ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ HUẾ ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG CHỌN TẠO GIỐNG LÚA CHỊU MẶN ỨNG PHÓ VỚI BIẾN ĐỔI KHÍ HẬU LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội, 2013 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ HUẾ ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG CHỌN TẠO GIỐNG LÚA CHỊU MẶN ỨNG PHÓ VỚI BIẾN ĐỔI KHÍ HẬU Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. Lê Hùng Lĩnh TS. Đỗ Thị Phúc Hà Nội, 2013 LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình thực tập và hoàn thành luận văn, ngoài sự nỗ lực cố gắng của bản thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của các cán bộ thuộc bộ môn Sinh học phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp. Tôi rất trân trọng các thầy cô trong bộ môn Di truyền, khoa Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN cùng lãnh đạo và các cán bộ thuộc Bộ môn Sinh học phân tử Viện Di truyền Nông Nghiệp đã tạo điều kiện giúp đỡ giúp tôi xây dựng và hoàn thành luận văn này. Đặc biệt tôi chân thành cảm ơn TS. Lê Hùng Lĩnh, TS. Đỗ Thị Phúc đã tận tình hướng dẫn trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Qua đây tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc TS. Tạ Hồng Lĩnh, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam đã giúp đỡ, chia sẻ kinh nghiệm và có nhiều ý kiến đóng góp để tôi hoàn thành luận văn này. Cuối cùng tôi xin tỏ lòng cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn. Trân trọng! Hà Nội, ngày 18 tháng 12 năm 2013 Nguyễn Thị Huế DANH MỤC BẢNG TT Tên bảng Bảng 1 Tác động của mực nƣớc biển dâng cao đến khu vực Đông Á 7 Bảng 2 Độ mặn tại một số điểm trên 4 hệ thống sông lớn vùng ĐBSH 9 Bảng 3 Kịch bản nƣớc biển dâng ở Việt Nam so với thời kỳ 1980 – 1999 11 Bảng 4 So sánh chỉ thị phân tử so với chỉ thị hình thái 23 Bảng 5 Thông tin về các chỉ thị phân tử trên NST1 31 Bảng 6 Đánh giá tiêu chuẩn cải tiến (SES) bằng quan sát mức hại của 37 Trang mặn giai đoạn mạ Bảng 7 Kết quả thanh lọc mặn sau 2 tuần của các giống 45 Bảng 8 So sánh hai giống FL478 và OM6976 46 Bảng 9 Kết quả thanh lọc mặn sau 2 tuần của các dòng 55 Bảng 10 Một số đặc điểm nông học và hình thái của các dòng/giống lúa 59 tham gia thí nghiệm tại Giao Thủy, Nam Định, năm 2012 Bảng 11 Năng suất và các yếu tố cấu thanh năng suất của các dòng/giống 62 tham gia thí nghiệm tại Giao Thủy, Nam Định, năm 2012 Bảng 12 Một số đặc điểm nông học và hình thái của các dòng chịu mặn 65 trong thí nghiệm tại Giao Thủy, Nam Định trong năm 2013 Bảng 13 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng chịu mặn trong thí nghiệm tại Giao Thủy, Nam Định năm 2013 69 DANH MỤC HÌNH Tên hình TT Trang Hình 1 Diễn biến nhiệt độ ở quy mô toàn cầu và khu vực 5 Hình 2 Xu thế biến động mực nƣớc biển trung bình tại các trạm quan 5 trắc nƣớc biển trên toàn cầu Hình 3 Mức tăng nhiệt độ trung bình mùa đông vào cuối thế kỷ 21 8 theo kịch bản phát thải trung bình Hình 4 Kịch bản nƣớc biển dâng cho các khu vực ven biển Việt Nam 10 Hình 5 Vị trí các chỉ thị trên NST1 và Locus gen Saltol 30 Hình 6 Thí nghiệm thanh lọc mặn giai đoạn mạ trong điều kiện nhân 37 tạo Hình 7 Kết quả kiểm tra DNA tổng số trên gel agarose 0,8% 47 Hình 8 Kết quả điện di với chỉ thị RM493 trên 20 cá thể BC1F1 49 Hình 9 Kết quả điện di với chỉ thị RM3412b trên 20 cá thể BC1F1 50 Hình 10 Kết quả điện di với chỉ thị RM493 trên 18 cá thể BC2F1 50 Hình 11 Kết quả điện di với chỉ thị RM3412b trên 18 cá thể BC2F1 51 Hình 12 Kết quả điện di với chỉ thị RM493 trên 22 cá thể BC3F1 51 Hình 13 Kết quả điện di với chỉ thị RM3412b trên 22 cá thể BC3F1 52 Hình 14 Kết quả điện di với chỉ thị RM493 trên 32 cá thể BC3F2 53 Hình 15 Kết quả điện di với chỉ thị RM3412b trên 32 cá thể BC3F2 53 Hình 16 Mạ đƣợc 14 ngày tuổi, bắt đầu thí nghiệm thanh lọc mặn 57 Hình 17 Mạ sau 7 ngày trong dung dịch mặn 57 Hình 18 Mạ sau 12 ngày trong môi trƣờng mặn 57 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TT Từ viết tắt Nội dung 1 CNSH Công nghệ sinh học 2 ANLT An ninh lƣơng thực 3 NST Nhiễm sắc thể 4 IRRI Viện nghiên cứu lúa Quốc tế 5 Bộ NN&PTNT Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn 6 ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long 7 TGST Thời gian sinh trƣởng 8 BĐKH Biến đổi khí hậu 9 SES Standard Evaluating Score 10 EB Extraction Buffer 11 TE Tris – EDTA 12 DNA Deoxyribonucleic acid 13 AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism 14 CTAB Cetyltrimethyl Amonium Bromide 15 EDTA Ethylenediaminetetra Acetic Acid 16 MAS Marker Assisted Selection 17 PCR Polymerase Chain Reaction 18 RAPD Random amplified polymorphism DNA 19 RFLP Restriction Fragment Length Polymorphisms 20 SDS Sodium Dodecyl Sulphate 21 SSR Simple Sequence Repeats 22 TBE Tris – Bric Acid – EDTA 23 BC Back Cross 24 QTL Quantitative Trait Loci MỤC LỤC MỞ ĐẦU ...............................................................................................................................1 1. Tính cấp thiết của đề tài: ...........................................................................................1 2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài .................................................................................2 3. Ý nghĩa của đề tài ......................................................................................................2 3.1.Ý nghĩa khoa học.....................................................................................................2 3.2. Ý nghĩa thực tiễn ....................................................................................................2 4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của đề tài. ............................................................2 4.1. Đối tƣợng nghiên cứu:............................................................................................2 4.2. Phạm vi nghiên cứu: ...............................................................................................3 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................................4 1.1. Ảnh hƣởng của BĐKH đến sản xuất nông nghiệp Thế giới và Việt Nam .............4 1.1.1. Ảnh hƣởng của BĐKH đến sản xuất nông nghiệp trên Thế giới ....................4 1.1.2. Ảnh hƣởng của BĐKH đến sản xuất nông nghiệp tại Việt Nam ....................8 1.2. Nghiên cứu các đặc tính sinh lý, sinh hóa liên quan đến chống chịu mặn ở cây lúa ................................................................................................................................ 11 1.2.1. Cơ chế chống chịu mặn .................................................................................11 1.2.2.Di truyền tính chống chịu mặn .......................................................................16 1.3.Chỉ thị phân tử và ứng dụng trong chọn tạo giống cây trồng ................................ 18 1.3.1. Khái niệm về chỉ thị phân tử .........................................................................18 1.3.2. Các loại chỉ thị phân tử..................................................................................19 1.3.3. Ứng dụng phƣơng pháp MAS(Marker Assisted Selection) trong chọn tạo giống ........................................................................................................................22 1.4. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn trong và ngoài nƣớc ............25 1.4.1. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn ở nƣớc ngoài ................25 1.4.2. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn trong nƣớc ...................27 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................30 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ...........................................................................................30 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu .......................................................................................30 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu .....................................................................................32 2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................32 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ......................................................................................32 2.3.1. Phƣơng pháp lai hữu tính giữa giống lúa cho và nhận gen ...........................32 2.3.1.1. Chuẩn bị cây mẹ: ....................................................................................32 2.3.1.2. Khử đực ..................................................................................................33 2.3.1.3. Chọn cây bố ...........................................................................................33 2.3.1.4. Thụ phấn .................................................................................................33 2.3.2. Phƣơng pháp chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử (MAS) .......................................33 2.3.3. Phƣơng pháp thử độ mặn nhân tạo ................................................................ 