Xây dựng phương pháp định lượng loratadin và pseudoephedrin trong huyết tương chó bằng UPLC MS MS

Bài báo này trình bày kết quả xây dựng phương pháp định lượng đồng thời LOR và PSE trong huyết tương bằng sắc ký lỏng siêu hiệu năng cao kết nối với khối phổ UPLC-MS/MS, phương pháp này

phase and lipid rafts in model and biological membranes", Curr Opin Colloid Interface So'., 8(6), p 459-468.

4 Morand K, Bartoletti AC, Bochot A, Barratt G, Brandely ML, Chast F (2007), Liposomal amphotericin B eye drops to treat fungal keratitis:

physico-chemical and formulation stability, Int J Pharm., 344(1-2), p 150-153.

5 Richard T Proffit, Jill Adler-Moore,Su-Ming Chiang (1999), Amphotericin B liposome preparation, patent USA.

5 Rojanapanthu Pleumchitt, Sarisuta Narong ,Chaturon Korakot (2003), "Physicochemical properties of amphotericin B liposomes

prepared by reverse-phase evaporation method", Drug Dev.Ind.Pàm., 29(1), p 31-37.

7 Singodia D, Verma A, Khare P, Dube A, Mitra K, Mishra PR (2012), Investigations on feasibility of in situ development of amphotericin

B liposomes for industrial applications,! Liposome Res., 22(1), p 8-17.

8 Thomas L Leimke, David A Williams, Victotia F Roche and S William Zito (2013), Foye's principle of medicinal chemistry, Wolter Kluver/Lippincot William & Wilkins, 7th edition, p 1469.

9 Torchilin Vladimir, Weissig Volkmar (2003), Liposomes: A practical approach, OUP Oxford, p 27-4.

Xây dựng phương pháp định lượng

Loratadin và Pseudoephedrin trong

huyết tương chó bằng UPLC-MS/MS

Đinh Thị Hải Bình', Nguyễn Thị Kim Oanh^ Nguyễn Thanh HảP, Trịnh Văn Lẩu''

Lê Thị Quế^ Nguyễn Thị Kiểu Anh^

'Trường Cao đãng Dược Hỏi Dương, ^Khoa Dược, Trường Đợi học Y Thái Bình,

^Khoa Y Dược, Đọi học Quốc gia Hà Nội, ^Hội đổng Dược điển Việt Ham,

^Trường Đại học Dược Hà Mội

SUMMARY

An UPLC-M5/MS method was developed and validated for the determination o f loratadine and pseudoephedrine sufate in dog plasma The chromatographic cor)ditions are as follows: column: Shimpark UPLC C18 (50 mm X 3.0 mm; 2.1 ụm); mobile phase: acetonitrile -0.05% formic acid (70:30 v/vj; flow rate o f200 ụl/min; injection volume o f 25 ụl; internal standard is domperidone;positive electrospray ionization; detection: MS/MS with m/z o f259.17; n 7.06 and 175.08 for loratadine, pseudoephedrine and domperidone, respectively Loratadine and pseudoephedrine were extracted from plasma samples with a mixture o f diethyl ether - chloroform (8:2 v/v) It was proved that the method was stable, accurate, precise, very sensitive and suitable for determination o f loratadine and pseudoephedrine in plasma sample.

Từkhoá: Loratadin, pseudoephedrin, UPLC-MS/MS, huyết tương.

Đặt vấn đề

Loratadin (LOR) là một thuốc kháng histamin thế

hệ II có tác dụng làm giảm triệu chứng của viêm mũi

dị ứng do giải phóng histamin, có thời gian bán thải

dài Pseudoephedrin (PSE) là một chất có tác dụng

co mạch làm giảm xung huyết hữu hiệu, thời gian

bán thải ngắn Việc kết hợp 2 chất này trong một

chê' phẩm tạo nên tác dụng chữa viêm mũi dị ứng

rất hiệu quả [1 ], đặc biệt khi bào chế dưới dạng viên phóng thích có kiểm soát thì hiệu quả điểu trị tăng rõ rệt Trong nghiên cứu phát triển dạng sản phẩm viên bao phóng thích có kiểm soát chứa hai dược chất này, bên cạnh đánh giá tương đương bào chế (giải phóng hoạt chất in vitro) thì việc đánh giá sinh khả dụng in vivo trên cơ thể sống của chế phẩm nghiên cứu so với chế phẩm đối chiếu là rất cắn thiết, trong

