BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG ----------------0o0-------------- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA TRẠNG THÁI VÀ CHẤT LƯỢNG CHITIN ĐẾN KHẢ NĂNG DEACETYL BẰNG NaOH Giảng viên hướng dẫn : ThS. NGUYỄN CÔNG MINH Sinh viên thực hiện : ĐỖ THỊ CẨM NGUYÊN Mã số sinh viên : 53131089 Khánh Hòa: tháng 6/2015 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ----------------0o0-------------- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA TRẠNG THÁI VÀ CHẤT LƯỢNG CHITIN ĐẾN KHẢ NĂNG DEACETYL BẰNG NaOH GVHD : ThS. NGUYỄN CÔNG MINH SVTH : ĐỖ THỊ CẨM NGUYÊN MSSV : 53131089 Khánh Hòa, tháng 06/2015 i LỜI CẢM ƠN Qua 3 tháng nỗ lực phấn đấu, với sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô và bạn bè tôi đã hoàn thành đề tài này. Qua đây tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Th.s Nguyễn Công Minh người đã tận tình truyền đạt những kiến thức trong quá trình làm đề tài và trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo những kinh nghiệm quý báu để tôi hoàn thành tốt báo cáo đề tài này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Viện Công nghệ sinh học và Môi trường đã nhiệt tình giảng dạy, truyền dạt cho tôi những kiến thức quý báu trong những năm học vừa qua. Tôi xin gửi lời cảm ơn của mình đến các thầy, cô giáo quản lý các phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, khu Công nghệ cao, phòng Công nghệ thực phẩm, phòng Chế biến thực phẩm… đặc biệt là thầy Vũ Phương – giám đốc Trung tâm Thí nghiệm Thực hành đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu tại các phòng thí nghiêm của trường Đại học Nha Trang. Xin chân thành cảm ơn các bạn chi hội 53CNSH, cùng các bạn sinh viên làm nghiên cứu tại phòng thí nghiệm của trường đã nhiệt tình giúp đỡ, động viên tôi hoàn thành tốt đề tài. Cuối cùng con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ba, má kính mến cùng anh chị em trong gia đình, những người đã ủng hộ nhiệt tính cả vật chất lẫn tinh thần trong quá trình học tập là thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn. Nha trang, tháng 6 năm 2015 Sinh viên Đỗ Thị Cẩm Nguyên ii TÓM TẮT Chitin – chitosan có nhiều ứng dụng trong các ngành công, nông nghiệp, y dược và bảo vệ môi trường. Từ khả năng ứng dụng khá rộng rãi của chitin – chitosan mà nhiều nước đã nghiên cứu sản xuất các sản phẩm này. Ở Việt Nam, theo số liệu chiến lược xuất khẩu của bộ Thủy sản đến năm 2005 sản lượng tôm xuất khẩu đạt 140.000 tấn/năm; từ quá trình sản xuất này sẽ có một lượng lớn phế liệu riêng cho vỏ tôm, thải ra khoảng 70.000 tấn/năm; theo số liệu thực nghiệm chitosan chiếm khoảng 5% vỏ tươi và khoảng 20-40% vỏ khô, như vậy hằng năm có thể sản xuất gần 50.000 tấn chitosan từ vỏ tôm và ghẹ phục vụ sản xuất trong nước và xuất khẩu mang lại hiệu quả kinh tế cho ngành thủy sản. Với mục đích nghiên cứu ảnh hưởng của trạng thái và chất lượng chitin đến chất lượng chitosan thông qua quá trình deacetyl bằng NaOH nhằm đề xuất quy trình sản xuất chitosan có hiệu suất thu hồi cao đạt 85,14%, độ deacetyl là 79,5%, độ nhớt biểu kiến 1250 Cp và trọng lượng phân tử là 875 Kdal. iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................................i TÓM TẮT....................................................................................................................... ii MỤC LỤC ..................................................................................................................... iii DANH MỤC BẢNG ......................................................................................................vi DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................... vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................. viii LỜI MỞ ĐẦU .................................................................................................................1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ CHITIN - CHITOSAN ...............................................3 1.1.Tổng quan về chitin – chitosan ..............................................................................3 1.1.1.Lịch sử phát hiện.............................................................................................. 3 1.1.2.Sự tồn tại của chitin – chitosan trong tự nhiên ................................................4 1.1.3.Cấu trúc hóa học và tính chất hóa lý của chitin – chitosan ............................. 4 1.1.3.1.Cấu trúc hóa học của chitin – chitosan ......................................................4 1.1.3.2.Tính chất hóa lý của chitin – chitosan ....................................................... 6 1.2.Quy trình sản xuất chitin – chitosan.....................................................................12 1.2.1.Quá trình khử khoáng ....................................................................................13 1.2.2.Quá trình khử protein..................................................................................... 14 1.2.3.Quá trình deacetyl .......................................................................................... 15 1.3.Tình hình nghiên cứu, sản xuất chitin – chitosan trên thế giới và ở Việt Nam ...18 1.3.1.Sản xuất chitin – chitosan theo phương pháp hóa học ..................................18 1.3.1.1.Quy trình của Stevens .............................................................................18 1.3.1.2.Quy trình sản xuất chitin từ vỏ tôm hùm của Hackman ......................... 19 1.3.1.3.Quy trình thủy nhiệt của Yamasaki và Nakamichi (Nhật Bản) ..............20 1.3.2.Sản xuất chitin – chitosan theo phương pháp hóa học cải tiến ...................... 20 1.3.2.1.Quy trình sản xuất của Pháp ....................................................................20 1.3.2.2.Quy trình của Đỗ Minh Phụng, trường Đại học Thủy Sản ..................... 22 1.3.2.3.Quy trình sản xuất chitosan từ vỏ tôm bằng phương pháp hóa học với một công đoạn xử lý kiềm (Trần Thị Luyến, 2003) ............................................23 1.3.2.4.Quy trình của Trung tâm Chế biến Đại học Thủy sản ............................ 24 1.3.2.5.Qui trình sản xuất chitin và chitosan của Trang Sĩ Trung, Đại Học Nha Trang (2003) ........................................................................................................25 iv CHƯƠNG II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................... 27 2.1.Đối tượng nghiên cứu .......................................................................................... 27 2.2.Phương pháp nghiên cứu...................................................................................... 27 2.2.1.Bố trí thí nghiệm tổng quan ...........................................................................27 2.2.2.Bố trí thí nghiệm chi tiết ................................................................................28 2.2.2.1.Nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước chitin đến chất lượng chitosan thông qua quá trình deacetyl bằng NaOH ........................................................... 28 2.2.2.2.Nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm chitin đến chất lượng chitosan thông qua quá trình deacetyl bằng NaOH .....................................................................29 2.2.1.3.Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng protein, khoáng chitin đến chất lượng chitosan thông qua quá trình deacetyl bằng NaOH ..................................31 2.3.Các phương pháp phân tích ..................................................................................32 2.3.1.Hàm ẩm của chitin – chitosan được xác định bằng phương pháp sấy ở 1050C theo TCVN 3700 – 1990 (Phụ lục 1.1). ..................................................................32 2.3.2.Hàm lượng tro tổng số của chitin – chitosan được xác đinh bằng phương pháp nung ở 5500C theo TCVN 5405 - 1990(Phụ lục 1.2). ...................................32 2.3.3.Độ đục của chitosan được tiến hành đo bằng máy DR – 2000 (Direct reading spectrophotometer) (Phụ lục 1.3). ..........................................................................32 2.3.4.Độ nhớt của chitosan được xác định bằng nhớt kế Brookfield, model RVT (Phụ lục 1.4). ...........................................................................................................32 2.3.5.Độ tan của chitosan được xác định thông qua các phân tử không tan trong dung dịch (Phụ lục 1.5). .......................................................................................... 32 2.3.6.Hàm lượng protein của chitin – chitosan được xác định bằng phương pháp Microbiuret (Hein và cộng sự, 2004) (Phụ lục 1.6)................................................32 2.3.7.DD của chitin – chitosan được xác định theo phương pháp UV (Tao và cộng sự, 2008) (Phụ lục 1.7)............................................................................................ 32 2.3.8.Trọng lượng phân tử của chitin – chitosan được xác đinh theo phương pháp đo độ nhớt nội (Phụ lục 1.8). ..................................................................................32 2.4.Phương pháp xử lý số liệu: ..................................................................................32 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ....................................33 1.1.Chất lượng của chitin: .......................................................................................... 33 1.2.Ảnh hưởng của kích thước chitin đến khả năng deacetyl bằng NaOH ................34 v 1.3.Ảnh hưởng của độ ẩm chitin đến khả năng deacetyl bằng NaOH ....................... 38 1.4.Chất lượng của chitin so với chitin thương mại:..................................................42 1.5.Đề xuất quy trình ..................................................................................................44 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................ 45 4.1. Kết luận: ..............................................................................................................45 4.2. Kiến nghị .............................................................................................................45 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 46 PHỤ LỤC vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Độ deacetyl hóa của chitosan ở các điều kiện xử lý khác nhau (Trung và cộng sự, 2006) ........................................................................................................................ 17 Bảng 1.2. Phân tử lượng của chitosan ở các điều kiện deacetyl hóa khác nhau (Methacanon và cộng sự, 2003) ........................................................................................... 18 Bảng 1.3. Một số chỉ tiêu chất lượng của chitosan từ vỏ tôm sú theo phương pháp xử lý kiềm một giai đoạn (Trần Thị Luyến, 2003)……………………………………….24 Bảng 3.1. Một số chỉ tiêu cơ bản của chitin .................................................................. 33 Bảng 3.2. Một số chỉ tiêu cơ bản của chitosan khi deacetyl chitin có các kích thước khác nhau ................................................................................................................................ 35 Bảng 3.3. Một số chỉ tiêu cơ bản của chitosan khi deacetyl chitin có các độ ẩm khác nhau .......................................................................................................................................... 39 Bảng 3.4. Một số chỉ tiêu về chất lượng của chitin sản xuất theo quy trình của Trang Sĩ Trung và cộng sự (2010) và chitin thương mại .................................................................. 42 vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Sắp xếp các mạch trong phân tử chitin ........................................................... 5 Hình 1.2. Công thức cấu tạo của chitin ............................................................................ 5 Hình 1.3. Công thức cấu tạo của chitosan ........................................................................ 6 Hình 1.4. Phức của chitin – chitosan với kim loại .......................................................... 9 Hình 1.5. Quá trình khử khoáng của từ vỏ tôm sú .......................................................... 13 Hình 1.6. Quá trình khử protein của từ vỏ tôm sú ở các nhiệt độ khác nhau với nồng độ NaOH 50% ........................................................................................................................... 15 Hình 1.7. Quá trình deacetyl .............................................................................................. 15 Bảng 1.3. Một số chỉ tiêu chất lượng của chitosan từ vỏ tôm sú theo phương pháp xử lý kiềm một giai đoạn ......................................................................................................... 24 Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quan ................................................................... 27 Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước chitin đến chất lượng chitosan thông qua quá trình deacetyl bằng NaOH ............................................. 28 Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm chitin đến chất lượng chitosan thông qua quá trình deacetyl bằng NaOH ............................................. 30 Hình 2.4. Sơ đồ bố trí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng protein, khoáng chitin đến chất lượng chitosan thông qua quá trình deacetyl bằng NaOH................... 31 Hình 3.1: Quy trình sản xuất chitin ................................................................................... 33 Hình 3.2. Ảnh hưởng của kích thước chitin đến DD và Mw của chitosan .................. 36 Hình 3.3. Chitosan 2mm ............................................................................................. 37 Hình 3.4. Chitosan 4mm .................................................................................................... 37 Hình 3.5. Chitosan 6mm…………………………………………………………….37 Hình 3.6. Chitosan 8mm…………………………………………………………….37 Hình 3.7. Chitosan không xay……………………………………………………….37 Hình 3.8. Ảnh hưởng của độ ẩm chitin đến DD và Mw của chitosan .......................... 40 Hình 3.9. Chitin tự sản xuất ........................................................................................ 43 Hình 3.10. Chitin thương mại ............................................................................................ 