Khóa luận tốt nghiệp Mục lục Trang Lời cảm ơn Lời cam đoan Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Mở đầu Lí chọn đề tài Mục đích nghiên cứu ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Chương Tổng quan tài liệu nghiên cứu 1.1 Nguồn gốc giá trị kinh tế lúa 1.1.1 Nguồn gốc 1.1.2 Giá trị kinh tế định hướng phát triển lúa Việt Nam 10 1.2 Chỉ thị phân tử ứng dụng thị phân tử chọn tạo giống lúa 11 1.2.1 Cơ sở khoa học 11 a Thành phần cấu trúc hoá học ADN 11 b Biến tính hồi tính ADN 12 c Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 12 1.2.2 Phân loại 14 a Chỉ thị sinh hoá 14 b Chỉ thị phân tử 15 1.2.2 Các thị dựa phản ứng PCR 15 a Chỉ thị RFLP (Random Fragment Length Polymorphism) 15 b Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 17 c Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeat) 17 d Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA) 18 1.2.4 ứng dụng thị phân tử chọn tạo giống lúa Nguyễn Thị Huyền 19 K30C_Sinh_KTN N Khóa luận tốt nghiệp 1.2.5 Tình hình nghiên cứu nước giới 21 a Tình hình nghiên cứu nước 21 b Tình hình nghiên cứu giới 22 Chương Vật liệu, thời gian, địa điểm phương pháp nghiên cứu 23 2.1 Vật liệu nghiên cứu 23 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 23 2.3 Phương pháp nghiên cứu 23 2.3.1 Phương pháp thu mẫu (lá lúa) 23 2.3.2 Phương pháp tách chiết ADN từ lúa 23 2.3.3 Kiểm tra nồng độ ADN tổng số 25 2.3.4 Tiến hành phản ứng PCR 25 2.3.5 Phương pháp điện di sản phẩm PCR 26 2.3.6 Phân tích kết qủa PCR NTSYS - version 2.0 27 Chương Kết nghiên cứu thảo luận 29 3.1 Kết tách chiết ADN 29 3.2 Phân tích mối quan hệ giống lúa đột biến dựa kết đa hình mồi RAPD 29 3.2.1 Mồi OPC4 29 3.2.2 Mồi OPC5 31 3.2.3 Mồi OPN12 32 3.2.4 Mồi OPM6 33 3.3 Mối quan hệ giống lúa đột biến dựa phân tích RAPD 35 Kết luận đề nghị 38 Kết luận 38 Đề nghị 38 Tài liệu tham khảo 40 Nguyễn Thị Huyền K30C_Sinh_KTN N Khóa luận tốt nghiệp Lời cảm ơn Để hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này, trước hết em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Th.s Nguyễn Như Toản giáo viên hướng dẫn người tận tình hướng dẫn em suốt trình thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn Viện di truyền Nông nghiệp, tạo điều kiện sở vật chất cho em hoàn thành trình thực nghiệm Tiếp theo, em xin cảm ơn thầy, cô giáo khoa sinh KTNN, trường ĐHSP Hà Nội 2, người dìu dắt, đem đến cho em niềm đam mê khoa học, kiến thức bổ ích môn khoa học thú vị Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp động viên, cổ vũ giúp đỡ em suốt năm học tập hoàn thành khoá luận tốt nghiệp Vĩnh Phúc, ngày 14 tháng 05 năm 2008 Sinh viên Nguyễn Thị Huyền Nguyễn Thị Huyền K30C_Sinh_KTN N Khóa luận tốt nghiệp Lời cam đoan Tôi xin cam đoan kết trình bày khoá luận xác, trung thực, chưa công bố hội nghị khoa học Một số dẫn liệu đề tài xin phép tác giả trích dẫn để bổ sung cho khoá luận Nếu sai hoàn toàn chịu trách nhịêm Sinh viên Nguyễn Thị Huyền Nguyễn Thị Huyền K30C_Sinh_KTN N Khóa luận tốt nghiệp Danh mục chữ viết tắt ADN: Acid deoxyribonucleic AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism ARN: Acid ribonucleic CTAB: Cetyl Trimetyl Amonium Bromit dNTP: Dideoxyribonucleozit triphosphat EDTA: Etylen Diamine Tetra Acetic acid FAO: Tổ chức Nông Lương giới IRRI: Viện nghiên cứu lúa quốc tế NTSYS: Numerial Taxonomy System PCR: Polymerase Chain Reaction PVP: Polyvinyl Pyroledone RAPD: Random Amplyfied Polymorphic DNA RE: Restriction Enzyme RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism SDS: Sodium dodecyl sunphate SSR: Simple