Xác định hàm lượng vitamin c trong nước ép hoa quả bằng phương pháp vôn ampe

Theo nghiên cứu, Vit.C là một hợp chất có tính khử, có thể phân tích bằng các phương pháp điện hoá, đặc biệt là phương pháp cực phổ.. Đây là một trong những phương pháp phân tích hợp chấ

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô trong tổ phân tích, các thầy cô trong khoa Hoá, các thầy cô giáo trong Trường ĐHSP Hà Nội 2 và các bạn sinh viên Đặc biệt em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của

mình tới thầy TS Nguyễn Văn Hải - người đã tận tình giúp đỡ em trong quá

trình hoàn thành khoá luận

Do lần đầu tiên làm quen với công tác nghiên cứu khoa học Hơn nữa

do thời gian và năng lực của bản thân còn hạn chế nên không tránh khỏi những thiếu sót Em kính mong nhận được sự đóng góp ý kiến của các thầy

cô và các bạn sinh viên để khoá luận của em được hoàn thiện và có nhiều ứng dụng trong thực tế

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 05 năm 2010

Sinh viên thực hiện

Đỗ Thị Cam

LỜI CAM ĐOAN

Tôi khẳng định rằng: Đây là công trình nghiên cứu khoa học của riêng tôi do chính sức lực của bản thân tôi đã nghiên cứu và hoàn thành trên cơ sở những kiến thức đã học và tài liệu tham khảo Nó không trùng với bất cứ kết quả người nào khác

Hà Nội, tháng 05 năm 2010

Sinh viên thực hiện

Đỗ Thị Cam

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN

LỜI CAM ĐOAN

MỞ ĐẦU 1

NỘI DUNG 3

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ VITAMIN C 3

1.1.1 Công thức và nhận định 3

1.1.2 Tính chất hóa học 4

1.1.3 Hoạt tính sinh hóa 7

1.1.4 Các nguồn cung cấp Vit.C 8

1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VITAMIN C 9

1.2.1 Phương pháp hóa học 9

1.2.2 Nhóm các phương pháp phân tích công cụ 10

1.2.2.1 Các phương pháp phân tích quang học 11

1.2.2.2 Các phương pháp phân tích điện hóa 13

Chương 2: THỰC NGHIỆM 22

2.1 DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT 22

2.1.1 Dụng cụ 22

2.1.2 Thiết bị, máy móc 22

2.1.3 Hóa chất 22

2.2 CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 23

2.2.1.Nghiên cứu cơ bản 23

2.2.1.1 Khảo sát tính chất cực phổ của Vit.C trong một số nền 24

2.2.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của oxi hòa tan 26

2.2.1.3 Khảo sát pH của nền axetat 26

2.2.1.4 Khảo sát nồng độ nền axetat 26

2.2.1.5 Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính 27

2.2.1.6 Khảo sát các chất ảnh hưởng 31

2.2.1.7 Khảo sát độ bền của Vit.C theo thời gian 31

2.2.2 Ứng dụng xác định Vit.C trong mẫu thực tế 32

2.2.2.1 Kỹ thuật xử lý mẫu thực tế 32

2.2.2.2 Phương pháp xử lý kết quả 32

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU XÁC ĐỊNH VIT.C BẰNG PHƯƠNG PHÁP VÔN-AMPE 34

3.1.1 Chọn nền 34

3.1.2 Ảnh hưởng của oxi hòa tan 36

3.1.3 pH của nền đệm axetat 38

3.1.4 Nồng độ dung dịch đệm axetat 41

3.1.5 Khoảng nồng độ tối ưu 42

3.1.5.1 Xây dựng đường chuẩn 42

3.1.5.2 Kiểm tra đường chuẩn 44

3.1.5.3 Giới hạn phát hiện của phương pháp 46

3.1.6 Khảo sát các chất ảnh hưởng 46

3.1.6.1 Khảo sát ảnh hưởng của các axit hữu cơ 47

3.1.6.2 Khảo sát ảnh hưởng của ion clorua 48

3.1.7 Độ bền của Vit.C trong các môi trường khác nhau 50

3.2 XÁC ĐỊNH VIT.C TRONG MẪU THỰC TẾ 53

3.2.1 Mẫu nước trái cây tươi 53

3.2.1.1 Nước dứa ép 53

KẾT LUẬN 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

Vit.C còn được sử dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm với vai trò là chất chống oxi hoá Nó giúp cho các sản phẩm được giữ tươi ngon trong quá trình bảo quản Nhiều loại hàng hoá trên thị trường như nước giải khát, nước ép trái cây đóng hộp, bột dinh dưỡng cho trẻ em… chứa Vit.C nhằm duy trì chất lượng cũng như là một tiêu chí quảng cáo sản phẩm

Các loại rau và hoa quả là những nguồn cung cấp Vit.C tự nhiên, rất tốt cho sức khoẻ Ngoài ra Vit.C cũng được tổng hợp theo con đường nhân tạo, đáp ứng nhu cầu cao về vitamin của cơ thể người cũng như của các ngành công nghiệp có liên quan

Theo nghiên cứu, Vit.C là một hợp chất có tính khử, có thể phân tích bằng các phương pháp điện hoá, đặc biệt là phương pháp cực phổ Đây là một trong những phương pháp phân tích hợp chất hữu cơ nhanh và đạt được độ chính xác cao, hơn thế nữa chi phí cho máy móc và hoá chất rất phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm ở Việt Nam Vì vậy tôi chọn đề tài nghiên cứu:

“Xác định hàm lượng Vitamin C trong nước ép hoa quả bằng

phương pháp vôn- ampe”

Nhiệm vụ chính đặt ra:

- Nghiên cứu quy trình xác định Vit.C bằng phương pháp vôn- ampe một cách nhanh chóng, độ chính xác cao, chi phí thấp, dễ thực thi trong các phòng thí nghiệm ở Việt Nam

- Đánh giá độ tin cậy của quy trình phân tích

- Ứng dụng xác định Vit.C trong nước ép hoa quả đặc trưng là nước dứa ép

NỘI DUNG

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ VIT.C

1.1.1 Công thức và nhận định

Vit.C là tên thường gọi của axit L- ascobic, có tên quốc tế là:

2- oxo- L- threo- hexono- 1,4- lactone-2,3- enediol hoặc

(R)- 3,4- đihydroxy- 5- ((S)- 1,2- đihydroxylethyl)furan- 2(5H)- one

O

CH2OHOH

1 2 3 4 5 6

Axit ascobic rắn là những tinh thể đơn tà, không màu, không mùi, có vị chua, nóng chảy ở 1930C Axit ascobic dễ tan trong nước, ít tan hơn trong rượu và không tan trong các dung môi hữu cơ không phân cực

Axit ascobic rất dễ bị phân huỷ dưới tác dụng của ánh sáng, nhiệt độ vì vậy cần bảo quản axit ascobic trong bóng tối và nhiệt độ thấp

CH2OH OH

+ 2H+ + 2e

Axit L-ascobic Axit L-đehidroascobic

Thế khử của nó phụ thuộc nhiều vào pH của môi trường

Axit ascobic ở dạng khan khá bền vững, nhưng do trong phân tử có 2 nhóm OH đính vào C chưa no (C2,C3) nên khi bị ẩm ướt hoặc ở trong dung dịch nó rất dễ bị oxi hoá, ngay cả bởi oxi không khí nhất là khi có mặt các ion kim loại đồng, sắt, magiê theo phản ứng sau:

O

O

OH O

CH2OH

OH

+ H2O + 1/2 O2

Sản phẩm tạo ra là axit L- đêhidroascobic, chất này cũng có hoạt tính sinh học tương tự như axit L- ascobic, nhưng không bền, nó dễ bị phân huỷ

phá vòng tạo axit 2,3- đixetogulonic CH2OH-(CHOH)2-CO-CO-COOH, là chất không có tác dụng sinh lý

Tốc độ oxi hoá axit ascobic thành axit L- đehidroascobic càng lớn khi

pH càng tăng Các chất saccarozo, carotenoit, flavonoit… có khả năng làm chậm quá trình oxi hoá của axit ascobic nên được dùng làm chất ổn định hoá Vit.C

Cơ chế sự phân huỷ của axit ascobic bởi chất oxi hoá có thể được biểu diễn theo sơ đồ sau:

O OH

Axit L- ascobic

2H +

2e 2e 2H +

Axit L- dehidroascobic

H2O

COOH

OH HO Axit 2,3- dixetogulonic

OOH [ O] C

CH2OH

HO [ O]

COOH COOH

[ O]

O C

-Có thể thấy, axit L- ascobic đầu tiên bị oxi hoá thành axit L- đehidroascobic Dưới tác dụng của nước, axit L- đehidroascobic bị thuỷ phân

mở vòng tạo thành axit 2,3- đixetogulonic không còn hoạt tính vitamin nữa Phản ứng này không thuận nghịch, tăng nhanh theo pH và nhiệt độ của dung dịch Tiếp theo, axit 2,3- đixetogulonic bị phân huỷ thành một loạt các sản phẩm trung gian khác, cuối cùng tạo axit oxalic

Ngoài sự phân huỷ theo kiểu oxi hoá, axit ascobic còn có xu hướng phân huỷ theo kiểu thuỷ phân trong môi trường kiềm hoặc axit mạnh thành fufurol và các sản phẩm khác qua phản ứng decacboxyl hoá và đehydrat hoá

Tương tự như vậy, axit ascobic dễ dàng nhường hidro cho các peoxit,

vì vậy ngăn không cho các peoxit oxi hoá các hợp chất khác Do đó người ta

sử dụng axit ascobic làm chất chống oxi hoá trong công nghiệp chế biến

O

OH

CH2OH

H2O NaOH

O

Các muối này dễ tan trong nước hơn axit ascobic nên trong công nghiệp

họ sử dụng dạng muối của axit ascobic làm chất bảo quản các dung dịch nước quả

Trong dung dịch kiềm đặc, vòng γ- lacton bị phá vỡ tạo muối gluconat

O

Tuy nhiên khi axit hoá và đun nhẹ thì vòng lacton lại lặp lại

c, Tác dụng với axit hữu cơ tạo este

Trong CTCT của axit ascobic có nhiều nhóm OH như nhóm chức rượu,

có khả năng tạo este với các axit hữu cơ, đặc biệt là các axit béo như axit panmitic, axit stearic Sản phẩm este dạng 6- O- axyl L- ascobic (ascobyl panmitat, ascobyl stearat) có mạch cacbon dài, dễ tan trong dầu Những este này được tổng hợp dùng làm chất bảo quản chất béo trong công nghiệp chế biến Một số dẫn xuất khác của axit ascobic cũng được sử dụng là:

O

OR HO

O

CH2OH OH

3- O- ankyl axit ascobic

O O

OH HO

O O R

5,6- O- ankyliden

O

OH HO

O OH

1.1.3 Hoạt tính sinh hoá

Vit.C có tác dụng tăng cường sức đề kháng cho cơ thể, chống lại các hiện tượng choáng hoặc ngộ độc hoá chất, độc tính của vi trùng do tính chất khử mạnh của Vit.C

Vit.C tham gia vào quá trình oxi hoá khử khác nhau của cơ thể như: chuyển hoá hợp chất thơm thành phenol; quá trình hydroxyl hoá triptophan thành hydroxyltriptophan; điều hoà sự tạo AND từ ARN; chuyển procolagen thành colagen, nhờ có quá trình hydroxyl hoá prolin thành oxyprolin cần thiết cho việc tổng hợp colagen, vì vậy Vit.C làm cho vết thương mau lành

Vit.C có vị trí quan trọng trong quá trình hình thành các hoormon của tuyến giáp trạng và tuyến trên thận

Khi cơ thể thiếu Vit.C sẽ xuất hiện các triệu chứng bệnh lý như chảy máu ở lợi, răng, lỗ chân lông hoặc các cơ quan nội tạng Đó là do thành các mạch máu bị mỏng

Cơ thể bình thường có nhu cầu Vit.C trong 24 giờ là 60- 80 mg

1.1.4 Các nguồn cung cấp Vit.C

Trong tự nhiên, thực vật tổng hợp được Vit.C có nhiều trong rau xanh đặc biệt là ớt và các loại rau cải, rau ngót…, trong các loại quả như cam, chanh, bưởi, ổi, khế, táo, dưa hấu… Không thấy xuất hiện Vit.C trong các sản phẩm từ động vật như thịt, trứng, sữa…

Một số cơ thể sống có khả năng tổng hợp Vit.C từ D- glucozơ nhờ tác dụng của enzim theo sơ đồ sau:

H OH HOHC

COOH

enzim[ H]

COOH

OH H

H HO

OH H

OH H

CH2OH

enzim[ O]

CH2OH OH

O O

Ax it L- ascobic D- glucozo

Ngoài ra con người tổng hợp Vit.C nhằm các mục đích khác nhau Các chế phẩm dược chỉ chứa Vit.C, hay các viên Vitamin tổng hợp trong đó có Vit.C dùng mục đích chữa bệnh, tăng cường sức đề kháng cho người ốm Các loại nước hoa quả giải khát, bột dinh dưỡng trẻ em, sữa… chứa một lượng nhỏ Vit.C, là một tiêu chí quảng cáo cho sản phẩm Một lượng lớn Vit.C làm chất bảo quản thực phẩm

1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VIT.C

Có thể chia các phương pháp xác định Vit.C thành 2 nhóm lớn:

- Nhóm các phương pháp phân tích hoá học

- Nhóm các phương pháp phân tích công cụ

1.2.1 Phương pháp phân tích hoá học

Trong các phương pháp phân tích hoá học, phương pháp chuẩn độ oxi hoá khử được sử dụng nhiều nhất, dựa vào tính chất dễ bị oxi hoá thành axit đehidroascobic của axit ascobic Để oxi hoá người ta sử dụng các thuốc thử khác nhau như: 2,6- điclophenolindophenol, brom, iot, thuốc thử Feling…

2,6- điclophenolindophenol được coi như là thuốc thử chuẩn dùng để chuẩn độ xác định Vit.C một cách trực tiếp Nó là một chất oxi hoá có màu xanh đậm, có công thức phân tử là C12H6Cl2NO2,  maxtrong dung dịch nước =

602 nm Khi phản ứng với axit ascobic nó bị khử thành một hợp chất không màu

C6H8O6 → C6H6O6 + 2H++ 2e

-C12H7Cl2NO2 + 2H+ + 2e- → C12H9Cl2NO2Người ta có thể theo dõi quá trình chuẩn độ bằng mắt, đo quang hay đo điện thế

Việc chuẩn độ axit ascobic thông thường được tiến hành bằng cách nhỏ

từ từ dung dịch thuốc thử từ buret vào dung dịch nghiên cứu chứa axit ascobic trong môi trường có pH thích hợp Điểm cuối chuẩn độ được nhận ra khi có

sự xuất hiện màu của giọt thuốc thử dư đầu tiên Tuy nhiên trong các đối tượng như rau quả, lương thực, thực phẩm thường chứa các chất khử khác nữa và dung dịch nghiên cứu thường có màu và đục, gây khó khăn cho việc xác định điểm cuối chuẩn độ

Người ta cũng có thể chuẩn độ axit ascobic bằng dung dịch iot, với chất chỉ thị hồ tinh bột để xác định Vit.C trong bắp cải, hoặc chuẩn độ gián tiếp, xác định Vit.C trong mật ong, bằng cách thêm lượng dư dung dịch KBr vào dung dịch mẫu đã được axit hoá bằng dung dịch H2SO4 1:1 Hỗn hợp này được chuẩn độ bằng dung dịch KBrO3 cho đến khi xuất hiện kết tủa màu vàng của Br2 dư