43 Hình 3.11. Quy trình đề xuất sản xuất chitosan từ chitin ............................................... 44 viii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT - DD (Degree of Deacetylation): Độ deacetyl - Mw (Molecular weight): Trọng lượng phân tử - w/v (Weight/volume): Khối lượng/thể tích - D: D-glucosamine - PEG: Polyethylene glycol 1 LỜI MỞ ĐẦU Công nghệ chế biến thủy sản đang ngày càng phát triển trên quy mô toàn cầu, rất nhiều nước Đông Nam Á và Nam Mĩ đang đẩy mạnh ngành công nghiệp này chủ yếu cho xuất khẩu như Ấn Độ, Indonexia, Thái Lan, Việt Nam,…. Quá trình này bao gồm cả nuôi trồng và đánh bắt ở biển, với một sản lượng đông lạnh rất lớn, như vậy tất yếu một lượng phế thải không nhỏ bị vứt bỏ, để thối rữa và do đó gây ô nhiễm môi trường. Theo ước tính lượng phế thải tôm, cua…hàng năm là 1,44 triệu tấn (trọng lượng khô). Tuy vậy chính lượng phế thải vỏ tôm, cua, mực…này lại là một nguồn nguyên liệu to lớn để sản xuất chitin – chitosan, protein, chất màu…[23]. Chitin là một polymer thiên nhiên có cấu tạo mạch thẳng gồm các đơn vị N-acetylDglucosamin nối với nhau bằng các liên kết β-1,4-glucoside. Chitosan là một dẫn xuất của chitin được hình thành khi tách nhóm acetyl, vì vậy chitosan chứa rất nhiều nhóm amino. Chitosan thường ở dạng vẩy hay dạng bột có màu trắng ngà. Công thức phân tử của chitosan gần giống với chitin nhưng chitosan có chứa nhóm amin ở cacbon thứ 2. Chitosan có nhiều ứng dụng trong các ngành công, nông nghiệp, y dược và bảo vệ môi trường. Từ khả năng ứng dụng khá rộng rãi của chitin – chitosan mà nhiều nước đã nghiên cứu sản xuất các sản phẩm này. Ở Việt Nam, theo số liệu chiến lược xuất khẩu của bộ Thủy sản đến năm 2005 sản lượng tôm xuất khẩu đạt 140.000 tấn/năm; từ quá trình sản xuất này sẽ có một lượng lớn phế liệu riêng cho vỏ tôm, thải ra khoảng 70.000 tấn/năm; theo số liệu thực nghiệm chitosan chiếm khoảng 5% vỏ tươi và khoảng 20-40% vỏ khô, như vậy hằng năm có thể sản xuất gần 50.000 tấn chitosan từ vỏ tôm và ghẹ phục vụ sản xuất trong nước và xuất khẩu mang lại hiệu quả kinh tế cho ngành thủy sản [23]. Quy trình sản xuất chitosan cơ bản gồm ba quá trình là: quá trình khử khoáng, quá trình khử protein, quá trình deacetyl; trong đó quá trình deacetyl là quá trình quan trọng nhất quyết định đến chất lượng chitosan cuối cùng. Đã có nhiều đề tài nghiên cứu về các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình deacetyl hóa như nhiệt độ, nồng độ NaOH, thời gian xử lý… Tuy nhiên yếu tố ảnh hưởng lớn đến quá trình deacetyl hóa để tạo ra sản phẩm chitosan là nguyên liệu chitin ban đầu vẫn chưa được nghiên cứu rộng rãi. Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn và khoa học trên, được sự đồng ý của Bộ môn Công nghệ sinh học-Viện Công nghệ sinh học và môi trường-Trường Đại học Nha Trang, 2 dưới sự hướng dẫn của thầy Nguyễn Công Minh, tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu sự ảnh hưởng của trạng thái và chất lượng chitin đến khả năng deacetyl hóa bằng NaOH”.  Mục đích của đề tài Nghiên cứu sự ảnh hưởng của trạng thái và chất lượng chitin đến khả năng deacetyl hóa bằng NaOH để sản xuất ra chitosan đạt được những chỉ tiêu đề ra nhằm nâng cao chất lượng chitosan.  Nội dung của đề tài  Nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước chitin đến chất lượng chitosan thông qua quá trình deacetyl hóa bằng NaOH.  Nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm chitin đến chất lượng chitosan thông qua quá trình deacetyl hóa bằng NaOH.  Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng protein, khoáng của chitin đến chất lượng chitosan thông qua quá trình deacetyl hóa bằng NaOH. 3 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ CHITIN - CHITOSAN 1.1. Tổng quan về chitin – chitosan 1.1.1. Lịch sử phát hiện Chitin được Bracannot phát hiện lần đầu tiên vào năm 1811 trong cặn dịch chiết của một loại nấm và đặt tên là “fungine” để ghi nhớ nguồn gốc tìm ra nó. Năm 1823, Odier đã phân lập được một chất từ bọ cánh cứng và ông gọi là chitin hay “chitine” có nghĩa là lớp vỏ. Nhưng không phát hiện sự có mặt của nitơ, cuối cùng cả Bracannot và Odier đều cho rằng cấu trúc của chitin giống cấu trúc của cellulose [24]. Năm 1929, Karrer đun sôi chitin 24h trong dung dịch KOH 5% và đun tiếp 50 phút ở 1600C với kiềm bão hòa ông thu được sản phẩm có phản ứng màu đặc trưng với thuốc thử, chất đó chính là chitosan [24]. Trước đấy, người ta đã thử chiết tách chitin từ thực vật biển nhưng nguồn nguyên liệu không đủ để đáp ứng nhu cầu. Trữ lượng chitin phần lớn có nguồn góc từ vỏ tôm, cua. Trong một thời gian, các chất phế thải này không được thu hồi mà lại thải ra ngoài gây ô nhiễm môi trường. Năm 1977, Viện kỹ thuật Masachusetts (Mỹ) khi tiến hành xác định giá trị của chitin và protein trong vỏ tôm, cua đã cho thấy việc thu hồi các chất này có lợi nếu sử dụng trong công nghiệp. Phần protein thu được sẽ dùng để chế biến thức ăn gia súc, còn phần chitin sẽ dùng như một chất khởi đầu để điều chế các dẫn xuất có nhiều ứng dụng trong lĩnh vực công nghiệp [12]. Việc nghiên cứu về dạng tồn tại, cấu trúc, tính chất lý hóa, ứng dụng của chitosan đã được công bố từ những năm 30 của thế kỷ XX. Những nước đã thành công trong lĩnh vực nghiên cứu sản xuất chitosan đó là: Nhật, Mỹ, Trung Quốc, Ấn Độ, Pháp. Nhật Bản là nước đầu tiên trên thế giới năm 1973 sản xuất 20 tấn/năm, và đến nay đã lên tới 700 tấn/năm, Mỹ sản xuất trên 300 tấn/năm. Theo Knorr năm 1991 thì thị trường có nhiều triển vọng của chitin-chitosan là Nhật Bản, Mỹ, Anh, Đức. Nhật Bản được coi là nước dẫn đầu về công nghệ sản xuất và buôn bán chitin-chitosan. Người ta ước tính sản lượng chitosan sẽ đạt tới 118000 tấn/năm; trong đó Nhật Bản và Mỹ là hai nước sản xuất chính [14]. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và sản xuất chitin-chitosan và ứng dụng của chúng trong sản xuất phục vụ đời sống là một vấn đề tương đối mới mẻ. Vào những năm 4 1978-1980, trường Đại học Thủy Sản Nha Trang công bố quy trình sản xuất chitosan của tác giả Đỗ Minh Phụng đã mở đầu bước ngoặc quan trọng trong việc nghiên cứu, tuy nhiên chưa có ứng dụng nào thực tế trong sản xuất [8]. 1.1.2. Sự tồn tại của chitin – chitosan trong tự nhiên Chitin và dẫn xuất của nó chitosan là những polysaccharide mạch thẳng, chúng phổ biến trong tự nhiên chỉ sau cellulose, chitin tồn tại ở cả động vật và thực vật. Ở động vật thủy sản, chitin tồn tại rất nhiều, đặc biệt ở vỏ tôm, cua, ghẹ. Trong động vật: Chitin là thành phần cấu trúc quan trọng của vỏ bao của một số loại giáp xác, giun tròn. Trong thực vật: Chitin có trong vách tế bào của nấm và một số loài tảo chlorophyceae. Chitin tồn tại trong tự nhiên ở dạng tinh thể. Nó có cấu trúc gồm nhiều phân tử được nối với nhau bằng cầu nối hydro và tạo thành một hệ thống dạng sợi ít nhiều có tổ chức. Trong tự nhiên rất ít gặp dạng tồn tại tự do của chitin, nó liên kết dưới dạng phức hợp chitin-protein, chitin với các hợp chất hữu cơ,…khi tồn tại như thế chitin có sự đề kháng đối với các chất thủy phân, hóa học và enzyme. Do đó nó gây khó khăn cho việc tách chiết và tinh chế. Tùy thuộc vào đặc tính của cơ thể và sự thay đổi từng giai đoạn sinh lý mà trong cùng một loài, người ta có thể thấy sự thay đổi về hàm lượng cũng như chất lượng của chitin [2]. Chitosan trong tự nhiên cũng rất hiếm gặp, chỉ có trong vách ở một số lớp vi nấm (đặc biệt: zygomycetes, mucor) và ở vài loại côn trùng như ở thành bụng của mối chúa. Sự deacetyl bằng kiềm, chitin tạo thành chitosan và tan được trong dung dịch acid acetic loãng [16]. 