Sequence Repeats TAE: Tris- Acetat- acid EDTA TE: Tris EDTA UV: Ultra violet Nguyễn Thị Huyền K30C_Sinh_KTN N Khóa luận tốt nghiệp Danh mục bảng hình vẽ Danh mục bảng Bảng 3.1 Các phân đoạn ADN nhân ngẫu nhiên phản ứng PCR_RAPD với mồi OPC4 Bảng 3.2 Các phân đoạn ADN nhân ngẫu nhiên phản ứng PCR_RAPD với mồi OPC5 Bảng 3.3 Các phân đoạn ADN nhân ngẫu nhiên phản ứng PCR_RAPD với mồi OPN12 Bảng 3.4 Các phân đoạn ADN nhân ngẫu nhiên phản ứng PCR_RAPD với mồi OPM6 Bảng 3.5 Tổng số phân nhân ngẫu nhiên mồi đa hình Bảng 3.6 Thống kê mồi xuất đa hình Bảng 3.7 Ma trận tương đồng 16 giống (dòng) lúa đột biến Danh mục hình Hình 3.1 Kết phân tích sản phẩm PCR_RAPD 16 giống (dòng) lúa đột biến với mồi OPC4 Hình 3.2 Kết phân tích sản phẩm PCR_RAPD 16 giống (dòng) lúa đột biến với mồi OPC5 Hình 3.3 Kết phân tích sản phẩm PCR_RAPD 16 giống (dòng) lúa đột biến với mồi OPN12 Hình 3.4 Kết phân tích sản phẩm PCR_RAPD 16 giống (dòng) lúa đột biến với mồi OPM6 Hình 3.5 Sơ đồ hình 16 giống (dòng) lúa đột biến Nguyễn Thị Huyền K30C_Sinh_KTN N Khóa luận tốt nghiệp Mở đầu Lí chọn đề tài Lúa gạo nguồn thu nhập sống hàng triệu nông dân toàn giới Hàng năm có khoảng 150 triệu đất dùng để trồng lúa, đạt sản lượng khoảng 600 triệu Có khoảng 20 triệu gạo dùng làm hàng hóa buôn bán toàn giới Theo dẫn liệu từ tổ chức Nông Lương giới (FAO) năm 2006 sản lượng gạo hàng hóa đạt 27,8 triệu tấn, thấp so với năm 2005 (29 triệu tấn) Châu nơi sản xuất tiêu thụ khoảng 90% lượng gạo toàn giới Trong nước có khối lượng gạo xuất lớn Thái Lan (7 - triệu tấn), Việt Nam (4 - triệu tấn), ấn Độ (4 triệu tấn) (http:// vi.wikipedia.org) [24] Đáp ứng đòi hỏi việc nâng cao suất chất lượng lúa gạo vấn đề nhiều nhà khoa học quan tâm Để làm điều việc nghiên cứu, đánh giá nguồn gen lúa việc tìm hiểu đa hình di truyền dòng, giống lúa cần thiết, nhằm mục đích khai thác sử dụng chúng có hiệu áp dụng công nghệ sinh học đặc biệt sử dụng thị phân tử sinh học phân tử vào chọn tạo giống để phân tích, xác định đa dạng di truyền giống khoa học quan tâm nghiên cứu Dựa vào thị phân tử xác định tính đa dạng di truyền giống, loài, cá thể loài Mối quan hệ sở cho phân loại phát loài (Trần Duy Quý, 1997) [17] Chỉ thị phân tử sử dụng để phát hiện, đánh giá nghiên cứu phả hệ Ngoài sử dụng để đánh giá biến động quan hệ di truyền sinh vật mà không phụ thuộc điều kiện môi trường (Phạm Xuân Hội cs., 2002) [7] Nguyễn Thị Huyền K30C_Sinh_KTN N Khóa luận tốt nghiệp Để góp phần tìm hiểu rõ mối quan hệ dòng lúa đột biến thu được, bổ sung đa dạng nguồn gen, tạo nguồn vật liệu khởi đầu thêm phong phú cho công tác chọn tạo giống lúa tiến hành đề tài: Nghiên cứu mối tương quan di truyền dòng lúa đột biến chất lượng thị phân tử Mục đích nghiên cứu - Nghiên cứu mức độ đa hình tương quan di truyền dòng, giống lúa đột biến - Phân tích, xác định mối quan hệ di truyền dòng, giống lúa đột biến với với giống gốc dựa sai khác mức độ phân tử ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Việc nghiên cứu đa dạng di truyền dòng, giống lúa đột biến mức độ ADN góp phần lớn cho phương pháp chọn lọc giống truyền thống: 1/ Nhanh chóng xác định thông tin phả hệ dòng, giống lúa xử lí đột biến 2/ Xác định nhóm ưu lai 3/ Dự đoán ưu lai cặp lai ưu tú 4/ Giảm thiểu chi phí công sức lao động Với kết thu được, hi vọng đóng góp phần cho nghiên cứu di truyền lúa cung cấp thông tin ban đầu hữu ích cho công tác chọn giống lúa nước ta Nguyễn Thị Huyền K30C_Sinh_KTN N Khóa luận tốt nghiệp Chương Tổng quan tài liệu nghiên cứu 1.1 Nguồn gốc giá trị kinh tế lúa 1.1.1 Nguồn gốc Cây lúa nước phân