35 2.3.4. Phƣơng pháp thí nghiệm đồng ruộng ............................................................38 2.3.5. Phƣơng pháp tách chiết DNA và phân tích di truyền chỉ thị phân tử ..........38 2.3.5.1. Phƣơng pháp tách CTAB .......................................................................38 2.3.5.2. Kỹ thuật PCR với các mồi SSR.............................................................. 40 2.3.5.3. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose 0,8% ...........................................41 2.3.5.4. Phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide 4,5% .............................. 42 2.3.5.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu ......................................................................44 Chƣơng 3: KẾT QUẢ .........................................................................................................45 3.1. Kết quả đánh giá xác định vật liệu bố mẹ trong nghiên cứu ................................ 45 3.1.1 Kết quả đánh giá khả năng chịu mặn của các giống lúa trong điều kiện nhân tạo ............................................................................................................................45 3.1.2. Kết quả đánh giá xác định vật liệu bố mẹ trong nghiên cứu ........................45 3.2. Kết quả chọn tạo dòng lúa chịu mặn từ tổ hợp lai OM6976/FL478 ....................47 3.2.1. Kết quả tách chiết DNA bằng phƣơng pháp CTAB ......................................47 3.2.2. Kết quả kiểm tra đa hình tại locus gen saltol giữa FL478 và OM6976. .......48 3.2.3 Kết quả lai tạo con lai F1 của tổ hợp lai OM6976 và FL478..........................48 3.2.4. Sử dụng chỉ thị phân tử xác định các cá thể mang locus gen chịu mặn trong quần thể BC1F1 ........................................................................................................49 3.2.5. Sử dụng chỉ thị phân tử xác định các cá thể mang locus gen chịu mặn trong quần thể BC2F1 ........................................................................................................50 3.2.6. Sử dụng chỉ thị phân tử xác định các cá thể mang locus gen chịu mặn trong quần thể BC3F1 ........................................................................................................51 3.2.7. Sử dụng chỉ thị phân tử xác định các cá thể mang locus gen chịu mặn trong quần thể BC3F2 ........................................................................................................52 3.3. Đánh giá vật liệu sử dụng trong nghiên cứu và chọn tạo giống lúa chịu mặn .....54 3.3.1. Đánh giá tính chịu mặn của các dòng lúa chọn tạo trong điều kiện nhân tạo .................................................................................................................................54 3.3.2. Đánh giá các đặc tính nông sinh học, yếu tố cấu thành năng suất và khả năng chịu mặn của các dòng đƣợc tạo ra mang QTL/Saltol trong vụ mùa 2012 .............58 3.3.2.1. Đánh giá khả năng sinh trƣởng, phát triển của một số dòng chịu mặn tại Giao Thủy, Nam Định trong vụ mùa năm 2012 .................................................58 3.3.2.1. Đánh giá các yếu tố cấu thành năng suất của một số dòng chịu mặn tại Giao Thủy, Nam Định trong vụ mùa 2012..........................................................61 3.3.3. Đánh giá đặc tính nông sinh học, yếu tố cấu thành năng suất và khả năng chịu mặn của các dòng đƣợc tạo ra mang QTL/Saltol trong vụ xuân 2013 ............64 3.3.3.1. Đánh giá khả năng sinh trƣởng, phát triển của một số dòng chịu mặn tại Giao Thủy, Nam Định trong vụ Xuân năm 2013 ................................................64 3.3.3.2. Đánh giá các yếu tố cấu thành năng suất của một số dòng chịu mặn tại Giao Thủy, Nam Định trong vụ Xuân năm 2013 ................................................68 KẾT LUẬN .........................................................................................................................74 1. Kết luận ...................................................................................................................74 2. Kiến nghị .................................................................................................................74 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................................75 Tài liệu tiếng Việt ............................................................................................................75 Tài liệu tiếng Anh ............................................................................................................76 PHỤ LỤC ............................................................................................................................82 Phụ lục 1: Danh sách hóa chất và thành phần các dung dịch ..........................................82 Phụ lục 2: Phân tích chỉ tiêu hình thái và các chỉ tiêu cấu thành năng suất các dòng chịu mặn trong vụ mùa 2012 tại Giao Thủy, Nam Định .........................................................87 Phụ lục 3: Phân tích chỉ tiêu hình thái và các chỉ tiêu cấu thành năng suất các dòng chịu mặn trong vụ xuân 2013 tại Giao Thủy, Nam Định ........................................................91 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài: Trong những năm gần đây biến đổi khí hậu đang diễn ra ở quy mô toàn cầu do các hoạt động của con ngƣời làm phát thải quá mức khí nhà kính vào cầu khí quyển. Biến đổi khí hậu tác động nghiêm trọng đến sản xuất, đời sống và môi trƣờng trên phạm vi toàn thế giới. Theo báo cáo của trƣờng Đại học Stanford, đến năm 2030 sản lƣợng lƣơng thực ở Châu Á giảm 10% hoặc hơn, đặc biệt là lúa gạo, năng suất và sản lƣợng lúa luôn bị đe dọa bởi thiên tai, sâu bệnh và các yếu tố môi trƣờng và đáng chú ý là hiện tƣợng đất nhiễm mặn. Đất trồng trọt bị ảnh hƣởng mặn ƣớc tính khoảng 380 triệu ha, chiếm 1/3 diện tích đất trồng trên toàn thế giới. Việt Nam là một nƣớc với 90% dân số làm nông nghiệp và là nƣớc xuất khẩu gạo đứng hàng thứ 2 trên thế giới sau Thái Lan, chiếm khoảng 50% tổng sản lƣợng gạo thƣơng mại trên thế giới (số liệu tính đến năm 2009). Lúa gạo là nguồn thu ngoại tệ lớn nhất của nền nông nghiệp xuất khẩu Việt Nam và cũng là nguồn thức ăn chính gần 90 triệu dân số trong nƣớc. Tuy nhiên, với đƣờng bờ biển dài 3.620 km trải dài từ Bắc vào Nam, hàng năm những vùng trồng lúa ven biển chịu ảnh hƣởng rất nhiều do sự xâm nhiễm mặn từ biển. Theo báo cáo năm 2010 của Cục Trồng trọt (Bộ Nông nghiệp và PTNT), tại ĐBSCL, xâm nhiễm mặn đã ảnh hƣởng đến 620.000 ha/1.545.000 ha lúa đông xuân 2009 -1010, chiếm 40% diện tích toàn vùng tại các tỉnh ven biển nhƣ Tiền Giang, Trà Vinh, Sóc Trăng, Bạc Liêu, Kiên Giang, Cà Mau và Bến Tre. Trong đó, diện tích có nguy cơ bị xâm nhập mặn cao khoảng 100.000 ha/650.000 ha chiếm 16% diện tích canh tác lúa ở các tỉnh trên. Trƣớc những thách thức trên, việc chọn tạo những giống lúa có khả năng chịu mặn là hết sức cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn cao. Do đó chúng tôi tiến hành đề tài: “Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa chịu mặn ứng phó với biến đổi khí hậu”. 1 2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài Ứng dụng chỉ thị phân tử kết hợp với phƣơng pháp chọn giống truyền thống để tạo giống lúa chịu mặn năng suất cao đáp ứng nhu cầu về giống cho sản xuất, đặc biệt là cho các vùng ven biển ĐBSH nơi chịu nhiều ảnh hƣởng của BĐKH. 3. Ý nghĩa của đề tài 3.1.Ý nghĩa khoa học Ứng dụng phƣơng pháp chọn giống bằng chỉ thị phân tử để chọn tạo giống lúa chịu mặn giúp chọn lọc nhanh và chính xác nguồn gen chịu mặn ở các thế hệ con lai, nhờ vậy có thể rút ngắn thời gian chọn lọc trên đồng ruộng, giảm số lƣợng cá thể gieo trồng hàng vụ, giảm diện tích gieo trồng, giảm lao động nặng nhọc, giảm chi phí cho những thí nghiệm đồng ruộng góp phần tăng đầu tƣ cho nghiên cứu trong phòng thí nghiệm một cách chuẩn mực. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn - Những thành công bƣớc đầu trong việc ứng dụng chỉ thị phân tử để chọn lọc các cá thể lai sẽ mở ra hƣớng ứng dụng rộng rãi trong công tác chọn tạo giống nói chung, không chỉ với đặc tính chịu mặn mà còn đối với nhiều đặc tính nông sinh học quý khác. - Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ là vật liệu khởi đầu rất tốt trong nghiên cứu và chọn tạo giống lúa chịu mặn đặc biệt cho các vùng đồng bằng ven biển của Việt Nam nơi chịu ảnh hƣởng nặng nề của biến đối khí hậu. - Bổ sung thêm cơ sở lý luận trong công tác chọn tạo giống lúa bằng chỉ thị phân tử nhƣng vẫn kế thừa các phƣơng pháp chọn giống truyền thống. 4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của đề tài. 4.1. Đối tƣợng nghiên cứu: - Là các giống lúa thuần mang QTL/Saltol (gen chịu mặn) đƣợc nhập từ IRRI, - Các chỉ thị phân tử có liên quan đƣợc sử dụng trong nghiên cứu. 2 4.2. Phạm vi nghiên cứu: Thí nghiệm đƣợc triển khai tại: Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp (Từ Liêm, Hà Nội); Trung tâm Chuyển giao Công nghệ và Khuyến nông (Thanh Trì, Hà Nội); huyện Giao Thuỷ, Nam Định. Thời gian nghiên cứu: Từ năm 2010 đến năm 2013. 