Enzyme Glucoamylase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Mục lục Lời nói đầu Tài liệu tham khảo 10 Lời nói đầu Việc sản xuất enzyme từ vi sinh vật giới tiến hành mức độ công nghiệp, với qui mô lớn – hàng nghìn năm, sản phẩm thu chế phẩm enzyme khác nhau, dạng thô dùng cho chăn nuôi, ngành công nghiệp dệt, thuộc da,… dạng tinh khiết cho thực phẩm, y dược học Nhật nước đầu lĩnh vực với 20 công ty sản xuất chế phẩm enzyme Hàng năm Nhật sản xuất 9850 amylase, 8906 protease, 2200 glucoamylase, 100 lipase, 200 enzyme khác … Ở nước phát triển Đức, Hungary, Pháp, Anh, Đan Mạch, v.v… ngành công nghiệp sản xuất enzyme ý phát triển mạnh Hệ enzyme amylase số hệ enzyme sử dụng rộng rãi công nghiệp, y học nhiều lĩnh vực khác Theo tính chất chế tác dụng lên tinh bột amylase người ta phân biệt amylase gồm loại α – amylase, β – amylase, γ – amylase hay glucosamylase, oligo – 1,6 – glucosidase, transglucosyldase Trong glucoamylase sử dụng nhiều công nghiệp thực phẩm Hiện Glucoamylase enzyme chiếm vị trí hàng đầu sản xuất công nghiệp, đặc biệt công nghiệp lương thực thực phẩm dược phẩm Do khả thủy phân triệt để, sản phẩm cuối phản ứng xúc tác chủ yếu α – glucose, nên Glucoamylase sử dụng quy trình sản xuất α – glucose Glucose dùng bổ sung vào số dược phẩm, hay làm chất cho Enzyme Glucoamylase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn công nghiệp sản xuất rượu bia, nước giải khát, chế biến thực phẩm Sử dụng Glucoamylase sản xuất rượu bia giúp thay lượng lớn malt loại tinh bột khác rẻ tiền bột gạo, bột mì… giúp giảm bớt chi phí sản xuất giảm giá thành sản phẩm, nước phải nhập nguồn malt nguyên liệu Việt Nam I Tổng quan nguyên liệu Enzyme glucoamylase Giới thiệu chung Glucoamylase nhà khoa học Nhật tách lần từ Aspergillus awamori (Katihara, Kurushima, 1966) Sau tìm thấy Rhizopus delemar, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae nhóm vi sinh vật khác mô động vật Glucoamylase từ nấm mốc protein có khối lượng phân tử lượng dao động lớn từ 27.000 đến 112.000 Dal, tuỳ thuộc vào nguồn gốc enzyme Các glucoamylase chủ yếu tạo nên từ hai iso enzyme I II khác khả thuỷ phân tinh bột trạng thái rắn độ bền chúng Glucoamylase I tự hấp thụ thuỷ phân tinh bột trạng thái rắn, ngược lại glucoamylase II hai tính chất 1.1 Cấu tạo hóa học enzym glucoamylase Glucoamylase I glucoamylase II Cả hai dạng glucoamylase chuổi glyco – protein, phân tử có chứa D – gluco, D – maltose, D – galactose, thành phần carbonhydrate phân tử glucoamylase I chiếm khoảng 18%, với phân tử glucoamylase II 10% Phân tử carbonhydrate tham gia thành phần cấu tạo enzyme glucoamylase đóng vai trò giúp ổn định cấu trúc enzyme Ngoài chúng giúp tạo liên kết với chất phân tử polysaccharide giúp cho vùng xúc tác enzym gần với chất hơn, trình thủy phân enzyme thuận lợi Thành phần acid amine tham gia tạo thành chuổi polypeptid phân tử glucoamylase khác enzyme glucoamylase thu nhận từ nguồn khác Enzyme Glucoamylase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Số lượng acid amine tham gia vào chuổi polypeptid cấu tạo nên phân tử glucoamylase thu nhận từ nấm mốc Aspergillus niger Aspergillus awamori khoảng 650 – 700 acid amin Các acid amin tham gia trung tâm hoạt động enzyme glucoamylase bao gồm acid glutamic, tryptophan, tyrosin, asparagin, acid aspatic, lysin, serin Trong acid glutamic vị trí thứ 179 400 đóng vai trò việc xúc tác thủy phân liên kết O – glucozit chất Hình 1.1: Sơ đồ cấu tạo trung tâm hoạt động enzyme glucoamylase 1.2 Cấu trúc không gian enzym glucoamylase Trong không gian, phân tử glucoamylase chia làm ba vùng với chức riêng biệt: - Vùng SBD (Starch binding domain: vùng gắn kết với tinh bột) có kích thước khoảng 30 A Giữ chức liên kết với phân tử chất Vùng CD (Catalyse Domain: vùng xúc tác) có kích thước khoảng 60 A 0, giữ chức xúc tác phản ứng thủy phân liên kết O – glucozit Vùng Linker có độ dài khoảng 100 A0 liên kết hai vùng lại với Enzyme Glucoamylase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Hình 1.2: Sơ đồ cấu trúc không gian Enzyme Glucoamylase 1.3 Các tính chất glucoamylase • Enzym glucoamylase có mã số EC: 3.2.1.3 • Tên khoa học: glucan 1,4 – α – glucohydrolase Ngoài enzym glucoamylase có