loại sau: Angiospermae Nghành: Hạt kín: Lớp: Một mầm: Monocotyledoneae Bộ : Lúa: Poales Họ: Lúa: Poaceae Chi: Lúa: Oryza Lúa có 12 cặp nhiễm sắc thể (2n = 24) tự thụ phấn Người ta cho tổ tiên chi lúa Oryza loài hoang dại cách 130 triệu năm Hiện nay, có khoảng 21 loài hoang dại thuộc chi loài lúa hóa lúa châu (Oryza sativa) lúa châu Phi (Oryza glaberrima) Lúa châu O.sativa tổ tiên loại lúa hoang (O.rufipogon) phân bố quanh chân núi Himalaya, có hai thứ sau: + Oryza sativa var indica (ở phía ấn Độ) + Oryza sativa var japonica (ở phía Trung Quốc) Hiện nay, giống lúa gieo trồng làm lương thực khắp giới Có nhiều giả thuyết khác nơi tiến hành gieo trồng hay hóa giống lúa Lúa châu Phi: gieo trồng khoảng 3500 năm lưu vực châu thổ sông Niger Tuy nhiên loài không phát triển rộng chí việc gieo trồng suy giảm giống châu đem tới khoảng kỉ đến kỉ 11 (http:// vi.wikipedia.org) [24] Nguyễn Thị Huyền K30C_Sinh_KTN N Khóa luận tốt nghiệp Theo Cadnalle (1998) lúa có nguồn gốc từ ấn Độ Theo Roseleviez (1931) lúa có nguồn gốc từ Đông Nam đặc biệt từ ấn Độ Đông Dương Quan điểm nhiều người công nhận lúa có nguồn gốc từ Đông Nam Vì vùng có diện tích trồng lúa lớn giới, có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm phù hợp với sinh trưởng lúa Đây nơi trồng lúa sớm Thông qua việc trao đổi, mua bán mà lúa ngày phát tán rộng rãi khắp giới như: Nhật Bản (năm 300 TCN), Triều Tiên (khoảng 850 - 500 TCN), Địa Trung Hải châu Âu (khoảng năm 800 TCN), Nam Mỹ (đầu kỉ 18) (http://vi.wikipedia.org) [24] 1.1.2 Giá trị kinh tế định hướng phát triển lúa Việt Nam Lúa lương thực quan trọng thứ giới sau ngô (Bùi Mạnh Cường, 2007) [1], gieo trồng 112 nước, cung cấp lương thực cho 65% dân số giới Việt Nam, lúa gạo sử dụng hầu hết bữa ăn người dân Trong gần 30 năm trở lại sản xuất lúa gạo có bước tăng trưởng mạnh (70%) Năm 2005, Việt Nam xuất 5,2 triệu gạo thu 1,4 tỉ USD cho kinh tế quốc dân, đứng thứ giới (sau Thái Lan) (Đào Xuân Tân, 2003) [14] Cây lúa góp phần giải tình trạng thiếu đói sau chiến tranh đảm bảo an ninh lương thực nước Ngoài ra, phụ phẩm thu từ lúa rơm, rạ, trấu, cám, ứng dụng triệt để chăn nuôi, trồng trọt, làm phân bón, chất đốt giúp giảm chi phí nông nghiệp bảo vệ môi trường Với phát triển khoa học đại, người ta tạo giống lúa mang nhiều đặc điểm tốt chống lốp đổ, chín sớm, suất cao, chịu Nguyễn Thị Huyền 10 K30C_Sinh_KTN N Khóa luận tốt nghiệp + Agarose:1,5g + TAE 1X: 100ml Đun sôi dung dịch lò vi sóng để agarose tan hoàn toàn, sau để nguội đến 500C, bổ sung 10l Ethidium bromide đổ vào khay gel cài lược sẵn Sau 30 60 phút, gel nguội đông cứng chuyển khay chứa gel vào máy điện di cho đệm chạy TAE 1X vào buồng điện di cho ngập gel khoảng 0,5 cm Bước : Tra sản phẩm PCR vào giếng Sản phẩm PCR sau lấy khỏi máy tra vào giếng theo công thức sau: + Sản phẩm PCR : 8l + Xylen cyanol: 2l Trên gel để lại giếng để nạp kb ladder Bước 3: Tiến hành điện di Sau tra mẫu xong, máy điện di kết nối với nguồn đặt thông số sau: + Điện thế: 50 V + Cường độ: 90 mA Bước 4: Sau điện di xong, soi gel máy soi gel tia UV, ADN phát sáng nhờ liên kết với EtBr Bước 5: Chụp ảnh băng ADN xử lý chương trình NTSYS 2.2.6 Phân tích kết PCR NTSYS - Version 2.0 * Cơ sở liệu NTSYS - Version chương trình máy tính để tự động thiết lập sơ đồ hình biểu mối quan hệ hay độ tương đồng di truyền đối tượng cần nghiên cứu sau nhập liệu Qua sơ đồ ta đánh giá mối quan hệ di truyền chúng với Cơ sở liệu chương trình dựa vào hệ mã nhị phân (0, 1) để đánh giá vắng mặt (ghi 0) có mặt (ghi 1) băng đa hình ADN nghiên cứu theo thang ADN Nguyễn Thị