đó bước căn bản là đánh giá nống độ thuốc trong

dịch sinh học Trên thế giới, đã có một số nghiên cứu

định lượng PSE và LOR trong huyết tương [3],[4],[5],

[6] được công bố, nhưng ở Việt Nam chưa có công

bổ nào được đăng tải

Bài báo này trình bày kết quả xây dựng phương

pháp định lượng đồng thời LOR và PSE trong huyết

tương bằng sắc ký lỏng siêu hiệu năng cao kết nối

với khối phổ (UPLC-MS/MS), phương pháp này có

khả năng ứng dụng đánh giá sinh khả dụng của chế

phẩm viên phóng thích có kiểm soát chứa hai thành

phần LOR và PSE trên động vật (chó)

Hóa chất, thiết bị và phương pháp nghiên cứu

Hóa chất, động vật thí nghiệm

- Chất chuẩn: Loratadin hàm lượng 99,24%, độ

ẩm 0,02%; Pseudoephedrin hydroclorid hàm lượng

100%, độ ẩm 0,01%; Domperidol hàm lượng 99,44%

tính theo nguyên trạng do Viện Kiểm nghiệm thuốc

Trung ương cung cấp

- Các dung môi, hóa chất thuộc loại dùng cho

HPLC hoặc PA (Merck - Đức)

- Huyết tương trắng: được lấy từ chó khỏe mạnh

chưa dùng thuốc

- Động vật thí nghiệm: Chó đực, khỏe mạnh, 10

± 0,5 kg

- Mẫu thử: là huyết tương chó sau khi uống viên

nén Clarinase repetabs tablets (Schering-Plough), số

lô sản xuất 2JRPG80D01, hạn sử dụng 23.08.2014,

hàm lượng ghi nhãn Pseudoephedrin Sulfat 120 mg

và Loratadin 5 mg

Thiết bị

-Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ Waters XevoTQD

- Waters (Mỹ);

- Các thiết bị và dụng cụ khác: cân phân tích

Sartorius CP224S (d=0,1 mg), Đức Máy ly tâm lạnh

Sartorius sigma 2 - 16 K, Đức Máy lắc xoáy Vortex

ZX3 VELP - 236, Ý Tủ lạnh sâu MDF -192, Đức Tất cả

các thiết bị dụng cụ đểu được chuẩn hóa theo quỵ

định ISO/ lEC 17025 năm 2005

Phương pháp nghiên cứu

- Các dung dịch chuẩn gốc: cân chính xác một

lượng chất chuẩn hòa tan trong một thể tích chính

xác methanol để được dung dịch chuẩn gốc LOR,

PSE có nồng độ chính xác khoảng 250 ụg/mL (Các

dung dịch gốc được pha riêng) Từ các dung dịch chuẩn gốc này pha loãng trong MeOH thành các nồng độ thích hợp sao cho khi thêm huyết tương trắng vào ta thu được mẫu huyết tương chứa đổng thời LOR và PSE có nổng độ từ 0,2/10 và 50/2500 ng/

ml (LOR/PSE)

- Dung dịch chuẩn nội (IS): cân chính xác một

lượng domperidon, hòa tan trong một thể tích chính xác methanol để được dung dịch có nồng độ chính xác khoảng 250 ụg/ml Sau đó pha loãng trong MeOH đến nồng độ khoảng 125 |jg/ml