tên gọi khác như: amyloglucosidase; γ – amylase; lysosomal α – glucosidase; acid maltase; exo – 1,4 – α – glucoside; glucose amylase; γ – 1.4 – glucan glucohydrolase Đặc trưng phản ứng: enzyme glucoamylase xúc tác phản ứng thủy phân liên kết 1,4 – 1,6 o – glucoside tách gốc gluco từ đầu không khử chuỗi polysaccharide Enzym glucoamylase xúc tác phản ứng thủy phân tinh bột tách gốc glucose từ đầu không khử chuổi polysaccharide Gốc gluco từ đầu không khử gọi glycone, chuổi oligosaccharide sau gluco tách gọi Alglycone Cơ chế xúc tác thủy phân liên kết o – glucozit hoạt động chủ yếu cặp acid amin đóng vai trò cặp acid – base Khi tương tác với chất, acid glutamic vị trí thứ 179 đóng vai trò chất xúc tác acid, proton hóa oxi – glycosidic (phân tử oxi vị trí liên kết o – glucozit) Acid glutamic vị trí thứ 400 đóng vai trò chất xúc tác base, acid amin thu hút tạo liên kết với proton H+ phân tử nước làm giải phóng gốc OH-, gốc OH- công vào vị trí carbon glycosidic liên kết o – glucozit phân tử cỏ chất bị phá vỡ 1.4 I.4.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác enzyme glucoamylase Nhiệt độ Nhiệt độ yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác enzym, tăng nhiệt độ lên 100C vận tốc phản ứng enzyme tăng lên gấp đôi, tăng nhiệt độ lên cao vượt nhiệt độ tối ưu enzyme bắt đầu biến tính, vận tốc phản ứng enzyme giảm xuống Mỗi enzyme Enzyme Glucoamylase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn hoạt động khoảng nhiệt độ định, enzyme glucoamylase hoạt động khoảng 200C – 750C Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động enzym glucoamylase: 400C – 650C 1.4.2 pH pH yếu tố có ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzym, pH thay đổi có ảnh hưởng đến trạng thái ion hóa tham gia trung tâm hoạt động enzym nhóm α – COOH, ω – COOH, – NH2, – OH Vòng imodazol… trạng thái ion hóa chất phức chất trung gian ES Khoảng pH mà enzym glucoamylase hoạt động từ – 8, pH tối ưu: – 5.5 1.4.3 Các chất ức chế Enzyme glucoamylase bị ức chế ion kim loại Al3+, Hg2+, Pb2+, Ni2+,Cu2+ Ngoài ra, chất tinh bột schardinger dextrin hoạt động chất ngăn cản khả taog phức hợp enzyme glucoamylase tinh bột với chất maltose môi trường có diện gentitobiose, mantitol với nồng độ khoảng 20mM ức chế hoạt động enzyme glucoamylase 1.4.4 Các chất hóa học Khi cho thêm vào môi trường phản ứng dung môi như: chloroform, hexane, n – deoecane với nồng độ khoảng 50% làm tăng hoạt tính glucoamylase lên lần so với môi trường có nước chất dung môi Các chất 2,2’ – dipyridyl, iodoacetamyde làm tăng hoạt tính enzym glucoamylase 1.5 Tính chất glucoamylase Cơ chế tác động Enzym glucoamylase có khả thủy phân mạnh mẽ liên kết – 1,4 lẫn – 1,6 glucoside phân tử tinh bột Hình 1.3: Sơ đồ phân giải enzyme glucoamylase Khả thuỷ phân mạnh mẽ liên kết – 1,4 lẫn – 1,6 glucoside glucoamylase để tạo thành glucose đưa enzyme lên hàng đầu hiệu lực xúc tác thuỷ phân tinh bột Vì việc dùng chế phẩm glucoamylase từ chủng vi sinh vật việc sản xuất bia, rượu, mật, glucose… có ý nghĩa triển vọng lớn Enzyme glucoamylase xúc tác tách gốc glucose từ đầu không Enzyme Glucoamylase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn khử chuỗi polysaccharide Gốc glucose từ đầu không khử gọi glycone, chuỗi oligosaccharide sau glucose tách gọi alglycone Cơ chế xúc tác thủy phân liên kết O – glucoside hoạt động chủ yếu cặp acid amin đóng vai trò cặp acid – base Khi tương tác với chất, acid glutamic vị trí thứ 179 đóng vai trò chất xúc tác acid, proton hóa oxi – glycosidic (phân tử oxi vị trí liên kết o – glucoside) Acid glutamic vị trí 400 đóng vai trò chất xúc tác base, acid amin thu hút tạo liên kết với proton H+ phân tử nước làm giải phóng gốc OH-, gốc OH- công vào vị trí carbon glycosidic liên kết o – glucoside phân tử chất bị phá vỡ Glucoamylase phân thuỷ phân tinh bột thành dextrin có phân tử thấp, liên tục tách gốc glucose cuối tạo sản phẩm glucose Glucoamylase thuỷ phân tinh bột, glycogen, polysaccharide đồng loạt liên – 1,4 – 1,6 glucoside Nó có giá trị đặc biệt ngành sản xuất rượu, chuyển dextrin có phân tử lượng cao không lên men thành hợpchất lên men nâng cao hiệu suất lên men rượu từ nguyên liệu tinh bột Các chế phẩm enzyme