Huyền 27 K30C_Sinh_KTN N Khóa luận tốt nghiệp chuẩn (ADN marker) Dữ liệu cho phép thiết lập ma trận tương đồng (Similar matrix) ma trận khoảng cách (Distance matrix) Hệ số tương đồng di truyền mẫu nghiên cứu xác định theo công thức sau: 2AB SAB = A+B AB: số băng giống mẫu A B A: số băng mẫu A B: số băng mẫu B SAB: hệ số tương đồng mẫu A B Từ SAB ta suy mức độ sai khác di truyền A, B DAB = - SAB * Trình tự tiến hành phân tích kết PCR_RAPD NTSYS Kết PCR_RAPD nhập vào chương trình excel theo nguyên tắc: không xuất băng ghi , xuất băng ghi Số liệu xử lý tiếp chương trình Notepad ghi lại đĩa Ma trận tương đồng sơ đồ hình xây dựng sau xử lý NTSYS Nguyễn Thị Huyền 28 K30C_Sinh_KTN N Khóa luận tốt nghiệp Chương kết nghiên cứu thảo luận 3.1 Kết tách chiết ADN ADN sau tách chiết tiến hành điện di gel agarose nhằm xác định độ tinh sạch, độ nguyên vẹn mẫu Kết tách chiết cho thấy băng ADN 16 mẫu nghiên cứu gọn, rõ, vệt sáng ARN Mẫu tách chiết đủ độ tinh sạch, nguyên vẹn, đủ điều kiện cho thí nghiệm 3.2 Phân tích mối quan hệ dòng, giống lúa đột biến dựa kết đa hình mồi RAPD Sau tiến hành xong phản ứng PCR, thống kê 14 mồi PCR_RAPD sử dụng nghiên cứu thu 987 loại phân đoạn ADN nhân có 984 đoạn đa hình đoạn đơn hình Trong số 14 mồi RAPD nghiên cứu có mồi có tính đa hình cao với 13 đoạn nhân cho mồi Đó mồi: OPC4, OPC5, OPC15, OPN12, OPN17, OPM6 Phân tích kết với số mồi đặc trưng ta có 3.2.1 Mồi OPC4 Kết điện di sản phẩm RAPD (hình 3.1) dòng giống lúa với mồi OPC4 có từ 11 phân đoạn nhân ngẫu nhiên (Bảng 3.1) Trong dòng số dòng số có số phân đoạn nhân nhiều 11; dòng số 1, 8, có phân đoạn nhân Tính đa hình thể xuất hay không xuất phân đoạn ADN so sánh giống, dòng với mồi OPC4 có 12 băng đa hình nhân lên Nguyễn Thị Huyền 29 K30C_Sinh_KTN N Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.1 Kết điện di sản phẩm PCR-RAPD 16 giống (dòng) lúa với mồi OPC4 (Các giếng từ trái qua phải tương ứng với 1-16 giống (dòng) lúa) Bảng 3.1 Các phân đoạn ADN nhân ngẫu nhiên phản ứng PCR- RAPD với mồi OPC4 đđn 10 11 12 tpđ 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 10 Thứ tự giống (dòng) 10 11 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 11 5 12 1 1 1 1 0 10 13 1 1 1 0 14 1 1 1 1 0 10 15 1 1 1 0 16 1 1 1 0 Chú thích: tpđ: tổng số phân đoạn nhân mẫu; đđn: thứ tự đoạn nhân Số 1: đoạn ADN nhân, số 0: đoạn ADN không nhân Nguyễn Thị Huyền 30 K30C_Sinh_KTN N Khóa luận tốt nghiệp 3.2.2 Mồi OPC5 Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm PCR-RAPD 16 giống (dòng) lúa với mồi OPC5 (Các giếng từ trái qua phải tương ứng với 1-16 giống (dòng) lúa) Bảng 3.2 Các phân đoạn ADN nhân ngẫu nhiên phản ứng PCR RAPD với mồi OPC5 đđn tpđ 1 0 0 1 0 0 3 0 1 1 4 0 0 1 1 1 1 6 1 1 1 Thứ tự giống (dòng) 10 11 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1` 0 1 1 1 1 1 1 0 12 1 1 1 13 1 0 0 14 1 0 0 15 1 0 0 16 1 0 0 Chú thích: tpđ: tổng số phân đoạn nhân mẫu; đđn: thứ tự đoạn nhân Số 1: đoạn ADN nhân, số 0: đoạn ADN không nhân Nguyễn Thị Huyền 31 K30C_Sinh_KTN N Khóa luận tốt nghiệp Kết điện di cho ta từ băng ADN nhân lên 16 giống lúa nghiên cứu Số băng nhân lên giống số 12 nhiều băng, giống số 14 15 có băng ADN nhân ngẫu nhiên Tổng số băng ADN nhân 16 giống lúa với mồi OPC5 65 đoạn có 64 đoạn đa hình đoạn đơn hình 3.2.3 Mồi OPN12 Hình 3.3 Kết điện di sản phẩm PCR- RAPD ở16 giống (dòng) lúa với mồi OPN12 (Các giếng từ trái qua phải tương ứng với 1-16 giống (dòng) lúa) Kết điện di sản phẩm RAPD (Hình 3.3) giống (dòng) lúa với mồi OPN12 có từ 12 phân đoạn nhân ngẫu nhiên có 13 băng đa hình nhân