độ iot bằng dung dịch natri thiosunphat chuẩn

Tuy nhiên các phương pháp chuẩn độ tiến hành khá phức tạp, đồng thời

có độ chọn lọc, độ nhạy và độ chính xác không cao Vì vậy từ khi các phương pháp phân tích công cụ ra đời, người ta đã khắc phục được rất nhiều nhược điểm của các phương pháp phân tích hoá học

1.2.2 Nhóm các phương pháp phân tích công cụ

Thời gian gần đây, cùng với sự phát triển như vũ bão trong tất cả các lĩnh vực của xã hội, những yêu cầu đặt ra cho ngành phân tích là phải nhanh chóng, chính xác, qui trình đơn giản, lượng mẫu tiêu thụ nhỏ, không những tiết kiệm tiền của, công sức mà cả thời gian cho xã hội Với sự hỗ trợ của các phương pháp phân tích công cụ và những thiết bị hiện đại, việc xác định Vit.C cũng đã đạt được những yêu cầu đó Đặc biệt quy trình phân tích nhanh và đa

số trường hợp không phải xử lý mẫu trước đã giảm thiểu được sự mất mát Vit.C trong quá trình định lượng

Các phương pháp công cụ có thể xác định Vit.C gồm nhóm các phương pháp phân tích quang học và nhóm các phương pháp phân tích điện hóa

Trong đó hầu hết các phương pháp đều xác định Vit.C một cách gián tiếp Như đã trình bày, dung dịch Vit.C là không màu, do đó không thể cho tín hiệu đo quang ở vùng khả kiến, vì vậy người ta thường dùng một tính chất nào đó của Vit.C mà sự biến đổi nồng độ Vit.C sẽ gây ra tín hiệu quang biến đổi tương ứng, cùng tăng hoặc cùng giảm theo hàm lượng Vit.C Hay khi dùng phương pháp hấp thụ nguyên tử, do Vit.C rất dễ bị phân hủy ở nhiệt cao nên không thể cho tín hiệu trực tiếp trên máy AAS Người ta dùng một ion kim loại mang tính oxi hóa (ví dụ Fe (III)) để tác dụng với Vit.C theo tỉ lệ xác định Việc xác định hàm lượng kim loại đó trên máy AAS là dễ dàng, từ đó có thể tính ra hàm lượng Vit.C bằng phương pháp cực phổ, sử dụng điện cực giọt thủy ngân, là trực tiếp dựa trên tính chất oxi hóa khử của Vit.C Ngoài điện cực giọt Hg, người ta còn dùng các điện cực biến tính, bằng cách tạo một lớp màng có hoạt tính điện hóa với Vit.C trên bề mặt điện cực rắn

Để hỗ trợ thêm cho các phương pháp phát hiện Vit.C, các kĩ thuật tách cũng được kết hợp để tăng độ chính xác, độ nhạy và độ chọn lọc của phương pháp phân tích Có thể kể đến các kĩ thuật sắc kí, gồm sắc ký khí (GC)[25], sắc

ký lỏng cao áp (HPLC)[22,23], kỹ thuật tiêm mẫu phân tích vào dòng chảy (FIA)[17,27,28]

1.2.2.1 Các phương pháp phân tích quang học

Vit.C là chất rắn dạng tinh thể không màu, dung dịch Vit.C cũng trong suốt nhưng nó dễ bị oxi hóa và có tác dụng ức chế hay xúc tác cho các phản ứng phát quang Thông qua đó người ta có thể định lượng Vit.C

Các tác giả sử dụng các chất oxi hóa khác nhau và thông qua nó gián tiếp xác định hàm lượng Vit.C

Theo, kali cromat được sử dụng làm chất oxi hóa axit ascobic, kali cromat còn dư sẽ phản ứng với điphenyl cacbazit (DPC)có mặt axit nitric tạo phức màu có max 548nm sẽ tỷ lệ thuận với lượng kali cromat dư, và tỷ lệ nghịch với lượng Vit.C trong mẫu

2CrO42- + 3C6H8O6 +10H+ → Cr3+ + 3C6H6O6 + 8H2O CrO4

+ sym- DPC → Cr- DPCphức (max 548nm) Cr(III) tạo ra trong phản ứng thứ nhất là rất nhỏ nên không đóng góp đáng kể vào mật độ quang A đo ở max 548nm Ưu điểm của phương pháp là

sử dụng hóa chất đơn giản, dễ kiếm, máy đo quang không đắt tiền, phổ biến trong các phòng thí nghiệm

Hơn nữa, theo nghiên cứu thì các chất khác có mặt trong đối tượng nghiên cứu cùng với Vit.C: các hợp chất glucozo, fructozo, sucrozo, lactozo, saccarozo; các axit thường xuất hiện trong trái cây như axit xitric, axit oxalic, axit malic, axit tactric; các muối natri clorua, canxi clorua; các chất có thể xuất hiện trong thuốc tổng hợp như axit benzoic, axit salixilic, axetaminophen,… không gây ảnh hưởng đến kết quả đo ở mức sai số  5 %

khi hàm lượng của chúng gấp 200 lần lượng axit ascobic

Trong điều kiện thí nghiệm đó, tác giả và cộng sự đã xây dựng được đường chuẩn tuyến tính đến hàm lượng Vit.C đến 5g / mL(tương ứng với 5ppm, khoảng 3.10-5 mol/L), và giới hạn phát hiện tới 0,02 g / mL(20ppm, khoảng 10-7 mol/L) Ứng dụng xác định Vit.C trong thuốc viên và thuốc nước chứa Vit.C, nước ép hoa quả, các loại rượu hoa quả cho kết quả tốt

