Ngoài cây hoàn ngọc tên chính thức là xuân hoa là một cây đang được nhiều người quan tâm, trong dân gian còn có một cây nữa được dùng làm thuốc chữa các bệnh nhiễm khuẩn như tiêu chảy, v
PHẦN MỞ ĐẦU
Lí do chọn đề tài
Hiện nay, hóa học cây thuốc đang phát triển mạnh mẽ với nhiều loài cây hoang dại được sử dụng trong y học dân gian Nghiên cứu cho thấy các loài thuộc họ Ô rô có sự phong phú và đa dạng, hiệu quả trong việc chữa trị một số bệnh.
Cây hoàn ngọc (Pseuderanthemum bracteatum Imlay), thuộc họ ô rô (Acanthaceae), là loài cây phổ biến ở Việt Nam Người dân thường sử dụng lá cây này để chữa trị các chấn thương, cầm máu, tiêu chảy và viêm loét dạ dày với hiệu quả cao Hiện nay, thị trường có nhiều bài báo và sản phẩm từ cây hoàn ngọc, như trà túi lọc Tây Ninh Việc nghiên cứu và sử dụng dược liệu từ thiên nhiên đang được chú trọng tại Việt Nam và trên toàn thế giới.
Việc sử dụng thuốc có nguồn gốc thực vật thường mang lại hiệu quả cao hơn so với thuốc tổng hợp do ít tác dụng phụ có hại Do đó, đề tài “Bước đầu tìm hiểu thành phần hóa học của cây hoàn ngọc (Pseuderanthemum bracteatum Imlay)” được chọn nhằm nghiên cứu các hợp chất có liên quan đến hoạt tính sinh học của cây hoàn ngọc Nghiên cứu này không chỉ tạo cơ sở khoa học cho các bài thuốc dân tộc Việt Nam mà còn đảm bảo hiệu quả trong việc sử dụng loài thực vật này.
Một số nghiên cứu liên quan đến đề tài
- “Khảo sát thành phần hóa học của lá xuân hoa” - Huỳnh Kim Diệu - đã phân lập được stigmasterol và sitosterol, sitosterol3Oglucoside và apigenin ide glu
Lá xuân hoa trồng tại trại chăn nuôi thực nghiệm trường Đại Học Cần Thơ đã chứng minh công dụng trong việc phòng ngừa bệnh tim mạch, điều trị viêm nhiễm và hỗ trợ chữa ung thư, điều này phù hợp với những ứng dụng dân gian của loại thảo dược này.
- “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, đặc điểm giải phẫu và tác dụng kháng khuẩn của
Nghiên cứu về rễ cây hoàn ngọc đã thành công trong việc phân lập 4 loại triterpene có hoạt tính sinh học cao, bao gồm lupeol, lupenone, betulin và acid pomolic, cùng với triterpene epifriedelanol và hợp chất mới HN5-7NTN Trong đó, lupeol và betulin có hàm lượng cao trong mẫu rễ cây, cho thấy hoạt tính kháng vi sinh vật, chống oxy hóa và độc tế bào đối với dòng tế bào ung thư gan HepG2 và ung thư vú MCF7 tại Viện Hóa học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Giới hạn của đề tài
Bài viết này sẽ khám phá đặc điểm thực vật và sinh thái của cây hoàn ngọc, đồng thời phân tích thành phần hóa học dựa trên tài liệu hiện có Chúng tôi sẽ điều chế cao ethanol từ lá cây hoàn ngọc và sử dụng phương pháp sắc ký cột để cô lập một số hợp chất có tác dụng sinh học Do đó, nội dung chính của đề tài sẽ tập trung vào việc tìm hiểu cây hoàn ngọc và phân tích sơ bộ thành phần hóa học của loài cây đặc biệt này.
Giả thuyết của đề tài
Cây hoàn ngọc chứa nhiều hợp chất quý giá như steroid và triterpenoid, có khả năng hỗ trợ điều trị một số bệnh lý như tiêu chảy, cầm máu và ung thư Những nghiên cứu sơ bộ cho thấy các thành phần này mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe, mở ra tiềm năng ứng dụng trong y học.
Phương pháp và phương tiện nghiên cứu
Hợp chất steroid và triterpenoid là hai nhóm hợp chất quan trọng trong lĩnh vực hóa học tự nhiên Việc tổng kết tài liệu về các khái niệm liên quan đến chúng giúp hiểu rõ hơn về cấu trúc và tính chất của các hợp chất này Các phương pháp chiết xuất, cô lập sản phẩm và kết tinh đóng vai trò quan trọng trong quá trình nghiên cứu và ứng dụng các hợp chất này trong y học và công nghiệp Những kỹ thuật này không chỉ giúp thu nhận các hợp chất một cách hiệu quả mà còn đảm bảo chất lượng và độ tinh khiết của sản phẩm cuối cùng.