1.1.3. Cấu trúc hóa học và tính chất hóa lý của chitin – chitosan 1.1.3.1. Cấu trúc hóa học của chitin – chitosan CHITIN: Chitin là một polysaccharide mạch thẳng, có cấu trúc tuyến tính gồm các đơn vị N-acetyl-glucosamine nối với nhau nhờ cầu β-1,4-glucoside. Bằng phương pháp nhiễu xạ tia X, người ta đã chứng minh được chitin tồn tại ở 3 dạng cầu hình là: α, β, γ – chitin [1]. 5 Các dạng này của chitin chỉ do sự sắp xếp khác nhau về hướng của mỗi mắc xích (N-acetyl-D-glucosamine) trong mạch. Có thể biểu diễn mỗi mắc xích này bằng mũi tên sao cho phần đầu mũi tên chỉ nhóm -CH2OH, phần đuôi chỉ nhóm -NHCOCH3, thì các cấu trúc α, β, γ – chitin được mô tả như sau: Hình 1.1. Sắp xếp các mạch trong phân tử chitin [1]. α – chitin có cấu trúc các mạch được sắp xếp ngược chiều nhau đều đặn, nên ngoài liên kết hydro trong một lớp và hệ chuỗi, nó còn có liên kết hydro giữa các lớp do các chuỗi thuộc lớp kề bên nên rất bền vững. Do các mắc xích sắp xếp đảo chiều, xen kẽ nhau nên rất thuận lợi về mặt không gian và năng lượng. đây cũng là một dạng phổ biến trong tự nhiên [22]. β, γ – chitin do mắc xích ghép với nhau theo kiểu song song (β – chitin) và hai song song một ngược chiều (γ – chitin) nên giữa các lớp không có loại liên kết hydro nào. Dạng β – chitin cũng có thể chuyển sang dạng α – chitin nhờ quá trình acetyl hóa cho cấu trúc bền vững hơn [22]. Công thức cấu tạo của chitin: Hình 1.2. Công thức cấu tạo của chitin [26]. Tên gọi: poly (1,4) – 2 – acetamido – 2 – deoxy – β – D – glucose; poly (1,4) – 2acetamido – 2 – deoxe – β – D – glucopyranose. Công thức phân tử: (C8H13O5N)n 6 Phân tử lượng: M = (203,19)n Trong đó n phụ thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu: Đối với tôm hùm: n = 700 ÷ 800 Đối với cua: n = 500 ÷ 600 Đối với tôm thẻ: n = 400 ÷ 500. CHITOSAN: Chitosan là dẫn xuất đề acetyl hóa của chitin, trong đó nhóm (-NH2) thay thế nhóm (-COCH3) ở vị trí C2. Chitosan được cấu tạo từ các mắc xích D– glucosamine liên kết với nhau bởi các liên kết β–1,4–glucoside, do vậy chitosan có thể gọi là poly β–(1,4)–2–amino–2–deoxy–D–glucose hoặc là poly β–(1,4)–D– glucosamine (cấu trúc III) [13]. Công thức cấu tạo: Hình 1.3. Công thức cấu tạo của chitosan [26] Công thức phân tử: (C6H11O4N)n Phân tử lượng: M = (161,07)n 1.1.3.2. Tính chất hóa lý của chitin – chitosan CHITIN Chitin có màu trắng hay màu phớt hồng, dạng vảy hay dạng bột, không mùi, không vị, không tan trong nước, trong bazơ, trong acid loãng và các dung môi hữu cơ khác như ete, rượu. Chitin hòa tan được trong dung dịch đậm đặc, nóng của muối thyoxyanate liti (LiSCN) và muối thyoxyanate canxi (Ca(SCN)2) tạo thành dung dịch keo, tan được trong hệ dimetylacetamid (LiCl 8%) [5], tan trong hexafluoro-isopropyl alcohol (CF3CHOHCF3) và hexafuoracetone sesquihydrate. Chitin có khả năng hấp thụ tia hồng ngoại ở bước sóng 884 ÷ 890 cm [13]. 7 Chitin ổn định với chất oxy hóa như KMnO4, nước javen, NaClO… người ta lợi dụng tính chất này để khử màu cho chitin. Chitin là một polysaccharide nguồn gốc tự nhiên, có hoạt tính sinh học cao, có tính hòa hợp sinh học và tự phân hủy cao. Chitin bị men lysozyme, một loại men chỉ có ở cơ thể con người, phân giải thành monome N–acetyl–D–glucosamine. Chitin kết tinh ở dạng vô định hình, khó hòa tan trong dung dịch ammoniac (NH3), không hòa tan trong thuốc thử Scheizer – Sacrpamonia. Điều này có thể là do sự thay đổi nhóm hydroxyl (-OH) tại vị trí C2 bằng nhóm acetamic (NHCOCH3) đã ngăn cản sự tạo thành các phức hợp cần thiết [17]. Khi nung nóng chitin trong dung dịch NaOH đặc thì chitin sẽ bị khử mất gốc acetyl tạo thành chitosan.  Lợi dụng tính chất này người ta điều chế ra chitosan – chất có nhiều ứng dựng trong công nghiệp thực phẩm (màng bao gói, bảo quản thực phẩm), là chất trung gian điều chế ra glucosamine có nhiều tác dụng trong y học. Khi đun nóng chitin trong acid HCl đặc thì chitin sẽ thủy phân tạo thành Glucosamine 85,5% và acid acetic 14,5%.  Lợi dụng tính chất này người ta điều chế ra glucosamine là một loại thuốc có tác dụng chống thoái hóa khớp. Phản ứng este hóa: - Chitin tác dụng với HNO3 đậm đặc cho sản phẩm chitin nitrat. - Chitin tác dụng với anhydrite sunfuric trong pyridine, dioxin và N,N– dimetylanilin cho sản phẩm chitin sunfonat. 8 CHITOSAN a) Tính chất vật lý Là một chất rắn, xốp, nhẹ, hình vảy, có thể xay nhỏ theo các kích cỡ khác nhau. Chitosan có tính kiềm nhẹ, có màu trắng hay màu vàng nhạt, không mùi, không vị, không tan trong nước, dung dịch kiềm và acid đậm đặc nhưng tan trong acid loãng (pH = 6) tạo dung dịch keo trong, có khả năng tạo màng tốt, nhiệt độ nóng chảy 309 – 3110C [4]. Chitosan và các dẫn xuất của chúng đều có tính kháng khuẩn, như ức chế hoạt động của một số loại vi khuẩn như E. coli, diệt được một số loại nấm hại dâu tây, cà rốt, đậu và có tác dụng tốt trong bảo quản các loại rau quả có vỏ cứng bên ngoài [5]. Khi dùng màng chitosan, dễ dàng điều chỉnh độ ẩm, độ thoáng không khí cho thực phẩm (nếu dùng bao gói bằng PE thì mức cung cấp oxy bị hạn chế, nước sẽ bị ngưng đọng tạo môi trường cho nấm mốc phát triển). Màng chitosan cũng khá dai, khó xé rách, có độ bền tương đương với một số chất dẻo vẫn được dùng làm bao gói [7]. b) Tính chất hóa học Trong phân tử chitosan có chứa các nhóm chức -OH, -NHCOCH3 trong các mắc xích N-acetyl-D-glucosamine và nhóm -OH, - NH2 trong các mắc xích D–glucosamine có nghĩa nó vừa là ancol vừa là amin, vừa là amid. Phản ứng hóa học có thể xảy ra ở vị trí chứa nhóm chức tạo ra dẫn xuất thế O-, dẫn xuất thế N-, hoặc dẫn xuất thế cả O-, N-. Mặt khác, chitosan là polime mà các monome được nối với nhau bởi các liên kết β–1,4–glucoside; các liên kết này rất dễ bị cắt đứt bởi các chất hóa học như acid, bazơ, tác nhân oxy – hóa và các enzyme thủy phân [11]. - Các phản ứng của nhóm - OH  Dẫn xuất sunfat.  Dẫn xuất O – axyl của chitosan  Dẫn xuất O – tosyl hóa của chitosan - Phản ứng ở vị trí N  Phản ứng N – acetyl hóa chitosan  Dẫn xuất N – sunfat chitosan. 9  Dẫn xuất N – glycochitosan (N – hydroxyl – etylchitosan).  Dẫn xuất acroleylen chitosan.  Dẫn xuất acroleylchitosan. - Phản ứng xảy ra ở vị trí O, N  Dẫn xuất O, N – cacboxymetylchitosan.  Dẫn xuất N, O – cacboxychitosan.  Phản ứng cắt đứt liên kết β–1,4–glucoside.  Chitosan phản ứng với acid đậm đặc tạo muối khó tan.  Chitosan tác dụng với iod trong môi trường H2SO4 cho phản ứng lên màu tím. Đây là phản ứng dùng trong phân tích định tính chitosan [24]. - Khả năng hấp thụ tạo phức với các ion kim loại chuyển tiếp Trong phân tử chitosan có chứa các nhóm chức mà trong đó nguyên tử Oxi và Nitơ của nhóm chức còn cặp electron chưa sử dụng, do đó chúng có khả năng tạo phức, phối trí với hầu hết kim loại nặng và các kim loại chuyển tiếp như: Hg2+, Cd2+, Zn2+, Cu2+, Ni2+, Co2+,…. Tùy nhóm chức trên mạch polymer mà thành phần và cấu trúc của phức khác nhau [25]. Ví dụ: với phức Ni (II) với chitin có cấu trúc lục diện với số phối trí bằng 6, còn phức Ni (II) với chitosan có cấu trúc tứ diện với số phối trí bằng 4. Hình 1.4. Phức của chitin – chitosan với kim loại [24] 10 - Phản ứng đặc trưng khác của chitosan:  Phản ứng Van – Wisselingh: chitosan tác dụng với lugol tạo dung dịch màu nâu trong môi trường acid sunfuric có màu đỏ tím.  