lên (Bảng 3.3) Trong giống (dòng) số có phân đoạn ADN nhân nhiều 10 phân đoạn, giống số 16 số có phân đoạn nhân Nguyễn Thị Huyền 32 K30C_Sinh_KTN N Khóa luận tốt nghiệp Bảng 3.3 Các phân đoạn ADN nhân ngẫu nhiên phản ứng PCR RAPD với mồi OPN12 đđn 10 11 12 13 tpđ 1 1 1 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 Thứ tự giống (dòng) 10 11 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 1 1 1 10 12 1 0 1 0 13 1 1 1 1 14 1 1 1 0 15 1 1 0 0 0 16 1 0 0 1 0 0 Chú thích: tpđ: tổng số phân đoạn nhân mẫu; đđn: thứ tự đoạn nhân Số 1: đoạn ADN nhân, số 0: đoạn ADN không nhân 3.2.4 Mồi OPM6 Hình 3.4 Kết điện di sản phẩm PCR- RAPD ở16 giống (dòng) lúa với mồi OPM6 (Các giếng từ trái qua phải tương ứng 1-16 giống (dòng) lúa) Nguyễn Thị Huyền 33 K30C_Sinh_KTN N Khóa luận tốt nghiệp Bảng 3.4 Các phân đoạn ADN nhân ngẫu nhiên phản ứng PCR RAPD với mồi OPM6 đđn 10 11 12 tpđ 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 6 1 0 0 1 1 Thứ tự giống (dòng) 10 11 1 0 1 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 7 6 12 0 1 0 0 13 0 0 0 1 0 14 0 1 1 0 0 0 15 1 1 1 0 0 16 0 1 1 0 0 0 Chú thích: tpđ: tổng số phân đoạn nhân mẫu; đđn: thứ tự đoạn nhân Số 1: đoạn ADN nhân, số 0: đoạn ADN không nhân Mồi OPM6 sau phân tích điện di PCR_RAPD cho ta phân đoạn ADN nhân ngẫu nhiên Có tổng cộng 12 băng ADN đa hình đó, giống số cho số băng ADN nhân ngẫu nhiên cao 9, thấp giống số 13 có băng đa hình nhân Thống kê số lượng đoạn ADN nhân ngẫu nhiên mồi PCR_RAPD ta thu bảng sau Bảng 3.5 Tổng số phân đoạn ADN nhân ngẫu nhiên mồi đa hình Tên mồi OPC4 9 Thứ tự giống (dòng) 10 11 12 13 14 15 16 11 10 11 5 10 10 OPC5 3 6 2 OPC15 4 6 3 3 OPN12 4 7 OPN17 10 OPM6 6 7 4 4 Nguyễn Thị Huyền 34 K30C_Sinh_KTN N Khóa luận tốt nghiệp Nhận xét: Số lượng băng đa hình 16 giống (dòng) lúa mồi OPC4 cao (128 băng) Thấp OPC15 (57 băng) Số lượng đoạn ADN nhân ngẫu nhiên mồi theo thứ tự là: OPC4 (128) > OPN12 (101) > OPM6 (92) > OPN17 (86) > OPC5 (65) > OPC15 (57) Bảng 3.6 Thống kê mồi xuất đa hình SST Tên mồi Số băng nhân Số băng đa hình OPC4 12 12 OPC5 OPC15 8 OPN12 13 13 OPN17 10 10 OPM6 12 12 Số mồi đa hình 64 63 Nhận xét: giá trị thống kê bảng 3.6 phù hợp với bảng 3.5 Trong nghiên cứu cần tìm hiểu giá trị mồi đối tượng khác để khẳng định tính đa hình mồi 3.3 Mối quan hệ giống lúa dựa phân tích RAPD Dựa xuất hay không xuất phân đoạn ADN mẫu điện di sản phẩm RAPD, thiết lập mối liên quan dòng (giống) lúa mức độ phân tử Mức độ khác biểu hệ số sai khác dòng (giống) lúa đột biến Các dòng có hệ số di truyền cao xếp vào nhóm Giữa nhóm lại có liên hệ mức độ giống hệ số tương đồng di truyền Kết nhận trình bày bảng 3.7 mối tương quan di truyền cặp hình 3.5 dạng sơ đồ hình Nguyễn Thị Huyền 35 K30C_Sinh_KTN N Khóa luận tốt nghiệp Bảng 3.7 Ma trận tương đồng 16 giống (dòng) lúa đột biến 10 11 12 13 14 15 16 1.00 0.45 0.33 0.50 0.46 0.45 0.55 0.41 0.40 0.35 0.48 0.50 0.45 0.55 0.26 0.31 1.00 0.36 0.51 0.26 0.64 0.51 0.40 0.35 0.27 0.38 0.47 0.59 0.51 0.22 0.25 1.00 0.30 0.36 0.38 0.51 0.29 0.23 0.26 0.28 0.33 0.31 0.32 0.47 0.13 1.00 0.44 0.67 0.55 0.52 0.42 0.35 0.53 0.59 0.66 0.55 0.28 0.25 1.00 0.44 0.43 0.35 0.31 0.42 0.51 0.35 0.36 0.30 0.38 0.08 1.00 0.60 0.52 0.42 0.39 0.53 0.55 0.58 0.55 0.36 0.25 1.00 0.53 0.48 0.30 0.50 0.51 0.59 0.56 0.34 0.36 10 1.00 0.42 0.35 0.39 0.52 0.52 0.44 0.35 0.17 1.00 0.31 0.44 0.36 0.52 0.35 0.20 0.21 1.00 0.37 0.47 0.33 0.38 0.37 0.06 11 12 13 1.00 0.58 0.50 0.50 0.38 0.18 14 15 16 1.00 0.55 1.00 0.60 0.55 1.00 0.39 0.30 0.34 1.00 0.19 0.19 0.30 0.00 1.00 Chú thích: số từ 