- Phương pháp chiết rắn- lỏng
- Phương pháp chiết lỏng-lỏng
- Phương pháp sắc ký cột Theo dõi quá trình sắc ký cột bằng sắc ký bản mỏng
- Tiến hành định tính khảo sát thành phần hóa học có trong lá hoàn ngọc
- Phân tích sản phẩm tinh chế bằng phổ IR
- Sách, báo, tạp chí hóa học, tạp chí khoa học công nghệ, mạng internet
- Dụng cụ hóa chất trong phòng thí nghiệm vô cơ và hữu cơ: máy cô quay, cột sắc ký, bản mỏng, dung môi, thuốc thử.
Các bước thực hiện đề tài
Nhận đề tài từ giáo viên hướng dẫn, tìm tài liệu có liên quan, trao đổi với giáo viên hướng dẫn và hoàn thành đề cương chi tiết
Giai đoạn 2: Thực hiện đề tài từ tháng 9 năm 2010 đến tháng 4 năm 2011
Giai đoạn 3: Tháng 4 và tháng 5 năm 2011 tổng hợp kết quả và hoàn thành báo cáo luận văn tốt nghiệp
Đối tượng nghiên cứu
II.1.1 Thực trạng xung quanh nội dung nghiên cứu của đề tài
Cây hoàn ngọc hiện đang được nghiên cứu sâu rộng, đặc biệt trong việc sản xuất các sản phẩm từ loại thực vật này Nhiều sản phẩm với công dụng chữa bệnh đã được đưa ra thị trường, tạo sự tin tưởng từ người dân về khả năng chữa bách bệnh của cây hoàn ngọc Đồng thời, nhu cầu sử dụng thuốc nam trong cộng đồng ngày càng gia tăng Do đó, nghiên cứu cây hoàn ngọc là cần thiết để cung cấp cơ sở khoa học cho việc áp dụng hiệu quả loại thực vật này trong y học.
II.1.2 Tìm hiểu về cây hoàn ngọc [1], [5], [6], [9], [11]
II.1.2.1 Phân loại thực vật
Tên khoa học: Pseuderanthemum bracteatum Imlay
Tên khác : hoàn ngọc đỏ, xuân hoa lá - hoa
Giới : Thực vật Ngành : Magnoliophyta Lớp : Magnoliopsida
Cây bụi nhỏ, cao từ 1m trở lên, có tuổi thọ lâu năm với thân và cành mảnh, nhẵn Đường kính gốc thân khoảng 7 - 10 mm và cành khoảng 2 - 4 mm, thân non có hình vuông với màu đỏ tía, dài khoảng 6 - 8 cm Lá cây mọc đối, nguyên nhẵn, mặt trên màu lục thẫm, mặt dưới màu xanh nhạt, phiến lá hình thoi hẹp và dài khoảng 7 cm.
- 12 cm, rộng 1,5 - 2,5cm, có 5 - 6 đôi gân bên nổi rõ ở mặt dưới, mép lá không có răng Cuống lá dài khoảng 2 – 3 cm Các lá non ở ngọn có màu tía
Cụm hoa có dạng bông dài từ 2 đến 3cm, nằm ở đầu cành Lá bắc có màu xanh lục, kích thước khoảng 10 - 12mm x 4 - 6mm, được xếp theo 4 hàng Mặt trên và mép của lá bắc có lông, tạo nên vẻ đẹp đặc trưng cho cây.
PHẦN NỘI DUNG
PHẦN TỔNG QUAN
II.1.1 Thực trạng xung quanh nội dung nghiên cứu của đề tài
Cây hoàn ngọc hiện đang được nghiên cứu sâu rộng, đặc biệt trong việc sản xuất các sản phẩm từ loại thực vật này Nhiều sản phẩm với công dụng chữa bệnh đã được đưa ra thị trường, tạo niềm tin cho người dân về khả năng chữa bách bệnh của cây hoàn ngọc Đồng thời, nhu cầu sử dụng thuốc nam trong cộng đồng ngày càng gia tăng Do đó, việc nghiên cứu cây hoàn ngọc sẽ cung cấp cơ sở khoa học vững chắc cho việc ứng dụng loài thực vật này trong y học, nhằm đạt hiệu quả cao hơn.
II.1.2 Tìm hiểu về cây hoàn ngọc [1], [5], [6], [9], [11]
II.1.2.1 Phân loại thực vật
Tên khoa học: Pseuderanthemum bracteatum Imlay
Tên khác : hoàn ngọc đỏ, xuân hoa lá - hoa
Giới : Thực vật Ngành : Magnoliophyta Lớp : Magnoliopsida
Cây bụi nhỏ, cao từ 1m trở lên, có tuổi thọ nhiều năm Thân và cành của cây mảnh, nhẵn, với đường kính phần gốc khoảng 7 - 10 mm và cành khoảng 2 - 4 mm Thân non có hình vuông, màu đỏ tía, với đốt dài từ 6 - 8 cm và các mấu hơi phình Lá cây mọc đối, nguyên nhẵn, mặt trên có màu lục thẫm và mặt dưới màu xanh nhạt, phiến lá hình thoi hẹp, dài khoảng 7 cm.
- 12 cm, rộng 1,5 - 2,5cm, có 5 - 6 đôi gân bên nổi rõ ở mặt dưới, mép lá không có răng Cuống lá dài khoảng 2 – 3 cm Các lá non ở ngọn có màu tía
Cụm hoa có hình dạng bông dài từ 2 đến 3cm, nằm ở đầu cành Lá bắc có màu xanh lục với kích thước khoảng 10 - 12mm x 4 - 6mm, được sắp xếp theo 4 hàng, bề mặt trên và mép lá bắc có lông.
Tiền diệp là một loại cây nhỏ với lá hẹp dài khoảng 1 cm, dính liền ở 1/3 phía dưới Hoa của cây có hình ống, màu tím nhạt, chiều dài ống khoảng 2 - 2,5 cm và phía trên chia thành 5 thùy ngắn gần bằng nhau.
Bộ nhị của hoa bao gồm 2 nhị dài khoảng 11 - 14mm và 2 nhị ngắn, với chỉ nhị có lông đính trên ống tràng Bao phấn có chiều dài từ 2 - 3mm, trong khi bộ nhụy có vòi dài khoảng 1,8 - 2cm và núm nhụy chia thành 2 phần, hình mũi mác dài 2 - 3mm Bầu nhụy ở trên với 2 ô có đường kính khoảng 1 - 1,2mm Hiện tại, chưa quan sát thấy quả và hạt.
Hình 1: Mô tả cây hoàn ngọc Hình 2 : Hoa hoàn ngọc
Hình 3: Rễ cây hoàn ngọc
II.1.2.3 Phân bố sinh thái
Cây này phân bố chủ yếu ở các nước như Việt Nam, Ấn Độ và Nam Trung Quốc, thường mọc tự nhiên ở vùng núi Trong những năm gần đây, người dân đã trồng cây này nhiều trong các hộ gia đình Đây là loại cây ưa ẩm và ánh sáng, sinh trưởng mạnh mẽ quanh năm Việc trồng cây rất đơn giản, có thể tạo cây mới bằng cách cắm hoặc giâm cành.
II.1.2.4 Thành phần hóa học [1], [2], [5], [6]
Stigmasterol là một sterol thực vật được chiết xuất từ dầu đậu nành và nhiều loại thực vật khác, với công thức phân tử C29H48O Hợp chất này có một nhóm -OH tại vị trí C3, hai nối đôi giữa C5 và C6, C22 và C23, cùng với hai nhóm -CH3 tại C10 và C13, và một chuỗi hidrocacbon -C10H19 tại C17 Ngoài ra, stigmasterol còn có thêm một nối đôi ở C22 và một nhóm metyl ở C24, với nhiệt độ nóng chảy là 170°C trong điều kiện thường.
Khối lượng phân tử: 414 đvC
Khối lượng phân tử: 576 đvC
- Chất lupeol được đánh giá là tác nhân có tiềm năng để điều trị căn bệnh ung thư tuyến tụy
Các nhà khoa học từ khoa y Đại Học Hồng Kông đã tiến hành thử nghiệm với lupeol trên chuột và phát hiện rằng lupeol có khả năng giảm số lượng tế bào ung thư ở vùng cổ và đầu, đồng thời ngăn chặn quá trình trao đổi chất xung quanh khối u Đặc biệt, lupeol hầu như không gây ra các phản ứng phụ nghiêm trọng đối với các tế bào lành mạnh ở các cơ quan nội tạng như gan và thận.
Lupenone có khả năng kháng cao đối với virus HSV-1 và HSV-2, loại virus đơn typ-1 gây ra mụn nước tái phát trên da, lợi, miệng, hàm và kết mạc Virus này cũng có thể dẫn đến viêm màng não và nhiễm khuẩn nội tạng ở trẻ sơ sinh, trong khi ở người lớn, nó gây viêm màng não cho 5-7% bệnh nhân.