Phản ứng Alternative: tác dụng với acid sunfuric tạo thành tinh thế hình cầu chitosan sunfat làm mất màu dung dịch fucsin 1%.  Khử amin nhờ: Ba(BrO)2, AgNO3, N2O2,…  Cắt mạch bởi acid, enzyme, bức xạ.  Chitosan tác dụng với iod trong môi trường H2SO4 cho phản ứng lên màu tím. Đây là phản ứng dùng trong phân tích định tính chitosan [16]. c) Tính chất sinh học Vật liệu chitosan có nguồn gốc tự nhiên, không độc, dùng an toàn cho người. Chúng có tính hòa hợp sinh học cao với cơ thể, có khả năng tự phân hủy sinh học. Chitosan có nhiều tác dụng sinh học đa dạng như: có khả năng hút nước,, giữ ẩm, tính kháng nấm, tính kháng khuẩn với nhiều chủng loại khác nhau, kích thích sự phát triển tăng sinh của tế bào, có khả năng nuôi dưỡng tế bào trong điều kiện nghèo dinh dưỡng, tác dụng cầm máu, chống sung u [7]. Chitosan không những ức chế vi khuẩn gram+, gram- mà cả nấm men, nấm mốc. Khả năng kháng khuẩn của chitosan phụ thuộc một vài yếu tố như loại chitosan sử dụng (độ deacetyl, trọng lượng phân tử), pH môi trường, nhiệt độ, sự có mặt của một số thành phần thực phẩm. Khả năng kháng khuẩn của chitosan và dẫn xuất của nó đã được nghiên cứu bởi một số tác giả như Trần Thị Luyến và cộng sự (2005), Shimahara và cộng sự (1982). Mặc dù chưa có một giải thích đầy đủ cho khả năng kháng khuẩn liên quan đến mức độ hấp thụ chitosan lên bề mặt tế bào. Trong đó, chitosan hấp phụ lên bề mặt tế bào vi khuẩn gram- tốt hơn vi khuẩn gram+. Một số cơ chế được giải thích như sau: + Nhờ tác dụng của những nhóm NH3+ trong chitosan lên các vị trí mang điện tích âm ở trên màng tế nào vi sinh vật, dẫn tới sự thay đổi tính thấm của màng tế bào làm cho quá trính trao đổi chất qua màng tế bào bị ảnh hưởng. Lúc này, vi sinh vật không thể nhận các chất dinh dưỡng cơ bản cho sự phát triển bình thướng bên trong và bên ngoài tế bào và cuối cùng dẫn đến sự chết của tế bào. 11 + Chitosan có thể ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn do có khả năng lấy đi các ion kim loại quan trọng như Cu2+, Co2+, Cd2+ của tế bào vi khuẩn nhờ hoạt động của các nhóm amino trong chitosan có thể tác dụng với các nhóm anion của bề mặt thành tế bào. Như vậy, vi sinh vật sẽ bị ức chế phát triển do sự mất cân bằng liên quan đến các ion quan trọng. + Điện tích dương của những nhóm NH3+ của glucosamine monome ở pH < 6.3 tác động lên các điện tích âm ở thành tế bào của vi khuẩn, dẫn đến sự rò rỉ các phần tử ở bên trong màng tế bào. Đồng thời gây ra sự tương tác giữa sản phẩm của quá trình thủy phân có khả năng khuếch tán bên trong tế bào vi sinh vật với DNA dẫn đến sự ức chế mRNA và sự tổng hợp protein tế bào. + Chitosan có khả năng phá hủy màng tế bào thông qua tương tác của những nhóm NH3+ với những nhóm phosphoryl của thành phần phospholipid của màng tế bào vi khuẩn [19]. Có tác dụng làm giảm đáng kể số lượng vi sinh vật tổng số trên bề mặt thực phẩm. Với hàm lượng 1,5% đã giảm số lượng vi sinh vật trên bề mặt cam là 93%, trên bề mặt quýt là 96%, trên bề mặt cà chua là 98%,….[3]. Ngoài ra chitosan còn có tác dụng làm giảm cholesterol và lipid máu, làm to vi động mạch và hạ huyết áp, điều trị thận mãn tính, chống rối loạn nội tiết. Chitosan là chất thân mỡ có khả năng hấp thụ dầu mỡ rất cao có thể hấp thu đến gấp 6 – 8 lần trọng lượng của nó. Chitosan trọng lượng phân tử nhỏ có điện tích dương nên có khả năng gắn kết với điện tích âm của lipid và acid mật tạo thành những chất có trọng lượng phân tử lớn không bị tác động bởi men tiêu hóa và do đó không bị hấp thụ vào cơ thể mà được thải ra ngoài theo phân qua đó làm giảm mức cholesterol nhất là LDL – cholesterol, acid uric trong máu nên có thể giúp ta tránh các nguy cơ bệnh tim mạch, bệnh gút, kiểm soát được tăng huyết áp và giảm cân [19]. Với khả năng thúc đẩy hoạt động của các peptide – insulin, kích thích việc tiết ra insulin ở tuyến tụy nên chitosan được dùng để điều trị bệnh tiểu đường. Nhiều công trình đã công bố khả năng kháng đột biến, kích thích làm tăng cường hệ thống miễn dịch cơ thể, khôi phục bạch cầu, hạn chế sự phát triển của các tế bào u, ung thư, HIV/AIDS. Chitosan còn có thể chống tia tử ngoại, chống ngứa [19]. 12 d) Độc tính Để dùng trong y tế và thực phẩm, đã có nhiều công trình nghiên cứu về độc tinh của chitosan và đưa ra các kết luận sau: Chitosan hầu như không độc, không gây độc trên động vật thí nghiệm và người, không gây độc tính trường diễn [17]. Chitosan là vật liệu hòa hợp sinh học cao, nó là chất mang lý tưởng trong hệ thống vận tải thuốc, không những sử dụng cho đướng uống, tiêm tĩnh mạch, tiêm bắp, tiêm dưới da, mà còn ứng dụng an toàn trong ghép mô. Chitosan với trọng lượng phân tử thấp để tiêm tĩnh mạch, không thấy tích lũy ở gan. Loại chitosan có DD = 50% có khả năng phân hủy sinh học cao, sau khi tiêm vào ổ bụng chuột, nó được thải trừ dễ dàng, nhanh chóng qua thận và nước tiểu, chitosan không phân bổ tới gan và lá lách. Những ưu điểm của chitosan: tính cơ học tốt, không độc, dễ tạo màng, có thể tự phân hủy sinh học, hòa hợp sinh học không những đối với động vật mà còn đối với các mô thực vật, là vật liệu y sinh tốt làm mau liền vết thương. Chitosan không độc hoặc độc tính rất thấp trên động vật thí nghiệm và nó có thể sử dụng an toàn trên cơ thể con người [25]. 1.2. Quy trình sản xuất chitin – chitosan Mặc dù chitin phân bố rộng rãi trong tự nhiên nhưng nó không được tìm thấy ở dạng tinh khiết. Chitin ở trạng thái tự nhiên thì liên kết với protein, lipid, sắc tố và canxi. Vì vậy, nó cần phải được làm sạch trước khi sử dụng cho bất kì mục đích thương mại nào. Phương pháp dụng để phân tách và tinh sạch chitin phải đẩm bảo lấy đi khoáng và tận dụng được các hợp chất có giá trị khác. Do đó, nhiều phương pháp đã được áp dụng cho việc thu hồi chitin như phương pháp hóa học, phương pháp sinh học hoặc phương pháp kết hợp hóa học với sinh học. Tuy nhiên, hiện nay các qui trình sản xuất chitin ở qui mô lớn chủ yếu sử dụng phương pháp hóa học. Phương pháp hóa học có ưu điểm như nhanh, đơn giản, dễ thực hiện ở qui mô lớn. Tuy nhiên, phương pháp hóa học cũng có nhiều nhược điểm như sản phẩm chitin, chitosan có phân tử lượng thấp, độ nhớt thấp, dư lượng hóa chất lớn, ô nhiễm môi trường, ăn mòn thiết bị [1]. Chitosan được sản xuất từ chitin qua quá trình tách nhóm acetyl (deacetylation). Tất cả các công đoạn trên đều được xử lý bằng hóa chất, tùy theo loại nguyên liệu, 13 công nghệ, và yêu cầu về chất lượng sản phẩm chitin và chitosan mà các điều kiện xử lý sẽ khác nhau [1]. 1.2.1. Quá trình khử khoáng Quá trình khử khoáng có thể thực hiện bằng cách xử lý với các hóa chất sau: HCl, HNO3, H2SO4. Tuy nhiên, thông thường quá trình khử khoáng được thực hiện trong dung dịch HCl loãng ở nhiệt độ phòng, nồng độ HCl từ 0,5 N đến 2 N, nhiệt độ từ nhiệt độ rất thấp đến nhiệt độ phòng. Thời gian từ 0,5 h đến 48 h. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình này là:  Nồng độ acid: Nồng độ acid quá thấp sẽ không khử được hết khoáng dẫn đến sản phẩm còn nhiều tạp chất. Nồng độ quá cao sẽ gây đứt mạch chitin, giảm chất lượng sản phẩm.  