1-16 tương ứng với 1-16 giống (dòng) lúa D52N A-20 D52 CL8-1 XH-1 HD-1DB CL-9 XH-3 HD-1LM D51 BT-7 HD-01 HD-02 D53 XH-5 IR-64 0.20 0.32 0.44 0.56 0.68 Coefficient Hình 3.5 Sơ đồ hình 16 giống (dòng) lúa đột biến Phân tích bảng 3.7 cho thấy giống lúa có hệ số tương đồng di truyền cặp nằm khoảng từ 0,13 0,67 Cá biệt giống XH-5 Nguyễn Thị Huyền 36 K30C_Sinh_KTN N Khóa luận tốt nghiệp IR-64 có mức độ tương đồng 0,00 tức giống không tương đồng di truyền Cao hệ số tương đồng di ruyền giống D52 giống CL8-1 Dựa vào sai khác mức độ tương đồng di truyền 44% chia sơ đồ hình 16 giống (dòng) lúa đột biến thành nhóm chính: Nhóm 1: Gồm dòng (giống) A20, D52, CL8-1, XH-1 có hệ số tương đồng di truyền khác với dòng lại 0,40 (1 0,60) Được chia thành nhóm phụ Nhóm phụ 1: Chỉ có dòng (giống) A20 Nhóm phụ 2: Gồm dòng (giống) D52, CL8-1, XH-1 Nhóm 2: Dòng HD-1DB, có hệ số tương đồng di truyền khác với dòng lại 0,44 (1 0,56) Nhóm 3: Gồm dòng (giống) CL9 XH-3, có hệ số tương đồng di truyền khác với dòng lại 0,46 (1 0,54) Nhóm 4: Dòng HD1-LM, có hệ số tương đồng di truyền khác với dòng lại 0,53 (1 0,47) Nhóm 5: Dòng (giống) D51 BT7, có hệ số tương đồng di truyền khác với dòng lại 0,49 (1 0,51) Nhóm 6: Dòng HD-01, có hệ số tương đồng di truyền khác với dòng lại 0,58 (1 0,42) Nhóm 7: Dòng HD-01, có hệ số tương đồng di truyền khác với dòng lại 0,63 (1 0,37) Nhóm 8: Dòng D53 XH-5, có hệ số tương đồng di truyền khác với dòng lại 0,67 (1 0,33) Nhóm 9: Dòng (giống) IR-64, có hệ số tương đồng di truyền khác với dòng lại 0,80 (1 0,20) Nguyễn Thị Huyền 37 K30C_Sinh_KTN N Khóa luận tốt nghiệp Kết luận đề nghị Kết luận - Đã tách chiết ADN từ 16 giống (dòng) lúa đột biến nghiên cứu với độ tinh cao, đủ diều kiện để làm phản ứng PCR - Đã sử dụng 14 mồi ngẫu nhiên để nghiên cứu đa hình xác định mồi cho độ đa hình cao mồi: OPC4, OPC5, OPC15, OPN12, OPN17, OPM6 - Xử lý số liệu thu cho kết quả: xác định mức độ sai khác dòng, giống lúa nghiên cứu với hệ số tương đồng di truyền nằm khoảng 0,13 0,67 - Từ sơ đồ hình thu xác định mức độ tương đồng 44% 16 giống, dòng lúa chia thành nhóm là: + Nhóm 1: Gồm dòng (giống) A20, D52, CL8-1, XH-1 + Nhóm 2: Dòng HD-1DB + Nhóm 3: Gồm dòng (giống) CL9 XH-3 + Nhóm 4: Dòng HD1-LM + Nhóm 5: Dòng (giống) D51 BT7 + Nhóm 6: Dòng HD-01 + Nhóm 7: Dòng HD-01 + Nhóm 8: Dòng D53 XH-5 + Nhóm 9: Dòng (giống) IR-64 Đề nghị Sử dụng thị phân tử biện pháp nghiên cứu đa hình di truyền có hiệu quả, công tác chọn tạo giống lúa Sử dụng thị phân tử chọn giống, chọn giống từ nguồn đột biến nhằm rút ngắn thời gian chọn tạo, chọn cặp lai ưu tú Nguyễn Thị Huyền 38 K30C_Sinh_KTN N Khóa luận tốt nghiệp Tiếp tục khảo sát thêm số mồi RAPD, AFLP để khẳng định đa hình di truyền giống (dòng) lúa đột biến Sử dụng thị RAPD nghiên cứu đa dạng di truyền dòng lúa đột biến triển vọng phần xác định sai khác nguồn gốc dòng đột biến so với giống gốc Tuy nhiên, cần nghiên cứu để xác định điểm đột biến giải trình tự gen đột biến dòng nghiên cứu, từ cung cấp nguồn vật liệu rõ ràng cho công tác chọn tạo giống lúa chất lượng Nguyễn Thị Huyền 39 K30C_Sinh_KTN N Khóa luận tốt nghiệp Tài liệu tham khảo Bùi Mạnh Cường, (2007), Công nghệ sinh học chọn tạo giống ngô, NXB Nông Nghiệp Trịnh Đình Đạt, Nguyễn Văn Niệm, Nguyễn Thị Minh Nguyệt, Lê Trung Kiên, (1999), Nghiên cứu số izozym ong nội (Apis ceruna) địa phương khác nhau, báo cáo khoa học Trịnh Đình Đạt, (2007), Công nghệ sinh học (tập 4), NXB Giáo dục Nguyễn Văn Đồng, (1998), Nghiên cứu phát lập đồ phân tử gen bất dục đực nhạy cảm với nhiệt độ (TGMS) lúa Luận án tiến sĩ nông nghiệp