3 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Ảnh hƣởng của BĐKH đến sản xuất nông nghiệp Thế giới và Việt Nam 1.1.1. Ảnh hưởng của BĐKH đến sản xuất nông nghiệp trên Thế giới Biến đổi khí hậu gây nên thiên tai trên phạm vi toàn cầu xảy ra với tần suất nhiều hơn, phức tạp hơn, cƣờng độ tăng mạnh hơn làm trầm trọng thêm mức độ ảnh hƣởng của thiên tai. Sự tăng nhiệt độ không khí, và đại dƣơng, sự tan băng trên diện rộng và qua đó là mức tăng mực nƣớc biển trung bình toàn cầu gây ngập lụt, nhiễm mặn nguồn nƣớc, ảnh hƣởng đến mọi mặt của hệ thống kinh tế xã hội toàn cầu trong tƣơng lai [6]. Theo các nhà khoa học về biến đổi khí hậu (BĐKH) toàn cầu và nƣớc biển dâng cho thấy, đại dƣơng đã nóng lên đáng kể từ cuối thập kỷ 1950. Các nghiên cứu từ số liệu quan trắc trên toàn cầu cho thấy, mực nƣớc biển trung bình toàn cầu trong thời kỳ 1961-2003 đã dâng với tốc độ 1,8 0,5mm/năm, trong đó, đóng góp do giãn nở nhiệt khoảng 0,42 0,12mm/năm và tan băng khoảng 0,70 0,50mm/năm (IPCC, 2007), tốc độ mực nƣớc biển trung bình toàn cầu dâng khoảng 1,8mm/năm trong năm 2009 (Chuch và White, 2009). 4 Hình 1: Diễn biến nhiệt độ ở quy mô toàn cầu và khu vực (Nguồn: IPCC AR4 WG-I Report, 2007) Hình 2: Xu thế biến động mực nƣớc biển trung bình tại các trạm quan trắc nƣớc biển trên toàn cầu (Nguồn NOAA/2010) Tuy nhiên, mực nƣớc biển thay đổi không đồng đều trên toàn bộ đại dƣơng thế giới: Một số vùng tốc độ dâng có thể gấp một vài lần tốc độ dâng trung bình toàn cầu trong khi mực nƣớc biển ở một số vùng khác lại có thể hạ thấp. Xu thế tăng của mực nƣớc trung bình xuất hiện hầu hết tại các trạm quan trắc trên toàn 5 cầu, mặc dù, vẫn xuất hiện một số khu vực có xu hƣớng giảm nhƣ ở bờ biển phía Đông của Nam Mỹ và khu vực ven biển phía Nam Alaska và Đông Bắc Canada, vùng biển Scandinavia. Theo một số báo cáo của các nhà khoa học, trong thập kỷ vừa qua, mực nƣớc biển dâng nhanh nhất ở vùng phía Tây Thái Bình Dƣơng và phía Đông Ấn Độ Dƣơng [5]. Biến đổi khí hậu đã ảnh hƣởng trực tiếp đến ngành nông nghiệp, đây là ngành cung cấp lƣơng thực chính cho con ngƣời đang phải đứng trƣớc thách thức vô cùng to lớn, những khu vực tập trung trồng lúa nhiều nhất trên thế giới lại có nguy cơ bị xâm nhiễm mặn khi mực nƣớc biển dâng cao. Do đó, cần phải có các giống lúa có khả năng chịu đƣợc ngập và độ mặn cao. Bên cạnh đó, theo báo cáo của FAO (2010), trên 800 triệu ha đất trên toàn thế giới bị ảnh hƣởng nghiêm trọng bởi muối và khoảng 20% diện tích tƣới (khoảng 45 triệu ha) đƣợc ƣớc tính bị vấn đề xâm nhiễm mặn theo mức độ khác nhau. Mặt khác, ài liệu “Tác động của mực nước biển dâng cao đến các nước đang phát triển: Phân tích so sánh” của Ngân hàng Thế giới (WB) thực hiện tháng 2/2007 đã đánh giá các tác động của mực nƣớc biển dâng cao đối với tất cả các nƣớc đang phát triển bằng cách sử dụng bộ chỉ số đồng nhất các chỉ thị và với các kịch bản khác nhau về mực nƣớc biển dâng cao. WB đã chia 84 nƣớc đang phát triển ở ven biển thành 5 nhóm theo 5 văn phòng khu vực của WB gồm: Mỹ Latin và Caribê (25 nƣớc); Trung Đông và Bắc Phi (13 nƣớc); Châu Phi cận Xahara (29 nƣớc); Đông Á (13 nƣớc); và Nam Á (4 nƣớc). Các kết quả nghiên cứu cho thấy 0,31% (194.309 km2) vùng lãnh thổ của 84 nƣớc đang phát triển bị ảnh hƣởng khi mực nƣớc biển dâng cao 1m. Tỷ lệ bị ngập có thể tăng lên 1,2% theo kịch bản nƣớc biển dâng cao 5m. Cho dù tỷ lệ này nhỏ song sẽ có khoảng 56 triệu ngƣời (hay 1,28% dân số) ở 84 nƣớc đang phát triển bị ảnh hƣởng khi mực nƣớc biển dâng cao 1m. Với kịch bản nƣớc biển dâng cao 1m, Bahamas (khu vực Mỹ latinh và Caribê) là nƣớc bị ảnh hƣởng nặng nhất xét về diện tích bị ảnh hƣởng (12% tổng diện tích). Việt Nam đứng đầu danh sách 10 nƣớc bị ảnh hƣởng về dân số, khu vực đô thị và đất ngập nƣớc (khoảng 10%). Nông nghiệp của Ai Cập bị ảnh hƣởng nhiều nhất, gần 13%. 6 28% diện tích đất ngập nƣớc của Việt Nam, Jamaica và Belize có thể bị ảnh hƣởng khi mực nƣớc biển dâng cao 1m. Xét về tất cả các chỉ thị, theo Báo cáo của WB, Việt Nam nằm trong danh sách 5 nƣớc bị ảnh hƣởng nhiều nhất cùng với Ai Cập, Suriname và Bahamas [13]. Bảng 1. Tác động của mực nước biển dâng cao đến khu vực Đông Á Đối tƣợng 1m 2m 3m 4m 5m Tổng diện tích 14.140.767 km2 Diện tích % 74.020 119.370 178.177 248.970 325.089 0,52 0,84 1,26 1,76 2,30 Tổng dân số 1.883.407.000 ngƣời Dân số % 37.193.866 60.155.640 90.003.580 126.207.275 162.445.397 1,97 3,19 4,78 6,70 8,63 Tổng GDP 7.577.206 triệu USD GDP (triệu 158.399 255.510 394.081 592.598 772.904 2,09 3,37 5,20 7,82 10,20 USD) % Tổng diện tích đô thị 388.054 km2 Đô thị 6.648 11.127 17.596 25.725 34.896 % 1,71 2,87 4,53 6,63 8,99 Tổng diện tích đất nông nghiệp 5.472.581 km2 Đất nông 45.393 78.347 121.728 174.076 229.185 0,83 1,43 2,22 3,18 4,19 nghiệp % Tổng diện tích đất ngập nƣớc 1.366.069 km2 Đất ngập 36.463 56.579 79.984 110.671 130.780 2,67 4,14 5,86 8,10 9,57 nƣớc % Nguồn: Ngân hàng Thế giới, 2007 7 1.1.2. Ảnh hưởng của BĐKH đến sản xuất nông nghiệp tại Việt Nam Biến đổi khí hậu (BĐKH) trên phạm vi toàn cầu đã làm cho thiên tai ở Việt Nam ngày càng gia tăng về số lƣợng, cƣờng độ và mức độ ảnh hƣởng, ảnh hƣởng rất lớn đến các hoạt động sản xuất, phát triển kinh tế xã hội. Lĩnh vực chịu tác động mạnh mẽ nhất do BĐKH là nông nghiệp, thuỷ lợi, thuỷ sản, diêm nghiệp, lâm nghiệp, an ninh lƣơng thực; các vùng đồng bằng và dải ven biển do mực nƣớc biển dâng, ngƣời nghèo ở vùng nông thôn đòi hỏi chúng ta phải có chƣơng trình, kế hoạch hành động cụ thể nhằm ứng phó kịp thời. Tại các vùng ven biển Việt Nam sẽ phải chịu ảnh hƣởng nhiều nhất do biến đổi khí hậu gây ra nhƣ bão, lũ lụt, xói lở bờ biển và xâm nhập mặn…và đây là nguyên nhân làm chậm tốc độ tăng trƣởng kinh tế của khu vực, tăng tỷ lệ nghèo đói và làm giảm khả năng ứng phó đối với các thiên tai do biến đổi khí hậu gây ra. Đối với nƣớc ta, các tác động của biến đổi khí hậu ban đầu có thể nhận thấy đƣợc thông qua những thay đổi về khí hậu theo mùa ở các vùng miền khác nhau; lƣợng mƣa và mùa mƣa cũng sẽ thay đổi... Hình 3: Mức tăng nhiệt độ trung bình mùa đông vào cuối thế kỷ 21 theo kịch bản phát thải trung bình 8 Tuy nhiên, thách thức lớn nhất lại là khi mực nƣớc biển dâng cao. Dải ven biển thuộc vùng Đồng bằng sông Cửu Long và Đồng bằng sông Hồng - Thái Bình, hai vùng kinh tế trọng điểm của cả nƣớc, mật độ dân cƣ cao và tập trung, địa hình bằng phẳng và thấp (80% diện tích Đồng bằng sông Cửu Long và 30% diện tích Đồng bằng sông Hồng có độ cao dƣới 2,5m so với mặt nƣớc biển, là những vựa lúa lớn của cả nƣớc). Những ảnh hƣởng đầu tiên là gia tăng nguy cơ xâm nhập mặn, an ninh lƣơng thực bị đe dọa, tình trạng ngập lụt trong mùa mƣa bão, xói lở bờ biển, phá vỡ các hệ thống đê biển, hồ chứa nƣớc và nhấn chìm những cánh đồng lúa ở vùng đồng bằng ven biển, gây tổn hại nhiều hơn đối với các khu vực đất ngập nƣớc, rạn san hô, các hệ sinh thái và những ảnh hƣởng quan trọng khác đến đời sống của ngƣời dân. Bảng 2 Độ mặn tại một số điểm trên 4 hệ thống sông lớn vùng Đồng bằng sông Hồng Tên sông Sông Đáy Sông Ninh Cơ Sông Hồng Sông Trà Lý Trạm khảo sát Khoảng cách đến cửa sông Ngày có độ mặn lớn nhất Sđỉnh max (‰) Đ3 10 25/12 16,45 Đ2 22 26/12 0,75 Đ1 32 26/12 0,12 NC3 10 26/12 26,70 NC2 22 26/12 3,75 NC1 32 25/12 0,48 H3 10 26/12 19,35 H2 22 25/12 1,15 H1 30 26/12 0,12 TL3 10 26/12 21,63 TL2 22 26/12 1,61 TL1 32 25/12 0,15 Nguồn:Viện Khoa học Thuỷ lợi Việt Nam, 2007 9 Hình 4: Kịch bản nước biển dâng cho các khu vực ven biển Việt Nam Theo kịch bản nƣớc biển dâng, nếu nƣớc biển dâng cao 1m, khoảng 39% diện tích ĐBSCL, trên 10% diện tích ĐBSH và Quảng Ninh bị ảnh hƣởng trực tiếp, riêng thành phố Hồ Chí Minh khoảng 7% và các tỉnh ven biển miền trung gần 9% dân số bị ảnh hƣởng. Chỉ tính riêng nguyên nhân do đất ngập cũng làm giảm sản lƣợng lƣơng thực đến 12%, tức là khoảng 5 triệu tấn thóc. Theo báo cáo công bố tháng 2/2007, Ngân hàng Thế giới đề cập đến hiện tƣợng nƣớc biển dâng cao và ảnh hƣởng của nó trên 84 quốc gia đang phát triển và Việt Nam đƣợc xem là 1 trong 5 nƣớc chịu ảnh hƣởng nặng nề nhất. Khi nƣớc biển dâng cao 1m, Việt Nam bị thiệt hại nhiều nhất về số dân bị ảnh hƣởng (gần 11%), về giá trị GDP bị tổn thất (10%), về diện tích các đô thị bị ngập (10%) và về diện tích các vùng ngập nƣớc, ngập mặn đã đƣợc quy hoạch mất đi. Việt Nam cũng 10 đứng thứ hai về diện tích đất bị ngập (5%, chỉ sau Bahamas 12%), về đất trồng trọt bị mất đi (7%, chỉ sau Ai Cập 13%). Tuy nhiên, báo cáo của Ngân hàng Thế giới chỉ đƣa ra những con số tối thiểu, nƣớc biển dâng là một vấn đề mang tính gay gắt nhất đối với nƣớc ta, ngày càng phức tạp và khó giải quyết. Nhằm ứng phó ngay từ bây giờ, Bộ Tài nguyên và Môi trƣờng đã chủ trì tổ chức nghiên cứu xây dựng các phƣơng án hành động cho Việt Nam trong tƣơng lai dựa trên 3 kịch bản phát thải khí nhà kính: phát thải thấp, phát thải trung bình và phát thải cao để xem xét và đánh giá những tổn thất do BĐKH gây ra. Bảng 3: Kịch bản nƣớc biển dâng ở Việt Nam so với thời kỳ 1980 – 1999 (đơn vị tính: cm) Kịch bản nƣớc biển Các mốc thời gian của thế kỷ 21 2020 2030 2040 2050 2060 2070 2080 2090 2100 dâng Thấp (B1) 11 17 23 28 35 42 50 57 65 Trung 12 17 23 30 37 46 54 64 75 12 17 24 33 44 57 71 86 100 bình (B2) Cao (A1F1) (Kịch bản BĐKH nước biển dâng cho Việt Nam, nguồn Bộ Tài nguyên Môi trường 2001) 1.2. Nghiên cứu các đặc tính sinh lý, sinh hóa liên quan đến chống chịu mặn ở cây lúa 1.2.1. Cơ chế chống chịu mặn Lúa là cây lƣơng thực thích hợp nhất trên đất mặn mặc dù nó luôn đƣợc đánh giá là cây nhiễm trung bình với mặn vì đất mặn luôn ở dƣới điều