* Betulin - một chất triterpene tự nhiên
Khoa học hiện đại đã chỉ ra rằng betulin có vai trò quan trọng trong việc chống lại bệnh sốt rét và viêm nhiễm, đồng thời là nguồn nguyên liệu quý giá để phát triển thuốc điều trị HIV - AIDS.
Các nhà khoa học tại đại học Minnesota của Mỹ và đại học Irkutsk của Nga đã phát hiện ra cơ chế ức chế hoạt động của HIV và độc tính của nó trên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau Nghiên cứu cho thấy betulin có khả năng ngăn chặn HIV thâm nhập vào tế bào.
T bằng cách phong tỏa gp41 - một protein tối thiểu cần thiết của HIV giúp cho virus truyền bệnh vào tế bào lành
Betulin có khả năng tiêu diệt nhiều loại tế bào ung thư bằng cách kích thích cơ chế phá hủy tế bào bệnh, đồng thời được chuyển hóa thành acid betulinic, một hợp chất quý hiếm có tác dụng ức chế khối u và HIV hiệu quả hơn so với một số thuốc hiện có Trong điều trị bệnh gan, betulinic được sử dụng để bảo vệ tế bào gan khỏi tổn thương do các tác nhân khác Ngoài ra, bệnh nhân điều trị bằng hóa trị hoặc xạ trị cũng được khuyến khích sử dụng sản phẩm chứa betulin Các thực phẩm chức năng có chứa betulin có khả năng tăng cường hệ miễn dịch cho những người sống trong môi trường ô nhiễm và giúp kéo dài tuổi thọ trong điều kiện bình thường.
Các nghiên cứu cho thấy acid pomolic (PA) có khả năng giải quyết vấn đề kháng thuốc (MDR) trong các khối u bằng cách ức chế các protein Bcl-2 và Bcl-xl, giúp tăng cường hiệu quả điều trị ung thư.
Ngoài các thành phần trên, cây hoàn ngọc còn chứa các thành phần khác như flavonoid, saponin, tannin, coumarine và các hợp chất vô cơ……
Cây hoàn ngọc được trồng chủ yếu lấy cả rễ, thân và lá Cây trồng khoảng 2 tháng là có thể dùng được
II.1.2.6 Tính vị và tác dụng dược lý của cây [9]
Toàn cây có vị chát và hơi nhớt, được sử dụng làm thuốc Lá già có vị đắng, trong khi lá non nhỏ không có mùi vị Vỏ và rễ của cây cũng mang hương vị tương tự như lá già.
Cây hoàn ngọc, được biết đến trong dân gian như một loại thuốc "kỳ diệu", có khả năng chữa trị nhiều bệnh như tiêu hóa kém, tiêu chảy, đau dạ dày, loét hành tá tràng, trĩ nội, táo bón, viêm thận, cầm máu, đau gan, xơ gan cổ trướng, và u xơ tuyến tiền liệt Ngoài ra, cây còn giúp điều chỉnh huyết áp, đường huyết, giải độc cho cơ thể, cải thiện giấc ngủ và phục hồi sức khỏe cho những người ốm yếu, suy nhược.
1.2.7.1 Trong y học dân gian
Cây hoàn ngọc đã được người dân truyền miệng và ứng dụng trong y học Tại Hà Nội, các dược sĩ, bác sĩ và lương y đã trồng và nghiên cứu cây này, chia sẻ kinh nghiệm tại các hội nghị và trên báo “Thuốc và Sức khỏe” số 101 ngày 1/2/1997.
Bệnh ung thư ở giai đoạn đầu có thể được quản lý bằng cách ăn uống hợp lý, với chế độ ăn 2 lần hoặc nhiều hơn trong ngày, tùy thuộc vào mức độ đau đớn Việc duy trì thói quen ăn uống thường xuyên giúp người bệnh tỉnh táo, ngủ ngon và giảm đau hiệu quả.
Bệnh gan thận như viêm gan, xơ gan và cổ trướng có thể được điều trị bằng cách ăn hai lần một ngày khi đói Ngoài ra, sử dụng lá khô tán bột hòa với cây tam thất theo tỷ lệ bằng nhau cũng là một phương pháp đặc trị cho xơ gan cổ trướng Đối với các bệnh viêm thận cấp hoặc mãn tính như suy thận và tiểu ra máu, chế độ ăn uống hợp lý cũng rất quan trọng.