- Sử dụng các phương pháp kết tủa protein và chiết lỏng - lỏng trong xử lý mẫu để chiết tách LOR

và PSE trong mẫu huyết tương

- Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu

năng cao kết nối với khối phổ (UPLC-MS/MS) trong định lượng LOR và PSE trong huyết tương Điều kiện khối phổ và sắr ký được lựa chọn sau khi thực hiện: tối ưu hóa điều kiện khối phổ, khảo sát các loại cột tách khác nhau, các loại pha động có thành phần, tỉ

lệ khác nhau

- Tiến hành th ẩm định phương pháp phân tích

theo hướng dẫn của FDA các chỉ tiêu: tính chọn lọc- đặc hiệu, khoảng nồng độ tuyến tính, độ đúng, độ chính xác, giới hạn định lượng dưới, độ ổn định

- Xác định nổng độ PSE và LOR trong huyết tương của chó sau khi uống chế phẩm viên phóng thích có kiểm soát chứa loratadin 5 mg và pseudoephedrin

120 mg Tính kết quả dựa vào đường chuẩn được xây dựng trong cùng ngày phân tích với hệ số tương quan r > 0,99

Kết quả nghiên cứu

Khảo sát lựa chọn điều kiện phân tích

Tối ưu hóa điều kiện khối phổ

Pha dung dịch chuẩn LOR và PSE với nồng độ 1 ng/mL trong MeOH Tiêm dung dịch chuẩn vào hệ thống khối phổ thông qua nguồn ion hóa cùng với dòng pha động Lựa chọn chế độ phân tích khối phổ một lẩn và quét toàn phổ để tìm ion có cường độ tín hiệu cao nhất, tươnq ứng với ion mẹ của chất

phân tích từ đó xác địni I được m ảnh ion m ẹ với giá

trị m/z của LOR, PSE và IS lần lượt là 383,17; 166,04

và 426,17

Sau khi xác định được ion mẹ, tiến hành điểu

chỉnh để tối ưu điểu kiện nguồn ion hóa với hai

thông số là hiệu điện thế mao quản và hiệu điện thế

cone để cường độ ion mẹ lớn và ổn định nhất Kết

quả đã lựa chọn được giá trị tối ưu với hiệu điện thế

mao quản là 4,0 KV; Hiệu điện thế cone lẩn lưcrt là

46V; 20 V và 54 V với LOR, PSE và IS

Việc xác định nồng độ LOR và PSE được tiến hành

dựa trên các mảnh con Kết quả với PSE, ở mức thế

phân mảnh 18 V cho mảnh ion con m/z có giá trị

117,06 cho cường độ tín hiệu lớn và ổn định nhất, với

LOR giá trị này là 28 V tương ứng ion con m/z bằng

259,17 và với IS là 28 V, ion con m/z bằng 175,08

Khảo sát chương trình sắc ký

Sử dụng các cột sắc ký có pha tĩnh là C18 của các

hãng khác nhau, qui cách khác nhau như cột Themo

Hypersil GOLD C18 (50 mm X 2,1 mm; 1,9 |jm),

o ctad ecylsilan Acquity UPLC- BEH C18 (50 X 2,1 m m ;

1,7 |jm) và Shimpark UPLC C18 (50 mm X 3,0 mm; 2,1

um), ba hệ dung môi pha động là acetonitril: dung

dịch amoni acetat 10 mM (50:50), acetonitril; dung

dịch acid acetic 0,1% (80:20), acetonitril: dung dịch

acid formic 0,05% (70:30), ba mức lưu lượng dòng

pha động (200, 400 và 500 |jl/phút) và ba mức thể

tích tiêm mẫu (5,10 và 20 fil)