Nguyễn Hữu Đống, KS Đào Thanh Bình, KS Lâm Quang Dụ, KS Phan Đức Trực, (1997), Đột biến: sở lý thuyết ứng dụng, NXB nông nghiệp Phạm Thành Hổ, (2006), Di truyền học, NXB Giáo dục Phạm Xuân Hội, Trần Duy Quý, (2002), Công nghệ gen việc tăng sản lượng lúa, Thông tin công nghệ sinh học ứng dụng số 1/2001, Viện di truyền Nông nghiệp Bộ nông nghiệp phát triển nông thôn IRRI, (1996), Hệ thống tiêu chuẩn đánh giá nguồn gen lúa, tái lần thứ 4- 1996 Phan Cự Nhân, (2006), Di truyền học (tập 1,2), NXB Đại học Sư phạm 10 Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, (2005), ứng dụng Marker phân tử đánh dấu gen mùi thơm lúa, Tạp chí di truyền học ứng dụng 11 Hoàng Thị Sản, Nguyễn Phương Nga, (2004), Hình thái giải phẫu học thực vật, NXB Đại học Sư phạm 12 Hoàng Thị Sản, Nguyễn Thị Bé, (2006), Phân loại học thực vật, NXB Đại học Sư phạm Nguyễn Thị Huyền 40 K30C_Sinh_KTN N Khóa luận tốt nghiệp 13 Hoàng Thị Sản, (1999), Phân loại học thực vật, NXB Giáo dục 14 Đào Xuân Tân, (2003), Đặc điểm hình thái yếu tố cấu thành suất dòng lúa đột biến từ giống IR-64 A20 hệ thứ 3, Thông báo khoa học ĐHSP Hà Nội 15 Lê Duy Thành, (2001), Cơ sở di truyền chọn giống thực vật, NXB Khoa học Kỹ thuật 16 Trương Bá Thảo, (2006), ứng dụng thị phân tử sở phản ứng chuỗi Polymerase (PCR) để chọn tạo giống lúa (Oryza sativa L.), Luận án tiến sĩ nông nghiệp, Cần Thơ- 2006 17 Trần Duy Quý, (1997), Các phương pháp chọn tạo giống trồng, NXB Nông nghiệp 18 Báo cáo khoa học, (1993 - 2003) Hội nghị sinh học toàn quốc năm 2003, NXB Khoa học Kỹ thuật 2003 19 Ahn, SN., Bollich CN., Tanksley SD., (1992), RFLP tagging of a gen for aroma in rice, Theor, Appl 20 Jin Q.S., Vanvichi TA and Trakoonrung S., (1996), Indentifitcation and potential use of a RAPD marker for aroma in rice, J.Gent Breed 21 Lorieux M., Goffinet B., Perrier X., Gonzalez de Leon D., Lannaud C., (1995), Maximum - likelihood models for mapping genertic markers showing segregation, 1, Backcrocss populations, Theor, Appl, Genet.90 22 Neelu Jain, Navinder Saini, Poonam Rana, Sunita Jain and Rajinder K.J (2003), microsatellite diversity for chromosome number in Basmati rice, rice Genertics New sletter, vol.19 23 Webside: http:// www.dantri.com.vn 24 Webside: http:// vi.wikipedia.org 25 Webside: http:// www.vietnamnet.vn Nguyễn Thị Huyền 41 K30C_Sinh_KTN N [...]... kết - In dấu vân tay ADN - Phân tích di truyền của các quần thể 1.2.4 ứng dụng của chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa Chỉ thị phân tử với nhiều ưu điểm của nó như thực hiện nhanh, dễ làm, cho kết quả chính xác; đã và ngày càng trở thành công cụ hữu hiệu cho nghiên cứu đa dạng di truyền của thực vật Trên đối tượng cây lúa, thông qua việc phân tích đa hình di truyền, các nhà khoa học đã tìm ra... các dòng (giống) lúa ở mức độ phân tử Mức độ khác nhau được biểu hiện bằng hệ số sai khác giữa các dòng (giống) lúa đột biến Các dòng có hệ số di truyền cao sẽ được xếp vào một nhóm Giữa các nhóm lại có sự liên hệ về mức độ giống nhau của hệ số tương đồng di truyền Kết quả nhận được trình bày ở bảng 3.7 về mối tương quan di truyền từng cặp và hình 3.5 dưới dạng một sơ đồ hình cây Nguyễn Thị Huyền 35 K30C_Sinh_KTN... hành hơn các phương pháp sử dụng chỉ thị ADN Tuy nhiên, với số lượng ít ỏi các izozym, chúng chỉ thể hiện ở những giai đoạn nhất định của quá trình phát triển cá thể và thực tế nó cũng chỉ là sản phẩm của gen nên chưa phản ánh được chính xác bản chất di truyền của các cá thể Do vậy, việc sử dụng chỉ thị izozym còn có những hạn chế nhất định (Nguyễn Văn Đồng, 1998) [4] b