2 lần Sau 15 ngày bệnh thuyên giảm rõ rệt
Các bệnh tiêu hóa như tiêu chảy, kiết lỵ, đau bụng và rối loạn tiêu hóa cần được điều trị bằng cách ăn từ 2-3 bữa mỗi ngày cho đến khi khỏi Nên nấu canh nhạt để dễ tiêu hóa, và trong trường hợp đau ruột thừa, có thể sử dụng 15 lá để giảm cơn đau sau hai giờ Tuy nhiên, sau khi giảm đau, cần đưa bệnh nhân đến bệnh viện để kiểm tra kịp thời.
Bệnh lý có triệu chứng chảy máu như chảy máu dạ dày, chảy máu mũi hay thổ huyết cần được chú ý Để hỗ trợ điều trị, nên ăn từ 2-4 lần mỗi ngày và có thể sắc thuốc uống hoặc nấu canh để bổ sung dinh dưỡng Các phương pháp này có tác dụng tương tự như Vitamin K.
Tiết niệu sinh dục: viêm bàng quang, đường tiết niệu, tiểu gắt, tiểu buốt, bị ngã, viêm sưng, ra máu bộ phận sinh dục
Các loại u bướu như u phổi và u sơ nhiếp hộ tuyến có thể cải thiện tình trạng ăn uống và giấc ngủ Đặc biệt, đối với u sơ nhiếp hộ tuyến, cần thực hiện điều trị đúng cách trong 10 ngày của hạ tuần trăng (từ ngày 20-30 âm lịch) và kéo dài trong 3 tuần trăng (30 ngày trong 3 tháng) để đạt hiệu quả tốt nhất.
Các bệnh viêm và loét như viêm loét dạ dày, tá tràng, đại tràng, trĩ nội và trĩ ngoại có thể tái phát nếu uống rượu trong vòng một tuần Để giảm đau răng và viêm lợi, có thể nhai lá với một chút muối và ngậm trong 5-10 phút Để điều chỉnh huyết áp, cần ổn định thần kinh bằng cách nghỉ ngơi sau bữa ăn khoảng 15 phút, và liên tục thực hiện trong 5-7 ngày để huyết áp trở lại bình thường Khi gặp rối loạn thần kinh thực vật, ăn lá vào buổi sáng và nằm yên sẽ giúp ổn định tình trạng vào buổi chiều hoặc hôm sau.
Để trị cảm cúm, cần chú ý đến việc nâng cao sức đề kháng và chăm sóc vết thương Triệu chứng cảm cúm thường bao gồm đau đầu và sốt, do đó nên ăn cháo nấu với lá để phục hồi sức khỏe, mỗi 2 giờ một lần sau khi sốt Đối với vết thương, nếu là vết thương kín, hãy nhai lá và đắp lên; nếu là vết thương hở, giã lá đắp và băng chặt lại Ngoài ra, có thể uống hoặc ăn để cầm máu, chống viêm nhiễm, vì lá có tác dụng như kháng sinh và cung cấp Vitamin K Đặc biệt, khi cảm thấy mệt mỏi hoặc muốn nâng cao sức chịu đựng trong tập luyện, nên ăn 5-7 lá trước 30 phút.
Trị bệnh cho súc vật như trâu, bò, chó, mèo, gà, vịt và chim bồ câu bằng cách cho ăn lá có thể giúp chữa tiêu chảy và động kinh, đồng thời kích thích tiêu hóa và tăng trưởng Đối với phụ nữ, việc sử dụng lá này không ảnh hưởng đến tuyến sữa Trẻ em cần phải giã lá để lấy nước uống.
Chữa trị các bệnh về đường tiêu hóa như đau bụng, quặn bụng, sôi bụng và đầy hơi không rõ nguyên nhân bằng cách ăn từ 7 đến 9 lá mỗi ngày, chia thành 2-3 lần Ngoài ra, có thể nấu canh từ lá để sử dụng.
Bệnh kèm theo chảy máu như chảy máu dạ dày, đường ruột, hoặc tiểu ra máu có thể được hỗ trợ bằng cách ăn lá khi chưa ăn gì Sắc nước lá để uống hoặc nấu canh với một lát nhỏ để sử dụng hai lần mỗi ngày.
Lá hoàn ngọc có khả năng cầm máu hiệu quả cho các vết thương; để sử dụng, bạn chỉ cần lấy lá tươi, rửa sạch, giã nát và đắp lên vết thương, sau đó băng chặt lại Đối với việc điều trị các bệnh đường ruột, có thể dùng hoàn ngọc đỏ với liều lượng từ 20 - 40g/ngày, hoặc phối hợp với các vị thuốc khác như hoàn ngọc đỏ 16g, nam mộc hương 12g, hậu phác 12g, trần bì 10g, và thương truật 10g, sắc uống một thang mỗi ngày trong vòng 3 tuần.