glucoamylase tách chiết từ tế bào vi sinh vật có điểm giống nhau, song chúng có vài điểm khác Ngay chế phẩm tách từ chủng nấm mốc Aspergillus khác nhau, chí chủng loài khác đặc điểm tính chất lý, hoá, phân tử lượng, thành phần acid amin, tính đặc hiệu với chất điều kiện hoạt động Khi nghiên cứu chế thủy phân số oligosaccharide polysaccharide glucoamylase nấm mốc, Backer cộng thấy thủy phân tinh bột thực theo chế “đa mạch” theo chế đơn mạch Sơ đồ thủy phân tinh bột glucoamylase: Glucoseamylase kiểu Asp.niger khác Tinh bột hay Phản ứng cho 80 – 85 % glucose oligosaccharide 1.6 Glucose Ứng dụng enzym glucoamylase Chế phẩm glucoamylase từ nấm mốc Aspergillus, Rhizopus … thay malt làm tác nhân đường hóa tinh bột sản xuất rượu, bia từ nguyên liệu có bột Việc sử dụng chế phẩm amylase vi sinh vật thay malt tiết kiệm hàng vạn đại mạch loại tốt, giảm giá thành, rút ngắn quy trình sản xuất Trong giai đoạn đường hóa, glucoamylase chiếm vị trí hàng đầu đóng vai trò định việc chuyển hóa tinh bột thành đường để lên men, cần chọn chủng vi sinh vật có khả sản sinh nhiều enzym glucoamylase Trong sản xuất rượu người ta thường dùng hỗn hợp canh trường bề mặt Aspergillus Usamii Aspergillus Balatae Enzyme Glucoamylase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Nếu coi tổng lượng đường maltose, glucose, saccharose, fructose 100% đường hóa malt ta có 71% maltose, 24 – 28% glucose, đường hóa amylase nấm mốc có 14 – 21% maltose, 80 – 85% glucose, sản phẩm cuối thủy phân amylase nấm mốc chủ yếu glucose – đường dễ lên men, lên men rượu xảy nhanh Glucose ứng dụng nhiều lĩnh vực y học, công nghiệp thực phẩm ngày việc sản xuất glucose đa số sử dụng công nghệ enzyme Enzyme glucoamylase enzyme chủ yếu cho trình đường phân tinh bột để tạo thành glucose Tinh bột có số DE khoảng – 8, sau thủy phân enzyme glucoamylase số DE tăng lên 96 – 98 Dung dịch sau thủy phân trực tiếp sử dụng để sản xuất siro giàu fructose sản xuất glucose dạng tinh thể Trong công nghiệp dược phẩm, enzyme glucoamylase bổ sung vào số loại thuốc giúp tăng khả tiêu hóa cho thể Ngày nay, enzyme glucoamylase sử dụng kết hợp với enzyme cellulase protease dạng canh trường nấm mốc bổ sung vào thức ăn gia súc, làm tăng trình đồng hóa giúp cho gia súc tăng trọng nhanh 2.1 Nấm mốc Aspergillus niger Tổng quan nấm sợi Aspergillus niger Giống Aspergillus có khoảng 200 loài phân bố khắp nơi tự nhiên, có loài Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae,…có giá trị sử dụng sản xuất enzyme, rượu, axit hữu cơ… Van Tieghem người phát phân lập chủng nấm mốc Aspergillus niger từ hạt chứa nhiều dầu như: hạt đậu nành, đậu phộng, hạt ngũ cố, hạt bắp…; Aspergillus niger phân lập từ sản phảm lên men cổ truyền 2.2 Vị trí phân loại Aspergillus niger Giống Aspergillus Michelli mô tả lần đầu vào năm 1729 Năm 1901 Wehmer cho đời chuyên luận phân loại giống nấm bất toàn Raper and Fennell (1965) dùng tên Aspergillus cho tất loài tạo thành bào tử trần Như Aspergillus niger có vị trí phân loại sau: Bảng 1.1: Phân loại Aspergillus niger Giới Fungi Enzyme Glucoamylase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Lớp Fungi imperfecti Bộ Moniliales Họ Aspergillaceae Loài Aspergillus niger Khuẩn ty phân nhánh có vách ngăn, bào tử đính không nằm tron bọc bào tử, cuống sinh thể bình phình rõ rệt đầu tạo thành bọc lớn hình cầu – x 20 – 30µm, – 10 x 60 – 70µm màu nâu đen Hình 1.4: Nấm mốc Aspergillus Niger 2.3 Đặc điểm sinh hoc Aspergillus niger Aspergillus niger sinh trưởng nhiệt độ tối thiểu – 80C tối đa 45 – 470C, tối ưu 28 – 350C, môi trường có độ ẩm tối thiểu 23% Độ ẩm môi trường thích hợp để lên men bán rắn Aspergillus niger 60 – 65%, sinh trưởng phát triển có mặt O2 pH tối ưu – 6.5, có chủng Aspergillus niger sinh trưởng pH Sự thay đổi pH môi trường nuôi cấy từ đến 6.5 làm thay đổi đáng kể hình thái Aspergillus niger Enzyme Glucoamylase 2.4 GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Sinh trưởng nấm mốc A.Niger Asp.niger có nhiều kiểu sinh sản khác nhau: Sinh sản sinh dưỡng, sinh sản vô tính bào tử sinh sản hữu tính 2.4.1 • Điều kiện sinh trưởng Nhiệt độ Nấm mốc có nhiệt độ phát triển tốt ưu 28 – 320C, trình sinh trưởng phát triển vi sinh vật đồng hóa chất