kiện bị ngập nƣớc, những cây trồng khác không thể sinh trƣởng đƣợc ngoại trừ lúa (Aslam và ctv., 1993). Nhiễm mặn gây tổn hại đến cây lúa do mất cân bằng thẩm thấu và tích 11 luỹ quá nhiều ion Cl- (Akbar, 1975). Những nghiên cứu gần đây cho thấy nguyên nhân gây tổn hại cho cây lúa trong môi trƣờng mặn là do tích luỹ quá nhiều ion Na+, và ion này trực tiếp gây độc trên cây trồng, làm cho Cl- trở thành ion trơ nên phổ kháng của cây tƣơng đối rộng (Yeo và Flower, 1984). Nhƣ vậy, sự tổn hại ở cây lúa trên đất mặn là do cây hấp thu quá dƣ cả ion Na+ và Cl-. Ảnh hƣởng của Na+ là phá vỡ và cản trở vai trò sinh học của tế bào chất. Hơn nữa, sự mất cân bằng tỷ lệ Na-K trong cây sẽ làm giảm năng suất hạt. Cây lúa chống chịu mặn bằng cơ chế ngăn chặn, giảm hấp thu Na+ và gia tăng hấp thu K+ để duy trì sự cân bằng Na-K tốt trong chồi. Ion K có vai trò quan trọng làm kích hoạt enzyme và đóng mở khí khổng, tạo ra tính chống chịu mặn (Ponnamperuma, 1984). Tuy thế việc khám phá ra cơ chế và những tổn hại trên cây lúa do mặn thì rất phức tạp, ngay cả dƣới những điều kiện ngoại cảnh kiểm soát đƣợc. Mặn gây hại trên cây trồng bắt đầu bằng triệu chứng giảm diện tích lá, những lá già nhất bắt đầu cuộn tròn và chết, theo đó là những lá già kế tiếp và cứ thế tiếp diễn. Cuối cùng, những cây sống sót có những lá già bị mất, những lá non duy trì sự sống và xanh. Trong điều kiện thiệt hại nhẹ, trọng lƣợng khô có xu hƣớng tăng lên trong một thời gian, sau đó giảm nghiêm trọng do giảm diện tích lá. Trong điều kiện thiệt hại nặng hơn, trọng lƣợng khô của chồi và rễ suy giảm tƣơng ứng với mức độ thiệt hại ( Gregorio và ctv, 1997). Nhiều nghiên cứu còn cho thấy, cây lúa chống chịu mặn trong suốt thời gian nảy mầm, trở nên rất nhiễm ở giai đoạn mạ non (giai đoạn 2-3 lá), tiếp tục chống chịu trong giai đoạn sinh sản dinh dƣỡng, kế đến nhiễm suốt trong giai đoạn thụ phấn và thụ tinh, cuối cùng trở nên chông chịu hơn trong giai đoạn chín (Ponnamperuma, 1984). Tuy thế, một nghiên cứu khác cho rằng, tại giai đoạn trổ, cây lúa không mẫn cảm với mặn (Aslam và ctv., 1993). Do đó, sinh trƣởng và phát triển của cây lúa phải đƣợc chia ra nhiều giai đoạn để nghiên cứu một cách đầy đủ về cơ chế chống chịu mặn của lúa. 12 Cơ chế chống chịu mặn của cây lúa đƣợc biết thông qua nhiều công trình nghiên cứu rất nổi tiếng (Akbar và ctv. 1972, Korkor và Abdel-Aal 1974, Maas và Hoffman 1977, Mori và ctv. 1987). Mặn ảnh hƣởng đến hoạt động sinh trƣởng của cây lúa dƣới những mức độ thiệt hại khác nhau ở từng giai đoạn sinh trƣởng phát triển khác nhau (Maas và Hoffman 1977). Yeo và Flower và cs (1984) đã tổng kết cơ chế chống chịu mặn của cây lúa theo từng nội dung nhƣ sau: • Hiện tƣợng ngăn chặn muối - Cây không hấp thu một lƣợng muối dƣ thừa nhờ hiện tƣợng hấp thu có chọn lọc. • Hiện tƣợng tái hấp thu - Cây hấp thu một lƣợng muối thừa nhƣng đƣợc tái hấp thu trong mô libe. Na+ không chuyển vị đến chồi thân • Chuyển vị từ rễ đến chồi - Tính trạng chống chịu mặn đƣợc phối hợp với một mức độ cao về điện phân ở rễ lúa, và mức độ thấp về điện phân ở chồi, làm cho sự chuyển vị Na+ trở nên ít hơn từ rễ đến chồi • Hiện tƣợng ngăn cách từ lá đến lá - Lƣợng muối dƣ thừa đƣợc chuyển từ lá non sang lá già, muối đƣợc định vị tại lá già không có chức năng, không thể chuyển ngƣợc lại. • Chống chịu ở mô - Cây hấp thu muối và đƣợc ngăn cách trong các không bào (vacuoles) của lá, làm giảm ảnh hƣởng độc hại của muối đối với hoạt động sinh trƣởng của cây • Ảnh hƣởng pha loãng - Cây hấp thu muối nhƣng sẽ làm loãng nồng độ muối nhờ tăng cƣờng tốc độ phát triển nhanh và gia tăng hàm lƣợng nƣớc trong chồi Lúa có cơ chế điều chỉnh hàm lƣợng muối đi vào chồi rất nhỏ, điều này có thể là do sự hấp thu chọn lọc rất hiệu quả đối với K+. Một khả năng khác là ion Na+ đƣợc hấp thu với hàm lƣợng lớn có ý nghĩa, nhƣng đƣợc hấp thu lại trong nhựa xylem trong những phần của đầu rễ hoặc chồi và sau đó đƣợc dự trữ hoặc chuyển lại trở vào đất (Yeo và Flower, 1984). Theo Aslam và ctv. (1993), khi cây lúa đƣợc đặt trong dung dịch NaCl, hàm lƣợng sodium, calcium, kẽm, phosphorus và 13 chioride đều gia tăng, trong khi hàm lƣợng potassium và magnesium đều giảm trong nhựa của chồi. Khả năng chống chịu mặn của cây lúa cao hay thấp có quan hệ với hiệu quả ngăn chặn Na+ và Cl- vào cây. So sánh khă năng hấp thu lựa chọn K+ cho thấy rằng, đã có sự khác nhau lớn giữa các giống lúa về khả năng hấp thu chọn lọc K+ trong môi trƣờng có nồng dộ 100 mol/m3 NaCl. Trong đó, giống NIAB6 (chống chịu) và BG402-4 có khả năng hấp thu chọn lọc K+ tốt hơn của chồi và rễ so với Na+. Hai giống IR1561 (giống nhiễm) và Basmati 370 có sự lựa chọn thấp nhất trong tất cả những dòng so sánh. Tỷ lệ “K+/Na+” hay đúng hơn là hàm lƣợng K+ trong dịch của chồi lúa xác định tính chống chịu mặn của những dòng lúa khác nhau. Ngƣời ta còn thấy vai trò của kẽm (Zn) trong chồi có liên quan đến tính chống chịu mặn của cây lúa. Khi hàm lƣợng Zn trong chồi của giống NIAB6 cao, tính chống chịu mặn cao. Muhammed và ctv.(1987) cũng đã chứng minh rằng, ở giống chống chịu mặn KS282, nồng độ của Zn cao hơn so với dòng nhiễm IR28. Vai trò của Zn tham gia vào tính chống chịu mặn, có thể là do Zn làm gia tăng hàm lƣợng N trong chồi. Điều này dẫn tới việc sinh trƣởng nhanh hơn và năng suất lúa cao hơn trong điều kiện mặn. Vì vậy, ở những giống chống chịu mặn tốt có liên quan đến hiệu quả ngăn chặn các ion Na+ và Cl- , sự hấp thu ƣu tiên và lựa chọn ion K+ và Zn2+ , để có tỷ lệ K+/Na+ và Zn/P tốt hơn cho tính chống chịu và S(K+,Na+) tốt hơn (Aslam và ctv.,1993). Akbar và cs, 1985[25] bằng những thí nghiệm đánh giá tính chống chịu mặn ở giai đoạn mạ, trong dung dịch dinh dƣỡng Yoshida có độ mặn EC=12dSm-1, các yếu tố môi trƣờng đƣợc kiểm soát trong 19 ngày. Kết quả cho thấy, tăng khả năng hấp thu K+ là duy trì tốt tỷ lệ cân bằng Na+/K+ trong chồi. Tỷ lệ Na+/K+ này đƣợc kiểm soát bởi hiệu quả gen cộng và gen trội, hai nhóm gen này rất phức tạp và đi đến kết luận tính chống chịu mặn ở cây lúa đƣợc điều khiển bởi đa gen. Chính vì vậy, để chọn lọc những giống lúa chống chịu mặn tốt, cần phải hiểu cơ chế chống chịu mặn của chúng, từ đó mới có thể cải tiến cấu trúc di truyền. Khả 14 năng chống chịu mặn ở cây lúa có thể do cơ chế hấp thu lựa chọn giữa K+ và Na+, nhằm cân bằng ion K+ và Na+ trong tế bào, nếu mất sự cân bằng này sẽ gây ra giảm năng suất hạt. Ion K+ đóng vai trò quan trọng trong việc làm tăng hoạt động của một số enzyme, gây ảnh hƣởng lên quá trình đóng mở của khí khổng, liên quan rất nhiều đến tính chống chịu mặn của cây lúa (Ponnamperuma, 1984). Những nghiên cứu cho thấy, có mối tƣơng quan giữa số lƣợng muối đƣợc đi vào rễ cây lúa với nồng độ muối trên chồi. Mối quan hệ này đƣợc xác định bởi mối quan hệ giữa tốc độ sinh trƣởng của chồi với sự di chuyển thực của những ion ngoài rễ. Giá trị này là số lƣợng thực của những ion đƣợc di chuyển tới chồi trên đơn vị trọng lƣợng của rễ trong một đơn vị thời gian (Flower và Yeo, 1984). Ví dụ ở giống lúa Pokkali (giống chống chịu mặn), hàm lƣợng Na ở chồi trung bình thấp hơn của giống IR22 (giống nhiễm mặn). Bởi vì hàm lƣợng Na ở chồi của giống lúa Pokkali đƣợc pha loãng do sự sinh trƣởng dinh dƣỡng nhanh của nó. Với cơ chế này, cây hấp thu muối nhƣng sẽ làm loãng muối nhờ tăng cƣờng tốc độ phát triển nhanh và gia tăng hàm lƣợng nƣớc trong chồi (Flower, 1988). Quan sát kiểu chất của lá lúa trong điều kiện nhiễm mặn cho thấy có sự khác nhau về hàm lƣợng Na+ trong những lá khác nhau, tại bất cứ thời gian nào. Những lá già bị chết trong khi những lá non hơn vẫn giữ màu xanh và sinh trƣởng. Đây là điểm đặc trƣng nhất trong cơ chế chống chịu mặn ở họ hoà bản. Cây lúa là một tập hợp gồm lá cây/đốt/bộ rễ hợp lại, những nhánh cây có khả năng sống độc lập đƣợc tách ra. Dạng sinh trƣởng này giúp cây một lá mầm tự huỷ những phần, bộ phận của cây dễ dàng hơn so với những cây hai lá mầm. Vì vậy, rụng lá là một hiện tƣợng thông thƣờng ở những cây một lá mầm chống chịu mặn. Qua phân tích những lá lúa sống trong môi trƣờng mặn cho thấy, có sự chênh lệch hàm lƣợng muối từ lá này tới lá khác, muối luôn đƣợc tích luỹ ở nồng độ cao trong những lá già, và hiện tƣợng chết ở những lá già là một cơ chế loại muối ra khỏi cơ thể của cây lúa ( Yeo và Flower, 1984). 15 Sự thay đổi nồng độ Na+ trong những lá lúa cho thấy, có sự thay đổi rõ rệt hàm lƣợng Na+ từ những lá non sang những lá già trong cây khi trồng trong môi trƣờng mặn (Yeo và Flower, 1984). Qua phân tích trong từng lá lúa sau khi bị mặn 14 ngày cho thấy, ion Na+ tích luỹ cao nhất ở những lá già nhất (lá số 1). Và giảm dần trên những lá non nhất, nê những lá non hơn luôn đƣợc bảo vệ. Những quan sát này là do sự kết hợp của: (1) tốc độ sinh trƣởng nhanh của những lá non và (2) sự phân bố muối vào những lá già nhiều hơn (Greenway và Munns, 1980). Các gen chịu mặn trên cây lúa qua nhiều nghiên cứu cho thấy nhiều QTLs (Quantitative Trait Loci) ở lúa đã đƣợc nhận biết cho chịu mặn chủ yếu nằm ở nhiễm sắc thể số 1, có một số gen chính liên quan đến khả năng chịu mặn nhƣ: - Một gen trong số đó là saltol. - QNa với hút Na. - QTL quyết định tính trạng hút Na+, nồng độ K+ và tỷ lệ Na /K ratio, SKC1 hoặc OsHKT8, RNTQ1, SDS1. - Vận chuyển Na+ và Cl- trong thân lúa và qST1. Các gen chịu mặn: Cũng có những nghiên cứu xác định một số lớn QTL trên các nhiễm sắc thể khác nhƣ: NST số 3, 4, 10 và 12 (Glenn, 1997). NST số 4, 6 và 9 (Flowerset al, 2000). NST số 4, 6 và 9 (Koyama et al, 2001). NST số 4, 6, 7 và 9 (Lin et al, 2004). NST số 2, 3, 8, và 9 (Ammar, 2004). NST số 3 (Lee et al, 2006). NST số 8 và 10 (Islam et al, 2006). 