1.2.7.2 Trong đời sống
PHẦN THỰC NGHIỆM
II.2.1 Dụng cụ và hóa chất
- Máy cô quay chân không
II.2.2 Thu hái và xử lí mẫu
Lá hoàn ngọc được thu hái tại quận Ninh Kiều, Thành phố Cần Thơ, với tiêu chí chọn lựa lá già và lá non tươi, đảm bảo không có sâu bệnh hay nấm mốc.
Lá tươi được rửa sạch, cho vào tủ sấy ở nhiệt độ 50 0 C đến trọng lượng không đổi, sau đó đem xay nhỏ
Ghi chú : m t : khối lượng lá tươi m k : khối lượng lá khô Kết quả thu được sau 3 lần đo như sau:
Bảng 1: Kết quả đo độ ẩm
Khối lượng lá hoàn ngọc tươi (g)
Khối lượng lá hoàn ngọc khô (g) Độ ẩm A%
Vậy độ ẩm trung bình của lá hoàn ngọc là 82,14 %
II.2.3 Khảo sát sự hiện diện của các loại hợp chất tự nhiên có trong lá hoàn ngọc [11], [12]
II.2.3.1 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất alcaloid
Trong một erlen 250ml, cho vào 5g lá khô và 80ml dung dịch HCl 1%, ngâm dung dịch trong 4-6 giờ Sau đó lọc lấy dịch lọc làm mẫu thử
Một số loại thuốc thử dùng định tính:
Hòa tan I2 trong 10 ml H2O cất và KI trong 60 ml H2O cất Trộn đều hai hỗn hợp và thêm nước vào vừa đủ 100 ml
+ Thuốc thử Mayer: KI, HgCl2, H 2 O
Hòa tan HgCl 2 trong 60 ml H 2 O cất và KI trong 10 ml H 2 O cất Trộn đều hai hỗn hợp và thêm nước vào vừa đủ 100 ml
+ Thuốc thử Erdmann: H2SO 4 đặc, HNO 3 đặc, H 2 O Đong 20 ml H2SO4 đặc, sau đó nhỏ 10 giọt HNO3 đặc vào Cho từ từ hỗn hợp vào 100 ml nước cất, lắc đều
Cho 1ml dung dịch mẫu vào mỗi ống nghiệm, sau đó nhỏ từng loại thuốc thử vào thành ống nghiệm Lắc đều hỗn hợp và để yên Kết quả sẽ được coi là dương tính nếu
+ Thuốc thử Bouchardat: thuốc thử sẽ cho trầm hiện màu nâu với dung dịch có chứa alcaloid
+ Thuốc thử Mayer: thuốc thử sẽ cho trầm hiện màu cam với dung dịch có chứa alcaloid
+ Thuốc thử Erdmann: dung dịch chuyển từ màu đỏ sang màu đỏ tía
II.2.3.2 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất flavonoid Đun hoàn lưu 5g lá khô với 50ml ethanol 98 0 trong 30 phút, lọc lấy dịch lọc làm mẫu thử
Lấy 1ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt HCl đậm đặc và một ít bột Mg, sau đó lắc đều Nếu dung dịch chuyển sang màu đỏ, có thể xác định sự hiện diện của flavonoid.
II.2.3.3 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất Sterol
Ngâm 1g lá khô với 20ml CHCl 3 trong 2 giờ Sau đó lọc lấy dịch lọc làm mẫu thử
Một số loại thuốc thử dùng định tính:
H2SO4 đặc + Thuốc thử Salkowski:
Cho vào mỗi ống nghiệm 2ml dung dịch mẫu Nhỏ từ từ theo thành ống nghiệm từng loại thuốc thử và quan sát Các kết quả dương tính nếu:
+Thuốc thử Libermann- Burchard: xuất hiện vòng có màu hồng đến màu xanh dương
+Thuốc thử Salkowski: Lớp dịch CHCl3 có màu xanh hoặc nâu đỏ
II.2.3.4 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất Saponin Đun cách thủy 5g lá khô với 50ml ethanol 70 0 trong 5 phút rồi lọc Cô cạn dưới áp suất kém đến cặn khô Cặn khô dùng làm mẫu thử
Cho mẫu thử vào ống nghiệm Hòa tan mẫu bằng 1ml acetic anhydride, thêm từ từ 0,3 – 0,5ml H2SO 4 đặc Nếu xuất hiện vòng ngăn cách :
+ Có màu hồng đến đỏ tím thì sơ bộ nhận định có saponin triterpene
+ Có màu xanh lá cây thì sơ bộ nhận định có saponin steroid
II.2.3.5 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất Tanin Đun sôi 5g lá khô với 100ml nước cất trong 10 phút Lọc lấy dịch lọc làm mẫu thử
Để kiểm tra sự hiện diện của tanin, lấy 2ml dịch lọc cho vào ống nghiệm và thêm 2ml dung dịch FeCl3 1% Nếu dung dịch chuyển sang màu xanh đen hoặc lục đen, có thể sơ bộ nhận định rằng có tanin trong mẫu.