Chen, Xu- wei và các cộng sự đã nghiên cứu quy trình xác định Vit.C bằng phương pháp tiêm mẫu vào dòng chảy kết nối với detecto đo quang Trên cơ sở sử dụng Fe(III) làm chất oxi hóa axit ascobic, sản phẩm Fe(II) sinh

ra tạo phức màu với 2,2’- dipiridin trong môi trường axit yếu (pH = 5), kết quả đo A ở max 523nm sẽ tỷ lệ thuận với lượng axit ascobic trong mẫu Ưu điểm của phương pháp này là khả năng tự động hóa, cho phép xác định 60 mẫu thuốc/giờ

Trong khi đó, Yebra- Biurrun và cộng sự lại sử dụng pemanganat làm chất oxi hóa axit ascobic, dùng kỹ thuật FIA và đầu ghi AAS để xác định hàm lượng Mn(VII) còn dư, Mn(II) tạo ra sẽ được giữ trên lớp nhựa poly(axit aminophotphoric) sẽ không gây ảnh hưởng đến kết quả xác định Mn(VII) dư Theo báo cáo cho biết thì giới hạn phát hiện chỉ khoảng 0,06 mg/mL (khoảng

60 ppm, 3,5.10-4 mol/L), tuy nhiên điều này không quan trọng lắm, vì hàm lượng Vit.C trong mẫu phân tích thường lớn Nhưng quy trình phân tích này cho phép xác định tự động 90 mẫu/h, có khả năng ứng dụng trong các phòng phân tích của các nhà máy

Việc tăng độ nhạy xác định Vit.C đạt được khi sử dụng các phản ứng quang hóa mà axit ascobic có tác dụng xúc tác cho quá trình chuyển mức năng lượng Dựa trên phản ứng quang hóa của Rodamin B và Ceri(IV) trong môi trường axit sunfuric, quy trình cho phép xác định Vit.C tới 10-13

mol/L, đường chuẩn tuyến tính trong khoảng 3,8.10-13

đến 10-10mol/L

Vit.C có khả năng phản ứng với nhiều chất oxi hóa khác nhau, do vậy các tài liệu nghiên cứu xác định hàm lượng Vit.C bằng phương pháp phân tích quang học rất phong phú và đa dạng Tuy nhiên không tránh khỏi một phần Vit.C có thể phản ứng với các chất oxi hóa đó

1.2.2.2 Nhóm các phương pháp phân tích điện hóa

1.2.2.2.1 Sơ lược về phương pháp phân tích vôn- ampe

 Nguyên tắc của phương pháp

Nhóm phương pháp phân tích vôn- ampe (cực phổ) là những phương pháp phân tích quan trọng nhất trong số các phương pháp phân tích điện hóa

Phương pháp này đều dựa trên lý thuyết về quá trình điện cực, phụ thuộc chủ yếu vào việc đưa chất điện hoạt từ trong lòng dung dịch đến bề mặt điện cực làm việc và ghi đường vôn- ampe (đường biểu diễn sự phụ thuộc cường độ dòng Faraday vào giá trị thế của điện cực làm việc so với điện cực so sánh)

Hình 1.1: Sơ đồ thiết bị phân tích von- ampe

 Điện cực làm việc:

Trong các phương pháp phân tích vôn- ampe, điện cực làm việc thường dùng là: điện cực giọt Hg, điện cực rắn làm từ Platin, vàng, bạc hoặc cacbon kính

Phương pháp phân tích cực phổ sử dụng điện cực giọt Hg, hay dùng là điện cực giọt treo (HMDE), điện cực giọt rơi (DME), và điện cực giọt tĩnh (SMDE) Điện cực là giọt Hg lỏng hình cầu có đường kính khá nhỏ ( 1mm), được rơi ra từ một mao quản có chiều dài khoảng 10- 15cm, với đường kính trong khoảng 30- 50m, mao quản được nối với bình chứa Hg bằng một ống dẫn nhỏ polietilen

Trong điện cực giọt rơi, giọt Hg liên tục được hình thành ở đầu ống mao quản và rơi ra do lực hấp dẫn, kích thước và chu kì (hay tốc độ chảy) của giọt Hg được điều khiển bởi kích thước mao quản và chiều cao của bình chứa

Hg Tốc độ đó được quy ước tính bằng khối lượng Hg rơi ra khỏi mao quản trong một đơn vị thời gian (theo mg/s) Thông thường người ta chọn kích thước mao quản và chiều cao bình chứa sao cho tốc độ chảy khoảng 1,5 4,0 mg/s Chu kì mỗi giọt khoảng từ 2- 6s

Trong điện cực giọt treo (thường dùng trong phân tích vôn- ampe hòa tan và vôn- ampe vòng), giọt Hg có kích thước nhỏ, có thể thay đổi được tùy theo yêu cầu thực nghiệm Giọt được hình thành rất nhanh và được giữ ở đầu mao quản trong quá trình đo