dinh dưỡng thải lượng nhiệt lớn Do trình nuôi cấy cần phải có trang thiết bị phù hợp để trì ổn định nhiệt độ canh trường UI (Hoạt độ enzyme) t0 • Hình 1.5: Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính enzyme glucoamylase Độ ẩm Độ ẩm tối ưu trình nuôi cấy nấm mốc 65 – 70% Tuỳ theo điều kiện khí hậu điều kiện vô trùng phòng thí nghiệm quốc gia mà lựa chọn độ ẩm cho thích hợp, độ ẩm thường khống chế 50 – 60%, thường sử dụng 58 – 60% Độ ẩm mà tăng 55 – 70% làm giảm độ thoáng khí, thấp 50 – 55% kìm hãm sinh trưởng phát triển vi sinh vật tạo Enzyme Glucoamylase Trong điều kiện tiệt trùng tốt (môi trường bình tam giác, tủ ấm phòng thí nghiệm hoạt lực Glucoamylase cao thu độ ẩm 65 – 68%) Cần nhớ nuôi điều kiện không vô trùng tuyệt đối (trên khay), độ ẩm môi trường không vượt 60%, cao dễ bị nhiễm khuẩn Tuy vậy, việc giữ độ ẩm cao (việc phòng ngừa Enzyme Glucoamylase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn hạn chế hư hỏng canh trường) suốt trình sinh trưởng nấm sợi lại có ý nghĩa to lớn tạo thành Enzyme • pH Khi nuôi cấy môi trường bán rắn theo phương pháp bề mặt pH ảnh hưởng đến sinh trưởng nấm mốc, thường người ta sử dụng pH tự nhiên vào khoảng 5.5 – UI (Hoạt độ enzyme) pH • Hình 1.6:Ảnh hưởng pH lên hoạt tính enzyme glucoamylase Cung cấp Oxy Trong trình phát triển tích tụ enzyme nấm mốc cần oxy, nuôi cấy nấm mốc theo phương pháp bề mặt nấm mốc dễ dàng tiếp xúc với không khí qua hệ thống sợi tơ micell đòi hỏi môi trường phải xốp giúp cho nấm mốc tạo nhiều hệ sợi tích luỹ nhiều enzyme Nếu môi trường dính bết, không đủ độ xốp, không khí tiếp xúc vi sinh vật xảy hô hấp yếm khí ảnh hưởng đến việc tích luỹ enzyme Độ hoà tan oxy vào môi trường nuôi cấy phụ thuộc nhiều yếu tố: nhiệt độ, nồng độ chất phương pháp thổi khí, nhiệt độ cao khả hoà tan oxy kém, nồng độ chất tỷ lệ nghịch với khả hoà tan oxy, ngược lại có số yếu tố làm tăng khả hoà tan oxy: ete, rượu, acid hữu cơ… I.4.2 Nguồn chất • Nguồn C 10 Enzyme Glucoamylase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Hình 2.3: Buồng nuôi cấy bề mặt Giá để khay Quạt Van nóng để điều hoà Lọc khí nhiệt độ Đường thông khí vào Hệ thống phun nước thành Đường thông khí bụi Thông số công nghệ: Buồng nuôi cấy buồng kín có kích thước 10000×2800×2100 mm với hai cửa, cửa nối với hành lang thải liệu Bên phòng có ba đoạn ống thông khí để nạp không khí điều hoà từ hướng, từ hướng ngược lại – ống để thải không khí phòng Diện tích phòng tính cho 18 – 20 giàn có khoảng – 10 khay cho bên Khoảng cách giàn 80 – 100 mm, giàn có khoảng cách rộng 1000 – 1200 mm để lại cách tường 200 – 300 mm Các điều hoà độc lập phân bổ phòng tiệt trùng nhằm để đẩy không khí có nhiệt độ 22 – 320C, độ ẩm tương đối 96 – 98% vào phòng Không khí tuần hoàn có bổ sung 10% không khí từ điều hoà chính, hành lang nạp tháo phòng cần phải cách ly phòng bên cạnh Điều thực nhờ thông gió hai chiều trao đổi không khí nhiều lần (đến lần) nhờ làm không khí thải khỏi bào tử Nghiền Mục đích công nghệ: chuẩn bị cho trình trích ly Quá trình nghiền làm cho nguyên liệu cám mì, cám trở nên tơi xốp hơn, làm tăng diện tích bề mặt tiếp xúc tăng hiệu sử dụng chất, đồng kích thước dễ phối trộn Ở đây, cám mì cám gạo sẵn dạng bột, ta bỏ qua trình nghiền, nhiên nguyên liệu xuất nhiều hạt kích thước lớn vón cục độ ẩm, ta phải cho nguyên liệu qua máy nghiền 23 Enzyme Glucoamylase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Các biến đổi nguyên liệu: • Vật lí: quan trọng trình nghiền kích thước nguyên liệu giảm, diện tích bề mặt riêng tăng lên Việc tăng diện tích bề mặt riêng tăng hiệu trình truyền nhiệt truyền khối Trong trình nghiền, tác dụng lực, nhiệt độ vật liệu tăng lên, chủ yếu lực ma sát • Hóa học: Khi nghiền vật liệu, cấu trúc vật liệu bị phá vỡ, thành phần dễ bị oxy hóa vật liệu acid béo, vitamin, có điều kiện tiếp xúc với oxy, phản ứng oxy hóa xảy ra, làm giảm giá trị dinh dưỡng môi trường Ngoài ra, có số phản ứng hóa học khác diễn trình nghiền nhiệt sinh thúc đẩy phản ứng hóa học dễ xảy • Hóa lí: diện tích bề mặt riêng tăng nhiệt độ tăng nên tốc độ bay tăng, tổn thất cấu tử dễ bay Ngoài ra, việc tăng diện tích bề mặt làm tăng trình hút ẩm nguyên liệu việc tăng nhiệt độ làm đông tụ protein • Sinh học: nghiền vật liệu, tác dụng lực học, vi sinh vật bị tiêu diệt mức độ không đáng kể Sau nghiền, diện tích bề mặt riêng tăng, mật độ vi sinh vật tăng lên Đồng thời, thành phần dinh dưỡng thích hợp vi sinh vật bên nguyên liệu thoát bề mặt, làm vi sinh vật phát triền mạnh Sự phát triển vi sinh vật làm giảm chất lượng môi trường, ảnh hưởng đến chế độ trùng • Hóa sinh: phản ứng oxy hóa xúc tác enzyme diễn mạnh tiếp xúc với oxy nhiều Thiết bị: Hình 2.4: Thiết bị nghiền dĩa dạng pin-disc Đây dạng thiết bị nghiền dĩa Cấu tạo bao gồm dĩa quay dĩa cố định Trên dĩa có rảnh sâu rãnh ăn khớp với Hình dạng đường gân rãnh tạo thành khác nhau, tròn, vuông dạng lưỡi dao Tốc độ đạt 10.000rpm Thiết bị có thêm lớp vỏ áo để giải nhiệt 24 Enzyme Glucoamylase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Thông số công nghệ: Kích thước vật liệu vào: – µm Kính thước vật liệu ra: Vận tốc lưỡi dao: 5000 – 7000rpm Trích li Mục đích công nghệ: Khai thác, dùng nước để chiết rút enzyme glucoamylase canh trường Các biến đổi nguyên liệu: - - Vật lí: khuyết tán phân tử chất tan từ tâm nguyên liệu đến vùng bề mặt dịch chuyển từ vùng bề mặt nguyên liệu vào dung môi (nước) Động lực khuyếch tán chênh lệch nồng độ Hóa học: phản ứng hóa học cấu tử không đáng kể trích ly nhiệt độ thường Hóa lí: hòa tan các enzyme cấu tử khác vào tan vào nước Hóa sinh: trích ly nhiệt độ thường enzyme canh trường xúc tác phản ứng chuyển hóa chất từ nguyên liệu Sinh học: Thời gian trích ly kéo dài vi sinh vật phát triển Thiết bị: Thiết bị trích ly bậc Hình 2.5: Thiết bị trích li bậc Nguyên lý hoạt động: Thiết bị bể hình trụ đứng, phía bên có đáy lưới Người ta cho nguyên liệu cần trích ly vào thiết bị qua cửa đỉnh Dung môi bơm vào thiết bị qua hệ thống phân phối vào phía đỉnh Dung môi chảy qua lớp nguyên liệu từ xuống Dịch trích tháo qua đáy Dịch trích hồi lưu lại nhờ vào đường ống dẫn bơm gần cửa đáy Để tránh vi sinh vật nhiễm cần thêm vào nước formalin chất sát trùng khác Dịch chiết rút đựơc thường suốt có màu xám chứa từ 10 – 15 % chất khô tất enzyme nấm mốc 25 Enzyme Glucoamylase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Dịch chiết lọc thu lại bình thu làm lạnh nhiệt độ 10 – 120C Thông số công nghệ: - Nhiệt độ: tnước = 25 – 280C - Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi (nước) = 1/2 (v/v) Li tâm Mục đích công nghệ: Khai thác: Tách sinh khối khỏi dung dịch sau trích ly Những biến đổi trình ly tâm • • Biến đổi vật lý: Khối lượng giảm dung dịch giảm, nồng độ cấu tử hòa tan tăng Biến đổi hóa lý: Tách pha Hình 2.6: Thiết bị ly tâm dạng dĩa a) Đĩa ly tâm b) Sơ đồ chuyển động dòng Chất lỏng tỉ trọng thấp Chất lỏng tỉ trọng cao Dĩa Đĩa ly tâm Kênh thoát cho chất lỏng có tỷ trọng thấp Lổ biên Cửa vào cho nguyên liệu Nguyên lý hoạt động: Nhập liệu phân phối vào đáy chén xoay, theo kênh tạo thành lỗ, vào khoảng trống dĩa, khoảng trống này, tác dụng lực ly tâm, pha nặng di chuyển xa tâm dĩa Còn pha nhẹ di chuyển vào gần tâm dĩa đẩy lên đỉnh chén xoay để thu hồi Trong thiết bị này, khoảng di chuyển chất lỏng ngắn so với thiết bị ly tâm ống thiết bị diễn trình trượt lớp chất lỏng trình ly tâm, góp phần phá vỡ hệ nhũ tương 26 Enzyme Glucoamylase - GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Thông số công nghệ Nhiệt độ : 15 – 20 oC Thời gian : – phút 27 Siêu lọc UF Mục đích công nghệ: - Chuẩn bị: Dịch thu sau phân riêng membrane tách phần nước (cô đặc) chuẩn bị cho trình sắc ký trao đổi ion Khai thác: Sau trình phân riêng, nồng độ enzyme dung dịch tăng Các biến đổi nguyên liệu: - Vật lí: nhiệt độ tăng ít, sau phân riêng độ nhớt, tỷ trọng, độ đục…của hai pha (permeate retentate) thay đổi Hóa học: biến đổi đáng kể nồng độ chất thay đổi Hóa lí: có phân riêng thành hai pha lỏng chuyển pha Hóa sinh: phản ứng thủy phân xúc tác hệ enzyme thủy phân: cellulase, amylase, protease,… tiếp tục xảy chất dung dịch Sinh học: biến đổi đáng kể Thiết bị: Thiết bị mô hình sợi (Hollow fiber module) sử dụng màng siêu lọc (UF) Hình 2.7: sợi sử dụng màng siêu lọc Cấu tạo: Thiết bị có dạng hình trụ, bên chứa nhiều sợi membran xếp song song với nhau, đường kính 1,6m Màng lọc đóng vai trò vật liệu lọc cao cấp với nhiều kích cỡ lỗ màng, từ 