Kết quả khi phân tích trên cột Themo Hypersil

GOLD C18 các pic tách khỏi nhau tốt nhưng chưa đạt

độ phân giải đường nền, đối với cột Acquity UPLC-

BEH C18 các pic xuất hiện sớm nhưng không ổn

định Khi phân tích trên cột Shimpark UPLC C18 các

pic LOR, PSE và IS cho đáp ứng tương đối tốt, hình

dáng pic cân đối, thời gian lưu ngán

Khảo sát với 3 hệ pha động cho thấy, hệ pha

động gổm acetonitril: dung dịch acid formic 0,05%

cho các pic LOR, PSE và IS có hình dạng khá cân đối,

đáp ứng pic giữa các lần sắc ký ổn định hơn hẳn so

với khi phân tích với hai hệ pha động còn lại Tốc độ

dòng pha động là 200 nl/phút và thể tích tiêm mẫu

10 nl là hợp lý cho phép phân tích với thời gian lưu

khá ngắn (khoảng 3 phút), hình dạng pic cân đối,

đáp ứng pic đảm bảo yêu cầu định lượng

Từ kết quả khảo sát, điểu kiện phân tích được

lựa chọn là: cột sắc ký Shimpark UPLC C18 (50 mm

X 3,0 mm; 2,1 |am); nhiệt độ cột 30°C; pha đ ộng

acetonitril: dung dịch acid formic 0,05% (70:30); lưu

lượng dòng 200 Ịjl/phút; thể tích tiêm mẫu 10 |al Kiểu khối phổ MS/MS, ion mẹ/ ion con của LOR, PSE

và IS có m/z lắn lượt là 383,17/259,17; 166,04/117,06

và 426,17/175,08

Khảo sát phương pháp xử lý mâu

Chuẩn bị các mẫu huyết tương tựtạo chứa chuẩn LOR, PSE và IS nồng độ lẩn lượt là 50 ng/mL, 500 ng/

mL và 200 ng/mL Tiến hành xử lý mẫu bằng cách tủa protein hoặc chiết lỏng - lỏng

Khi dùng tác nhân gây tủa protein khác nhau như acid percloric, acid tricloacetic, acid trifluoroacetic hoặc dung môi hữu cơ methanol, acetonitril Kết quả là cường độ tín hiệu thu được của mẫu không

ổn định, pic của LOR bị doãng, chưa đạt độ phân giải đường nền Tiếp tục khảo sát cách dùng acetonitril tủa protein, sau đó chiết bằng dicloromethan, kết quả cho thấy thời gian xử lý mẫu kéo dài do quá trình trải qua hai bước và thời gian bay hơi dicloromethan tương đối lâu, không phù hợp với việc phân tích nhiều mẫu trong cùng ngày

Với phương pháp chiết lỏng - lỏng dùng hỗn hợp dung môi diethyl ether: cloroform (8:2), kết quả cho thấy hệ dung môi này khắc phục được nhược điểm khi chiết bằng một dung môi riêng rẽ (với cloroform thường dễ tạo nhũ tương bể mặt phân cách, nằm

ở lớp dưới gây khó khăn khi tách lấy dung môi, với diethyl ether cho tỷ lệ thu hồi thấp) Khảo sát lượng dung môi sử dụng, thời gian lắc, kiềm hoá hoặc không kiểm hoá mẫu thử, từ đó xác định được quy trình xử lý mẫu như sau: lấy 1 ml huyết tương, thêm

100 ụl dung dịch IS, lắc xoáy 30 giây Thêm 0,5 ml dung dịch amoniac 0,1 M, lắc xoáy 30 giây Thêm 5

ml hỗn hợp diethyl ether: cloroform (8:2) Lắc xoáy

10 phút Ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút Lấy 3,5 ml dung môi hữu cơ ở lớp trên, cô dưới dòng khí

nitơ ở 40°c tới cắn Hòa tan cắn trong 1,00 ml pha

động và tiêm sắc ký

Thẩm định phương pháp phân tích

Tiến hành thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của US- FDA [7],

Tính chọn lọc của phương pháp được đánh giá dựa vào so sánh thời gian lưu, các pic của chất phân tích và IS phải được nhận diện rõ ràng và có hình dạng cân đối Đáp ứng pic của mẫu trắng so với mẫu chuẩn (mẫu LLOQ) tại thời gian lưu của chất phân

- ề

tích không quá 20%, tại thời gian lưu của IS không quá 5%

Khoảng nồng độ tuyến tính của phương pháp được xác định dựa trên mối tương quan hổi quy giữa nồng

độ LOR, PSE và tỷ lệ giữa diện tích pic của LOR, PSE và chuẩn nội

Độ đúng và độ chính xác của phương pháp được thực hiện ở 3 mức nồng độ LQC, MQC và HQC, mỗi mức

nồng độ tiến hành 6 lán song song Nổng độ ứng với các mức LQC, MQC và HQC của LOR/ PSE lẩn lượt là