1.2.2.Di truyền tính chống chịu mặn Phần lớn những tính trạng chống chịu với điều kiện bất lợi do môi trƣờng là tính trạng di truyền số lƣợng. Tính trạng số lƣợng đƣợc định nghĩa một cách kinh điển là tính trạng có phân bố liên tục (continuous distribution), tính trạng này đƣợc điều khiển bởi nhiều gen, mỗi gen có một ảnh hƣởng nhỏ đối với tính trạng mục tiêu [20]. Đã có khá nhiều các công trình nghiên cứu sự di truyền của tính chống chịu mặn. Theo Mishra và ctv, 1998: Tính trạng chống chịu mặn là một tính trạng di 16 truyền đa gen, không có ảnh hƣởng của cây mẹ (không phải là các gen trong tế bào chất) Rất nhiều nghiên cứu cho rằng, yếu tố di truyền tính chống chịu mặn biến động rất khác nhau giữa các giống lúa. Vì vậy, muốn chọn giống lúa chống chịu mặn có hiệu quả, cần nghiên cứu sâu về cơ chế di truyền tính chống chịu mặn, từ đó loại bỏ ở ngay từ những thế hệ đầu, những dòng không đáp ứng đƣợc yêu cầu của ngƣời chọn giống. Nghiên cứu di truyền số lƣợng tính chống chịu mặn cho thấy, cả hai ảnh hƣởng hoạt động của gen cộng tính và gen không cộng tính đều có ý nghĩa trong di truyền tính chống chịu mặn ( Gregorio và Senadrina,1993; Lee, 1995). Teng và cs 1994 [63] bằng những thí nghiệm đánh giá tính chống chịu mặn tại giai đoạn mạ của cây lúa trong dung dịch dinh dƣỡng Yoshida có độ mặn tƣơng đối cao (EC= 12 dSm-1) trong môi trƣờng kiểm soát đƣợc các yếu tố ngoại cảnh; cho thấy tính trạng chiều dài chồi, hàm lƣợng Na và K ở trong chồi, khối lƣợng khô của chồi và rễ thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa giống chống chịu và giống nhiễm, tính trạng này chủ yếu đƣợc điều khiển do hoạt động của nhóm gen cộng tính. Hệ số di truyền tính chống chịu thông qua các tính trạng này rất thấp. Do ảnh hƣởng rất lớn của môi trƣờng bên ngoài, sự thể hiện di truyền là rất thấp trong các tính trạng. Phƣơng pháp chọn giống chống chịu mặn có thể dùng phƣơng pháp trồng dồn có cải tiến hoặc có thể dùng phƣơng pháp phân hạt đơn (single seed descent) sẽ là thích hợp trong chọn giống chịu mặn. Bằng phƣơng pháp lai diallel đầy đủ Gregorio cad Senadhina (1993) cho rằng, có thể tìm ra một số cặp lai tốt phục vụ cho chƣơng trình ƣu thế lai. Nghiên cứu về di truyền số lƣợng tính chống chịu mặn thông qua lai diallel 6 x 6, năng suất thể hiện hoạt động của nhóm gen cộng tính không có ý nghĩa trong điều kiện bình thƣờng, nhƣng trở nên có ý nghĩa trong điều kiện xử lý mặn. Trong một số giống lúa, ƣu thế hoạt động của gen cộng tính đối với năng suất là điều kiện thuận lợi cho chọn lọc giống trong môi trƣờng mặn 17 Trong phân tích di truyền số lƣợng thông qua lai diallel 9 x 9, tính chống chịu mặn đƣợc xem xét qua hàm lƣợng Na+, K+ và tỷ lệ Na+/K+ và điểm chống chịu mặn cho thấy, tính trạng này đƣợc kiểm soát bởi hoạt động của cả hai nhóm gen không cộng tính và cộng tính. Hai nhóm gen này không đối xứng, kiểm soát tính trạng chống chịu mặn và tỷ lệ Na+/K+. Riêng tính trạng thể hiện khả năng hấp thu K+ đƣợc kiểm soát bằng gen đối xứng. Nghiên cứu của Gregorio và Senadhira (1993) còn cho thấy, tính trạng tỷ lệ Na+/K+ thấp còn thể hiện ảnh hƣởng siêu trội và đƣợc điều khiển bởi ít nhất hai nhóm gen trội, ảnh hƣởng của môi trƣờng rất có ý nghĩa và hệ số di truyền thấp (19,18%). Từ đó, các tác giả đề nghị quần thể con lai phải thật lớn, và việc tuyển chọn nên đƣợc thực hiện ở các thế hệ sau cùng, trong điều kiện mặn đƣợc kiểm soát chặt chẽ và giảm thiểu thấp nhất ảnh hƣởng biến động của môi trƣờng. Nghiên cứu về các thông số di truyền Mishra và ctv. (1996) cho thấy, chiều dài bông và khối lƣợng 1000 hạt chịu tác động rất ít bởi các yếu tố môi trƣờng, nếu nhƣ chọn giống chống chịu mặn dựa vào hai tính trạng này là không có hiệu quả. Khối lƣợng bông, số hạt chắc trên bông, chiều cao cây có hệ số path rất cao trong môi trƣờng mặn. Chính ba tính trạng này đóng góp phần lớn trong việc tăng năng suất lúa trong môi trƣờng mặn, nhất là khối lƣợng bông và số hạt chắc trên bông. Narayanan và ctv. (1990) cho rằng, số hạt chắc trên bông, chiều dài bông là tính trạng chính đóng góp vào năng suất của các giống lúa trong những vùng đất bị nhiễm mặn. 1.3.Chỉ thị phân tử và ứng dụng trong chọn tạo giống cây trồng 1.3.1. Khái niệm về chỉ thị phân tử Các chỉ thị phân tử ADN là những chỉ thị dựa trên bản chất đa hình ADN. Nó cho phép xác định đƣợc các chỉ tiêu trực tiếp của kiểu gen thông qua việc xác định các trình tự nhất định của gen, hay các trình tự đặc hiệu liên kết chặt với các gen mang các tính trạng mong muốn. Bằng việc sử dụng các chỉ tiêu phân tích trực tiếp kiểu gen, khắc phục ảnh hƣởng của các yếu tố môi trƣờng, theo dõi và 18 phát hiện đƣợc các gene mong muốn, sự biến đổi của chúng qua các thế hệ khi chƣa có sự biểu hiện ra kiểu hình. 1.3.2. Các loại chỉ thị phân tử - Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) Loại chỉ thị này đƣợc tạo ra bằng cách nhân lên một cách chọn lọc DNA hệ gen đã đƣợc cắt bằng enzyme giới hạn bằng máy PCR. Sản phẩm tạo ra sẽ cho biết sự đa hình chiều dài đoạn phân cắt giới hạn của phân tử DNA. Chỉ thị AFLP đƣợc sử dụng rộng rãi trong những nghiên cứu lập bản đồ gen và xác định chỉ thị phân tử liên kết gen. Kỹ thuật tạo ra loại chỉ thị này đƣợc gọi là nhân bội chọn lọc những đoạn cắt giới hạn (Selective Restriction Fragment Amplification - SRFA) Sử dụng phƣơng pháp này có thể tạo ra một bộ tập hợp những đoạn cắt giới hạn nhờ PCR mà không cần biết trình tự của chúng, cho phép nhân đặc hiệu một số lƣợng lớn những mảnh cắt giới hạn. Mỗi bộ gồm tập hợp một số lƣợng lớn những mảnh cắt DNA có thể phân tích đồng thời phụ thuộc vào độ phân giải của hệ thống phát hiện. Phân tích sản phẩm bằng điện di trên gel polyacrylamide, mỗi mẫu thí nghiệm sẽ cho từ 50-100 băng DNA khác nhau nhờ sử dụng đồng vị phóng xạ hoặc nhuộm bạc. Đây là kỹ thuật có thể tạo ra nhiều chỉ thị di truyền nhất với số lƣợng mồi tối thiểu. Hệ thống này có độ phân giải rất cao, lƣợng băng thu đƣợc rõ nét. Vì vậy, nó đƣợc ứng dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm hiện nay [2]. Đây là một kỹ thuật thiết thực và đáng tin cậy bởi sự nghiêm ngặt của điều kiện phản ứng. Đối với mỗi tổ hợp mồi, kỹ thuật AFLP có thể tạo ra số lƣợng chỉ thị di truyền nhiều nhất so với các kỹ thuật khác. Lƣợng DNA tổng số tiêu tốn cho kỹ thuật này lại rất ít. Đây là phƣơng pháp có hiệu quả cao trong nghiên cứu đa dạng di truyền, tìm chỉ thị liên kết và lập bản đồ gen. Tuy nhiên chỉ thị này là di 19 truyền trội, không có khả năng phân biệt giữa thể đồng hợp và thể dị hợp, khi sử dụng giá thành tƣơng đối cao. - Chỉ thị STS (Sequence tagged sites) Loại chỉ thị này lần đầu tiên đƣợc đề xuất bởi Olson năm 1989. Chỉ thị này đƣợc đƣa ra từ việc xác định trình tự hai đầu của mẫu dò RFLP, trên cơ sở đó ngƣời ta thiết kế mồi dùng cho phản ứng PCR. STS là các trình tự xác định, có vị trí duy nhất trên bản đồ, có thể sử dụng nhƣ các chỉ thị cho lập bản đồ những gen quan trọng trên NST. STS đƣợc ứng dụng nhƣ một chỉ thị DNA trong chọn giống vì đây là kỹ thuật thực hiện khá nhanh, thuận tiện, đặc hiệu cao, xác định trên NST và giá thành thấp trong phân tích di truyền. Nhƣ vậy, về bản chất, chỉ thị STS là chỉ thị RFLP nhƣng lại đƣợc phát hiện bằng kỹ thuật PCR thay cho kỹ thuật lai DNA [2]. Tuy nhiên, những ứng dụng của chị thị STS hiện nay vẫn còn hạn chế vì số lƣợng chỉ thị STS đƣợc phát hiện còn rất thấp và ít đa hình. - Chỉ thị RAPD (Random amplified polymorphism DNA) Đây là loại chỉ thị di truyền đƣợc tạo ra trên cơ sở của phản ứng PCR, sử dụng loại mồi đơn lẻ, ngẫu nhiên dài 10 nucleotide ở nhiệt độ kết cặp thấp (khoảng 370C) và quá trình nhân bội ngẫu nhiên những đoạn DNA hệ gen. Sản phẩm nhân bội có thể đƣợc phân tách bằng điện di trên gel agarose hoặc polyacrylamide và có thể quan sát đƣợc sau khi gel đƣợc nhuộm với các hóa chất đặc trƣng. Tuy nhiên, chỉ thị này là loại di truyền trội, không phân biệt đƣợc thể đồng hợp và thể dị hợp. Sự khác biệt giữa 2 cá thể có thể nhận biết bằng sự có mặt hoặc vắng mặt của các băng RAPD đặc trƣng. Đó là hạn chế của loại chỉ thị này so với chỉ thị đồng trội AFLP. Mặc dù vậy, chỉ thị này vẫn là một công cụ hữu hiệu trong việc lập bản đồ ở những dòng nhị bội, những dòng cận phối hay các quần thể lai trở lại. Lợi thế của loại này là không cần biết những thông tin về 20 trình tự. Chỉ thị RAPD còn có thể sử dụng trong việc điền vào chỗ trống trên bản đồ phân tử RFLP, lập bản đồ gen kháng đạo ôn ở lúa… Phƣơng pháp này đơn giản, rẻ tiền, dễ sử dụng. Tuy nhiên độ chính xác còn phụ thuộc vào điều kiện phản ứng, thiết bị vận hành (máy PCR), và các kỹ năng thực hành của cá nhân cán bộ nghiên cứu. - Chỉ thị SSRs (Simple sequence repeats hay Microsatellites) Các chỉ thị phân tử DNA thƣờng đƣợc gọi tên theo kỹ thuật tƣơng ứng nhƣ: RAPD, AFLP, STS, SSR… Tùy thuộc vào từng nghiên cứu cụ thể, các nhà khoa học sẽ lựa chọn chỉ thị thích hợp để sử dụng SSRs là những đoạn DNA lặp lại một cách có trật tự (theo trật tự đầu cuối), gồm những đơn vị có chiều dài từ 1-6 nucleotide lặp lại (hay kiểu lặp lại ngắn) đƣợc gọi là Microsatellites. SSRs có trong khắp hệ gen của cơ thể Eukaryote khác nhƣ gia cầm, động vật có vú, cá và trên vài loại cây một lá mầm và hai lá mầm. Bản chất đa hình của Microsatellites có thể đƣợc tạo ra do sự nhân bội từ DNA tổng số của hệ gen nhờ việc sử dụng hai đoạn mồi bổ sung với trình tự gần kề hai đầu đoạn lặp lại. Giá trị của SSR ở chỗ nó sinh ra đa hình từ nhiều vùng tƣơng ứng, bao phủ rộng khắp hệ gen và có bản chất đồng trội nên dễ dàng phát hiện bằng phản ứng PCR. Những đoạn đa hình đơn giản này đã đƣợc ứng dụng trong việc lập bản đồ ở cả động vật và thực vật. Kỹ thuật SSR là kỹ thuật khuếch đại các đoạn lặp đơn giản, còn gọi là phƣơng pháp vi vệ tính (Microsatellites). Các đoạn lặp lại gồm 2 đến 6 cặp nucleotide đƣợc lặp đi lặp lại nhiều lần trong hệ gen. Đoạn SSR điển hình là các đoạn có trình tự gồm 3 cặp nucleotide , lặp lại từ 9-30 lần. Các đoạn trình tự bảo thủ thƣờng dùng trong kỹ thuật SSR là ATT, AT, CTT, CT… Các đoạn lặp lại có kích thƣớc dài ngắn khác nhau tùy theo từng loài, từng giống vật nuôi cây trồng [2]. 