0,01µm đến 0,1µm Kích thước lỗ màng bé có khả giữ lại tất vật chất cần loại bỏ nguồn nước, phần tử có kích thước lớn 0,01 microns Trong thiết bị khung đỡ Trong trình hoạt động, dung dịch nguyên liệu bơm vào bên sợi membrane từ phía, đầu lại sợi membrane chỗ thoát ratentate Một số cấu tử chui qua phần thân sợi membrane để tạo dòng permeate thoát bên thiết bị hình trụ Hình 2.7: Thiết bị phân riêng mô hình sợi Nguyên lý hoạt động: Ultra Filtration(UF) công nghệ lọc dùng màng áp suất thấp để loại bỏ phân tử có kích thuớc lớn khỏi nguồn nước Dưới áp suất không 2,5 bars, nước, muối khoáng phân tử/ ion nhỏ lỗ lọc (0.01- 0.005 micron) “chui” qua màng dễ dàng Các phân tử có lớn hơn, loại virus, vi khuẩn bị giữ lại thải xả Màng lọc Ultrafiltration hoạt động theo nguyên lý: • • Từ vào trong: Lớp lọc nằm bên màng Dòng nước có chất ô nhiễm đẩy vào từ bên màng lọc Nước sau lọc thu bên màng lọc Từ ngoài: Lớp lọc nằm bên màng Dòng nước có chất ô nhiễm châm vào từ bên màng lọc Nước sau lọc thu bên màng lọc Hình 2.8: Cơ chế thẩm thấu màng lọc Thông số kỹ thuật: • Nhiệt độ làm việc: 28-30oC • • • • • • 10 Dải pH làm việc: 2~13 Khả chịu Clo: 100ppm Hàm lượng Clo mức: 200ppm Áp lực làm việc lớn nhất: 0.25 Mpa Độ đục sau lọc < 0.1NTU Loại bỏ tạp chất:100% Sấy thăng hoa Mục đích: - Chế biến: trình sấy tách bớt nước khỏi bán thành phẩm, chuyển nguyên liệu sang dạng rắn, làm thay đổi sâu sắc tính chất vất lí hóa lí bán thành phẩm Bảo quản: trình sấy làm giảm giá trị hoạt độ nước, ức chế hoạt động enzyme, chế phẩm enzyme không bị biến đổi trình bảo quản Các biến đổi nguyên liệu: - - - Vật lí: Nhiệt độ nguyên liệu giảm, tính chất vật lí nguyên liệu hình dạng, kích thước, khối lượng, tỉ trọng, độ giòn,… thay đổi Sự khuếch tán ẩm xảy chênh lệch ẩm vùng khác bên nguyên liệu Hóa học: biến đổi đáng kể Hóa lí: biến đổi hóa lí quan trọng chuyển pha nước từ lỏng thành rắn từ rắn thành Ngoài ra, giảm nhiệt độ trình sấy làm biến tính phần protein (trong có enzyme) Sinh học: biến đổi đáng kể Hóa sinh: biến đổi đáng kể Thiết bị: thiết bị sấy thăng hoa Hình 2.9: Thiết bị sấy thăng hoa liên tục Hình 2.10: Các phận thiết bị sấy thăng hoa Hình 2.11: Cấu tạo bình ngưng tụ đóng băng • • Hình 2.12: nguyên lí cấu tạo hoạt động buồng sấy thăng hoa Thiết bị sấy thăng hoa gồm hai phận sau: Hệ thống lạnh đông: để chuyển phần ẩm có nguyên liệu cần sấy sang trạng thái rắn Buồng sấy thăng hoa: để tách ẩm chuyển ẩm từ trạng thái rắn sang trạng thái Nguyên liệu lạnh đông thông qua tiếp xúc với khí lạnh Thực tế cho thấy, trình lạnh đông nguyên liệu, chuyển hóa toàn lượng ẩm trong nguyên liệu sang dạng rắn, phần ẩm dạng lỏng nguyên liệu sau giai đoạn lạnh đông Buồng sấy thăng hoa có dạng hình trụ kín, nằm ngang thẳng đứng Nguyên liệu sau giai đoạn lạnh đông vào buổng sấy thăng hoa Nguyên liệu gia nhiệt phương pháp xạ Ngoài phận gia nhiệt, buồng sấy thăng hoa kết nối với hệ thống tạo chân không Hệ thống gồm có phận tụ nước (hơi thoát từ nguyên liệu cần sấy) bơm chân không để tách cấu tử dễ bay khí không ngưng khác Quá trình sấy thăng hoa thường gồm ba giai đoạn: • • • Giai đoạn 1: lạnh đông nguyên liệu để chuyển phần nước nguyên liệu sang dạng rắn Do nhiệt độ bình thăng hoa thấp áp suất chân không lớn nên truyền nhiệt thành hộp chứa nước nóng vật liệu sấy chủ yếu xạ nhiệt Giai đoạn 2: tạo áp suất chân không gia nhiệt nguyên liệu lạnh đông buồng sấy để thăng hoa Hơi nước làm lạnh bám vào thành bình, không khí khô thải vào khí Giai đoạn 3: giai đoạn lạnh đông, chuyển toàn lượng nước nguyên liệu sang dạng rắn nên sau giai đoạn sấy thăng hoa giai đoạn sấy chân không để tách thêm phần ẩm dạng lỏng nguyên liệu, đảm bảo độ ẩm nguyên liệu sau trình sấy đạt giá trị yêu cầu Áp suất sử dụng trình sấy thăng hoa thường dao động khoảng 27 – 133 Pa Ưu điểm lớn phương pháp sấy thăng hoa không làm tổn thất cấu tử mẫn cảm với nhiệt như: vitaimin, chất có hoạt tính sinh học,…Tuy nhiên, phương pháp sấy thăng hoa tốn chi phí đầu tư trang thiết bị lượng Trong công nghiệp thực phẩm, thiết bị sấy thăng hoa sử dụng để sấy chế phẩm vi sinh vật, enzyme sản phẩm giàu hợp chất có hoạt tính sinh học Thông số công nghệ: • Áp suất bình thăng hoa : 27-133 Pa • Nhiệt độ: không 