Ưu điểm của điện cực giọt Hg

- Khoảng thế phân tích rộng, quá thế H2 trên điện cực giọt Hg lớn, vì vậy mở rộng khoảng thế phân tích đến -1V (so với điện cực calomen bão hòa) trong môi trường axit và đến -2V trong môi trường bazo Tuy nhiên do có quá trình oxi hóa của Hg lỏng nên điện cực chỉ được sử dụng đến -0,3V hoặc 0,4V (so với điện cực calomen bão hòa) tùy môi trường

- Bề mặt giọt luôn được đổi mới và không bị làm bẩn bởi sản phẩm của phản ứng điện cực

- Với các điện cực hiện đại, giọt Hg được điều khiển bởi hệ thống van khí, do vậy độ lặp lại của giọt cao, tăng độ lặp, độ đúng và độ chính xác khi phân tích

- Kích thước giọt lên lượng chất tiêu tốn khi phân tích là không đáng

kể, do đó sự giảm nồng độ trong quá trình phân tích do sự oxi hóa khử trên điện cực thực tế là không xảy ra

 Điện cực so sánh:

Thường hay sử dụng điện cực Ag/AgCl hay điện cực calomen bão hòa Điện cực so sánh phải có thế ổn định

 Sóng cực phổ khuếch tán:

- Sóng cực phổ cổ điển có dạng bậc thang, dòng cực đại id tỷ lệ tuyến tính với nồng độ chất phân tích trong dung dịch id = f(C), người ta lợi dụng tính chất này để phân tích định lượng Tuy nhiên sóng cực phổ cổ điển có độ phân giải không cao cũng như có dòng dư lớn Do đó hạn chế độ nhạy của phương pháp chỉ xác định được 10-5

M, và khả năng xác định nhiều chất cùng trong một hỗn hợp là khó khăn, độ chọn lọc kém (Hình 1.2)

- Với kỹ thuật quét thế, kỹ thuật ghi dòng hiện đại đã khắc phục được nhược điểm đó, đồng nghĩa với tăng độ nhạy lên rất nhiều Có thể kể đến

+ Cực phổ sóng vuông (SqW)

+ Cực phổ dòng xoay chiều hình sin (AC)

+ Cực phổ xung thường và xung vi phân (NP và DP)

+ Các phương pháp vôn- ampe trên điện cực đĩa quay

+ Phân tích điện hóa hòa tan

Với độ nhạy đối với

+ Cực phổ sóng vuông và xung vi phân 10-6 - 10-8 M + Vôn- ampe hòa tan anot điện cực giọt Hg treo 10-6- 10-9 M + Vôn- ampe hòa tan anot dùng cực màng Hg 10-8- 10-10 M trên cực rắn đĩa

Có thể thấy các phương pháp phân tích điện hóa rất phong phú đa dạng Phạm vi đối tượng nghiên cứu rộng, cả hai hợp chất vô cơ và hàng nghìn hợp chất hữu cơ các loại Trong đó Vit.C là một trong những hợp chất hữu cơ được nghiên cứu ứng dụng xác định theo nhiều cách khác nhau dưới lý thuyết của các phương pháp phân tích điện hóa

1.2.2.2.2 Ứng dụng các phương pháp phân tích điện hóa xác định Vit.C

Phương pháp phân tích điện hóa được dùng chủ yếu là các phương pháp phân tích cực phổ và phương pháp vôn- ampe Trong đó việc sử dụng điện cực thủy ngân đặc biệt là có sự hỗ trợ thiết bị điên tử, kết nối với máy vi tính, tăng độ nhạy và độ chính xác của phép phân tích nên rất nhiều, đồng thời quy trình cho phép phân tích nhanh, không cần xử lý mẫu phức tạp, tránh được sự mất mát Vit.C do sự oxi hóa của không khí

Trước năm 1950, phương pháp cực phổ cổ điển đã được áp dụng xác định hàm lượng Vit.C trong nhiều mẫu thuốc, rau, quả Nhiều công trình nghiên cứu đã tìm được điều kiện thích hợp cho phép xác địnhVit.C Tuy nhiên do giới hạn của phương pháp cực phổ cổ điển, mà việc xác định lượng Vit.C vẫn bị gây cản trở bởi một số chất có thế khử gần với thế khử của axit ascobic Các loại hợp chất sunfuhydryl thường có mặt trong các mô thực vật

là một trong số đó Vì vậy đối tượng phân tích còn hạn chế

Gần đây, các kỹ thuật quét thế và ghi dòng được hỗ trợ bởi các thiết bị điện tử hiện đại, những máy điện hóa đa chức năng ra đời và rất phổ biến ở các phòng thí nghiệm Những nhược điểm đó được khắc phục, nhưng không nhiều công trình nghiên cứu xác định Vit.C trực tiếp trên điện cực giọt thủy ngân mà một số nghiên cứu đi theo hướng chế tạo điện cực biến tính, điện cực sinh học Chủ yếu là tạo màng sinh học, hay màng polime, các loại màng được chế tạo đều có khả năng hoạt động điện hóa với axit ascobic