21 SSR là kỹ thuật dựa trên chuỗi phản ứng PCR với mục tiêu đầu tiên là nhận dạng các trình tự lặp lại đơn giản. Sau khi các trình tự lặp lại đơn giản này đƣợc nhận dạng, bƣớc tiếp theo là xác định trình tự của DNA và thiết kế mồi. Các trình tự liền kề và các trình tự lặp lại sẽ tạo nên SSR. Các mồi SSR sau đó sẽ đƣợc sử dụng nhƣ với mồi RAPD. Nhƣ vậy có thể thấy chỉ thị SSR là một loại chỉ thị chính xác, hữu hiệu trong nghiên cứu đa dạng di truyền, phân loại các giống vật nuôi, cây trồng khác nhau trong cùng một loài. Do đó, SSR cung cấp cho nhà chọn giống công cụ hiệu quả để liên kết kiểu hình với sự đa dạng của kiểu gen, chọn lọc các tính trạng mong muốn. Ngoài ra, SSR còn có thể phân định sự sai khác giữa các giống trong cùng một loài phụ do khả năng cho phép đánh giá mức độ alen của cùng một locus. Để xác định sự có mặt của gen Saltol trong quần thể BC1F1, BC2F1, BC3F1, BC3F2 chúng tôi lựa chọn sử dụng chỉ thị SSRs liên kết với QTL/Saltol . 1.3.3. Ứng dụng phương pháp MAS(Marker Assisted Selection) trong chọn tạo giống Từ lâu các nhà chọn giống đã quan tâm đến các chỉ thị hình thái liên kết với một số tính trạng nông học quan trọng và sử dụng nó nhƣ một phƣơng tiện hữu ích trong quy trình chọn tạo giống mới. Thay vì phải đánh giá kiểu hình của cả quần thể nhằm phát hiện những cá thể chứa gen mong muốn, ngƣời ta chỉ cần đi tìm những cá thể riêng biệt mang các chỉ thị hình thái liên kết với các gen đó. Ngày nay phƣơng pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử là phƣơng tiện hữu ích trợ giúp cho chọn giống truyền thống nhằm khắc phục những trở ngại mà công tác chọn giống truyền thống khó giải quyết. Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ, chỉ thị phân tử đã giải phóng cho các nhà chọn giống khỏi một lƣợng lớn công việc khi phải chọn lọc, phát hiện một lƣợng ít ỏi các cá thể quan tâm trong rất nhiều cá thể khác nhờ việc xác định sự có mặt hay vắng mặt của chỉ thị phân tử liên kết những alen đặc hiệu mà không cần đánh giá kiểu 22 hình. Phƣơng pháp này có thể giúp chọn lọc những cá thể mang nhiều tổ hợp gen cần thiết và loại bỏ các nhiễu do các tƣơng tác trong cùng alen hay giữa các alen khác nhau gây ra. Các tƣơng tác này thƣờng không thể phát hiện đƣợc bằng các phân tích kiểu hình. Bảng 4 So sánh chỉ thị phân tử so với chỉ thị hình thái Nội dung Chỉ thị phân tử Chỉ thị hình thái Kiểu gen của Có thể xác định tại bất kỳ Có thể phân biệt đƣợc trong các locus giai đoạn nào và ở bất kỳ những giai đoạn nhất định và mức độ nào: tế bào, mô thƣờng ở mức độ toàn bộ cơ thể hay toàn cơ thể Số lƣợng chỉ thị Cực lớn Rất hạn chế Các allen khác Không liên kết với các hiệu Việc đánh giá thƣờng đi kèm ứng có hại nhau với những hiệu ứng kiểu hình không mong muốn Các allen Phần lớn là đồng trội, nên Tƣơng tác theo kiểu trội – lặn, cho phép phân biệt mọi nên bị hạn chế sử dụng trong kiểu gen ở bất kỳ thế hệ nhiều tổ hợp lai. phân ly nào Hiệu ứng lấn át hoặc cộng Hiệu ứng lấn át làm sai lệch tính rất hiếm gặp việc đánh giá các cá thể phân ly ở trong cùng một quần thể phân ly Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử giúp các nhà chọn giống có thể: - Tìm kiếm phát hiện những biến dị di truyền trong số các cá thể giữa các loài, giống - Lai tạo để tạo ra các tổ hợp lai mới 23 - Chọn lọc chính xác các tổ hợp gen quan tâm ngay ở giai đoạn cây con, nên tiết kiệm đƣợc thời gian, nguồn lực, tiền bạc - Cải tiến giống cây trồng nhanh, hiệu quả do không phụ thuộc vào giai đoạn sinh trƣởng, không bị ảnh hƣởng của môi trƣờng. Chỉ thị phân tử làm tăng hiệu quả sàng lọc trong các chƣơng trình chọn giống nhờ các ƣu điểm sau: - Khả năng chọn lọc ngay từ giai đoạn cây con đang nẩy mầm trong khi nhiều dấu hiệu chỉ có thể sàng lọc và phát hiện khi chúng đƣợc biểu hiện ở những giai đoạn muộn hơn trong quá trình sống nếu chỉ sử dụng phƣơng pháp chọn giống truyền thống (nhƣ chất lƣợng quả, hạt, tính bất dục đực, khả năng phản ứng với chu kỳ quang…) - Khả năng sàng lọc những dấu hiệu mà việc đánh giá các đặc tính này khó khăn, đắt tiền và tốn thời gian (nhƣ hình thái rễ, tính kháng hay nhiễm đối với dịch hại hoặc đối với những nòi, những bệnh đặc hiệu, hay tính chống chịu những điều kiện gây sốc sinh học nhƣ hạn, mặn, thiếu muối, các chất độc…) - Khả năng phân biệt trạng thái đồng hợp hay dị hợp của nhiều locus trong cùng một thế hệ mà không cần kiểm tra thế hệ sau. - Khả năng chọn lọc đồng thời nhiều đặc tính trong cùng một thời gian, do đó có thể đƣa vào cùng lúc nhiều gen có giá trị về mặt nông học (nhƣ đƣa cùng lúc nhiều gen kháng dịch hại khác nhau). Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đã đƣa ra và phân tích rất chi tiết một vài mô hình MAS. Theo một số mô hình thì chỉ cần tiến hành lai trở lại 4 thế hệ thay vì 6 thế hệ nhƣ trƣớc kia, ngay cả khi quần thể chọn giống có kích thƣớc nhỏ và các dữ liệu về chỉ thị phân tử bị hạn chế. Trong một số trƣờng hợp thuận lợi, các nhà chọn giống có thể chỉ cần 3 lần lai trở lại là có thể đạt đƣợc kết quả nhƣ ý. Hƣớng nghiên cứu chọn giống nhờ chỉ thị phân tử có thể nói là hƣớng đi đầy triển vọng khi gắn kết đƣợc chọn giống truyền thống và công nghệ sinh học hiện 24 đại. Nhờ đó, quá trình lập bản đồ di truyền, quá trình chọn lọc tính trạng đơn gen, đa gen có giá trị cao về mặt di truyền và kinh tế. 1.4. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn trong và ngoài nƣớc 1.4.1. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn ở nước ngoài 1.4.1.1. Nghiên cứu theo phƣơng pháp truyền thống Trên Thế giới, việc chọn tạo giống lúa chịu mặn đáp ứng với biến đổi khí hậu đã đƣợc các nhà khoa học chú trọng nghiên cứu từ lâu. Đánh giá khả năng chịu mặn ở lúa: kiểu gen chịu ảnh hƣởng của các chất dinh dƣỡng (K+, Ca2+ và Mg2+) ở giai đoạn mạ do Zhang Zhen –hua và cộng sự, đăng trên tạp chí Khoa học nông nghiệp Trung Quốc(2011). Một số nghiên cứu trên các giống lúa khác nhau đã cho hệ số biến động di truyền khác nhau. Các giống lúa chịu mặn duy trì nồng độ Na+ và Cl- thấp, nồng độ K+ và Zn2+ cao hơn và tỷ lệ Na+/K+ thấp trong mầm lúa. Kết quả trên một số giống lúa chịu mặn nhƣ Pokkli, SR26B IR28 và IR29 cho thấy, tỷ lệ Na+/K+ rất thấp trong giống Pokkli (0,397) , SR26B (0,452) trong khi tỷ lệ này khá cao ở IR28 (0,652), IR29 (0,835) [19]. Tính chống chịu của lúa đƣợc điều khiển bởi đa gen [33]. Khi đánh giá tính chống chịu mặn ở giai đoạn mạ, trong dung dịch dinh dƣỡng Yoshida có độ mặn EC = 12dSm-1, các yếu tố môi trƣờng đƣợc kiểm soát trong 19 ngày. Kết quả cho thấy, lúa tăng khả năng hấp thu K+ là duy trì tốt tỷ lệ cân bằng Na+/K+ trong chồi. Tỷ lệ này đƣợc kiểm soát bởi hiệu quả của gen cộng sinh và gen trội. Theo báo cáo kết quả nuôi cấy tế bào soma lúa để tạo ra các biến dị soma chống chịu mặn cho thấy, từ giống Pokkali đã thu đƣợc dòng biến dị soma TCCP226-2-49-B-B-3 là giống lúa cao sản, thấp cây, sinh trƣởng mạnh, chống chịu mặn cao nhƣ Pokkali, gạo có màu trắng và phẩm chất gạo tốt hơn giống gốc, cho năng suất cao hơn Pokkali. Giống lúa này đƣợc sử dụng nhiều trong các chƣơng trình chọn tạo giống lúa mặn tại nhiều trung tâm nghiên cứu lúa trên thế giới [43]. 25 Với nhóm Japonica, có ít dòng giống thể hiện tính kháng mặn hơn nhóm Indica. Một số giống thuộc các nƣớc ôn đới có tính chịu mặn khá nhƣ Harra (Tây Ban Nha), Agami (Ai Cập) và Daeyabyeo (Hàn Quốc). Các giống Japonica nhiệt đới giống nhƣ Moroberekan mang tính kháng mặn cao, có nguồn gốc ở Guinea nơi đất canh tác ảnh hƣởng ngập mặn. Giống này đã đƣợc nghiên cứu và sử dụng làm cây cho gen kháng mặn và lập bản đồ quần thể [44]. Cho đến thời điểm hiện tại đã có rất nhiều nghiên cứu đánh giá và xác định về tính chịu mặn của các giống lúa bản địa và giống lúa cải tiến. Các giống lúa địa phƣơng có nguồn gốc từ các vùng duyên hải Đông Á có tính kháng mặn cao nhƣ Nona Bokra (Ấn Độ), Pokkali (Sri Lanka), Getu (Ấn Độ), Khao Seetha (Thái Lan)… các giống thể hiện tính kháng mặn trên đều thuộc nhóm Indica. Theo số liệu cập nhật gần đây, một số dòng giống thuộc nhóm Indica có nguồn gốc từ Saudi Arabia, Hawashi thể hiện tính chịu mặn vƣợt trội cao hơn cả Pokkali và Nona Bokra [43]. 