Chỉ thị phân tử Các chỉ thị được... có liên quan đến chất lượng lúa gạo Hiện tại có hơn 2300 chỉ thị ADN (RFLP) do đại học Cornell của Mỹ công bố và có hơn 600 chỉ thị AFLP do Nhật Bản công bố trong chương trình Rice genome (Nguyễn Thị Lang và cs., 2005) [10] Với số lượng chỉ thị phân tử lớn như trên các nhà chọn giống có được cơ hội tốt để nghiên cứu đa dạng di truyền trong phân nhóm các giống lúa và nghiên cứu xác định gen mục tiêu trong... Nhận xét: các giá trị thống kê ở bảng 3.6 phù hợp với bảng 3.5 Trong các nghiên cứu tiếp theo cần tìm hiểu giá trị của các mồi trên những đối tượng khác nhau để khẳng định tính đa hình của các mồi trên 3.3 Mối quan hệ giữa các giống lúa dựa trên phân tích RAPD Dựa trên sự xuất hiện hay không xuất hiện các phân đoạn ADN của các mẫu điện di sản phẩm RAPD, chúng tôi thiết lập mối liên quan giữa các dòng (giống)... 12 (các thành phần của prolamin) Hàm lượng protein biến động mạnh mẽ do tác động của môi trường, qua nhiều năm nghiên cứu cho thấy hệ số tương quan với môi trường từ 0,130 đến 0,372 Kết quả nghiên cứu của Shenoy và cs., (1991), chứng tỏ rằng hệ số di truyền hàm lượng protein đạt 71% Một số cặp lai nghiên cứu cho thấy hệ số di truyền hàm lượng protein rất thấp 11,1% Từ những biến động đó cần phải phân. .. giá sự đa dạng di truyền của các quần thể sinh vật - Xác định các dòng giống khác nhau Sollor và Backman (1983) đã phân biệt các dòng nội phối của ngô và cà chua với 20 dấu chuẩn RFLP - Xác định biến dị sôma Các biến dị này là do ảnh hưởng của các đột biến không xác định và có thể xảy ra trong quá trình nuôi cấy in vitro (Brettell và cs., 1996) - Thiết lập bản đồ phân tử các gen cần quan tâm (Bùi Mạnh... [19] Dựa vào các băng ADN trên gel điện di có thể phát hiện được các thể đồng (hoặc dị) hợp tử trội (lặn) + Nhóm chỉ thị phân tử dựa trên nguyên lý khuếch đại gen mong muốn bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction): RAPD, SSR, AFLP, 1.2.3 Các chỉ thị dựa trên phản ứng PCR Trong giới hạn nghiên cứu của khoá luận tốt nghiệp tôi xin được trình bày một số chỉ thị phân tử như sau a Chỉ thị RFLP (Restriction... định đến năng suất và chất lượng lúa gạo Có thể kể ra những thành tựu đã đạt được nhờ việc ứng dụng của chỉ thị phân tử trên đối tượng cây lúa đó là a Đối với tính trạng amylose Nhiều nghiên cứu cho thấy, hàm lượng amylose có liên quan mật thiết đến độ hoá hồ He và cs., (1999), sử dụng chỉ thị CT 201- RZ 450 để nghiên cứu Nguyễn Thị Huyền 19 K30C_Sinh_KTN N Khóa luận tốt nghiệp hệ di truyền độ hoá hồ trên... trên 29 dòng thuần để nghiên cứu đa dạng di truyền của tập đoàn giống ngô lai [1] - Nguyễn Thị Dung, Viện Công nghệ sinh học đã phân tích mối tương đồng di truyền của 11 cây vải ở các độ tuổi khác nhau dựa trên cơ sở phân tích đa hình ADN bằng phương pháp RAPD với 5 mồi ngẫu nhiên [15] - Trần Nhân Dũng và cs., Viện Nghiên cứu và Phát triển công nghệ sinh học trường Đại học Cần Thơ, nghiên cứu tính ... giống lúa tiến hành đề tài: Nghiên cứu mối tương quan di truyền dòng lúa đột biến chất lượng thị phân tử Mục đích nghiên cứu - Nghiên cứu mức độ đa hình tương quan di truyền dòng, giống lúa đột biến. .. biệt sử dụng thị phân tử sinh học phân tử vào chọn tạo giống để phân tích, xác định đa dạng di truyền giống khoa học quan tâm nghiên cứu Dựa vào thị phân tử xác định tính đa dạng di truyền giống,... biến - Phân tích, xác định mối quan hệ di truyền dòng, giống lúa đột biến với với giống gốc dựa sai khác mức độ phân tử ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Việc nghiên cứu đa dạng di truyền dòng,