Tỉ lệ acid/nguyên liệu: Nếu quá nhỏ thì sẽ không khử hết khoáng, nếu quá lớn sẽ ảnh hưởng xấu đối với mạch, tốn chi phí.  Nhiệt độ, thời gian xử lí: Tốc độ phản ứng của quá trình khử khoáng diễn ra rất nhanh ở thời gian đầu (trong vòng 30 phút) với hàm lượng khoáng giảm đến 90%, sau đó quá trình diễn ra rất chậm (Hình 2.3). Kết quả tương tự cũng được ghi nhận trong nghiên cứu của No và cộng sự (1989) và Percot và cộng sự (2003). Trong quá trình ngâm acid thường thực hiện ở nhiệt độ thường, kết hợp với khuấy đảo, quá trình khử khoáng chưa đạt nếu vỏ còn cứng và không thấy bọt khí nổi lên, cần bổ sung thêm acid [15]. Hình 1.5. Quá trình khử khoáng của từ vỏ tôm sú (Trung, 1999) 14 Trong sản xuất chitin, việc thực hiện công đoạn khử khoáng sau khi tách protein thì sản phẩm chitin sẽ có hàm lượng khoáng còn lại thấp hơn so với sản phẩm chitin trong qui trình bắt đầu bằng công đoạn tách khoáng. Điều này có thể giải thích là HCl sẽ có tác dụng tốt hơn đối với mẫu phế liệu đã qua công đoạn tách protein, HCl sẽ tiếp xúc tốt hơn với các chất khoáng có trong phế liệu, hòa tan vào trong dung dịch. Tuy nhiên, sản phẩm chitosan sản xuất từ chitin của qui trình bắt đầu bằng công đoạn khử khoáng sau đó khử protein có độ nhớt cao hơn (Lertsutthiwong và cộng sự, 2002). Ngoài ra, để nâng cao chất lượng chitin, người ta có thể tiến hành khử khoáng nhiều lần với nồng độ acid xử lý thấp. Để xác định chế độ xử lý khử khoáng phù hợp có thể dùng phương pháp thực nghiệm, kết hợp với tính toán dựa trên phương trình phản ứng hóa học [15]. 1.2.2. Quá trình khử protein Tương tự như quá trình khử khoáng, quá trình khử protein từ phế liệu thủy sản cũng có thể thực hiện với nhiều hóa chất như NaOH, Na2CO3, NaHCO3, KOH, K2CO3, Ca(OH)2. Tuy nhiên, NaOH là được sử dụng nhiều nhất, nồng độ từ 1 đến 10%, ở nhiệt độ phòng hoặc nhiệt độ cao, có khi lên đến 100oC, thời gian xử lý từ vài giờ đến vài ngày. Tùy theo tính chất của nguyên liệu mà chúng ta có chế chọn chế độ để khử protein phù hợp [1]. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình này là:  Nhiệt độ: Đối với quá trình khử protein, nhiệt độ đóng vai trò quan trọng, ở nhiệt độ thường, quá trình tách protein diễn ra chậm, thời gian thủy phân từ 1 ngày đến vài ngày. Khi nâng nhiệt độ xử lý thì thời gian cần thiết để tách protein giảm đáng kể. Để rút ngắn thời gian tách protein chỉ còn vài giờ thì nhiệt độ cần đạt khoảng 90-100oC. Ngoài ra, tỷ lệ giữa phế liệu với dung dịch hóa chất cũng đóng vai trò quan trọng quyết định hiệu quả của quá trình tách protein. Để tăng hiệu quả tách protein, trong nhiều nghiên cứu quá trình tách protein được lập lại nhiều lần. Tuy nhiên, cần phải lưu ý là sử dụng nhiệt độ cao hoặc thời gian xử lý dài sẽ dẫn đến quá trình cắt mạch của sản phẩm chitin.  Nồng độ kiềm sử dụng ảnh hưởng đến chất lượng chitin và chitosan thu được. Nồng độ cao thì khả năng thủy phân protein cao, thời gian xử lý ngắn, hàm lượng protein còn lại trong sản phẩm chitin thấp. Tuy nhiên, gây ra hiện tượng cắt mạch chitin và chitosan. Thông thường nồng độ kiềm sử dụng là 4%. 15  Tỷ lệ giữa dung dịch kiềm và phế liệu cũng ảnh hưởng lớn đến hiệu quả tách protein, thường là tỷ lệ 5/1 đối với nguyên liệu tươi và 15/1 đối với nguyên liệu khô thường. Để tăng cường hiệu quả của quá trình tách protein thì trong quá trình xử lý cần thực hiện khuấy đảo. Để đáp ứng yêu cầu chất lượng của chitosan công nghiệp, thì hàm lượng protein còn lại trong sản phẩm chitin phải nhỏ hơn 1% [13]. Hình 1.6. Quá trình khử protein của từ vỏ tôm sú ở các nhiệt độ khác nhau với nồng độ NaOH 50% (Trung, 1999) 1.2.3. Quá trình deacetyl Quá trình sản xuất chitosan từ chitin được thực hiện bởi công đoạn deacetyl (deacetylation), đây là quá trình tách nhóm acetyl khỏi phân tử chitin. Thông thường quá trình deacetyl được thực hiện bằng cách ngâm chitin trong dung dịch NaOH hoặc KOH đậm đặc. Nồng độ thường sử dụng từ 40 – 50%, ở nhiệt độ 100oC hoặc cao hơn. Công đoạn deacetyl được thực hiện ở các chế độ rất đa dạng, phong phú, tùy thuộc vào nguồn chitin và yêu cầu về tính chất của chitosan [18]. Quá trình deacetyl theo phản ứng sau: Hình 1.7. Quá trình deacetyl [13] 16 Ngoài ra, người ta có thể sử dụng acid đặc để thực hiện quá trình deacetyl. Tuy nhiên, việc xử lý bằng acid đặc thường kèm theo quá trình cắt mạch của polyme, do đó thực hiện deacetyl trong môi trường kiềm đặc vẫn là phương pháp thường được sử dụng. Hiệu quả của quá trình deacetyl phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Dưới đây, các nhân tố ảnh hưởng chính được trình bày:  Nhiệt độ của quá trình deacetyl: Nhiệt độ càng cao thì quá trình deacetyl diễn ra càng nhanh. Sản phẩm chitosan thu được có độ deacetyl cao. Tuy nhiên, nhiệt độ cao ảnh hưởng lớn đến phân tử lượng của chitosan.  Thời gian và nồng độ kiềm: Quá trình deacetyl diễn ra nhanh ở giai đoạn đầu. Theo Wu và Bough (1978), quá trình deacetyl đạt được 68% trong thời gian 1 giờ khi thực hiện deacetyl với nồng độ 50% NaOH ở nhiệt độ 100oC. Tuy nhiên, quá trình deacetyl diễn ra chậm lại, sau 5 giờ chitosan chỉ đạt được 78% DD. Kết quả của nghiên cứu này cũng cho thấy, sau 2 giờ xử lý độ deacetyl không thay đổi nhiều so với 1 giờ mà chỉ có phân tử lượng của chitosan xử lý sau 2 giờ giảm đáng kể, điều đó cho thấy, từ sau 1 giờ đến hết 2 giờ, chủ yếu diễn ra quá trình cắt mạch chitosan. Ngoài ra, nồng độ kiềm cũng ảnh hưởng đến chất lượng chitosan. Nếu nồng độ kiềm quá cao thì sẽ ảnh hưởng đến độ nhớt và phân tử lượng của chitosan. Tuy nhiên, nếu nồng độ kiềm xử lý nhẹ dẫn đến sản phẩm chitosan sẽ không tan hoặc tan không hoàn toàn.  Tỷ lệ giữa chitin và dung dịch kiềm: Tỷ lệ chitin: dung dịch NaOH thường dùng là 1:10, trong một số nghiên cứu sử dụng tỷ lệ 1:15.  Ảnh hưởng của chất lượng chitin ban đầu: nếu chitin ban đầu không được chiết rút trong điều kiện phù hợp (ví dụ: xử lý tách khoáng ở nồng độ acid HCl quá cao, thời gian dài) thì chitin bị cắt mạch dẫn đến chitosan thu được có phân tử lượng và độ nhớt thấp. Kích thước của chitin ban đầu, kích thước hạt càng nhỏ thì quá trình deacetyl hóa diễn ra nhanh và sản phẩm chitosan thu được có chất lượng cao hơn (độ nhớt, phân tử lượng, độ tan tốt hơn).  Điều kiện môi trường xử lý: Để hạn chế sự cắt mạch chitin trong quá trình deacetyl hóa, người ta thực hiện công đoạn này trong môi trường khí nitơ 17 để hạn chế sự tiếp xúc với oxy không khí. Kết quả nghiên cứu của Bough và cộng sự (1978) khẳng định deacetyl hóa trong môi trường khí nitơ thì tạo ra sản phẩm chitosan có phân tử lượng và độ nhớt cao hơn sản phẩm chitosan được deacetyl hóa trong môi trường không khí [15]. Quá trình deacetyl diễn ra chậm, đặc biệt ở nhiệt độ thấp, vì vậy muốn rút ngắn thời gian sản xuất thì công đoạn deacetyl nên thực hiện ở nhiệt độ cao. Độ deacetyl của sản phẩm chitosan thu được phụ thuộc nhiều vào các yếu tố nồng độ NaOH sử dụng, nhiệt độ và thời gian xử lý tỷ lệ. Nồng độ NaOH và nhiệt độ xử lý càng cao thì độ deacetyl đạt càng cao. Tuy nhiên, phân tử lượng của sản phẩm chitosan thu được sẽ thấp (Bảng 1.1).