1.4.1.2. Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử Việc nghiên cứu, ứng dụng chỉ thị phân tử trong di truyền chọn giống cây trồng đƣợc rất nhiều phòng thí nghiệm trên Thế giới thực hiện và đạt đƣợc những thành tựu đáng kể. Các nhà khoa học tại trƣờng Đại học Cornel (Mỹ) đã định vị hàng loạt các chỉ thị phân tử RFLP trên bản đồ di truyền ở lúa. Hiện nay có rất nhiều chỉ thị phân tử ở lúa đã đƣợc phát hiện và thiết kế, trong đó có nhiều chỉ thị liên kết với gen có ý nghĩa kinh tế quan trọng: khoảng 20 gen kháng bệnh bạc lá, 30 gen kháng bệnh đạo ôn, 12 gen kháng rầy nâu… Phần lớn các nghiên cứu sử dụng các quần thể Indica lai với Japonica (nhƣ IR64 x Azucena hoặc Co29 x Moroberekan), và lập bản đồ quần thể RIL, DH hoặc F2. Tuy nhiên, gần đây, việc sử dụng quần thể lai hồi giao thì quy tụ đƣợc QTLs chịu mặn nhanh hơn rất nhiều [44]. Các tính trạng liên quan đến khả năng chịu mặn ở lúa thể hiện do các gen phức hợp kiểm soát. Các QTL liên quan đã 26 đƣợc xác định trên NST số 1, 4, 6 và 7. Một số nghiên cứu khác phát hiện số ít QTL trên NST số 2, 3, 5, 9, 10 và 12. Tuy nhiên, hiện nay vẫn chƣa tìm thấy QTL thể hiện tính chịu mặn ở NST số 8 và 11. Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ, việc ứng dụng các chỉ thị phân tử kết hợp với lai truyền thống và các lần lai trở lại để chọn tạo các dòng/giống lúa có khả năng chống chịu với các điều kiện bất ổn của môi trƣờng nhƣ chống chịu mặn, chịu hạn, ngập chìm… có ý nghĩa to lớn đối với sản xuất nông nghiệp [41]. Ngoài ra có rất nhiều gen nhƣ gen thơm của giống Jasmin, gen điều khiển tính trạng hạt dài, gen điều khiển thời gian sinh trƣởng và nhiều gen QTL có liên quan đến tính trạng khác của cây lúa nhƣ gen chịu mặn, khô hạn, ngập chìm, chịu độc tố nhôm, chịu thiếu phosphor… cũng đã đƣợc phát hiện và lập bản đồ di truyền phân tử để đƣa vào sử dụng chọn tạo giống. Do có thể xác định đƣợc kiểu gen tại bất kỳ giai đoạn nào, ở bất kỳ cơ quan (mô, cơ quan, toàn cơ thể…) nên việc chọn tạo giống bằng chỉ thị phân tử đƣợc dự đoán là phƣơng pháp chủ yếu trong việc lai tạo của thế kỷ 21 [42]. 1.4.2. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn trong nước 1.4.2.1. Chọn giống theo phƣơng pháp truyền thống Giai đọan 2009-2013 Viện Lúa ĐBSCL đã thực hiện chọn tạo bộ giống lúa chịu mặn bƣớc đầu đã xác định đƣợc 30 dòng lúa có triển vọng chịu mặn đó là những dòng kế thừa, đƣợc phát hiện chịu mặn qua nhiều lần thanh lọc trong phòng thí nghiệm và nhà lƣới. Các dòng này đang đƣợc trồng khảo nghiệm trên đồng ruộng tại các tỉnh: Sóc Trăng, Kiên Giang, Bến Tre, Bạc Liêu… Trung tâm Thực nghiệm sinh học nông nghiệp công nghệ cao thuộc Viện Di truyền nông nghiệp - đơn vị thực hiện đề tài “Nghiên cứu khảo nghiệm và tuyển chọn giống lúa chịu mặn thích hợp cho vùng đất nhiễm mặn tỉnh Thái Bình” (thực hiện trong hai năm từ tháng 1/2012- tháng 12/2013) vừa khảo nghiệm và 27 tuyển chọn thành công 3 giống lúa chịu mặn, chất lƣợng gạo ngon, thích nghi với đồng đất tỉnh Thái Bình, đó là các giống Hƣơng ƣu 98, DT 68 và H2 - DT. Tại bộ môn Sinh học Phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp, đã tiến hành thực hiện nhiều đề tài về chọn tạo giống lúa, ứng phó với các điều kiện khô hạn, ngập chìm, hay chịu mặn… Kết quả đã chọn tạo thành công một số giống lúa có khả năng chịu mặn nhƣ Bắc Thơm 7, chịu ngập chìm nhƣ AS996… 1.4.2.1. Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử: Việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong việc đánh giá nguồn gen và vật liệu phục vụ chọn tạo giống đã đƣợc triển khai và thu đƣợc một số thành tựu đáng kể. Tại một số viện nghiên cứu nhƣ Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện lúa ĐBSCL, Viện Công nghệ sinh học… đã triển khai sử dụng chỉ thị phân tử để phát hiện gen kháng bệnh và lập bản đồ di truyền gen kháng bệnh bạc lá với cây lúa [3]. Một số báo cáo về việc ứng dụng phƣơng pháp này trong việc chọn tạo giống lúa kháng bạc lá và đã có một số dòng kháng có triển vọng [1]. Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đã bắt đầu sử dụng chỉ thị phân tử để xác lập bản đồ di truyền và chuyển những gen kháng đạo ôn vào những giống có tính trạng ƣu việt. Ngoài ứng dụng nghiên cứu chỉ thị phân tử trong chọn giống kháng đạo ôn, còn có các dự án nghiên cứu kháng rầy nâu nhƣ: - Sử dụng chỉ thị phân tử có thể xác định các chỉ thị DNA liên quan tới các gen kháng bệnh (bạc lá lúa, gỉ sắt ở cà chua, lạc, hay bệnh xoăn lùn ở bông…). Bằng việc ứng dụng STS để phân tích gen kháng rầy nâu từ loài hoang dại Oryza australiensis vào giống lúa trồng Oryza sativa L. (IR 31917-45-3-2), Nguyễn Thị Lang và ctv (1999),Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long. - Lập bản đồ phân tử cho 3 gen kháng rầy nâu bphX, bph4, Bph6 và phát hiện một loạt các chỉ thị SSR liên kết gần với các gen kháng đó, Lƣu Thị Ngọc Huyền, Vũ Đức Quang, Bộ môn Sinh học phân tử, Viện Di truyền nông nghiệp, - Một số nghiên cứu ứng dụng maker phân tử trong chọn giống lúa chịu mặn tạo bằng kỹ thuật nuôi cấy túi phấn, hay sử dụng chỉ thị phân tử để phân 28 tích đa hình và phân tích dựa trên bản đồ QTL để chọn tạo giống lúa có khả năng chịu nóng… đƣợc PGS.TS. Nguyễn Thị Lang (Viện Lúa ĐBSCL), Phạm Thị Xim (Trung tâm Giống tỉnh Kiên Giang), GS.TS. Bùi Chí Bửu (Viện KHKT Nông nghiệp miền Nam) phối hợp thực hiện nghiên cứu. Ngoài ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa mới có khả năng chống chịu lại điều kiện bất lợi của môi trƣờng, các giống cây trồng khác cũng đƣợc ứng dụng nghiên cứu: keo lá tràm, bông, ngô… 29 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu - Giống lúa FL478 là giống chịu mặn nhập từ Viện lúa Quốc tế IRRI. Thông qua dự án hợp tác: “Tạo giống lúa chịu ngập chìm và chịu mặn thích nghi với điều kiện nước biển dâng cho các vùng bờ biển đồng bằng Việt Nam” do chính phủ Đan Mạch tài trợ giai đoạn 2010-2012, - Giống OM6976 là giống lúa năng suất cao tại ĐBSCL. - Giống lúa Pokkali: giống chống chịu có nguồn gốc từ Ấn Độ - Giống lúa IR29: giống mẫn cảm từ Viện Lúa Quốc tế (IRRI) - Các chỉ thị phân tử SSR liên kết chặt với gen Saltol trên nhiễm sắc thế số 1: RM3412b, RM493, AP3206; RM10748; RM140; RM10825 (Niones JM, 2004), [57], thông tin chi tiết về chỉ thị phân tử đƣợc thể hiện qua bảng 6 hình 5 Hình 5 Vị trí các chỉ thị trên NST1 và Locus gen Saltol Ghi chú: Bên trái là tên các chỉ thị phân tử, bên phải là vị trí trên NST1; Vùng đỏ QTL/Saltol; vùng gạch chéo: tái tổ hợp.) 30 Bảng 5: Thông tin về các chỉ thị phân tử trên NST1 Tên mồi TT NST Vị trí (Mb) 1 AP3206 1 11,2 2 RM3412b 1 11,6 3 RM10748 4 RM140 5 RM493 6 RM10825 1 1 1 1 11,8 12,3 12,3 13,3 Nhiệt độ Trình tự mồi thuận/nghịch gắn mồi (0C) GCAAGAATTAATCCATGTGAAAGA AGTGCAGGATCTGCCATGA TGATGGATCTCTGAGGTGTAAAGAGC TGCACTAATCTTTCTGCCACAGC CATCGGTGACCACCTTCTCC 60 60 55 CCTGTCATCTATCTCCCTCAAGC CTTGCACAAGAGATGATGATGAGC 55 CATGCTGAGAAATAGTACGCTTGG GTACGTAAACGCGGAAGGTGACG 55 CGACGTACGAGATGCCGATCC GGACACAAGTCCATGATCCTATCC 55 GTTTCCTTTCCATCCTTGTTGC (Nguồn http://www.gramene.org) o o o o o Các vật tƣ, hóa chất sinh học phân tử chuyên dụng, sử dụng trong nghiên cứu: Máy PCR (hãng Eppendorf) Máy li tâm lạnh (Eppedorf 5810 – R và 2K15 Sigma) Máy điện di ngang Bio-Rad GT (Anh), máy điện di đứng Bio-Rad Máy soi gel (T2201, sigma), mặt nạ chắn tia UV (Sigma) Thiết bị Votex (Genie 2 và MS1 Minishaker) o o o o o Nồi hấp thanh trùng (05MBI-160T-3- Nga) Cân điện tử Sartorious (Đức) Máy lắc Lò vi sóng Micropipet, ống Eppendorf, bình tam giác các loại 31 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu - Bộ môn Sinh học phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp, đƣờng Phạm Văn Đồng, Hà Nội - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Thanh Trì, Hà Nội - Thí nghiệm đồng ruộng đƣợc thực hiện tại huyện Giao Thủy, tỉnh Nam Định 2.2. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu đánh giá vật liệu bố mẹ trong nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn - Ứng dụng chỉ thị phân tử xác định cá thể mang locus gen Saltol. - Đánh giá và trồng thử nghiệm các dòng chịu mặn đƣợc chọn tạo bằng phƣơng pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử. Xác định các dòng chịu mặn triển vọng phục vụ công tác phát triển giống lúa chịu mặn cho sản xuất. 