Detector PAD bước sóng 260nm

- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

- Thể tớch tiờm mẫu: 10 àl

- Thứ tự rửa giải: adenosin cordycepin

Tiến hành tiêm dung dịch thử và dung dịch chuẩn hỗn hợp vào hệ thống sắc ký, ghi lại sắc ký đồ

Để xác định thành phần adenosin và cordycepin trong mẫu thử, phương pháp định tính được thực hiện thông qua việc so sánh thời gian lưu và phổ UV của các đỉnh xuất hiện trong sắc ký đồ của dung dịch mẫu với thời gian lưu và phổ tương ứng của các đỉnh trong sắc ký đồ của dung dịch mẫu chuẩn.

Hàm lượng adenosin (cordycepin) trong mẫu thử (mg/g) được xác định dựa vào đường chuẩn theo công thức sau:

- AT: diện tích pic của adenosin (cordycepin) trong sắc ký đồ của dung dịch mẫu thử (mAU.s)

- mt: khối lượng mẫu thử (g)

- a, b: hệ số của phương trình đường chuẩn adenosin (cordycepin) y = ax +b biểu diễn sự phụ thuốc tuyến tính giữa diện tích pic và hàm lượng chất chuẩn.

Đánh giá phương pháp

3.4.1 Độ thích hợp của hệ thống

Tiêm 6 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp adenosin và cordycepin có nồng độ chính xỏc khoảng 20 àg/ml mỗi chất theo điều kiện sắc ký đó lựa chọn (mục 3.3.2), ghi lại sắc ký đồ Kết quả được trình bày ở bảng sau:

Bảng 3.9 Kết quả độ thích hợp của hệ thống

Hệ số bất đối xứng Độ phân giải

Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD %) của thời gian lưu và diện tích pic đều nhỏ hơn 1% Đồng thời, pic thể hiện sự cân đối với hệ số bất đối xứng gần bằng 1, và số đĩa lý thuyết cũng được xác định.

> 5000 đối với cả 2 chất, độ phân giải giữa hai pic adenosin và cordycepin > 6, đạt yêu cầu cho phép phân tích định lượng với cả hai chất adenosin và cordycepin

3.4.2 Độ đặc hiệu Độ đặc hiệu được đánh giá qua phân tích các mẫu thử, mẫu placebo và mẫu chuẩn:

- Dung dịch mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn adenosin và cordycepin trong MeOH cú nồng độ chớnh xỏc khoảng 20 àg/ml mỗi chất

Cân chính xác 0,50 g bột hỗn hợp các dược liệu (nhân sâm, tam thất, tổ yến) theo tỷ lệ đồng lượng vào ống ly tâm Thêm khoảng 15 ml nước (H2O) và lắc đều Tiến hành chiết và phân tích mẫu dạng rắn theo quy trình đã lựa chọn (mục 3.3.1).

Cân 1,00 g hỗn hợp dịch chiết dược liệu (nhân sâm, tam thất, nước yến) theo tỷ lệ đồng lượng, cho vào bình định mức 25 ml Thêm 15 ml MeOH, lắc đều và tiến hành chiết xuất cùng phân tích theo quy trình đã chọn cho mẫu thử dạng lỏng.

Dung dịch mẫu R1 cần được chuẩn bị bằng cách đồng nhất mẫu và cân chính xác khoảng 0,30 – 0,50 g chế phẩm vào ống ly tâm Sau đó, tiến hành chiết và phân tích theo quy trình đã lựa chọn cho mẫu thử dạng rắn (mục 3.3.1).

Để chuẩn bị dung dịch mẫu L1, cần cân chính xác khoảng 1,00 g chế phẩm vào bình định mức 25 ml, sau đó tiến hành chiết và phân tích theo quy trình đã chọn cho mẫu thử dạng lỏng (mục 3.3.1).

Tiến hành tiêm dung dịch mẫu placebo 1, placebo 2, dung dịch thử các mẫu R1 và L1, cùng với mẫu chuẩn hỗn hợp vào hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao theo điều kiện sắc ký đã lựa chọn Kết quả thu được bao gồm sắc ký đồ của dung dịch mẫu placebo 1, sắc ký đồ của dung dịch mẫu placebo 2, sắc ký đồ của dung dịch mẫu chuẩn adenosin, sắc ký đồ của dung dịch mẫu chuẩn cordycepin, sắc ký đồ của dung dịch mẫu chuẩn hỗn hợp, sắc ký đồ của dung dịch mẫu R1 và sắc ký đồ của dung dịch mẫu L1.

Hình 3.18 Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu phương pháp

Phân tích phổ của adenosin và cordycepin được thực hiện tại thời gian lưu tương ứng trong sắc ký đồ của dung dịch chuẩn và các dung dịch thử Kết quả thu được cho thấy sự khác biệt rõ rệt giữa các mẫu, như minh họa trong hình ảnh kèm theo.

Hình 3.19 So phổ adenosin của mẫu R1 (A) và mẫu L1 (C), so phổ cordycepin của mẫu R1 (B) và mẫu L1 (D)

Trên sắc ký đồ của dung dịch placebo tương ứng không xuất hiện pic nào tại thời gian lưu tương ứng của các pic adenosin và cordycepin

Trên sắc ký đồ của dung dịch mẫu thử, các pic tương ứng với các chất nghiên cứu trong sắc ký đồ của dung dịch chuẩn cho thấy phổ tương ứng với hệ số Match lớn hơn 0,99 Điều này cho thấy phương pháp này có độ đặc hiệu cao.

3.4.3 Xây dựng đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính

Chúng tôi tiến hành khảo sát tính tuyến tính giữa diện tích pic sắc ký và nồng độ các chất phân tích:

- Dung dịch chuẩn gốc: chuẩn bị các dung dịch chuẩn gốc trong MeOH adenosin 1000 àg/ml, cordycepin 1000 àg/ml

Dung dịch chuẩn làm việc được tạo ra bằng cách pha loãng các dung dịch chuẩn gốc với MeOH, nhằm đạt được nồng độ của chất chuẩn adenosin và cordycepin trong khoảng từ 1 àg/ml đến 40 àg/ml.

Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã lựa chọn (mục 3.3.2), ghi lại sắc ký đồ Kết quả được trình bày trong hình 3.21 và bảng 3.10:

Hình 3.20 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp hàm lượng mỗi chất từ 1- 40 àg/ml (pic adenosin tR = 20,1 phỳt, pic cordycepin tR = 22,2 phỳt)

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát tính tuyến tính giữa nồng độ adenosin, cordycepin và diện tích pic

Nồng độ (àg/ml) Diện tớch (mAU.s)

Hỡnh 3.21 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ (àg/ml) và diện tớch pic (mAU.s) của adenosin (a) và cordycepin (b)

Kết quả khảo sát tính tuyến tính chỉ ra rằng có mối tương quan chặt chẽ giữa nồng độ từ 1 đến 40 àg/ml và diện tích pic, với hệ số tương quan r > 0,995.

3.4.4 Khảo sát độ chính xác

3.4.4.1 Độ lặp lại của phương pháp y = 153969x - 48266 R² = 0.998

Nồng độ (àg/ml) Đường chuẩn adenosin y = 126124x - 70764 R² = 0.9982

Nồng độ (àg/ml) của cordycepin được xác định thông qua việc phân tích các mẫu độc lập trong cùng một điều kiện Phương pháp được lặp lại 6 lần độc lập trên mẫu thử R1 và mẫu thử L1 theo quy trình chiết mẫu đã chọn Kết quả cho thấy hàm lượng adenosin và cordycepin trong mẫu thử cùng với độ lệch chuẩn tương đối được tính toán và trình bày như sau:

Bảng 3.11 Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp với mẫu R1

Bảng 3.12 Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp với mẫu L1

Theo tiêu chuẩn AOAC, phương pháp phân tích cần đạt độ lặp lại (RSD %) dưới 5,3% tại nồng độ ≥ 0,01% Kết quả cho thấy độ lặp lại của phương pháp đối với adenosin và cordycepin trên hai nền mẫu đều đáp ứng yêu cầu này, khẳng định rằng phương pháp phân tích đạt tiêu chuẩn AOAC.

3.4.4.2 Độ chính xác trung gian

Tiến hành định lượng mẫu thử R1 và L1 với 6 lần lặp lại song song, thực hiện theo quy trình chiết và phân tích đã được chọn ở mục 3.3, nhưng vào 3 ngày khác nhau.

Kết quả được thể hiện ở bảng sau:

Bảng 3.13 Kết quả độ chính xác trung gian

Kết quả thẩm định chỉ tiêu độ chính xác trung gian cho thấy phương pháp khảo sát đạt yêu cầu của AOAC với độ chính xác cho khoảng nồng độ ≥ 0,01% và độ lặp lại RSD < 5,3%.

Áp dụng phương pháp phân tích trên một số TPCN chứa ĐTHT 54 1 Định tính

Các mẫu thực phẩm chức năng (TPCN) chứa ĐTHT được chuẩn bị theo hướng dẫn trong mục 3.3.1, với mỗi mẫu thực hiện 3 thử nghiệm riêng biệt Sắc ký được tiến hành theo điều kiện đã nêu trong mục 3.3.2, và kết quả sắc ký được ghi lại Kết quả định tính và định lượng được trình bày trong hình 3.24, 3.25 (có trong phụ lục C) và bảng 3.17, 3.18.

Sắc ký đồ dung dịch thử cho thấy các mẫu thử có pic tại thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic adenosin và cordycepin trong sắc ký đồ dung dịch chuẩn.

Kết quả so phổ của pic tại thời gian lưu của adenosin và cordycepin với phổ chuẩn adenosin và cordycepin của các mẫu thử đều cho hệ số Match > 0,99

(phổ hai chất tương đối giống nhau) Do vậy có thể kết luận các mẫu thử khảo sát thể hiện phép thử định tính của adenosin và cordycepin

Bảng 3.17 Kết quả thời gian lưu pic adenosin và cordycepin các mẫu thử và chuẩn hỗn hợp

Thời gian lưu pic dung dịch mẫu chuẩn (phút)

Thời gian lưu pic dung dịch mẫu thử (phút) Hệ số Match Adenosin Cordycepin Adenosin Cordycepin Adenosin Cordycepin

Hình 3.23 Sắc ký đồ mẫu R2 (a), L2 (b)

Hinh 3.24 So phổ adenosin (a) và cordycepin (b) của mẫu thử R2 và mẫu chuẩn tương ứng

Dựa trên khối lượng mẫu thử và nồng độ chất phân tích trong sắc ký đồ, cùng với đường chuẩn được xây dựng trong ngày phân tích, chúng tôi xác định hàm lượng adenosin và cordycepin trong mẫu thử (mg/g).

Kết quả được thể hiện ở bảng 3.18

Bảng 3.18 Kết quả hàm lượng adenosin và cordycepin trong các mẫu thử

Mô tả Hàm lượng (mg/g)(TB ± SD) (n = 3)

Viên nang cứng vỏ màu vàng nhạt, bột bên trong màu vàng nâu m = 0,5313 g

Viên nang cứng vỏ trong, bột bên trong màu vàng nhạt m = 0,5031 g

Viên nang cứng màu vàng nhạt, bột bên trong màu nâu m = 0,4986 g

R5 Bột màu vàng cam 0,063 ± 0,002 mg/g

R6 Viên hoàn cứng màu nâu đen

Chế phẩm dạng dịch lỏng màu vàng nâu, lẫn mảnh nhỏ màu trắng

L3 Chế phẩm dạng dịch lỏng màu nâu 0,0087 ± 0,0006 mg/g

L4 Chế phẩm dạng cao lỏng màu nâu đen

L5 Chế phẩm dạng dịch lỏng màu nâu đen 0,122 ± 0,004 mg/g

L6 Chế phẩm dạng dịch lỏng màu vàng 0,0094 ± 0,0008 mg/g

Các mẫu thực phẩm chức năng (TPCN) đã được kiểm tra định tính và định lượng adenosin và cordycepin, cho thấy sự hiện diện của hai hoạt chất này Tuy nhiên, hàm lượng adenosin và cordycepin trong các mẫu khảo sát rất khác nhau, phụ thuộc vào hàm lượng, chất lượng và loài dược liệu mà nhà sản xuất sử dụng Điều này dẫn đến khó khăn trong việc đánh giá tiêu chuẩn chất lượng của các sản phẩm đang lưu hành trên thị trường.

1 Về lựa chọn phương pháp phân tích

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật định tính và định lượng phổ biến cho nhiều loại hoạt chất Với tính đặc hiệu cao, độ chính xác và độ đúng vượt trội, HPLC được ứng dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm hiện nay.

Phương pháp sắc ký lớp mỏng và đo màu hiện tại chỉ được áp dụng trên nền mẫu dược liệu ĐTHT, chưa có nghiên cứu trên chế phẩm có thành phần khác Mặc dù sắc ký lớp mỏng đơn giản, nhưng kết quả dễ bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như thể tích chấm sắc ký và thiết bị xử lý Phân tích thực phẩm chức năng có nhiều thành phần tương tự cordycepin và adenosin sẽ gặp khó khăn trong việc đảm bảo tính chính xác do ảnh hưởng của nền mẫu Phương pháp điện di mao quản tuy hiệu quả và thân thiện với môi trường, nhưng không phổ biến trong phòng thí nghiệm Do đó, nghiên cứu này lựa chọn phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để cung cấp phương pháp phân tích chính xác và thường quy cho hàm lượng adenosin và cordycepin trong thực phẩm chức năng chứa ĐTHT.

2 Về quy trình xử lý mẫu

Các loại dung môi chiết mẫu được khảo sát dựa trên độ tan của hai hoạt chất trong các dung môi thông thường Kết quả cho thấy rằng với mẫu rắn, nước là dung môi chiết hiệu quả nhất, cho hàm lượng hai chất phân tích cao nhất nhờ khả năng phân tán và làm rã các hạt nhỏ, đồng thời là dung môi rẻ tiền và không độc hại Đối với mẫu lỏng, dung môi MeOH cho hàm lượng hai hoạt chất cao nhất, nhờ vào thành phần chủ yếu là nước trong các mẫu TPCN, giúp phân tán tốt các tiểu phân hoạt chất Thêm vào đó, việc sử dụng MeOH cũng giúp kết tủa các thành phần như đường và protein trong mẫu nước yến, làm cho quá trình lọc mẫu trở nên dễ dàng hơn.

Trong nghiên cứu của chúng tôi, hai phương pháp chính được áp dụng là siêu âm và đun hồi lưu cách thủy Kết quả khảo sát cho thấy phương pháp chiết siêu âm mang lại hàm lượng adenosin và cordycepin cao hơn so với phương pháp hồi lưu, cả trên mẫu rắn và mẫu lỏng Sự khác biệt này có thể được lý giải bởi khả năng tăng cường tính thấm và khuếch tán của sóng siêu âm, giúp tăng diện tích tiếp xúc giữa hai pha bằng cách phân tán chúng thành những hạt nhỏ và cải thiện sự xáo trộn của hỗn hợp.

Nhiệt độ chiết mẫu khảo sát trên nền mẫu dạng rắn cho thấy nhiệt độ tối ưu là 40 o C, phù hợp với nghiên cứu của Jiamin Li về hàm lượng adenosin và cordycepin trong C militaris Tác giả chỉ ra rằng adenosin chiết xuất ở nhiệt độ từ 20 – 40 o C là hiệu quả nhất do tính bền vững kém của adenosin ở nhiệt độ cao, trong khi cordycepin không bị ảnh hưởng Đối với mẫu dạng lỏng, nhiệt độ chiết xuất tốt nhất là 75 o C, cho thấy adenosin ít bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ trong môi trường methanol, phù hợp với phương pháp chiết xuất adenosin trong C sinensis theo dược điển Trung Quốc 2010.

Nghiên cứu chỉ ra rằng thời gian chiết mẫu ảnh hưởng đến hàm lượng hoạt chất chiết ra, với việc tăng thời gian chiết từ 15 phút đến 30 phút làm tăng hàm lượng adenosin và cordycepin Tuy nhiên, khi thời gian chiết kéo dài từ 30 đến 120 phút, hàm lượng hoạt chất không thay đổi đáng kể Do đó, thời gian chiết 30 phút là tối ưu, giúp tiết kiệm thời gian và tránh giảm hàm lượng adenosin do tác động nhiệt Hơn nữa, khảo sát cho thấy chiết 1 lần đã đủ để lấy hết hoạt chất ra khỏi mẫu, với ưu điểm tiết kiệm thời gian và dung môi chiết so với chiết 2 hoặc 3 lần.

Nghiên cứu của Jian – Ping Yuan và cộng sự chỉ ra rằng, dược liệu C militaris có thể được chiết bằng dung môi nước qua phương pháp siêu âm, cho hàm lượng 12 nucleosid cao nhất Trong khi đó, Lei Huang và nhóm nghiên cứu đã sử dụng phương pháp siêu âm công suất 75W với hỗn hợp dung môi methanol và nước (tỷ lệ 1:1) để chiết adenosin và cordycepin từ mẫu quả thể và sinh khối các loài Cordyceps Điều này cho thấy nước là dung môi chiết hiệu quả cho hai hoạt chất adenosin và cordycepin trong nền mẫu dạng rắn Tuy nhiên, hiện tại chưa có nghiên cứu nào về phương pháp tách chiết hai hoạt chất này từ nền mẫu dạng lỏng.

3 Về điều kiện sắc ký

Sắc ký lỏng pha đảo hiện nay được ưa chuộng nhờ khả năng tách và phân tích hiệu quả nhiều hợp chất có độ phân cực khác nhau, từ phân cực đến không phân cực Với nước là thành phần chính của pha động, phương pháp này cũng rất kinh tế Nghiên cứu này áp dụng pha tĩnh không phân cực từ silicagel được xilan hóa bởi nhóm octadecyl (C18), một loại pha tĩnh hiệu quả và phổ biến trong việc tách hợp chất.

Nhiệt độ cột ảnh hưởng đến khả năng phân tích thông qua việc tác động đến sự rửa giải của hoạt chất Khi nhiệt độ cột tăng lên 40 o C, pha động giảm độ nhớt, giúp chất phân tích được rửa giải nhanh hơn Tuy nhiên, trong nền mẫu phức tạp, việc rửa giải nhanh có thể dẫn đến khả năng tách kém cho cột Nghiên cứu cho thấy ở nhiệt độ 40 o C, mặc dù cả hai chất phân tích rửa giải nhanh hơn, nhưng vẫn không tách được hoạt chất adenosin ra khỏi nền mẫu thử.

Pha động đóng vai trò quan trọng trong việc rửa giải chất phân tích trong sắc ký lỏng So sánh khả năng rửa giải adenosin và cordycepin bằng methanol và acetonitril cho thấy acetonitril rửa giải nhanh hơn với pic gọn, cân đối Tuy nhiên, do mẫu TPCN có nhiều thành phần, rửa giải sớm có thể không tách hoàn toàn pic hoạt chất Methanol, mặc dù chậm hơn, lại là dung môi rẻ hơn, đảm bảo kinh tế mà vẫn duy trì khả năng rửa giải hiệu quả Khảo sát 3 chương trình gradient cho thấy chương trình lựa chọn đảm bảo độ phân giải giữa 2 chất (>6), pic sắc ký gọn, cân đối, với thời gian phân tích 40 phút, giúp rửa giải hoàn toàn các thành phần khác.

Phổ hấp thụ tử ngoại của hai hoạt chất cho thấy cực đại hấp thụ tại bước sóng 260 nm, do đó chúng tôi đã chọn 260 nm làm bước sóng phát hiện nhằm nâng cao độ nhạy và đáp ứng phân tích của chất phân tích Bước sóng này cũng tương đồng với bước sóng phát hiện trong định lượng adenosin theo dược điển Trung Quốc 2010, trong khi một số nghiên cứu khác lại lựa chọn bước sóng 254 nm.

4 Về việc thẩm định phương pháp phân tích