Để đạt được độ deacetyl cao trên 90% thì một thì cần thực hiện quá trình deacetyl nhiều lần. Kết quả nghiên cứu của Trung và cộng sự (2006) cho thấy muốn chitosan thành phẩm đạt được độ deacetyl 96% khi sử dụng chitin từ phế liệu tôm thì cần phải thực hiện công đoạn deacetyl ở nhiệt độ 65oC và xử lý 2 lần (Bảng 1.1). Thực hiện quá trình deacetyl một lần khó đạt được độ deacetyl cao trên 90% vì giai đoạn cuối của quá trình deacetyl thì tốc độ tách nhóm acetyl diễn ra rất chậm. Tuy nhiên, sau khi rửa sạch mẫu và tiếp tục deacetyl thì quá trình deacetyl diễn ra nhanh hơn và đạt được độ deacetyl cao [11]. Bảng 1.1. Độ deacetyl hóa của chitosan ở các điều kiện xử lý khác nhau [1] Nồng độ Nhiệt NaOH (%) độ (oC) Thời gian (h) Số lần xử lý lặp lại Độ deacetyl (%) 50 40 24 1 75 50 65 20 1 87 50 65 20 2 96 Tuy nhiên, cần phải lưu ý là chế độ deacetyl ảnh hưởng lớn đến phân tử lượng và độ nhớt của chitosan của sản phẩm chitosan, chế độ deacetyl càng cao (nồng độ NaOH cao, nhiệt độ cao, thời gian dài) thì chitosan thu được có phân tử lượng thấp (Bảng 1.2). Do đó, để đạt được độ nhớt cao, phân tử lượng lớn thì thực hiện quá trình 18 deacetyl ở chế độ phù hợp, không nên sử dụng nồng độ NaOH quá cao, nhiệt độ quá cao. Bảng 1.2. Phân tử lượng của chitosan ở các điều kiện deacetyl hóa khác nhau (Methacanon và cộng sự, 2003) [15] Điều kiện xử lý 1.3. Phân tử lượng *105 (dalton) NaOH 40%, 80oC, 120 phút 8,74 NaOH 40%, 100oC, 60 phút 4,58 NaOH 60%, 80oC, 60 phút 10,9 NaOH 60%, 80oC, 120 phút 8,87 NaOH 60%, 100oC, 60 phút 4,53 NaOH 60%, 100oC, 120 phút 3,22 Tình hình nghiên cứu, sản xuất chitin – chitosan trên thế giới và ở Việt Nam Việc nghiên cứu về dạng tồn tại, cấu trúc, tính chất lý hóa, ứng dụng của chitosan đã được công bố từ những năm 30 của thế kỷ XX. Những nước đã thành công trong lĩnh vực nghiên cứu sản xuất chitosan đó là: Nhật Bản, Mỹ, Trung Quốc, Ấn Độ, Pháp. Cho đến nay trên thế giới đã có nhiều quy trình sản xuất chitin – chitosan, với nguồn nguyên liệu khác nhau nhưng chủ yếu là vỏ tôm, cua, ghẹ như: 1.3.1. Sản xuất chitin – chitosan theo phương pháp hóa học 1.3.1.1. Quy trình của Stevens Từ nguồn nguyên liệu tôm tươi, khử protein bằng NaOH 4% ở nhiệt độ phòng trong 24H, sau đó tiến hành kiểm tra hàm lượng protein.Công đoạn khử khoáng được thực hiện bằng HCl 4% ở nhiệt độ phòng sau 24h, tiến hành kiểm tra hàm lượng khoáng. Cuối cùng chitin thu được có dang vảy to, màu sắc trắng sáng. 19 Quy trình đơn giản, không tốn nhiều thiết bị, dụng cụ đắt tiền nhưng thể tích hóa chất dùng để xử lý nguyên liệu lớn mà chưa có biện pháp xử lý trước khi thải ra môi trường làm ô nhiễm môi trường [20, 21]. Phế liệu tôm tươi Khử protein (NaOH 4%, t = 24h, t0 phòng) Kiểm tra hàm lượng protein Thấp hơn 1% Khử khoáng (HCl 4%, t = 24h, t0 = 300C) Kiểm tra hàm lượng khoáng Thấp hơn 1% Chitin 1.3.1.2. Quy trình sản xuất chitin từ vỏ tôm hùm của Hackman (1962) Vỏ tôm hùm Ngâm HCL HCl 2M t0 phòng t = 5h, w/v = 1/10 Rửa trung tính, sấy khô, nghiền mịn HCl 2M Ngâm HCl Li tâm Ngâm NaOH Li tâm t0 phòng t = 48h, w/v = 1/ 2,5 NaOH 1M t0 = 1000C t = 42h, w/v = 1/ 2,5 NaOH 1M Ngâm NaOH Rửa sạch bằng li tâm Làm khô Chitin dạng bột màu kem t0 = 1000C t = 12h, w/v = 1/ 2,5 20 Từ nguồn nguyên liệu tôm hùm, khử khoáng bằng cách ngâm nguyên liệu với HCl 2M, nhiệt độ phòng 2 lần với các thời gian khác nhau là 5h và 48h, khử protein bằng cách ngâm nguyên liệu với NaOH 1M, 1000C 2 lần với các thời gian khác nhau là 42h và 12h. Quy trình này nhiều công đoạn, thời gian sản xuất kéo dài 65 giờ nên chỉ có ý nghĩa trong công tác nghiên cứu thí nghiệm vì khi đưa ra sản xuất đại trà thì thiết bị công kềnh, tốn kém, hóa chất đắt tiền, dễ hao hụt khi sản xuất [26]. 1.3.1.3. Quy trình thủy nhiệt của Yamasaki và Nakamichi (Nhật Bản) Vỏ cua khô HCl 2M Sấy khô t0 = 1200C t = 1h Rửa trung tính Sấy khô Khử protein và chitin NaOH 15M t0 = 1500C t = 1h Rửa trung tính Khử chất vô cơ Chitosan Nguyên liệu là vỏ cua khô được khử khoáng bằng HCl 2M, 1200C trong 1h, rửa sạch và sấy khô, tiếp theo là khử protein và chitin bằng NaOH 15M 1500C trong 1h, cuối cùng sấy khô thu được chitosan. Quy trình đã đơn giản hóa công đoạn, rút ngắn đáng kể thời gian sản xuất so với các quy trình khác. Hóa chất sử dụng ít (HCl và NaOH), chitosan thu được có độ tinh khiết cao. Tuy nhiên sản phẩm chitosan có độ nhớt thấp do nhiệt độ xử lý ở các công đoạn khá cao [25]. 1.3.2. Sản xuất chitin – chitosan theo phương pháp hóa học cải tiến 1.3.2.1. Quy trình sản xuất của Pháp Nguyên liệu là vỏ tôm được hấp chín, phơi khô, nghiền nhỏ và khử protein bằng NaOH 3,5% ở nhiệt độ 65OC trong 2h. Công đoạn khử khoáng bằng HCl 2N ở nhiệt độ phòng sau 0,5 h. Để tách chất màu, dùng NaOCl 0.135% 6 phút, nhiệt độ phòng, 21 1/10 (w/v). Sấy, thu được chitin. Chitin được deacetyl bằng NaOH 40%, 650C, t = 2h, w/v = 1/10. Cuối cùng rửa sạch ta thu được chitosan [27]. Quy trình sản xuất này rút ngắn được thời gian sản xuất rất nhiều, sản phẩm thu được rất sạch, có màu trắng đẹp do đã khử được sắc tố triệt để. Tuy nhiên, do NaOCl là một chất oxy hóa mạnh nên ảnh hưởng đến mạch polymer làm cho độ nhớt của sản phẩm giảm một cách rõ rệt. Mặt khác, acetone rất đắt tiền, tổn thất nhiều, giá thành sản phẩm sao. Chưa kể đến các yếu tố an toàn sản xuất công nghệ này khó áp dụng trong điều kiện sản xuất của nước ta hiện nay. Vỏ tôm Hấp chín, phơi khô Xay nhỏ NaOH 3.5%, 650C Tách protein t = 2h, w/v = 1/10 Rửa trung tính Ngâm HCl HCl 1N, RT t = 2h, w/v = 1/10 Ngâm acetone Ngâm NaOCl RT, t = 2h w/v = 1/10 NaOCl 0.135%, RT t = 6phút, w/v = 1/10 Rửa trung tính NaOH 40% Deacetyl chitin t0 = 650C, t = 2h w/v = 1/10 Rửa trung tính Chitosan 22 1.3.2.2. Quy trình của Đỗ Minh Phụng Gần đây, khi chitosan trở thành nhu cầu trong nhiều ngành công nghiệp và có giá trị thì rất nhiều cơ quan nghiên cứu như: trường Đại học Thủy Sản, Trung tâm nghiên cứu polymer – Viện khoa học Việt Nam, Xí nghiệp Thủy sản Hà Nội, Trung tâm Công nghệ và sinh học Thủy sản – Viện nghiên cứu môi trường Thủy sản 2,…đã tập trung vào nghiên cứu và ứng dụng công nghệ này. Trong đó, các kết quả công bố gần đây của các nhà khoa học thuộc trường Đại học Thủy sản Nha Trang đã đi sâu nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất ở bước cao hơn theo hướng giảm thiểu sử dụng hóa chất trong xử lý, ứng dụng công nghệ enzyme. Những kết quả đó đã góp phần đáp ứng yêu cấu cấp bách xử lý phế liệu của tôm đông lạnh và trước những yêu cấu khắt khe hơn về chất lượng chitin – chitosan trên thị trường đầy tiềm năng hiện nay [8]. Năm 1978, trường Đại học Thủy sản bắt đầu nghiên cứu tách chiết chitin – chitosan do Đỗ Minh Phụng thực hiện. Vỏ tôm khô HCl 6N Ngâm HCl RT, t =48h w/v = 1/ 2,5 Rửa trung tính Ngâm NaOH NaOH 8% 1000C, t = 48h w/v = 1/ 2,5 Rửa trung tính Tẩy màu Chitin NaOH 40% Nấu trong NaOH 800C, t = 24h w/v = 1/ 1 Rửa trung tính Chitosan 23  Nhận xét: Sản xuất chitosan theo quy trình này sản phẩm tạo thành có chất lượng khá tốt, chitin có màu sắc đẹp. Tuy nhiên, lại có nhược điểm là thời gian sản xuất kéo dài, tiêu tốn nhân công, nồng độ hóa chất sử dụng cao kết hợp với thời gian xử lý dài (công đoạn khử khoáng) làm cắt mạch polymer trong môi trường acid dẫn đến độ nhớt giảm. 1.3.2.3. Quy trình sản xuất chitosan từ vỏ tôm bằng phương pháp hóa học với một công đoạn xử lý kiềm (Trần Thị Luyến, 