Theo tác giả, thì sự xuất hiện của ion Cu2+

có mặt trong các enzim trong

vỏ quả dưa chuột, và các loại quả khác, cũng như các ion Cu2+

, Ni2+ được tạo

ra trên bề mặt màng polyme là tác nhân oxi hóa axit ascobic Tín hiệu đo được tỷ lệ thuận với hàm lượng axit ascobic trong mẫu phân tích Các chất khác có mặt trong mẫu đều không ảnh hưởng đến phép phân tích Giới hạn phát hiện theo những nghiên cứu này đạt được lớn nhất là 2,5.10-7

M

Khả năng tự động hóa tăng lên, cho phép xác định 120 mẫu/h Tuy nhiên tuổi thọ của các điện cực này ngắn, do trong quá trình phân tích, axit ascobic đã khử các ion kim loại trên bề mặt điện cực Để duy trì điện cực người ta thường cho thêm vào hỗn hợp phản ứng một chất oxi hóa để tái tạo các ion trên bề mặt, Julio Cesar đã dùng H2O2 là chất oxi hóa giúp tái tạo ion

Cu2+ từ Cu+, là sản phẩm của phản ứng điện cực với axit ascobic

Quay trở lại điện cực giọt Hg, ngoài nhược điểm duy nhất là tính độc của Hg thì nó vẫn là điện cực tối ưu trong phương pháp cực phổ xác định các chất hữu cơ Tuy nhiên các hãng sản xuất cũng đã khắc phục tối đa nhược điểm này, kích thước hạt nhỏ (đường kính < 1 mm), nếu sử dụng giọt treo khối lượng thủy ngân cho một phép đo là không đáng kể, có thể thu hồi được,

ví dụ một giọt Hg ở thiết bị phân tích điện hóa đa năng VA757 của Metrohm

có diện tích bề mặt từ 0,15 đến 0,60 mm2

Thế của axit ascobic trên điện cực Hg, trong điều kiện nền thích hợp, (so với điện cực Calomen bão hòa) cách khá xa thế khử của các ion kim loại cũng như các vitamin và các hợp chất khác Các vitamin A, D, B1, B2, B3, B12, Bc đều có sóng cực phổ ở khoảng thế âm, từ -0,3V của Vit.B2trong nền đệm Britton- Robinson pH = 1,81 đến -2,01V của Vitamin D2 trong nền H2O: dioxan 1:9, TBAOHO 1M, còn thế của Vit.C là +0,23V trong nền axetat 0,05M pH = 3, NaNO3 0,01M Thêm nữa, dùng kỹ thuật (DDP), giúp cho các việc xác định vị trí và chiều cao píc của Vit.C một cách rõ ràng và chính xác Điều này có nghĩa là có khả năng xác định trực tiếp Vit.C trên điện cực giọt

Hg mà không cần xử lý mẫu để loại trên nền ảnh hưởng đến bản chất hóa học của phương pháp Quy trình nhanh, chính xác, khả năng phân tích hàng loạt là

có thể đạt được Vì vậy chúng tôi chọn sử dụng điện cực giọt thủy ngân treo trong phân tích Vit.C

1.2.2.2.3 Phương pháp cực phổ xung vi phân

Phương pháp cực phổ xung vi phân là phương pháp phân tích điện hóa hiện đại, được cải tiến cả về kỹ thuật quét thế và kỹ thuật ghi dòng, khắc phục được đa số nhược điểm của phương pháp cực phổ cổ điển và phương pháp xung thường

Trong phương pháp xung vi phân, điện cực được phân cực bằng một điện áp một chiều biến thiên tuyến tính với tốc độ chậm Ghi dòng tại hai thời điểm trước khi nạp xung và trước khi ngắt xung Đường biểu diễn sự khác nhau giữa hai dòng này vào thế điện cực có dạng píc, rất dễ xác định, có độ phân giải cao Do vậy mà phương pháp xung vi phân giảm tối đa dòng dư, một hạn chế của cực phổ cổ điển (hình 1.2)

Sự phụ thuộc dòng cực đại trong cực phổ xung vi phân vào các thông

số của quá trình đo cực phổ được tính toán lý thuyết cho hệ thức sau:

1/ 2

2

( 1) 1

Hình 1.2: Sơ đồ biểu diễn sự biến thiên thế theo thời gian và dạng sóng

cực phổ trong một số phương pháp

(a): Thế biến thiên trong thời gian đo cực phổ

(b): Thế biến thiên trong một chu kì giọt, ( : thời điểm ghi dòng)

(c): Sóng cực phổ

DC: Cực phổ cổ điển NP: Cực phổ xung thường

DP: Cực phổ xung vi phân

2.1.2 Thiết bị, máy móc

 Máy phân tích điện hóa đa chức năng 757 VA Computrace, Metrohm

- Điện cực làm việc: điện cực giọt Hg

- Điện cực so sánh: điện cực Ag/AgCl

- Điện cực phù trợ: điện cực Pt

 Máy pH meter Precisa 900, Thụy Sĩ

 Cân phân tích STARTORIUS (độ chính xác 0,2 mg)

 Xử lý số liệu trên máy tính, dùng chương trình Excel

2.1.3 Hóa chất

 Axit ascobic (North general pharmaceutical factory China)

 Axit axetic băng

 Natri axetat, natri clorua, NaH2PO4.2H2O, K2HPO4.3H2O

 Axit pecloric, axit oxalic, axit tactric, axit citric

Các hóa chất đều thuộc loại tinh khiết phân tích (PA)