0,6/30 ng/ml, 25/1250 ng/ml, 40/2000 ng/ ml

Giới hạn định lượng của phương pháp dựa vào pic của chất phân tích được nhận diện rõ ràng, hình dạng

cân đối và có đáp ứng ít nhất bằng 5 lẩn đáp ứng của mẫu trắng tại thời gian lưu của chất phân tích, độ đúng

nằm trong khoảng 80 -120% so với nồng độ thực và độ chính xác có RSD không quá 20%

Kết quả được trình bày ở hìnhl và bảng 1

426.17 > 175-08 (D o m f«ttin ) 100 2-<l95 0.06 0^1

0.2 0 0.40 0.60 0.80 11 » 1.20 1,40 1,60 1,80 2.1X1 2.2 0 2.40 2,60 2.80 3.00 3,20

Ab

_ -lẽ

02 0 D.40 0.60 0.80 1,00 ' 1.20 1.40 1.60 1.S1 2.00 22 0 2,40 2,60 2.80 3.00 ' 3.20

MRMorSCTHVHÌsES^

383.17 > 259.17{LoratadinB)

3.10 3 i3

LQC01

Ũ.2Ũ 0.40 0.60 0.80 1.00 l i o 1.40 1,60 1.00 2.00 2 Ì0 140 2.60 2.80 3.Ũ0 3.20

Ac

0 ^ Ữ4Ũ 0.60 OÌO 1.00 l iO 140 1.60 1.60 2.00 2 ^ 2.40 2.60 2.60 3.00 3 i0

N 6 M > 117.06 (P H u d C M p M n )

133 255 2.75 213 ị ; *

B c MRMdaCtmekES*

n m 11W I? f i u n Ifiíi i m ĩCfi ?7fi ?4fi ĩÁ n aón 3 jf i

A

I M 1,20 1,40 1,60 1.80 2 00 2.ffl 24 0 2.60 2 00 3 w 3,20

Hình 1 Sâckỷđỗ A) mâu huỵểt tươnq chứũ lOR, PSE và IS:Aơ: IS: AblOR:Ac:PSE: Bj màu huỵỗ tương tráng Ba: /5; B b M ; BcPSE

Báng l Tóm tát két quà thẳm định phương pĩháp

Độ tuyến

tính

r t i a i M l h l độ tuyến tính 0 ,2 -1 0 n g /m l 1 0-2 5 00 n g /m l

P h N h g trình hói quy y = 0 ,0 0 4 4 x -0,0261 y = 0,0164x + 0,0065

Hê số tương quan r > 0,998 r = 0,9983 r = 0,9995 Giới hạn

đ ị n h l ^ Đáp ứng pic mẫu LLOQ/ mẫu trắng > 5

Độ đúng

LQC

8 5 -1 1 5 %

9 1,1 3 % a-1 13 ,3 3% b 103,53%C

9 4 ,2 7 % a -1 1 4 ,2 % b 102,3%c

107,6%c

9 0,1 8 % a-1 12 ,9 5% b 99,11%c

102,06%c

85,36% a-100,63% b 92,62% c

Độ chính

xác

LQC

R S 0 < 1 5 %

Tỉ lệ thu

hổi

LQC

3 0 -1 1 0 % (RSD < 15%)

90,93% (RSD = 9 ,5 % ) 40,67% (RSD = 8,6% )

‘giá trị nhỏ nhót, ‘’giá trị l ề nhát, ‘giá trị trung bình.