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp lai hữu tính giữa giống lúa cho và nhận gen Các giống lúa OM6976, FL478 đƣợc gieo trồng trên đồng ruộng. Để hai giống lúa cùng trỗ bông cùng thời điểm, phục vụ việc lai tạo, nên gieo giống FL478 sớm 15 ngày so với giống OM6976. Khi thời kỳ cây lúa ra hoa, tiến hành chọn các cây sinh trƣởng khỏe, không sâu bệnh để tiến hành lai. 2.3.1.1. Chuẩn bị cây mẹ: - Chọn cây: chọn cây sinh trƣởng tốt, không sâu bệnh, chuyển cây vào chậu (đã đƣợc chuẩn bị trƣớc), cột thẻ ghi tên giống vào cây. Chọn 2-3 bông/tổ hợp lai. Chọn bông đã trổ khỏi bẹ 50–60%. Cẩn thận tách bông đƣợc chọn ra khỏi các bông xung quanh, cắt bỏ các bông đã trổ. - Dọn cây lai: loại bỏ những hoa trên (chóp bông) và hoa dƣới (gần cổ bông); chỉ giữ lại các hoa có chiều cao bao phấn ở khoảng ½ - ⅓ vỏ trấu (nhìn xuyên qua vỏ trấu). Mỗi bông giữ lại 15-20 hoa tốt, đúng thời điểm để lai. 32 - Cắt vỏ trấu: cắt xiên vỏ trấu, bỏ từ ⅓ - ⅔ vỏ trấu để lộ ra những túi phấn. Không cắt quá thấp sẽ làm tổn thƣơng nhụy cái. Nếu cắt quá cao sẽ khó khử đực và phấn sẽ khó rơi xuống nhụy cái. 2.3.1.2. Khử đực - Dùng mũi nhọn của cây kẹp các túi phấn ra ngoài. Thao tác này phải làm rất cẩn thận để tránh thiệt hại đến nhụy cái (6 túi phấn phải đƣợc loại bỏ bao bông lúa) - Sau khi khử đực, bao bông lúa lại bằng bao giấy bóng mờ (trên bao giấy bóng mờ ghi ngày khử đực, tên ngƣời khử đực), để giữ bông cho chặt 2.3.1.3. Chọn cây bố - Chọn bông từ những cây đại diện, tốt, có nhiều hoa sẽ nở, hoa ở chóp bông đã tung phấn. Cắt bông lúa có độ dài thích hợp, cắt bỏ lá cờ. cột các bông lúa cùng cây cha lại và gắn các thẻ ghi vào bó bông. Mang các bông từ ruộng vào nơi thụ phấn. - Đặt các bông vào chậu nƣớc, nơi ít gió, dễ di chuyển. Sắp xếp các bông để rút bất cứ bông nào mà không ảnh hƣởng đến bông khác 2.3.1.4. Thụ phấn - Quan sát kỹ các bông, khi nào túi phấn vƣơn ra khỏi vỏ trấu của cây cha phải thụ phấn ngay khi hoa nở, càng nhanh càng tốt, tận dụng thời gian thụ phấn nhiều nhất. - Lấy bao giấy ra khỏi bông cây mẹ (OM6976), rút một bông của cây cha (FL478) đang nở rắc lên các bông cây mẹ đã khử đực. Bao bông cây mẹ lại sau khi thụ phấn. Xếp cạnh miệng bao, dùng kẹp giấy kẹp vào trục bông để giữ bông cho chặt (ghi rõ cây cha đƣợc thu phấn cho cây mẹ và ngày thụ phấn) 2.3.2. Phương pháp chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử (MAS) Những chỉ thị di truyền liên kết chặt với các gen đƣợc sử dụng để chọn lọc các cá thể ngay ở giai đoạn sớm mà không phụ thuộc vào điều kiện môi trƣờng. 33 Trong nghiên cứu này, đã tiến hành xây dựng mô hình sàng lọc trong các thế hệ chọn giống nhƣ sau: Bước 1: Lai tạo tổ hợp F1 - Các dòng bố mẹ đƣợc lựa chọn là cây nhận QTL/Saltol (OM6976) sẽ đƣợc lai tạo với giống cho QTL/Saltol (FL478). - Để hai giống lúa cùng trỗ bông cùng lúc để tiến hành lai tạo, đã tiến hành trồng FL478 trƣớc OM6976 15 ngày. - Khi hai giống lúa cùng trỗ bông, tiến hành thực hiện phép lai hữu tính, để tạo thế hệ F1. Bước 2: Tạo thế hệ BC1F1, - Các tổ hợp lai F1 đƣợc lai trở lại với giống nhận QTL/Saltol (OM6976) để tạo quần thể BC1F1 - Sử dụng chỉ thị phân tử đa hình, liên kết chặt với QTL/Saltol để xác định các cá thể mang gen trong quần thể BC1F1 Bước 3: Tạo cây BC2F1, - Để tạo các cây BC2F1 , các cây BC1F1 đƣợc cho lai với dòng nhận QTL/Saltol - Chu trình đánh giá kiểu gen đƣợc lặp lại nhƣ trên. - Chọn từ 20 - 30 cá thể BC2F1 dị hợp tử với gen đích, nhƣng chứa nền gen di truyền lớn nhất từ cây nhận gen. Bước 4: Tạo cây BC3F1, - Để tạo các cây BC3F1, các cây BC2F1 đƣợc xác đinh mang locus QTL/Saltol tiếp tục cho lai với dòng nhận gen - Chu trình đánh giá kiểu gen đƣợc lặp lại nhƣ trên. - Chọn từ 15-20 cá thể BC3F1 dị hợp tử với gen đích -Bước 5: Tạo cây BC3F2, - Các cá thể BC3F1 đƣợc tự thụ trong điều kiện nhà lƣới để tạo quần thể BC3F2. - Sử dụng chỉ thị phân tử để xác định và chọn lọc các cá thể BC3F2 mang QTL/Saltol đồng hợp tử. 34 - Đánh giá khả năng chịu mặn nhân tạo và khả năng sinh trƣởng phát triển của các dòng chịu mặn đƣợc chọn tạo. - Đánh giá các dòng mang locus gen chịu mặn Saltol trên đồng ruộng - Các cá thể BC3F2 mang QTL/Saltol tiếp tục trồng và chọn lọc thuần với về các đặc điểm nông sinh học, yếu tố cấu thành năng suất… Ghi chú: RP: Recipient Parent, DP: Donor Parent 2.3.3. Phương pháp thử độ mặn nhân tạo - Thí nghiệm đánh giá khả năng chịu mặn của các dòng đƣợc chọn tạo đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, có lặp lại trong điều kiện pH = 5, với công thức có bổ sung muối (NaCl) vào dung dịch Yoshida là 6‰. NaCl tƣơng đƣơng với độ dẫn điện EC=12dS/m. - Vật liệu nghiên cứu: 35 o Sử dụng giống Pokkali (giống chịu mặn có nguồn gốc từ Ấn độ, làm đối chứng) o Giống IR29 (giống mẫn cảm có nguồn gốc từ IRRI) o Giống OM6976 o Các dòng BC3F2 - Trƣớc khi tiến hành thử nghiệm khả năng chịu mặn, tiến hành xử lý hạt giống bằng cách đặt trong lo đối lƣu ở 500C trong 3 ngày để phá ngủ cho giống tránh tác động ảnh hƣởng của sự ngủ nghỉ đến khả năng nảy mầm của hạt. - Sau thời gian phá ngủ (3 ngày), tiến hành đem hạt đã khử trùng cho vào đĩa Petri với giấy thấm ẩm, đặc trong tủ thúc mầm ở nhiệt độ 300C trong 48 giờ. - Khi hạt đã nảy mầm, tiến hành gieo hạt vào các hốc của phao cấy. Cây mạ con sinh trƣởng, rễ có thể xuyên qua lớp lƣới xuống dung dịch bên dƣới. Để hạt có thể làm quen với môi trƣờng, đồng thời tránh gây bất kỳ tổn hại nào đến hệ thống rễ cây - cơ quan trực tiếp ảnh hƣởng đến cơ chế chống chịu mặn, chúng tôi đặt các phao cấy trong nƣớc đã tiệt trùng (3-4 ngày), trƣớc khi đƣa vào dung dịch dinh dƣỡng đã mặn hóa. - Tiến hành thử nghiệm trên phao cấy gồm có 10 hàng, một hàng có 10 hốc gieo, mỗi hốc gieo 5 hạt trong cùng một dòng/giống. o Hàng 1 đến hàng 3: gieo các cá thể thuộc dòng D1 lần lƣợt từ hốc 1 đến hốc 10 tƣơng ứng với mỗi hàng o Hàng 4 đến hàng 6: gieo các cá thể thuộc dòng D16 lần lƣợt từ hốc 1 đến hốc 10 tƣơng ứng với mỗi hàng o Hàng 7: sử dụng để gieo OM6976 o Hàng 8: sử dụng để gieo FL478 o Hàng 9: sử dụng để gieo IR29 o Hàng 10: sử dụng để gieo Pokkali 36 Hình 6: Thí nghiệm thanh lọc mặn giai đoạn mạ trong điều kiện nhân tạo - Sau 3 đến 4 ngày, khi mạ ổn định, thay nƣớc tiệt trùng bằng dung dịch Yoshida có NaCl nồng độ 6‰, định kỳ thay dung dịch 7 ngày 1 lần, hàng ngày đo pH, luôn duy trì tại pH = 5,0. Sau 14 ngày thử mặn, bắt đầu tiến hành đánh giá Bảng 6: Đánh giá tiêu chuẩn cải tiến (SES) qua quan sát mức hại của mặn ở giai đoạn mạ. Mức độ 1 Khả năng chống Quan sát chịu Sinh trƣởng bình thƣờng, lá không có triệu Chống chịu cao chứng, rễ phát triển mạnh 3 Sinh trƣờng gần nhƣ bình thƣờng, một vài lá hơi Chống chịu khá trắng và cuộn 5 Sinh trƣởng đã bị chậm lại, hầu hết lá bị cuộn lại, Mức trung bình chỉ một vài lá vƣơn ra 7 Hoàn toàn ngừng tăng trƣởng, hầu hết lá bị khô, Mẫn cảm một số cây chết 9 - Tất cả cây chết hoặc sắp chết (khô) Mẫn cảm cao Để đánh giá khả năng chịu mặn đƣợc sử dụng thang điểm đánh giá tiêu chuẩn cải tiến (bảng 6) để ghi triệu chứng quan sát đƣợc của ngộ độc muối, cho điểm phân biệt kiểu gen nhiễm và kiểu gen chống chịu vừa phải. 37 2.3.4. Phương pháp thí nghiệm đồng ruộng - Các thí nghiệm một nhân tố đƣợc bố trí theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên (RCB), mỗi thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. - Bố trí thí nghiệm ngoài đồng ruộng: o Thời vụ: vụ mùa 2012, vụ xuân 2013. o Cấy 1 dảnh, mật độ 45 khóm/m2 o Cây cách cây 15cm, hàng cách hàng 18cm o Bón phân, chăm sóc nhƣ đại trà. - Thu nhận mẫu lá của các quần thể BC1F1, BC2F1, BC3F1, BC3F2 - Đánh giá các chỉ tiêu theo dõi về khả năng sinh trƣởng, phát triển cũng nhƣ các chỉ tiêu cấu thành năng suất của các dòng/giống lúa trên đồng ruộng theo phƣơng pháp nghiên cứu của IRRI, 1980. Các chỉ tiêu theo dõi gồm có: o Thời gian sinh trƣởng o Chiều cao cây: đo từ mặt đất đến chóp lá cao nhất theo từng lần lặp lại, đơn vị tính cm. o Chiều dài lá đòng: đo từ cổ lá đến chóp lá o Độ thoát cổ bông o Chiều dài bông: đo từ cổ bông đến chóp bông lúa trƣớc thu hoạch 3 ngày, đơn vị tính là cm. o Số gié/bông o Số bông/khóm o Tỷ lệ hạt chắc (%) = Số hạt chắc/tổng số hạt x 100 o Tỷ lệ hạt lép (%) = Số hạt lép/tổng số hạt x 100 2.3.5. Phương pháp tách chiết DNA và phân tích di truyền chỉ thị phân tử 2.3.5.1. Phƣơng pháp tách CTAB - Phƣơng pháp tách CTAB cải tiến dựa trên phƣơng pháp của Shagai Maroof (năm 1984). 38 o Lá của các dòng, giống lúa nghiên cứu đƣợc cắt và lấy mẫu vào các ống eppendorf 1,5ml để trong đá lạnh (mục đích giữ lá đƣợc tƣơi). Thời gian thu mẫu tốt nhất: vào sáng sớm khi nồng độ muối trong lá thấp, các enzyme hoạt động ít o Nghiền mẫu với nitơ lỏng trong eppendorf hoặc cối, đến khi thành bột mịn (chú ý khi nghiền luôn để mẫu ở trong nitơ lỏng) o Cho mẫu đã nghiền mịn vào ống eppendorf 2ml và cho 1ml đệm chiết EB (extraction buffer) rồi đảo đều, giữ trong đá. Thêm 50µl SDS 10% o Đặt vào thiết bị ủ trong 30phút ở 650C, thỉnh thoảng đảo cho dung dịch đƣợc trộn đều o Ly tâm ở 13500 rpm trong 20phút o Lấy ra, chiết dịch nổi ở phía trên sang 1 eppendorf mới. Thêm 1ml Isopropanol alcohol rồi để vào tủ 40C cho kết tủa khoảng 30phút o Ly tâm ở 13500 rpm trong 25 phút o Đổ hết dịch nổi ở phía trên rồi giữ lại phần tủa ở dƣới đáy eppendorf. Cho 400µl đệm TE (tỷ lệ 10:0,1) cho vào tủ ấm 650C ủ trong 5phút. Dùng pipet nhỏ hoặc búng nhẹ hòa tan tủa, có thể giữ ở 40C qua đêm. o Cho 3 µl Rnase (10mg/ml) vào mỗi eppendorf. Ủ trong 370C trong 3 tiếng. o Thêm 400 µl đệm CTAB, đặt vào nhiệt độ 650C trong 15 phút, thỉnh thoảng trộn, lắc đều o Cho vào tủ hút thêm 800 µl Chloroform/Isoamyl alcohol (tỷ lệ 24:1), lắc, trộn từ 5-7 phút nhằm loại bỏ protein. o Ly tâm ở 13500 rpm trong 10phút. Dung dịch bên trong eppendorf chia làm 2 phần. o Dùng pipet, hút chuyển dịch nổi ở phía trên sang một enppendorf mới. Nếu chƣa sạch có thể chiết lại lần 2 với Chloroform/Isoamyl alcohol (tỷ lệ 24:1), o Thêm 2,5 lần thể tích Ethanol 96% và cất giữ ở tủ lạnh sâu (-200C) o Ly tâm ở 13500 rpm trong 30phút. Loại bỏ cồn để giữ lại phần tủa trắng ở đáy ống 39 o Rửa tiếp bằng 400cồn 70% rồi đƣa vào máy ly tâm. Ly tâm ở 13500 rpm trong 5phút o Đổ cồn đi giữ lại tủa, cho vào máy làm khô chân không khoảng 10phút làm khô tủa DNA, sau đó cho vào 100µl TE (tỷ lệ 10:0,1) vào mