133 Chương VI THAY ĐỔI TRÌNH TỰ AMINO ACID VÀ ÁI LỰC CỦA TRICHOBAKIN TÁI TỔ HỢP VÀ CÁC DẪN XUẤT ĐỐI VỚI CM-SEPHAROSE Chương V giới thiệu với kết thiết kế tạo số dạng protein lai tái tổ hợp sở trình tự gen mã hóa cho Trichobakin (TBK) gồm hai dạng chính: (i) biến đổi trình tự amino acid đầu amino (đầu N) tạo protein lai PBL-2 (ATFTBK), PBL-3 (GnRH-TBK), PBL-5 (TGF-TBK) (ii) biến đổi đầu carboxyl (đầu C) trường hợp PBL-4 (mini-TBK) Các dẫn xuất TBK biểu E coli xác định, tinh chế Chương VI trình bày số kết nghiên cứu thay đổi cấu trúc bậc TBK dẫn xuất số đặc tính hóa lý khối lượng phân tử, pI lực protein tái tổ hợp CM-Sepharose 6.1 Mức độ biểu TBK dẫn xuất Để biểu protein, vector biểu tái tổ hợp sau thiết kế (pQV, pGnRH-TBK, puPA-TBK pMTBK), biến nạp vào chủng vi khuẩn E coli BL21(DE3) nuôi cấy môi trường LB lỏng có cảm ứng IPTG Các mẫu tế bào thu thời điểm 0, 1, 2, sau cảm ứng Dịch chiết protein tổng số mẫu tế bào phân tích SDS-PAGE Kết điện di SDS-PAGE cho thấy, dịch chiết protein tổng số mẫu tế bào thu thời điểm khác sau cảm ứng IPTG, có xuất băng protein có trọng lượng phân tử phù hợp với kết tính toán lý thuyết trường hợp cụ thể Để khẳng định mức độ biểu trên, phản ứng Western blot tiến hành, kiểm tra với tất mẫu biểu với kháng thể kháng TBK Các clone biểu 134 Phan Văn Chi, Nguyễn Bích Nhi cho kết dương tính, điều cho thấy thu protein tái tổ hợp mong muốn (Phan Van Chi et al, 2001a; Lê Thị Bích Thảo et al, 2002; Đặng Thành Nam et al, 2003; Lê Thị Bích Thảo et al, 2003, 2007) Tế bào E coli chủng BL21(DE3) chứa vector biểu pQV, pGnRH-TBK, puPA-TBK pMTBK chứng minh có khả biểu protein ổn định, tiếp tục sử dụng làm đối tượng nghiên cứu Để thu protein tái tổ hợp dạng tan, đồng thời xây dựng quy trình tinh sạch, nhằm phục vụ cho nghiên cứu việc xác định điều kiện biểu thích hợp cần thiết Trong phạm vi nghiên cứu mình, tiến hành khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ tới biểu protein tái tổ hợp dạng tan Sự biểu loại protein nói tiến hành khảo sát 22, 30 37oC Tế bào nuôi cấy môi trường LB lỏng bình tam giác giống nhau, lắc 200 vòng/phút 37oC, A600nm đạt 0.4-0.6 tiến hành cảm ứng IPTG (nồng độ cuối 0.4 mM) Sinh khối tế bào thời điểm khác 1, 2, 3, qua đêm (16 giờ) thu lại ly tâm xử lý mô tả phần phương pháp để tách riêng phần cặn Protein tổng số thu phần cặn kiểm tra điện di SDS-PAGE gel polyacrylamide 12.5% Từ kết thu cho thấy, tất điều kiện khảo sát, protein biểu ổn định Không thấy có khác biệt động học biểu độ tan chúng, điều kiện thay đổi nhiệt độ tốc độ lắc trình nuôi cấy vi khuẩn 6.2 Ái lực Trichobakin dẫn xuất CMSepharose Để phục vụ cho tinh chế nghiên cứu tiếp theo, trình biểu protein tái tổ hợp nói tiến hành 22oC qua đêm (16 giờ) Sau biểu hiện, sinh khối tế bào TBK dẫn xuất thu lại phá siêu âm đệm 50 mM TrisHCl pH 7.0 có chứa 20 mM EDTA, Triton X-100 0,1%, lysozyme 100 μg/ml Huyễn dịch tế bào ly tâm 10 000 vòng/phút 20 phút, để tách riêng phần cặn Phần nạp thẳng vào cột CM-Sepharose (XK-16/20) hệ FPLC (Pharmacia-Biotech) quy trình tinh chế tiến hành Chương VI Thay ₫ổi trình tự amino acid lực Trichobakin tái tổ hợp … 135 Hình 6.1 Sắc ký đồ tinh chế protein tái tổ hợp hệ thống FPLC (Pharmacia-Biotech) sở cột trao đổi ion CMSepharose (Đặng Thành Nam et al, 2003) Phần dịch tế bào sau siêu âm ly tâm nạp thẳng vào cột CM-Sepharose (XK16/20) hệ FPLC (Pharmacia-Biotech) Các tạp chất rửa đệm 50 mM Tris-HCl pH 7.0 A280nm trở lại đường Protein tái tổ hợp khỏi cột gradient nồng độ 0.0-0.4 M NaCl đệm 50 mM Tris-HCl pH 7.0 với tốc độ dòng chảy 30 ml/giờ kích thước phân đoạn ml A Tách hỗn hợp mini-TBK (I) PBL-3(II); B Tinh chế mini-TBK; C: Tinh chế PBL-3 Phan Văn Chi, Nguyễn Bích Nhi 136 mô tả Chương V Protein đích giữ cột, protein khác tạp chất bị rửa trôi khỏi cột đệm 50 mM TrisHCl có pH 7.0 A280nm trở lại đường Protein tái tổ hợp khỏi cột gradient nồng độ 0.0-0.4M NaCl đệm 50 mM Tris-HCl pH 7.0 với tốc độ dòng chảy 30 ml/giờ kích thước phân đoạn ml Bằng kết thực nghiệm cho thấy loại protein tái tổ hợp có độ bám dính giải phóng khỏi cột trao đổi ion gradient nồng độ NaCl khác tổng kết Bảng 6.1 Trên Hình 6.1 ví dụ điển hình trình tinh chế không hỗn hợp PBL-3 với mini-TBK, mà trường hợp PBL-3 mini-TBK riêng biệt Kết cho thấy, hai loại protein khỏi cột CM-Sepharose nồng độ NaCl khác Điều chứng tỏ có tương quan khác biệt rõ ràng hai giá trị pI chúng với lực CM-Sepharose Tuy nhiên, trường hợp PBL-2 lại thấy có tương ứng Với giá trị pI 9.01 protein lại có số lực với CMSepharose tương đương TBK mini-TBK (0.16 M NaCl) Từ kết nghiên cứu cho thấy, thay đổi trình tự bậc cách thêm bớt số amino acid đầu amino carboxyl dẫn đến thay đổi số đặc tính lý hóa protein, kể pI không làm thay đổi khả biểu Trichobakin hệ pET E coli Tuy nhiên, số liệu tinh chế protein cho thấy, lực số dạng protein tái tổ hợp CM-Sepharose không hoàn toàn tương ứng với giá trị pI Trong trường hợp này, có thể, biến đổi thành phần amino acid làm biến đổi cấu trúc không gian protein tái tổ hợp Bảng 6.1 Một số đặc tính TBK dẫn xuất (Đặng Thành Nam et al, 2003) Đặc tính TBK Số lượng amino acid MW (Da) pI Ái lực với CM-Sepharose PBL-2 PBL-3 Mini-TBK 247 269 271 240 27198.95 29687.76 29880.96 26401.06 9.28 9.01 9.32 9.14 %B 40 40 50 40 NaCl (M) 0.16 0.16 0.2 0.16 Chương VI Thay ₫ổi trình tự amino acid lực Trichobakin tái tổ hợp … 137 137 Chương VII NHẬN DẠNG, XÁC ĐỊNH TBK TÁI TỔ HỢP VÀ CÁC DẪN XUẤT TRÊN HỆ KHỐI PHỔ MALDITOF MS VÀ MS/MS Bên cạnh việc xác định protein lai tái tổ hợp nhận phương pháp Western – blotting sử dụng kháng thể kháng TBK, để đưa chứng có tính khoa học xác thực hơn, chương trình bày số kết nghiên cứu nhận dạng, khẳng định biến đổi trình tự TBK dẫn xuất phương pháp khối phổ liên tục MALDI-TOF MS/MS (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight) hệ thống QSTAR XL (MDS Sciex, Toronto, Canada) Các protein lai tái tổ hợp TBK, PBL-2, PBL-3, PBL-4 PBL-5 dạng tinh chế dùng để xác định, nhận dạng Các phân đoạn sử dụng phân tích xác định có độ tinh cao (95% - 99%) có nồng độ khoảng 0.8 mg/ml đến 1.0 mg/ml 7.1 Nhận dạng xác định TBK Theo nguyên lý MALDI, tác dụng chùm xung laser, phân tử matrix (α-cyano-4-hydrocycinamic acid, HCCA) hay 3,5-dimethoxy-4-hydroxycinamic acid (sinapinic acid-SA) nhanh chóng phân li proton Những proton làm thăng hoa ion hóa phân tử protein/peptide kết tinh matrix Do khối lượng protein thấp nằm khoảng có khả xác định (700 Da - 35000 Da), chiến lược phân tích, xác định TBK dẫn xuất xác định sau Phan Văn Chi, Nguyễn Bích Nhi 138 a b d c Hình 7.1 Nhận dạng xác định TBK phương pháp khối phổ MALDI-TOF MS MS/MS (Đặng Thành Nam et al, 2003) a: Giá trị m/z Trichobakin tái tổ hợp tinh xác định 27328,60 amu; b: Phổ TOF-MS Trichobakin sau thủy phân trypsin Peptide có kích thước 2168,22 amu chọn để xác định MS/MS; c: Phổ MS/MS trình tự amino acid peptide 2168,22 amu cho thấy peptide thứ hai từ đầu C Trichobakin sau bị thủy phân trypsin; d: Kết tìm so sánh với liệu NCBI chương trình Mascot Trichobakin đứng đầu bảng với điểm số (score) cao (128) danh sách protein tìm Chương VII Nhận dạng, xác ₫ịnh TBK tái tổ hợp dẫn xuất … 139 Đầu tiên, phổ protein tinh sạch, nguyên dạng ghi phần TOF thiết bị Với TBK, phổ MALDI-TOF MS cho phép xác định protein có giá trị m/z 27328.60 amu (Hình 7.1a) Nếu tính giá trị m/z thể theo công thức m/z = (MW + nH+)/n, m/z tỷ lệ khối lượng điện tích, MW phân tử lượng protein, n điện tích ion H khối lượng proton (1.008 Da), khối lượng phân tử TBK tương đương với kết lý thuyết tính theo trình tự protein (monoisotopic mass: 27313,24 Da) Tiếp theo, protein thủy phân trypsin để xác định phổ hỗn hợp peptide theo điểm cắt hạn chế đặc hiệu đầu C lysine (K) arginine (R) Kết thu Hình 7.1b cho thấy, hầu hết peptide sau thủy phân ghi rõ nét phù hợp với kết phân tích lý thuyết điểm cắt theo trình tự TBK Khi sử dụng toàn phổ hỗn hợp peptide thu để tìm kiếm sở liệu NCBI, kết cho thấy protein tìm có số điểm cao (128) TBK Để khẳng định thêm kết tìm kiếm này, peptide có giá trị m/z 2169.22 amu lựa chọn để phân tích phổ MS/MS trình tự amino acid Kết ghi phổ MS/MS peptide 2169.22 thể rõ nét đặc trưng Hình 7.1c Sử dụng chương trình tìm kiếm Mascot khẳng định peptide phân tích peptide thứ hai từ đầu C TBK sau bị thủy phân trypsin, gồm 21 amino acid: VTITNVDAGVVTSNIALLPNR Đây peptide chứa điểm khác biệt trình tự amino acid (P) so với RIPs nhóm khác Kết tìm kiếm Mascot (Hình 7.1d) sử dụng phổ 7.2 Nhận dạng xác định PBL-2 PBL-2 protein lai thiết kế sở trình tự TBK đoạn peptide có nguồn gốc từ urokinase-type plasminogen activator người (Lê Thị Bích Thảo et al, 2003; Hà Văn Huân et al, 2003) có khối lượng phân tử xác định giá trị m/z Hình 7.3a Cũng tương tự trường hợp dẫn xuất TBK, hỗn hợp peptide sau thủy phân trypsin cho thấy phổ TOF-MS có peptide tương đồng với peptide TBK Bởi dựa riêng vào liệu phổ TOFMS để tìm kiếm theo chương trình MASCOT thu kết tương tự TBK Tuy nhiên, chọn peptide có giá Phan Văn Chi, Nguyễn Bích Nhi 140 trị m/z 1788,15 amu (Hình 7.2b) để xác định MS/MS kết cho biết mảnh cắt (thủy phân trypsin) từ đoạn peptide chọn để thiết kế protein lai tái tổ hợp Đây peptide thứ hai từ đầu N protein đánh dấu theo thứ tự phân cắt trypsin Mảnh peptide có trình tự xác định hoàn toàn phù hợp với kết phân tích theo Mascot: Y F S N I H W C N D V S F R a b Hình 7.2 Nhận dạng xác định PBL-2 phương pháp khối phổ MALDI-TOF MS/MS (Đặng Thành Nam et al, 2003) a Giá trị m/z PBL-2 tái tổ hợp tinh xác định 29691,22 amu; b Phổ TOF-MS PBL-2 sau thủy phân trypsin Peptide có giá trị m/z 1788,15 amu chọn để xác định MS/MS trình tự amino acid peptide 1788.15 cho thấy peptide đầu N PBL-2 sau bị thủy phân trypsin Bằng phương pháp đo phổ MALDI-TOF MS hệ QSTAR XL (MDS Sciex, Toronto, Canada) xác định protein tái tổ hợp TBK, PBL-2 PBL-3 với giá trị m/z tương ứng 27328.60 amu; 29889.44 amu 29691.22 amu Số liệu trùng lặp với số liệu lý thuyết thu qua chương trình xác định khối lượng peptide (http://us.expasy.org/ tools/peptideamass.html) Để nhận dạng xác định TBK dẫn xuất tiến hành ghi sử dụng ảnh phổ TOF-MS hỗn hợp peptide sau thủy Chương VII Nhận dạng, xác ₫ịnh TBK tái tổ hợp dẫn xuất … 141 phân trypsin phổ MS/MS peptide thứ hai từ đầu C (peptide 2168,22) để so sánh với sở liệu NCBI qua chương trình MATRIX SCIENCE MASCOTTM V1.8 Các dẫn xuất TBK sau thủy phân trypsin phân biệt rõ ràng với TBK phổ MS/MS peptide thay đổi trình tự amino acid đầu N thiết kế: Peptide 1531.70 PBL-2, peptide 1788.15 PBL-3 7.3 Nhận dạng xác định PBL-3 Chiến lược nhận dạng xác định protein PBL-3 tiến hành tương tự TBK Hình 7.3a cho thấy phổ TOF-MS PBL-3 tinh nguyên dạng với giá trị m/z 29889.44 amu Hình 7.3b phổ TOF-MS hỗn hợp peptide sau thủy phân trypsin Mặc dù có khác biệt cường độ (tính theo trục tung), hình thấy peptide giống (theo trục a b Hình 7.3 Nhận dạng xác định PBL-3 phương pháp khối phổ MALDI-TOF MS/MS (Đặng Thành Nam et al, 2003) a Giá trị m/z PBL-3 tái tổ hợp tinh xác định 29889,44 amu; b Phổ TOF-MS PBL-3 sau thủy phân trypsin Peptide có giá trị m/z 1531,70 chọn để xác định MS/MS trình tự amino acid peptide 1531.70 cho thấy peptide đầu N PBL-3 sau bị thủy phân trypsin 234 Phan Văn Chi, Nguyễn Bích Nhi 544 Wang P and Tumer NE (1999) Pokeweed antiviral protein cleaves double-stranded supercoiled DNA using the same active site required to depurinate rRNA Nucleic Acids Res 27: 1900-1905 545 Wang QC, Ying WB, Xie H, Zhang ZC and Ling LQ (1991) Trichosanthin-monoclonal antibody conjugate specifically cytotoxic to human hematoma cells in vitro Cancer Res 51: 3353-3355 546 Wang Y (2001) The role and regulation of urokinase-type plasminogen activator receptor gen expression in cancer invation and metastasis Med Res Rev 21(2): 146-170 547 Wang Y, Qian RQ, Gu ZW, Jin SW, Zhang LQ, Xia ZX Tian GY and Ni CZ (1986) Sientific evaluation of Tian Hua Fen (THF)- history, chemistry and application Pure Appl Chem 58: 789-798 548 Wang YX, Jacob J, Wingfield PT, Palmer I, Stahl SJ, Kaufman JD, Huang PL, Huang PL, Lee-Huang S, Torchia DA (2000) Anti-HIV and anti-tumor protein MAP30, a 30 kDa single-strand type-I RIP, shares similar secondary structure and beta-sheet topology with the A chain of Ricin, a type-II RIP Protein Sci 9(1): 138-144 549 Weaver M, Laske DW (2003) Transferrin receptor ligandtargeted toxin conjugate (Tf-CRM107) for therapy of malignant gliomas J Neurooncol 65: 3-13 550 Weber FW, Floeth F, Asher A (2003) Local convection enhanced delivery of IL4-Pseudomonas exotoxin (NBI-3001) for treatment of patients with recurrent malignant glioma In: Westphal M, Tonn JC, Ram Z, eds Local Therapies for Glioma: Present Status and Future Developments Vienna, Austria: Springer-Verlag Wien: 93-103 551 Weisdorf D, Filipovich A, McGlave P, Ramsay N, Kersey J, Miller W, Blazar B (1993) Combination graft-versus-host disease prophylaxis using immunotoxin (anti-CD5-RTA [xomazyme-CD5] plus methotrexate and cyclosporine or prednisone after unrelated donor marrow transplantation Bone Marrow Transpl 12:531–536 Tài liệu tham khảo 235 552 Weissman AM, Harford JB, Svetlik PB, Leonard WL, Depper JM, Waldmann TA, Greene WC, Klausner RD (1986) Only high-affinity receptors for interleukin mediate internalization of ligand Proc Natl Acad Sci USA 83: 1463-1466 553 Wels W, Beerli R, Hellmann P, Schmidt M, Marte BM, Kornilova ES, Hekele A, Mendelsonhn J, Groner B, Hynes NE (1995) EGF receptor and p185(erB-2)-specific singlechain antibody toxins differ in their cell-killing activity on tumor cells expressing both receptor proteins Int J Cancer 60: 137-144 554 Wesche J, Rapak A, Olsnes S (1999) Dependence of Ricin toxicity on translocation of the toxin A-chain from the endoplasmic reticulum to the cytosol J Biol Chem 274: 34443-34449 555 Williams DP, Wen Z, Watson RS, Boyd J, Strom TB, Murphy JR (1990) Cellular processing of the interleukin-2 fusion toxin DAB486-IL-2 and efficient delivery of diphtheria fragment A to the cytosol of target cells requires Arg 194 J Biol Chem 265: 20673-20677 556 Williams DP, Parker K, Bacha P, Bishai, Borowski, Genbauffe, Stron TB, Murphy JR (1987) Diphtheria toxin receptor binding domain substitution with interleukin-2: genetic construction and properties of a diphtheria toxinrelated interleukin-2 fusion protein Protein Eng 1: 493-498 557 Wilson BA, Blanke SR, Reich KA, Collier RJ (1994) Activesite mutations of diphtheria toxin Tryptophan 50 is a major determinant of NAD affinity J Biol Chem 269: 23296-23301 558 Winkler U, Barth S, Schnell R, Diehl V, Engert A (1997) The emmerging role of immunotoxin in leukemia and lymphoma Ann Oncol (Suppl 1): 139-146 559 Woo JH, Liu YY, Stavrou S, Neville DM (2004) Increasing secretion of a bivalent anti-T-cell immunotoxin by Pichia pastoris Appl Environ Microbiol 70: 3370-3376 560 Wu S, Lu X, Zhu Y, Yang J, Dong Y (1998) N-glycosidase mechanism of Trichosanthin Science China 41: 174-180 236 Phan Văn Chi, Nguyễn Bích Nhi 561 Wu ZH, Nie HL, Lu B et al (2000) Activation of G protein on the membrane of TCS-sensitive cells Shi Yan Sheng Wu Xue Bao 32(2): 151-156 562 Xia ZX, Zhang ZM, Dong YC (1993) The three dimentional structure of Trichosanthin refined at 2.7 A resolution Chi J Chem 11: 280-288 563 Xiong JP, Xia ZX, Wang Y (1997) Crystal structure of the complex of Trichosanthin with NADPH at 0.172 nm resolution Clin J Chem 15: 265-277 564 Xiong JP, Xia ZX, Wang Y (1994) Crystal structure of Trichosanthin-NADPH complex at 1.7 A resolution reveals active-site architecture Nat Struct Biol 1(10): 695-700 565 Yamaizumi M, Mekada E, Uchida T, Okada Y (1978) One molecule of diphteria toxin fragment A introduced into a cell can kill the cell Cell 15: 245-250 566 Yang J, Wu S, Dong Y (1994) Crystal structure of complex of TCS with FMP Acta Biophys 10: 537-542 567 Yao QZ, Yu MM, Ooi LS, Ng TB, Chang ST, Sun SS, Ooi VE (1998) Isolation and characterrization of a type I ribosome-inactivating protein from fruiting bodies of the edible mushroom (Volvariella volcacea) J Agric Food Chem 46(2): 788-792 568 Ye XY and Ng TB (2002) A novel peptide with ribonuclease and translation-inhibitory activities from fruiting bodies of the oyster mushroom Pleurotus ostreatus J Pept Sci 8: 235-240 569 Zarling JM, Moran PA, Haffar O, Sias J, Richman DD, Spina CA, Myers DE, Kuebelbeck V, Ledbetter JA and Uckun FM (1990) Inhibition of HIV replication by pokeweed antiviral protein targeted to CD+ cells by monoclonal antibodies Nature 347: 92-95 570 Zhang CY, Gong, YX, Ma H, An CC, Chen DY (2001) Reactive oxygen species involved in Trichosanthin-induced apotois of human choriocarcinoma cells Biochem J 355(Pt3): 653-661 Tài liệu tham khảo 237 571 Zhang CY, Gong YX, Ma H, An CC, Chen DY (2000) Trichosanthin induced calcium-dependent genration of reactive oxygen species in human choriocarcinoma cells Analyst 125(9): 1539-1544 572 Zhong RK, van De Winkel JG, Thepen T, Schultz LD, Ball ED (2001) Cytotoxicity of anti-cd64-Ricin a chain immunotoxin against human acute myeloid leukemia cells in vitro and in SCID mice J Hematother Stem Cell Res 10: 95-105 573 Zhou KJ, Fu ZJ, Chen MH, Lin YZ, Pan KZ (1994) Structure of Trichosanthin at 1.88 A resolution Proteins 19: 4-13 574 Zhou X, Li XD, Yuan JZ, Tang ZH, Liu WY (2000) Toxicity of cinnamomin-a new type II ribosome-inactivating protein to bollworm and mosquito Insect Biochem Mol Biol 30(3): 259-264 575 Zhu F, Jia S, Xing G, Gao L, Zhang L, He F (2001) cDNA transfection of amino-terminal fragment of urokinase effiently inhibits cancer cell invasion and metastasis DNA Cell Biol 20(5): 297-305 239 INDEX Adenine Polynucleotide Glycosylase, tr 73 American Type Culture Collection, ATCC, tr 60 Amino Terminal Fragment, ATF, 35, 111 Antioxydant, tr 72 Apoptosis, tr 2, 12-15; 72; 103-107 ATF-TBK, PBL-2, 107-115; 133, 136-140, 149-155; 158-168 Bacillus subtilis, tr 96 BamHI, tr 49, 81-84; 108-110, 117, 118, 120, 122, 123, 128, 129 cl-2, tr 14, 104 Beta vulgaris, tr 67 Bệnh liệt não tủy dị ứng, tr 39 Bệnh Luput ban đỏ, tr 39 Bệnh Lymphoma Hodgkin, tr 2, 38 Bệnh Lymphoma non-Hodgkin (non-Hodgkin lymphoma, NHL), tr 1, 2, 21, 22, 26, 28, 29, 30, 38, 39 Bệnh Leukemia cấp dòng lympho, acute lymphoblastic leukemia, LL, tr 27, 30 Bệnh Leukemia cấp dòng lympho tế bào T, T-cell acute ymphoblastic leukemia, T-ALL, tr 27 Bệnh Leukemia cấp dòng tủy, acute myelogenous leukemia, AML, tr 2, 27, 29, 30 Bệnh Leukemia dòng bạch cầu hạt mãn, chronic lymphocyte leukemia, CLL, tr.17, 22-24, 26, 29, 30 Bệnh Leukemia mãn dòng tủy, chronic myelogenous leukemia, ML, tr 27 Bệnh Leukemia tế bào T trưởng thành, adult T-cell leukemia, ATL, r.20, 23 240 Phan Văn Chi Nguyễn Bích Nhi Bệnh Leukemia tế bào tóc, hairy cell leukemia, HCL, tr 23, 24, 29, 30 Bệnh Lymphoma tế bào T da, cutaneous T-cell lymphoma, TCL, tr 20, 21, 29, 30 Bệnh thải ghép, Graft versus Host Disease, GvHD, tr 6, 36, 38, 45, 46 Bệnh tiêu chảy, tr 70, 67 Bệnh tiểu đường phụ thuộc insulin nhóm I, insulin dependent diabetes mellitus, IDDM, tr 38, 39 Bệnh tự miễn, tr 19, 21, 36, 38, 39 BioanalystTM, tr 59 BioEdit, tr 52, 59 Bryodin, tr 7, 10, 86, 87 Buccal carcinoma, tr 98, 101 Carbonic anhydrase, tr 89 Cascade kinase, tr 103 Caspase, tr 14, 15, 72, 104 Cây Quát lâu, Dưa trời, Thao ca, tr 68, 77 Cấy ghép tủy xương nguồn, tr 47 CD2, tr 38 CD3, tr 38, 46 CD4, tr 36, 38, 41, 42, 70 CD5, tr 38, 39, 46, 47 CD7, 27, 28, 38, 47 CD8, tr 37, 70 CD9, tr 13 CD11, tr 38 CD18, tr 38 CD19, tr 26, 28, 38 CD20, tr 27 CD22, tr 24-26, 28, 29, 38 CD25, tr 20, 22-24, 28, 29, 37, 38 CD30, tr 2, 26, 27, 29, 38 CD33, tr.2, 29, 38 Index 241 CD38, tr 27 CD40, tr 10 CD56, tr 29, CD64, tr 27 CD80, tr 27 CD86, tr.27 CD87, tr 105 CD122, tr 20, 22, 24, 37 CD132, tr 20, Chất ức chế trypsin, trypsin inhibitor, tr 89 Chemokine, tr 104 Chỉ thị protein, protein marker, tr 1, 55 Chuỗi α-55 kDa, tr 37 Chuỗi β-75 kDa, tr 37 Chuỗi γ (p64), tr 37 Coccinia cordifolia Cogn., Mảnh bát, Hồng qua, tr 74 Cơ chất chết, tr 14 Cơ chất huỳnh quang, tr 16 Compound Q, tr 68 Công nghệ DNA tái tổ hợp, tr 116 Công nghệ protein tái tổ hợp, tr Cột CM-Sepharose, tr 90, 91, 113, 114, 125, 126, 133-136, 145, 147 Cột Sephacryl S-200 HR, tr 90 Cucumis sativus L, Dưa chuột, tr 75 Cycloheximide, tr 15 Cytochrome C, tr 104 Cytokine, tr 4, 17, 23, 37, 38, 50, 104, 107 DeepView/Swiss-Pdbviewer, tr 59 Denileukin difitox, tr 21, 22, Dianthin, tr 71 3,5-dimethoxy -4- hydroxycinamic acid, sinapinic acid, SA, tr 58, 137 Diphtheria toxin, tr 3, 7, 9, 10-12, 14 242 Phan Văn Chi Nguyễn Bích Nhi DNA array, tr DNA genome, tr 50, 81 EcoRI, tr 84, 121, 122, 128, 129 ElectroSpray Ionization, Ion hóa phương pháp xung điện, tr 143 Epithelial growth factor, EGF, tr 13, 30, 31, 38, 104-106, 127 Euphorbitaceae, Họ thầu dầu, tr 66, 76-78 ExPASy, tr 58, 59, 87, 88, 140 Fabaceae, Họ đậu, tr 66 Fas ligand, tr 107, 116 Fibroblast growth factor, FGF, tr 39 Flamulin, tr 67 Fusion protein, tr.103 Gel agarose, tr 50, 52, 117, 121-123 Gel polyacrylamide, 53-55, 57, 80, 109-115, 119, 124, 125, 130, 134 Gelonin, tr 27, 28, 35, 71, 72 Glycosyl hóa, tr 6, 8, 9, 30, 87 GM-CSF-R, tr 38 GnRH-TBK, PBL-3, tr 116-118, 133-137, 141, 142, 149-161, 163-167 Gonadotropin releasing hormone, GnRH, tr 105, 106, 116, 119, 120, 141 Gp41, tr 37, 41, 42-44 G-protein, tr 104 Herceptin, tr Herpes simplex virus, tr 71, 97 Hệ thống khối phổ, mass spectrometry, 57, 78, 79 Hệ thống sắc kí lỏng nhanh protein, Fast protein liquid chromatography, FPLC, tr 54, 78, 90, 114, 115, 125, 126, 134, 135 Họ bầu bí, Cucurbitaceae, tr 66, 68, 104, 107 Họ hoa phấn, Nygtaginaceae, tr 66 Họ hòa thảo, Poaceae, tr 66 Hoạt tính đa enzyme, tr 72 Index 243 Hội chứng dò mạch, vascular leak syndrome – VLS , tr 17, 21, 25, 2, 35 Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải, acquired immune deficiency syndrome, AIDS, tr 6, 19, 37, 38, 40, 42, 70 Horse radish peroxidase, HRP, tr 57 Human Epidermoid Carcinoma of the Mouth, tr 97-99, 102, 149, 150-153 Human immunodeficiency virus, HIV, tr 19, 36-38, 40-44, 70-73, 104 Hypsin, tr 67 Hypsizigus marmoreuse, tr 67 IC50, tr 93-95 Interleukin 2, IL-2, tr 10, 20, 22 37-39, 46 IL-4, tr 30, 38 IL-6, tr 38, 39 IL-7, tr 38, 39 IL-9, tr 38, 39 IL-15, tr 38, 39 Influenza virus, tr 97 Insulin, tr 38, 39 IPG Strip, Immobilized pH gradient strip, tr 57 Isopropyl beta D-thiogalactoside, IPTG, tr 53, 88, 89, 109-112, 118, 119, 124, 125, 131, 133, 146 ITs hướng đích kháng nguyên bề mặt tế bào T, tr 39 JAR, tr 72, 101 JIP60, tr 67 Karasurin, tr 86-88 Kháng thể đơn dòng, monoclonal antibodies, MABs, tr 1-5, 11, 37 Kháng nguyên biệt hóa đặc hiệu, tr 36 Kháng nguyên Lewis, tr 14 Khối phổ liên tiếp, Tandem Mass Spectrometry, MS/MS, tr 65, 66, 88, 152-158 Khối u thể rắn, tr 106 Leukemia, tr 2, 20, 22, 23, 27, 30, 36, 70 244 Phan Văn Chi Nguyễn Bích Nhi Liều dung nạp tối đa, maximum tolerated dose, MTD, 21, 41, 47 Luciferase assay reagent, LAR, tr 92 Lufin, tr 71 Lymphoma, tr 1, 20, 22, 26 Lysozyme, tr 54, 95, 134, 147 Màng PVDF, Polyvinylidene fluoride membrane, tr 56, 57, 110 Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization, MALDI, tr 58, 59, 91, 137-139, 140, 142 MAP-kinase, tr 103 MASCOT, tr 59, 79, 138-141, 143 Melanotropin, tr 39 2-Mercaptoethanol, tr 88 Methyl jasmonate, tr 67 mini-TBK, PBL-4, tr 120-126, 133, 136, 137, 142, 155, 158-168 Momordica charanthia, Mướp đắng, tr 74 Momordica conchinchinensis, Gấc, tr 74 Momordin, tr 69 Monoisotopic mass, tr 139 Mô hình tế bào nuôi cấy in vitro, tr 106 Môi trường LB, Luberia Bertani, tr 53, 83, 88, 109-112, 118, 124, 133, 146 Môi trường RPMI 1640, tr 60 Myeloma Sarcoma, tr 60, 97, 101, 102 National Center for Biotechnology Information, NCBI, Trung tâm Quốc gia thông tin Công nghệ Sinh học, tr 59, 138, 141, 143 NcoI, tr 49, 82-84,108, 109, 117, 118, 120, 122, 123 Neuro-decapeptide, tr 116 Ovalbumin, tr 89 Peptide tín hiệu, signal peptide, tr 69 Phản ứng PCR, Polymerase Chain Reaction, 50-53, 107, 108, 116, 117, 119-121 Phản ứng phiên mã ngược, reverse transcriptase PCR, RT-PCR, tr 50 Phát quang sinh học, bioluminescence, tr 92 Index 245 Phenyl metasulphonyl fluoride, PMSF, tr 90 Phosphorylase, tr 89 Phương pháp liên kết hóa học, tr 4, 106 Phytolacca americana, tr.116 Plasmodium falciparum, tr 72 Pleurotus ostreatus, nấm sò, tr 68 Pokweed antiviral protein, PAP, tr 34, 7, 36 Poliovirus, tr 68, 97 Poly (ADP-ribose) polymerase, PARP, tr 14, 15 Preprotein, tr 69 Protein bất hoạt ribosome, Ribosome inactivating protein, RIP, tr 4, 7, 65, 72-76, 84, 87, 96, 106, 120 Protein dung hợp với cytokine, tr 37 Protein đa kháng thuốc, tr 104 Protein độc tố, tr 3, 50 Protein hướng đích, tr 50 Protein vỏ gp160 HIV, tr 37, 44 Proteomics, tr Pseudomonas exotoxin (PE), tr 3, 4, 7, 9-15, 17 Rabdomyo Sarcoma, 60, 97, 99, 100, 102 Rabbit reticulocyte lysate, RRL, tr 91-93, 106 Reactive oxygen species, ROS, tr 72, 104 Ribonuclease inhibitor, RNAsin, tr 92 Ribotoxic stress, tr 103 Ricin, tr 4, 6, 7-9, 28, 29, 35, 36, 40, 41, 76 Rituximab, tr 1, 2, 12, 17, 27 RNA N-Glycosidase, tr 65, 70, 71, 93-95, 103 RNA tổng số, tr 50, 51 Sambucus ebulus, tr 67 SAPK/JNK, tr 103 Saporin, SAP, tr 4, 10, 25, 28, 71 Sarcoma 180, tr 61, 62, 155-167 246 Phan Văn Chi Nguyễn Bích Nhi SEK1/MKK, tr 103 Sephacryl S-200 HR, tr 90 Shiga toxin 1, tr 67 Solenin, tr 68 Solenognathus harwickii, tr 68 T4 DNA ligase, tr 53, 83, 108, 109, 117, 130 Taq DNA polymerase, tr 51, 81, 82 Tế bào gốc, stem cells, tr 36 TGF-TBK, PBL-5, 126-133, 136, 137, 143 Thể vùi, inclusion body, tr 15, 89 Thụ thể IL-2, tr 20-22, 38 Thuốc thai, tr 68 Tian Hua Fen,Thiên Hoa Phấn, tr 68, 69 Tỉ số phát triển u, tr 63, 159, 160 Tỉ số ức chế phát triển u, tr 63, 159 Trichoanguin, tr 69, 87 Trichosanthin, TCS, tr 68-70, 72, 75, 81, 87 Trichosanthes kirilowii Max., tr 68, 75 Trichosanthes sp BacKan 8-98, tr 74, 75, 77, 81, 85, 107 Trình tự nhận biết đặc hiệu, tr 14 Trophoblast, tr 69 Tubercidin, tr 69 U báng thực nghiệm, tr 155, 167 U hắc sắc tố, tr.39 Ung thư máu dòng lympho, tr 28 Ung thư bạch cầu tủy, tr 38 Ung thư bàng quang, tr 29 Ung thư gan, tr 39, 70 Ung thư mô bạch huyết, tr 38 Ung thư mô Kaposi, tr 39 Ung thư ruột kết, tr 14 Ung thư vú, tr 1, 14, 30, 32, 33, 105, 127 Index 247 Ung thư phổi tế bào nhỏ, small cell lung cancer, SCLC, tr 29, 30 Urokinase plasminogen activator receptor, uPAR, tr 35, 105 Vector tách dòng, PCR cloning vector, tr 50, 53 Vector biểu hiện, expression vector, tr 53, 107-109, 118 Velutin, tr 67 Viêm khớp dạng thấp, Rheumatoid Arthristis, RA, tr 36, 38, 39 Virus gây suy giảm miễn dịch người, human immunodeficiency virus, HIV, tr 36, 37, 40-43 Volvariella volcacea, tr 67 Vùng gắn đa vị, tr 49 Yếu tố hướng đích, target moiety, tr 3, 4, 37, 107, 116 Yếu tố kéo dài 2, elongation factor-2, EF-2, tr 3, 4, 10, 12-14, 16 Yếu tố hoạt hóa plasminogen niệu, urokinase plasminogen activator, uPA, tr 105-107, 139 Yếu tố sinh trưởng biến đổi alpha, transforming growth factor alpha, TGF-alphal, tr 30, 31, 106, 127, 143 Yếu tố sinh trưởng biểu bì, epidermal growth factor, EGF, tr 13, 30, 31, 104-106, 127 Western blotting, tr 31, 54, 56, 89, 91, 109, 118-120, 130, 133, 143 139, 159 NHÀ XUẤT BẢN KHOA HỌC TỰ NHIÊN VÀ CÔNG NGHỆ 18 đường Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội Điện thoại: Phòng Phát hành: 04.2149040; Biên tập: 04.2149034; Quản lý Tổng hợp: 04.2149041; Fax: 04.7910147, Email:nxb@vap.ac.vn; www.vap.ac.vn TRICHOBAKIN VÀ IMMUNOTOXIN TÁI TỔ HỢP Phan Văn Chi, Nguyễn Bích Nhi Chịu trách nhiệm xuất bản: GS TSKH Nguyễn Khoa Sơn Chủ tịch Hội đồng biên tập: GS.TSKH Đặng Vũ Minh PCT Hội đồng biên tập: GS.TSKH Nguyễn Khoa Sơn Thẩm định nội dung: GS TSKH Đái Duy Ban PGS TS Hoàng Thị Bích Ngọc Biên tập: Đinh Như Quang Trình bầy kỹ thuật: Trần Thị Kim Liên Trình bày bìa: Nguyễn Bích Nga In 400 khổ 16 × 24cm tại: Nhà in Khoa học Công nghệ Số đăng ký KHXB: 248-2008/CXB/001 - 01/KHTNCN cấp ngày 21 tháng năm 2008 In xong nộp lưu chiểu tháng 12 năm 2008 [...]... khô và bảo quản protein tái tổ hợp Sơ đồ qui trình lên men, tinh chế và bảo quản các protein tái tổ hợp được trình bày trong Hình 8.1 Hình 8.1 Sơ đồ qui trình lên men, tinh chế và bảo quản các độc tố miễn dịch tái tổ hợp ở qui mô 4 lit 146 Phan Văn Chi, Nguyễn Bích Nhi 8.1 Chuẩn bị chủng Plasmid tái tổ hợp chứa gen lai mã hóa cho TBK và các dẫn xuất được tiến hành biến nạp vào chủng vi khuẩn BL21(DE3)plysS... 10 .2 và Hình 10.3 Bảng 10 .2 Kết quả theo dõi thời gian sống thêm của chuột mang u báng S-180 được điều trị bằng TBK và các dẫn xuất (Nguyễn Bích Nhi et al, 20 04) Tuổi thọ của chuột (ngày) TT Đợt thí nghiệm I Đợt thí nghiệm II ĐC bệnh TBK PBL-3 ĐC bệnh PBL -2 PBL-4 1 17 24 8 12 9 6 2 17 28 10 13 12 7 3 18 30 10 13 13 8 4 19 32 10 13 15 19 5 19 34 10 14 20 28 6 21 38 11 17 26 48 7 21 45 11 17 26 48 8 22 ... lai tái tổ hợp, không lẫn các băng phụ khác 148 Phan Văn Chi, Nguyễn Bích Nhi 8.5 Đông khô và bảo quản protein tái tổ hợp Dịch protein tinh chế sau khi đã kiểm tra các thông số kỹ thuật, được chia nhỏ vào các lọ penicillin sạch vô trùng, mỗi lọ 1ml, dán nhãn đề tên protein tái tổ hợp, hàm lượng, ngày đông khô Các lọ được giữ ở -70°C qua đêm Ngay sáng hôm sau các lọ penicillin chứa protein tái tổ hợp. .. thử nghiệm (μg/ml % tế bào đếm được PBL -2 (ATF-TBK) PBL-3 (GnRH-TBK) TBK (Nguyễn Thúy Hà et al, 20 03) 0 (Đối chứng) 100 100 100 5.0 98.49 2. 85 97.66 ± 2. 37 96.83 ± 2. 26 7.5 83.46±1.93 71.09 ± 2. 01 68 .25 ± 2. 97 10 44.36±1.78 55.47 ± 1.94 52. 38 ± 2. 89 15 - 38 .28 ± 1.51 35.71 ± 0.90 20 21 .81±1.41 - - 30 - 19.53 ± 0.69 18 .25 ± 0.85 Giá trị ID50 (μg/ml) 8.65 ± 0 .22 11 .24 ± 0.46 10.60 ± 0.31 Chương IX Thử nghiệm... bào RD -26 bị ức chế hoàn toàn Kết quả thử nghiệm được trình bày trong Bảng 9 .2 Bảng 9 .2 Tác động của PBL -2 và PBL-3 lên sự phát triển của các tế bào ung thư cơ (Human Rabdomyo Sarcoma) dòng RD -26 (Nguyễn Bích Nhi et al, 20 03) Nồng độ protein thử nghiệm (μg/ml) % tế bào đếm được PBL -2 PBL-3 TBK (Nguyễn Thúy Hà et al, 20 03) 0 (ĐC) 100 100 100 2. 5 96. 92 ± 1.90 95.75 ± 3 .23 94. 62 ± 2. 75 5.0 64.65 ± 2. 13... ± 2. 06 73. 12 ± 1. 62 7.5 - 53.19 ± 1.16 48.39 ± 1 .21 10 33.33 ± 1.45 39.36 ± 1.04 36.56 ± 0.88 15 - 27 .66 ± 0.70 24 .73 ± 0.89 20 17.17 ± 1.39 - - Giá trị ID50 (μg/ml) 6.67 ± 0.17 7.98 ± 0 .23 7.30 ± 0.09 Các kết quả thử nghiệm trong Bảng 9 .2 cho thấy cả hai loại dẫn xuất PBL -2 và PBL-3 đều có tác dụng ức chế sự sinh trưởng của các tế bào ung thư cơ vân RD -26 nuôi cấy in vitro Phan Văn Chi, Nguyễn Bích. .. nhắt Các lô điều trị và theo dõi thời gian sống thêm (20 con/lô) sau khi được truyền tế bào S-180 và điều trị bằng TBK và các dẫn xuất (PBL -2, PBL-3 và PBL-4) với cùng liều 40 μg/con đã được nuôi trường diễn và theo dõi đến ngày thứ 90 (đối với TBK và PBL-3 trong thí nghiệm đợt I) và do thời gian không cho phép chỉ đến ngày Phan Văn Chi, Nguyễn Bích Nhi 164 thứ 60 (đối với PBL -2 và PBL-4 trong thí nghiệm... tái tổ hợp được biểu hiện ổn định và có trọng lượng phân tử 33 kDa phù hợp với tính toán lý thuyết của protein lai TGF-TBK Hình 7.5 là kết quả nhận dạng TGF-TBK qua các mảnh peptide: (A) KVTLPYSGNYER từ TBK và (B) FLVQEDKPACVCHSGYVGAR từ TGF Hình 7.5 Kết quả phân tích khối phổ nhận dạng TGF-TBK tái tổ hợp sau khi thủy phân bằng trypsin (Lê Thị Bích Thảo et al, 20 07) 144 Phan Văn Chi, Nguyễn Bích Nhi. .. 18 30 10 13 13 8 4 19 32 10 13 15 19 5 19 34 10 14 20 28 6 21 38 11 17 26 48 7 21 45 11 17 26 48 8 22 49 17 20 32 59 9 22 50 18 24 34 60 10 23 54 28 27 56 60 11 56 30 57 60 12 56 31 60 60 13 57 32 60 60 14 58 47 60 60 15 72 49 60 60 16 72 52 60 60 17 76 61 60 60 18 82 62 60 60 19 90 90 60 60 20 90 90 60 60 54.65 33.85 41.9 47.15 Trung bình 19.9 16.7 Chương X Khả năng ức chế các tế bào ung thư … ở chuột... 0 .2 ml dung dịch sinh lý/con (ii) Lô 2: đối chứng bệnh, được truyền 0 .2 ml dịch chứa 106 tế bào ung thư S-180/con (iii) Lô 3, 4, 5: điều trị, được truyền 0 .2 ml dung dịch chứa 106 tế bào ung thư S-180/con và sau 24 giờ được tiêm 0 .2 ml dung dịch chứa lần lượt mỗi lô là 80, 40 và 20 μg/con TBK tái tổ hợp (iv) Lô 6, 7, 8: điều trị, được truyền 0 .2 ml dung dịch chứa 106 tế bào ung thư S-180/con và sau 24 ... 14 20 28 21 38 11 17 26 48 21 45 11 17 26 48 22 49 17 20 32 59 22 50 18 24 34 60 10 23 54 28 27 56 60 11 56 30 57 60 12 56 31 60 60 13 57 32 60 60 14 58 47 60 60 15 72 49 60 60 16 72 52 60 60... Phan Văn Chi, Nguyễn Bích Nhi cho kết dương tính, điều cho thấy thu protein tái tổ hợp mong muốn (Phan Van Chi et al, 20 01a; Lê Thị Bích Thảo et al, 20 02; Đặng Thành Nam et al, 20 03; Lê Thị Bích. .. PBL -2 PBL-3 Mini-TBK 24 7 26 9 27 1 24 0 27 198.95 29 687.76 29 880.96 26 401.06 9 .28 9.01 9. 32 9.14 %B 40 40 50 40 NaCl (M) 0.16 0.16 0 .2 0.16 Chương VI Thay ₫ổi trình tự amino acid lực Trichobakin tái