Độ ổn định của mẫu thử được đánh giá trong điểu kiện bảo quản ở nhiệt độ -40°c, mẫu thử đựng trong ống

nghiệm thủy tinh nút xoáy, sau 15 ngày và ở bảo quản ở nhiệt độ phòng sau 6 giờ Xác định lượng chất phân tích

giảm đi sau thời gian bảo quản so với lượng chất phân tích trong mẫu mới chuẩn bị Tiến hành ở 2 mức nổng độ

là LQC và HQC của LOR/ PSE lẩn lượt là 0,6/30 ng/ml và 40/2000 ng/ ml Kết quả được trình bày ở bi ng 2

BÀI NGHIÊN CỨU

Báng 2 Két quờ khảo sát độ ồn định cùa mâu (n = 6)

Điểu kiện bảo quản

chát phân tích

Nóng độ ban đáu (ng/ml)

Nống độ sau bảo quản (ng/ml)

% giảm

so với ban đáu

RSD (% )

Nóng độ ban đáu (ng/ml)

Nóng độ sau bảo quản (ng/ml)

% giảm

so với ban đáu

RSD (% )

Kết quả ở bảng 1, 2 và hình 1 cho thấy phương

pháp có tính chọn lọc cao với LOR và PSE với giá

trị m/z của ion mẹ/ion mảnh đổi với LOR, PSE

và IS lẩn lượt là 383,17/259,17; 166,04/117,06 và

426,17/175,08 Khoảng nống độ tuyến tính xây

dựng khá rộng với hệ số tương quan đạt yêu cẩu của

LOR 0,2 - 50 ng/ml (r - 0,9983), PSE 10 - 2550 ng/ml

(r = 0,9995), dự đoán sẽ bao phủ toàn bộ nổng độ mẫu

huyết tương trong nghiên cứu sinh khả dụng Giới hạn

định lượng dưới nhỏ với LOR và PSE lẩn lượt là 0,2 ng/

ml và 10 ng/ml, độ đúng cao với LOR đạt từ 102,06%

-107,60%, với PSE: 92,62% đến 102,30%, độ chính xác

tốt với giá trị RSD của LOR dưới 10% và của PSE dưới

6% Tỷ lệ thu hồi hoạt chất ở cả ba khoảng nồng độ đạt

yêu cau và ổn định: IS (DOM): xấp xỉ 97%, LOR: 93% và

PSE 53% Hoạt chất ổn định trong các điểu kiện bảo

quản 6 giờ ở nhiệt độ phòng và sau 15 ngày ở -40°c

Các kết quả thẩm định đều đạt theo yêu cẩu của FDA

Bước đầu ứng dụng định lượng Loratadin và Pseudoephedrin trên mẫu thực

Cho chó uống 1 viên Clarinase repertabs với 50

ml nước Lấy 3,0 ml máu ở tĩnh mạch cổ vào ống chống đông chứa heparin tại các thời điểm trước khi uống thuốc, sau khi uống thuốc 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 4; 7; 9; 11; 24; 30; 35; 48 giờ Lắc nhẹ Ly tâm 3000 vòng/ phút trong 10 phút, lấy huyết tương và bảo quản ở

-40°c tới khi phân tích.

Xử lý mẫu và tiến hành sắc ký theo phương pháp

đã xây dựng Dựa vào đường chuẩn xây dựng trong cùng ngày phân tích (với r > 0,99) tính nồng độ LOR

và PSE trong mẫu thực Kết quệ'được trình bày ở hình 2 và bảng 3

p se u d o e p h e d rin

2500

60

th ò i gian (giờ)

Bòng ỉ Một sỗ thông số DĐH trên chó của LOR và PSE

Thông số c „ ( n g / m l) U ( g ì ờ ) AUC„.«

{ng/ml*giờ)

AUCo, (ng/ml*giờ)

A U C „ _

1 A Ư C (|_ „ J ĩ,„ ( g iờ )

Bàn luận

LC-MS/MS dùng định lượng thuốc trong dịch

sinh học đã nâng cao được tính chọn lọc, độ nhạy

của phương pháp phân tích Kết quả định lượng vẫn

đảm bảo độ đúng ngay cả khi pic chất phân tích chưa

tách hoàn toàn khỏi pic khác do giá trị đáp ứng của

pic chất phân tích ứng với tỉ số m/z riêng của chất đó

chứ không chung một điểu kiện như khi phát hiện

bằng detector thông thường khác Giới hạn định

lượng nhỏ (0,2 ng/ml với LOR và 10 ng/ml với PSE)