40-50oC • Độ ẩm nguyên liệu: tùy loại nguyên liệu 11 Phối trộn Mục đích: Hoàn thiện: giai đoạn ta trộn chất bảo quản chất ổn định hoạt tính enzyme vào để bảo quản hoàn thiện sản phẩm Các biến đổi nguyên liệu: • • Vật lí: nhiệt độ tăng nhẹ ma sát Hóa học, hóa lí, hóa sinh, sinh học: biến đổi đáng kể Thiết bị: Thiết bị trộn bột khô hình chữ V Hình 2.13: Thiết bị trộn bột khô hình chữ V Máy bao gồm hai trụ hình V có độ cao khác Trong suốt trình chuyển động nguyên vật liệu ống hình trụ, nguyên liệu thay đổi lặp lặp lại cách đạt hiệu trộn Thông số công nghệ: • • • • Nhiệt độ: nhiệt độ thường Thời gian trộn: 10 – 15 phút Tốc độ quay: 15 vòng/phút Tỉ lệ phối trộn 12 Đóng gói Mục đích: hoàn thiện sản phẩm, dễ dàng bảo quản vận chuyển, thương mại Các biến đổi nguyên liệu: không đáng kể Thiết bị: thiết bị đóng gói dạng bột, hạt rời Hình 2.14: Thiết bị đóng gói dạng bột, hạt rời III Sản phẩm Mô tả sản phẩm tiêu chất lượng sản phẩm Hình 3.1: Chế phẩm glucoamylase dạng rắn • • • • • Chế phẩm glucoamylase phân thành hai loại: dạng lỏng dạng rắn Mô tả chế phẩm enzyme dạng rắn Chỉ tiêu vật lý: Trạng thái vật lý: rắn Nhiệt độ hoạt động tối ưu: 58 – 600C Chỉ tiêu hóa học: pH hoạt động tối ưu: Chỉ tiêu hóa sinh: 150,000 U/g Các thông tin khác: 20 kg/túi Phạm vi sử dụng: tác nhân đường hóa trình sản xuất cồn, rượu bia, calci lactate Các phương pháp bảo quản enzyme glucoamylase Enzyme có chát protein thường bị biến tính điều kiện nhiệt độ, pH, nồng độ dung dịch đệm không thích hợp Điều kiện bảo quản tối ưu loại protein khác Tuy nhiên có vài nguyên tắc để bảo quản protein tóm tắt so sánh bảng sau Bảng 3.1: Điều kiện bảo quản enzyme Nhìn chung protein bảo quản tốt ≤ 4oC giữ hoạt tính vài ngày vài tuần Việc bảo quản nhiệt độ phòng làm giảm hay hoạt tính, thường bị nhiễm vi khuẩn Phương pháp đông khô cho phép kéo dài thời gian bảo quản mà gần không bị biến tính, protein bị hư hỏng phần trình đông khô Để giảm khả bất hoạt hoạt tính nêu đặc biệt đông khô dịch có nồng độ protein loãng (< 1mg/ml) Người ta thường bổ sung thêm protein chất mang huyết bò tinh khiết (BSA) nồng độ từ – 5mg/ml (0.1 – 0.5%), vào dung dịch protein loãng Ngoài có nhiều chất phụ gia khác bổ sung vào dịch protein để kéo dài họat tính bảo quản: - Glycerol hay ethylene glycol với nồng độ không đổi khoảng 25 – 50% giúp ổn định protein, ngăn chặn tinh thể hóa làm phá hủy cấu trúc protein – 20oC - Chất ức chế protease ngăn chặn phân hủy protein - Tác nhân chống vi khuẩn sodium azide (NaN3) nồng độ 0.02 – 0.05% (w/v) hay thimerosal - Chất tạo phức cua EDTA nồng độ – mM, tránh gây oxi hóa nhóm - S – H giúp protein trì trạng thái khử Tác nhân khử dithiothreitol (DTT) – mercatoethanol (2 – ME) nồng độ giúp ngăn chặn trạng thái oxi hóa nhóm cysteine, trì trạng thái khử protein Tài liệu tham khảo Lê Văn Việt Mẫn, Công nghệ chế biến thực phẩm, Nhà xuất đại học quốc gia Tp Hồ Chí Minh, 2010 Lê Ngọc Tú cộng sự, Hóa sinh cộng nghiệp, Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội, 2004, 443 trang Nguyễn Đức Lượng, Vi sinh vật học công nghiệp, tập 1, 2, Nhà xuất Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, 2002 Nguyễn Thị Lệ Ngọc, Nghiên cứu Các điều kiện tối ưu cho hoạt động enzyme glucoamylase từ số chủng nấm mốc ứng dụng, Tp.Hồ Chí Minh, 2010 Hoàng Bá Thanh Hải, Nghiên cứu tổng hợp đặc tính ứng dụng enzym glucoamylase dạng hòa tan dạng cố định thu nhận từ canh trường số chủng nấm mốc, Tp.Hồ Chí Minh, 2010 PGS.TSKH Lê Văn Hoàng, Các Quá Trình Và Thiết Bị Công Nghệ Sinh Học Trong Công Nghiệp, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, 356 trang [...]