+ Lấy 2ml dịch lọc cho vào ống nghiệm , thêm 2ml dung dịch nước Br2 ( dd Br2
3%) Xuất hiện kết tủa màu nâu đậm thì sơ bộ nhận định có tanin
II.2.3.6 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất Coumarine Đun hoàn lưu 5g lá khô trong 50ml ethanol 98 0 trong 30 phút Lọc lấy dịch lọc làm mẫu thử
+ Phản ứng mở vòng lacton
Cho 2ml dịch lọc vào mỗi ống nghiệm, sau đó thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10% vào một ống Đun nóng cả hai ống trên bếp cách thủy đến khi sôi, sau đó để nguội và thêm 4ml nước cất vào mỗi ống Kết quả sẽ dương tính nếu
+ Ống nào không có kiềm sẽ đục hơn ống có kiềm
+ Sau đó cho vào ống có kiềm vài giọt HCl đậm đặc, xuất hiện kết tủa hoặc dung dịch đục
Để kiểm tra mẫu, cho vào hai ống nghiệm mỗi ống 2ml dung dịch mẫu Sau đó, thêm vào một trong hai ống 2ml dung dịch Na2CO3 10% và 4ml nước cất Nếu dung dịch trong ống chuyển sang màu đỏ thẫm, kết quả sẽ được coi là dương tính.
Bảng 2: Tóm tắt sự hiện diện của các hợp chất tự nhiên có trong lá hoàn ngọc
Hợp chất tự nhiên Thuốc thử Phản ứng màu Kết quả Hình
Màu từ đỏ sang đỏ tía
FLAVONOID Mg/ HCl đặc Dung dịch màu đỏ + 6
Có vòng màu xanh dương Lớp dịch CHCl3 có màu nâu đỏ
SAPONIN Libermann-Burchard Có vòng màu đỏ tím
Có vòng màu xanh lá cây
Dung dịch chuyển màu xanh đen
Kết tủa màu nâu đậm
Na2CO3 10% và nước cất Ống không có kiềm đục hơn ống có kiềm
Dung dịch chuyển màu đỏ thẫm
Cây hoàn ngọc chứa nhiều hợp chất hữu cơ quan trọng như steroid, flavonoid, alcaloid, saponin, tanin và coumarine, theo khảo sát sơ bộ về thành phần hóa học của nó.
Các thành phần khác như: glycoside, acid hữu cơ, carotenoid… vẫn chưa được khảo sát
Một số hình ảnh thu đƣợc khi khảo sát sự hiện diện của các loại hợp chất tự nhiên có trong lá hoàn ngọc:
Hình 6: Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất flavonoid
Hiện tượng xảy ra: dung dịch có màu đỏ Kết luận: có thể có nhóm flavonoid
Hình 7a: Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất sterol
Hiện tượng xảy ra: có vòng màu xanh dương
Kết luận: có thể có nhóm sterol
Hình 7b: Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất sterol
Hiện tượng xảy ra: lớp dịch CHCl3 có màu xanh
Kết luận: có thể có nhóm sterol
Hình 8: Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất saponin
Hiện tượng xảy ra: xuất hiện vòng có màu đỏ tím
Kết luận: có thể có nhóm saponin triterpene
Hình 9: Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất tanin
Hiện tượng xảy ra: dung dịch chuyển màu xanh đen
Kết luận: có thể có nhóm tanin
Hình 10: Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất coumarin
Hiện tượng xảy ra: ống không có kiềm đục hơn ống có kiềm Kết luận: có thể có nhóm coumarin
II.2.4 Quy trình điều chế các loại cao:[11]
Tách riêng các hợp chất có tính phân cực khá
- Ngâm dầm với ethanol trong 7 ngày
- Cô cạn dưới áp suất thấp
Chiết kiệt với ether dầu hỏa
Cô cạn dưới áp suất thấp
Cô cạn dưới áp suất thấp Chiết kiệt với ethyl acetate
II.2.5 Quy trình tách chiết riêng các sterol, triterpene ra khỏi cao ether dầu hỏa và cao ethyl acetate: [11]
- 3052,88g lá tươi và 742,5g nhánh tươi rửa sạch cho vào tủ sấy ở 50 0 C đến trọng lượng không đổi, xay nhỏ được 594,16g bột
- Cho bột vào túi vải, ngâm bột trong ethanol 7 ngày, cô cạn dưới áp suất thấp được 36,77g cao ethanol
- Thực hiện phương pháp chiết lỏng- lỏng cao ethanol với ether dầu hỏa thu được cao ether dầu hỏa
- Phân lập các chất từ dịch chiết cao ether dầu hỏa:
Perform column chromatography using 4g of high-purity petroleum ether and 80g of silica gel, employing solvent mixtures of petroleum ether and ethyl acetate for elution Monitor the column chromatography process with thin-layer chromatography (TLC), utilizing a solvent system of acetone and petroleum ether in a 1:9 ratio, and visualize the spots with a 20% sulfuric acid reagent.
- Bã cao chiết còn lại khi chiết cao ethanol với ether dầu hỏa được tiếp tục chiết lỏng- lỏng với ethyl acetate thu được cao ethyl acetate
- Phân lập các chất từ dịch chiết cao ethyl acetate:
Perform column chromatography using 4g of ethyl acetate and 80g of silica gel, employing a solvent mixture of petroleum ether and ethyl acetate Monitor the column chromatography process with thin-layer chromatography (TLC) using a solvent system of acetone and petroleum ether (1:9), and visualize the spots with 20% H2SO4.
II.2.6 Kết quả sắc kí cột
II.2.6.1 Kết quả sắc kí cột trên cao ether dầu hỏa : [12]
Sắc ký cột silicagel sử dụng 4g cao ether dầu hỏa đã cho ra 17 phân đoạn, và kết quả của quá trình này được tóm tắt trong bảng 3.
Bảng 3: Kết quả sắc ký cột silicagel của cao chiết ether dầu hỏa:
Dung môi giải ly Thể tích dung môi
Sắc ký lớp mỏng Ghi chú
32-41 H6 E:EtOAc(90:10) 400ml 0,21 3 vết nâu, tím, vàng Khảo sát 42-46 H7 E:EtOAc(90:10) 200ml 0,17 1 vết nâu Khảo sát
125-147 H16 E:EtOAc(60:40) 700ml 0,28 Vết nâu dài
Ghi chú : E: ether dầu hỏa
Kết quả sắc ký cột silicagel từ 4g cao chiết xuất trong dung môi ether dầu hỏa đã tạo ra 17 phân đoạn Sau khi khảo sát, phân đoạn H6 với hệ dung môi ether đã được xác định là có tiềm năng đáng chú ý.
Sau khi cạn dung môi hai phân đoạn và rửa cặn bằng methanol, chúng tôi đã tiến hành kết tinh trong dichloromethane, thu được 45,9mg tinh thể hình kim màu trắng Sắc ký bản mỏng silicagel với hệ dung môi acetone: ether dầu hỏa (1:9) và sử dụng thuốc thử H2SO4 20% đã cho một vết màu nâu đen với Rf = 0,36 Sản phẩm này được đặt tên là HN1.
II.2.6.2 Nhận danh xác định cấu trúc hợp chất: [2]
Phổ hồng ngoại( IR): ,cm -1 : cho một số mũi dao động hóa trị đặc trưng như sau: 3428 (ứng với dao động của nối O-H), 2936 (ứng với dao động của -CH2), 2868,
2362, 1642 (ứng với dao động nối C=C) 1463 và 1378 (ứng với dao động của C-H),
Dựa trên các kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR), dữ liệu phổ IR của HN1 cho thấy sự tương đồng rõ rệt với phổ IR của chất S trong nghiên cứu của tác giả Huỳnh Kim Diệu về thành phần hóa học của lá xuân hoa (Pseuderanthemum palatiferum).
Bảng 4 : So sánh dữ liệu phổ IR của HN1 và S:
Dựa vào kết quả trên sơ bộ cho thấy HN1 là hỗn hợp của stigmasterol (C 29 H 48 O) và sitosterol (C 29 H 48 O) có công thức hóa học như sau ( hình 11):
Hình 11: Cấu trúc hóa học của Stigmasterol và Sitosterol
Kết quả nghiên cứu này phù hợp với phát hiện của Giang và cộng sự (2003) cũng như Trần Công Khánh và cộng sự (1998), khi họ đã xác định sự hiện diện của -sitosterol trong lá xuân hoa trồng tại miền Bắc.