rất phù hợp khi xây dựng đường cong nống độ - thời

gian trong đánh giá sinh khả dụng của thuốc Việc

kết nối UPLC và MS/MS giúp cho giảm thiểu thời

gian phân tích mẫu chỉ còn 2,2 phút (giảm khoảng

7 lẩn) so khoảng 15 phút khi sử dụng HPLC - MS/MS

nên sẽ tiêu tổn ít dung môi, đỡ ô nhiễm môi trường

và kinh tế hơn

Xử lý mẫu bằng cách chiết lỏng - lỏng với hỗn

hợp dung môi diethyl ether: cloroform (8:2) sau khi

đã kiểm hóa huyết tương bằng dung dịch amoniac

0,1 M cho hiệu suất chiết cao, ổn định (DOM: 97%,

LOR: 93% và PSE 53%) so với nghiên cứu [3] dung

môi chiết là ethyl ether, khôny có quá trình kiềm hóa

chuyển hoạt chất về dạng trung tính nên hiệu suất

chiết thấp hơn (LOR: 63% và PSE 40%)

Việc sử dụng một chất chuẩn nội domperidon

trong phân tích đống thời LOR và PSE đã giúp

đơn giản hóa quy trình phân tích hơn so với

nghiên cứu của các nhà khoa học Trung Quốc sử

dụng hai chất chuẩn nội là diazepam cho LOR và

phenylpropanolamin cho PSE [6]

Kết quả phân tích LOR và PSE trong 14 mẫu thực

sau khi cho chó uống viên phóng thích có kiểm soát chứa loratadin 5 mg và pseudoephedrin Sulfat 120

mg trong vòng 48 giờ đã chứng minh được sự phù hợp của phương pháp đã xây dựng Nồng độ trong huyết tương của LOR nằm trong khoảng 0,2 ng/ml -28,7 ng/ml và PSE 10 ng/ml - 2148,9 ng/ml đểu nằm trong khoảng nồng độ tuyến tính đá khảo sát Thời gian bán thải dài với LOR là 6,3 giờ và PSE là 3,9 giờ nên thời gian lấy mẫu trong vòng 48 giờ phù hợp cho nghiên cứu, điểu đó có thể được minh chứng bằng giá trị AUC(^^g/AUC|^ đểu lớn hơn 97% đối với

cả hai chất

Mặc dù tỉ lệ thành phần trong viên PSE/LOR là

24 (120/5) nhưng tỉ lệ nồng độ trong huyết tương là

74 (2148,9/28,68) là vì viên nén Clarinase Repertab chứa hai thành phẩn LOR hàm lượng 5 mg và PSE

120 mg, trong đó LOR và Vi lượng PSE (60 mg) thiết

kế giải phóng bình thường, còn '/2 lượng PSE được thiết kế giải phóng kéo dài nên nghiên cứu trên vẫn

có ý nghĩa vể mặt dược động học

Kết luận

Đã xây dựng được phương pháp định lượng loratadin và pseudoephedrin trong huyết tương chó bằng sắc ký lỏng siêu hiệu năng cao kết nối với khối phổ (UPLC-MS/MS) có độ chính xác cao, độ đúng tốt, khoảng tuyến tính khá rộng, tính chọn lọc cao, thời gian phân tích khá nhanh với quy trình xử lý mẫu đơn giản Kết quả nghiên cứu này rất khả thi để ứng dụng định lượng hai dược chất LOR và PSE trong huyết tương chó sau khi uống chế phẩm viên phóng thích có kiểm soát chứa hai thành phẩn này

TÀI LIỆU THAM KHÀO

1 Bộ Y tế (2009), Dược thư quốc gia ViêtNam, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr 2130 - 2136.

2 Ge QH, Zhou z, Zhi XJ, etal.(2007), "Simutaneous determination of pseudoephedrin and chlorpheniramine in human plasma by HPLC-

u v detection methods", Journal ofAOACInternational, Volume 93, Number 3, May 2010, pp.891 - 903.