2003) Nguyên liệu là vỏ tôm được ngâm HCl 10%, nhiệt độ phòng trong thời gian 5h để khử khoáng, rửa sạch, sau đó khử protein và lipid bằng NaOH 40%, 650C, trong vòng 2h. Cuối cùng rửa sạch thu được chitosan [9]. Nhận xét: Phương pháp xử lý kiềm một giai đoạn cho sản phẩm chitosan có chất lượng không thua kém so với quy trình thông thường với hai giai đoạn xử lý kiềm. Tổng thời gian cần thiết giảm đi rất nhiều và như vậy nếu so về mặt kinh tế thì đây là phương pháp tốt hơn hẳn. Tuy nhiên, phương pháp này vẫn còn nhược điểm là dung dịch NaOH đặc sau khi deacetyl có màu sẫm gây khó khăn cho việc tái sử dụng. Chitosan thu được được xác định các chỉ tiêu cơ bản. Kết quả được thể hiện ở Bảng 1.3. Vỏ tôm khô Ngâm HCl HCl 10% t0 phòng Vỏ tôm tươi HCl 10% t0 phòng Ngâm HCl t = 5h t = 5h w/v = 1/10 w/v = 1/5 Rửa trung tính Khử protein, lipid NaOH 40% t0 = 80 ± 20C t = 5h Rửa trung tính Chitosan w/v = 1/10 24 Bảng 1.3. Một số chỉ tiêu chất lượng của chitosan từ vỏ tôm sú theo phương pháp xử lý kiềm một giai đoạn (Trần Thị Luyến, 2003) [9] Chỉ tiêu Kết quả Chỉ tiêu Kết quả Màu sắc Trắng đẹp Độ Deacetyl 76,25% Trạng thái Mềm mại Tổng thời gian thực hiện 9,5 giờ Độ ẩm 10% Nts 8,07% Hàm lượng tro 0,023% Hiệu suất 40,25 Hàm lượng các 1,6% Độ tan 98,32% 14,480E Phản ứng biure Âm tính chất không tan Độ nhớt 1.3.2.4. Quy trình của Trung tâm Chế biến Đại học Thủy sản Phế liệu tôm tươi được khử khoáng bằng HCl 7%, ở nhiệt độ phòng trong 24h, tỉ lệ nguyên liệu/HCl = 1/5; sau đó được khử protein bằng NaOH 6%, ở nhiệt độ phòng trong 24h, tỉ lệ nguyên liệu/NaOH = 1/5 thu được chitin. Chitin được deacetyl hóa bằng NaOH 6%, ở 800C trong 24h, tỉ lệ nguyên liệu/NaOH = 1/10. Rửa sạch ta thu được chitosan. Quy trình đơn giản, không đòi hỏi máy móc thiết bị phức tạp. Do đó rất dễ dàng để sản xuất số lượng lớn. Tuy nhiên thời gian sản xuất kéo dài và nồng độ hóa chất sử dụng khá cao, vẫn chưa có hướng xử lý nước thải từ quá trình sản xuất [8]. Phế liệu tôm HCl 7% Khử khoáng RT, t = 24h Rửa trung tính w/v = 1/5 NaOH 6% Khử protein RT, t = 24h Rửa trung tính w/v = 1/5 NaOH 6% Deacetyl hóa t0 = 800C, t = 24h Phơi, sấy Chitosan w/v = 1/10 25 1.3.2.5. Quy trình sản xuất chitin và chitosan của Trang Sĩ Trung (2010) Nguyên liệu Ngâm trong NaOH 4% (24h, 30oC) Rửa trung tính Ngâm trong HCl 4% (18h, 30oC) Rửa trung tính Sấy khô, đến độ ẩm [...]... tiễn và khoa học trên, được sự đồng ý của Bộ môn Công nghệ sinh học-Viện Công nghệ sinh học và môi trường-Trường Đại học Nha Trang, 2 dưới sự hướng dẫn của thầy Nguyễn Công Minh, tôi đã tiến hành thực hiện đề tài Nghiên cứu sự ảnh hưởng của trạng thái và chất lượng chitin đến khả năng deacetyl hóa bằng NaOH  Mục đích của đề tài Nghiên cứu sự ảnh hưởng của trạng thái và chất lượng chitin đến khả năng. .. khả năng deacetyl hóa bằng NaOH để sản xuất ra chitosan đạt được những chỉ tiêu đề ra nhằm nâng cao chất lượng chitosan  Nội dung của đề tài  Nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước chitin đến chất lượng chitosan thông qua quá trình deacetyl hóa bằng NaOH  Nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm chitin đến chất lượng chitosan thông qua quá trình deacetyl hóa bằng NaOH  Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng protein,... cũng ảnh hưởng đến chất lượng chitosan Nếu nồng độ kiềm quá cao thì sẽ ảnh hưởng đến độ nhớt và phân tử lượng của chitosan Tuy nhiên, nếu nồng độ kiềm xử lý nhẹ dẫn đến sản phẩm chitosan sẽ không tan hoặc tan không hoàn toàn  Tỷ lệ giữa chitin và dung dịch kiềm: Tỷ lệ chitin: dung dịch NaOH thường dùng là 1:10, trong một số nghiên cứu sử dụng tỷ lệ 1:15  Ảnh hưởng của chất lượng chitin ban đầu: nếu chitin. .. yêu cầu, một lượng axít và xút còn lại sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả quá trình xử lý sau và chất lượng của chitin thành phẩm Bước ly tâm và sấy cần được thực hiện trong qui trình để loại bỏ nước và làm khô sản phẩm, nhiệt độ quá trình sấy không nên quá cao vì sẽ ảnh hưởng đến màu sắc của chitin thu được Qua nghiên cứu cho thấy quá trình tách protein thực hiện bằng phương pháp hóa học sử dụng NaOH ở nồng... protein, quá trình deacetyl; trong đó quá trình deacetyl là quá trình quan trọng nhất quyết định đến chất lượng chitosan cuối cùng Đã có nhiều đề tài nghiên cứu về các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình deacetyl hóa như nhiệt độ, nồng độ NaOH, thời gian xử lý… Tuy nhiên yếu tố ảnh hưởng lớn đến quá trình deacetyl hóa để tạo ra sản phẩm chitosan là nguyên liệu chitin ban đầu vẫn chưa được nghiên cứu rộng rãi... dẫn đến quá trình cắt mạch của sản phẩm chitin  Nồng độ kiềm sử dụng ảnh hưởng đến chất lượng chitin và chitosan thu được Nồng độ cao thì khả năng thủy phân protein cao, thời gian xử lý ngắn, hàm lượng protein còn lại trong sản phẩm chitin thấp Tuy nhiên, gây ra hiện tượng cắt mạch chitin và chitosan Thông thường nồng độ kiềm sử dụng là 4% 15  Tỷ lệ giữa dung dịch kiềm và phế liệu cũng ảnh hưởng. .. nấm mốc Khả năng kháng khuẩn của chitosan phụ thuộc một vài yếu tố như loại chitosan sử dụng (độ deacetyl, trọng lượng phân tử), pH môi trường, nhiệt độ, sự có mặt của một số thành phần thực phẩm Khả năng kháng khuẩn của chitosan và dẫn xuất của nó đã được nghiên cứu bởi một số tác giả như Trần Thị Luyến và cộng sự (2005), Shimahara và cộng sự (1982) Mặc dù chưa có một giải thích đầy đủ cho khả năng kháng... khoáng của chitin đến chất lượng chitosan thông qua quá trình deacetyl hóa bằng NaOH 3 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ CHITIN - CHITOSAN 1.1 Tổng quan về chitin – chitosan 1.1.1 Lịch sử phát hiện Chitin được Bracannot phát hiện lần đầu tiên vào năm 1811 trong cặn dịch chiết của một loại nấm và đặt tên là “fungine” để ghi nhớ nguồn gốc tìm ra nó Năm 1823, Odier đã phân lập được một chất từ bọ cánh cứng và ông... quá trình deacetyl phụ thuộc vào nhiều yếu tố Dưới đây, các nhân tố ảnh hưởng chính được trình bày:  Nhiệt độ của quá trình deacetyl: Nhiệt độ càng cao thì quá trình deacetyl diễn ra càng nhanh Sản phẩm chitosan thu được có độ deacetyl cao Tuy nhiên, nhiệt độ cao ảnh hưởng lớn đến phân tử lượng của chitosan  Thời gian và nồng độ kiềm: Quá trình deacetyl diễn ra nhanh ở giai đoạn đầu Theo Wu và Bough... tách chiết và tinh chế Tùy thuộc vào đặc tính của cơ thể và sự thay đổi từng giai đoạn sinh lý mà trong cùng một loài, người ta có thể thấy sự thay đổi về hàm lượng cũng như chất lượng của chitin [2] Chitosan trong tự nhiên cũng rất hiếm gặp, chỉ có trong vách ở một số lớp vi nấm (đặc biệt: zygomycetes, mucor) và ở vài loại côn trùng như ở thành bụng của mối chúa Sự deacetyl bằng kiềm, chitin tạo thành ... thực đề tài Nghiên cứu ảnh hưởng trạng thái chất lượng chitin đến khả deacetyl hóa NaOH  Mục đích đề tài Nghiên cứu ảnh hưởng trạng thái chất lượng chitin đến khả deacetyl hóa NaOH để sản xuất... sau: Chitin sản xuất phương pháp hóa học Nghiên cứu ảnh hưởng kích thước chitin đến khả deacetyl NaOH Nghiên cứu ảnh hưởng kích thước chitin đến khả deacetyl NaOH Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng. .. 33 1.1 .Chất lượng chitin: 33 1.2 .Ảnh hưởng kích thước chitin đến khả deacetyl NaOH 34 v 1.3 .Ảnh hưởng độ ẩm chitin đến khả deacetyl NaOH 38 1.4 .Chất lượng chitin so với chitin