Các dung dịch nghiên cứu đều được pha từ lượng cân chính xác hóa chất chuẩn bằng bình định mức đã được kiểm tra độ chính xác thể tích

2.2 CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

2.2.1 Nghiên cứu cơ bản

Trong bản khoá luận này, chúng tôi tập chung nghiên cứu điều kiện tối

ưu xác định Vit.C trên cơ sở thiết bị, máy móc, hóa chất, môi trường phòng thí nghiệm ở Việt Nam Mục đích là xác định Vit.C trong các đối tượng thực

tế một cách nhanh chóng, chính xác và hiệu quả

Bảng 2.1: Chương trình ghi sóng cực phổ của Vit.C

Thời gian khuấy sau khi cho mẫu 3 s

Thời gian cân bằng trước khi quét thế 10 s

2.2.1.1 Khảo sát tính chất cực phổ của Vit.C trong một số nền

CH2OH OH

Axit ascobic Axit dehidroascobic

+ 2H+ + 2e

-Trong phương trình trên, có sự góp mặt của H+, vì vậy nồng độ H+

ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính cực phổ của axit ascobic Chúng tôi chọn điều kiện ghi tín hiệu cực phổ của axit ascobic trong các nền đệm, nhằm duy trì pH ổn định trong suốt quá trình đo Theo tài liệu nghiên cứu, ba loại đệm hay được dùng trong phân tích các chất hữu cơ bằng phương pháp cực phổ là đệm xitrat + hidrophotphat, đệm axetat và đệm photphat Chúng tôi tiến hành ghi sóng cực phổ của axit ascobic trong ba nền như trên

- Trộn hai dung dịch theo thể tích

pH Vdd ax.axetic 0,2 M (mL) Vdd natri axetat 0,2 M (mL)

Thực nghiệm

Lấy 10mL dung dịch đệm vào bình đo, đuổi khí oxi hòa tan 300s, đo đường nền, thêm 0,1mL dung dịch Vit.C tương ứng Nhận xét chất lượng píc của Vit.C trong các nền đệm khác nhau

2.2.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của oxi hòa tan

Đo đường cực phổ của dung dịch chứa Vit.C 2mg/L trong đệm axetat 0,2M, thời gian đuổi khí lần lượt là 3s, 30s, 60s, 90s, 120s, 150s Chọn thời gian đuổi khí khi píc của Vit.C đã ổn định

2.2.1.3 Khảo sát pH của nền axetat

Để nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến píc của Vit.C, chúng tôi chuẩn bị một dãy dung dịch đệm axetat 0,1 M có pH khác nhau, bằng cách trộn hai dung dịch axit axetic 0,1 M và natri axetat 0,1 M theo tỷ lệ thể tích (9,5:0,5), (8:2), (5:5), (2:8), (0,5:9,5), đo pH của các dung dịch đó trên máy pH meter

Tiến hành ghi đường cực phổ của Vit.C ở 3 nồng độ 1, 2, 3 mg/L trong các nền đã chuẩn bị Lặp lại 2 lần Chọn nền axetat có pH thích hợp cho các phép đo tiếp sau

2.2.1.4 Khảo sát nồng độ nền axetat

Để loại trừ dòng điện chuyển, nồng độ chất điện ly trơ trong dung dịch phải lớn hơn nồng độ chất nghiên cứu khoảng 50 lần [1], khoảng nồng độ chất phân tích đo bằng cực phổ tốt nhất theo tài liệu là 10-5

10-4 M, vậy nồng độ chất điện ly trơ nên lớn hơn hoặc bằng 0,01 M tương đương nồng độ nền axetat (5:5) là 0,02 M Tuy nhiên thực tế nghiên cứu cho thấy cần nồng độ nền lớn hơn, vì vậy chúng tôi tiến hành khảo sát píc của Vit.C trong các dung dịch nền có nồng độ khác nhau như sau:

 Chuẩn bị dung dịch đệm axetat

- Dung dịch đệm axetat 1M (CH3COOH 0,5M; CH3COONa 0,5M):

Cân 20,5075 g natri axetat cho vào bình định mức 500mL, thêm nước cất hai lần, hòa tan hoàn toàn, thêm 18,75 mL axit axetic băng, định mức đến vạch

- Pha loãng dung dịch đệm axetat 1M bằng nước cất hai lần để được các dung dịch đệm có nồng độ 0,5M; 0,2M; 0,1M; 0,05M; 0,01M; 0,005M

 Tiến hành đo đường cực phổ của Vit.C trong các nền trên ở 3 khoảng nồng độ 5, 10, 15 mg/L (2,8; 5,6; 8,4.10-5M), đo lặp 2 lần, lấy giá trị trung bình

Chọn nồng độ nền tối ưu

2.2.1.5 Khảo sát nồng độ tuyến tính

Xây dựng đường chuẩn ip = f(CVit.C) theo phương pháp hồi quy tuyến tính, từ đó chọn được khoảng nồng độ tối ưu, tại đó chiều cao sóng cực phổ của Vit.C phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ của nó

Các giá trị cho trong bảng

Bảng 2.2: Bảng số liệu xây dựng đường chuẩn theo phương pháp

hồi quy tuyến tính

y y

s x

x n

ns s

i i

2 2 2

2 2

) ( )

x s x

x n

x s s

i

i i