... mặt môi trường nhờ hệ thống vòi phun ở phía trên Thông số công nghệ: 5 Tỉ lệ giống cấy: 5 – 10% v/v Lên men Mục đích công nghệ: Khai thác, lên men nhằm thu nhận chế phẩm enzyme glucoamylase Các biến đổi diễn ra trong quá trình lên men: - - - Sinh học: biến đổi sinh học quan trọng trong quá trình lên men là sự trao đổi chất và sự sinh trưởng của nấm mốc Chúng sẽ tiết enzyme phân giải cơ chất trong môi... bị cho quá trình lên men 18 Enzyme Glucoamylase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Quá trình tiệt trùng sẽ làm giảm lượng vi sinh vật có trong nguyên liệu, tức là giảm các yếu tố cạnh tranh và các yếu tố làm thay đổi thành phần dinh dưỡng môi trường lên men, nhằm tạo điều kiện tốt cho Aspergillus Niger phát triển và tạo hệ enzyme glucoamylase Các biển đổi của nguyên liệu: - - Vật lí: trong quá trình tiệt... 1 GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trộn Mục đích công nghệ: chuẩn bị cho quá trình lên men Quá trình trộn làm cho nguyên liệu phân tán đều vào nhau, đảm bảo thành phần dinh dưỡng ở mọi vị trí là gần như nhau để thích hợp cho vi sinh vật sử dụng Các biến đổi của nguyên liệu: do đây là quá trình phối trộn vật liệu rời nên trong quá trình phối trộn thường không tạo ra biến đổi nào đáng kể • • • • • Vật lí:... van bảo hiểm Thông số công nghệ: - Nhiệt độ: 1210C - Thời gian: 20 – 30 phút 3 Quá trình nhân giống Mục đích công nghệ: Chuẩn bị cho quá trình cấy giống, thu nhận bào tử vi sinh vật chuẩn bị cho quá trình nuôi cấy thu nhận enzyme glucoamylase Các biến đổi trong quá trình nhân giống: - - Sinh học: vi sinh vật thực hiện quá trình trao đổi chất và sinh sản tạo ra nhiều tế bào mới Hóa sinh: các phản ứng hóa... trường một lượng phụ liệu trong khoảng 15 – 20% Mặc khác, để tăng cường quá trình sinh tổng hợp enzyme thì cần phải bổ sung vào môi trường nuôi vi sinh vật những chất cảm ứng để cảm ứng tổng hợp enzyme 16 Enzyme Glucoamylase II GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Quy trình công nghệ Nguyên liệu Trộn Tiệt trùng Cấy giống Nấm mốc Nhân Lên men Nghiền Nước Chất độn Bao bì Trích li Bã Li tâm Siêu lọc UF Bã Sấy thăng... một số biến đổi về pha trong quá trình lên men như sự hòa tan một phần oxy do việc sục khí và khuấy trộn canh trường, khí CO2 do vi sinh vật thải ra trong quá trình phân giải cơ chất cũng sẽ hòa tan một phần trong canh trường… Vật lý: sự tăng nhiệt độ canh trường do năng lượng được thải ra từ hoạt động sống của vi sinh vật, sự thay đổi về tỷ trọng, khối lượng… Quá trình nuôi cấy nấm mốc thường kéo... Mẫn Các biến đổi của nguyên liệu: • Vật lí: quan trọng nhất trong quá trình nghiền là kích thước nguyên liệu sẽ giảm, diện tích bề mặt riêng tăng lên Việc tăng diện tích bề mặt riêng có thể là tăng hiệu quả của quá trình truyền nhiệt và truyền khối Trong quá trình nghiền, dưới tác dụng của các lực, nhiệt độ của vật liệu sẽ tăng lên, chủ yếu do lực ma sát • Hóa học: Khi nghiền vật liệu, cấu trúc của... công nghệ: Chuẩn bị cho quá trình lên men thu nhận chế phẩm enzyme glucoamylase Các biến đổi của nguyên liệu: Không có biến đổi đáng kể Thiết bị: Thiết bị phun bào tử vi sinh vật Môi trường sau khi được xử lý sẽ được phân phối vào các khay rồi được đưa vào một thiết bị kín có băng tải, các khay di chuyển trên băng tải, giống được cấy vào môi trường bằng cách phun bào tử lên bề mặt môi trường nhờ hệ... canh trường, do trong quá trình sinh trưởng một phần năng lượng sẽ được vi sinh vật thải ra bên ngoài tế bào dưới dạng nhiệt năng Nhân giống bao gồm 2 quá trình: • • Trong phòng thí nghiệm: Ở số lượng nhỏ Môi trường nhân giống được đưa tiệt trùng, sau đó cấy giống vi sinh vật vào môi trường và cho sinh trưởng ở điều kiện bình thường Trong phân xưởng: Ta sử dụng thiết bị lên men hình trụ, có cánh khuấy,... khí thải khỏi các bào tử 6 Nghiền Mục đích công nghệ: chuẩn bị cho quá trình trích ly Quá trình nghiền làm cho nguyên liệu như cám mì, cám trở nên tơi xốp hơn, làm tăng diện tích bề mặt tiếp xúc và tăng hiệu quả sử dụng cơ chất, đồng đều về kích thước và dễ phối trộn Ở đây, do cám mì và cám gạo đã ở sẵn dạng bột, ta có thể bỏ qua quá trình nghiền, tuy nhiên nếu nguyên liệu xuất hiện nhiều hạt kích thước ... 14 đầu, xảy trương đính bào tử bắt đầu mọc nấm Trong thời kỳ phòng nuôi cấy cần giữ nhiệt độ không 28 – 300C, để không kiềm hãm phát triển ban đầu chúng Qua thời gian trên, hệ sợi nấm bắt đầu. .. tách gốc gluco từ đầu không khử chuỗi polysaccharide Enzym glucoamylase xúc tác phản ứng thủy phân tinh bột tách gốc glucose từ đầu không khử chuổi polysaccharide Gốc gluco từ đầu không khử gọi... Enzyme glucoamylase xúc tác tách gốc glucose từ đầu không Enzyme Glucoamylase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn khử chuỗi polysaccharide Gốc glucose từ đầu không khử gọi glycone, chuỗi oligosaccharide