3 Jianguo Sun, Guạngi Wang, Wei Wang, Shuai Zhao, Yi Gu, Jinwen Zhang, Mingwen Huang, Fen Shao, Hao Li, Qi Zhang, Haitang Xie (2005),

"Simultaneous determination of loratadine and pseudoephedrine sulfat in human plasma by liquid chromatography - electrospray mass

spectrometry for pharmacokinetic stud\es", Journal o f Pharmaceutical and Biomedical Analysis,wiume 39, pp 217 - 224.

4 Laurian Vlase, Silvia Imre, Dana Muntean, Sorin E Leucuta (2007), "Determination of loratadin and its active metabolite in human

plasma by high - performance liquid chromatography with mass spectrometry detection", Journal o f Pharmaceutical and Biomedical

Analysis, Volume 44, Issue 3,27 July 2007, pp.652- 657.

5 Macek J.et al (2002), "Rapid determination of pseudoephedrin in human plasma by high - performance liquid chromatography",

Journal o f Chromatography B, 766, pp.289- 294.

6 F.Zeeshan, (2008), "Simultaneous Determination of Loratadine and Pseudoephedrine Using High Performance Liquid Chromatography

Method", 22"'' MSPP scientific meeting 2008, Oral 48.

7 U.S Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evalution and Research (2001),

Guidance for Industry - Bioanalytical Method Validation.

Chiết tách Enzym Protease ngoại bào từ

Bacillus subtììỉs natto

Đàm Thanh Xuân, Đinh Thị Thanh Thảo, Đinh Thu Hương, Lê Ngọc Khánh

Trường Đại học Dược Hà Nội

SUMMARY

Study on extracellular protease enzyme extractiori from the cultured medium o f Bacillus subtilis natto Results show that 60% ammonium sulfate saturation concentration is the optimal concentration to precipitate enzyme with highest activity o f proteose (172.54 nKat) arid also prevent the present o f other enzymes in the B subtilis nano culture medium (amylase and cellulose) Electrophoresis results o f some segments obtained after purified with column chromatography and gel filtration through Sephadex

G - 75 showed that the highest protease activity segment might contain nattokinase enzyme with a molecular weight in the range o f 27-28 KDa and also capable o f fibrinolytic action.

Từ khóa: Bacillus subtilis natto, enzym ngoại bào, protease.

Đặt vấn đề

Bệnh tim mạch đang trở thành vấn để thời sự

vì sự gia tăng căn bệnh này trong cộng đồng cùng

với sự phát triển của xã hội Hiện nay, các thuốc

tiêu huyết khối trên thị trường như Urokinase,

Streptokinase, Alteplase, được sử dụng chủ yếu

trong cấp cứu tai biến, chi phí khá đắt tiền và gây

ra nhiều tác dụng phụ Nattokinase là một enzym

có khả nàng tiêu huyết khối được lên men nhờ vi

khuẩn Bacillussubtilisnatto [2], Nhiểu nghiên cứu đã

chứng minh khả năng làm giảm lượng fibrinogen

trong huyết tương của Nattokinase Nghiên cứu

này nhằm mục tiêu tách chiết và tinh chế enzym

protease từ môi trường nuôi cấy B subtilis natto, xác

định các tính chất cơ bản của enzym thu được như

trọng lượng phân tử, hoạt tính protease, khả năng

tiêu fibrin để hướng tới việc chủ động tạo nguồn nguyên liệu enzym nattokinase bằng phương pháp lên men sinh học

Nguyên liệu, thiết bị và phương pháp nghiên cúu

Nguyên liệu

Chủng Bacillus subtilis natto - nguồn gốc Nhật

Bản được nuôi cấy và lưu giữ tại Bộ môn Công nghiệp Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội

Pepton, cao thịt của Merck; Sephadex G75 của Sigma; casein, tinh bột, thạch, CMC và các một số hóa chất cẩn thiết khác đạt tiêu chuẩn phân tích Enzynn nattokinase của Đài Loan (20.000 FU/g)

Thiết bị

Tủ cấy, tủ ấm nuôi vi sinh vật, máy lắc ổn nhiệt, máy ly tâm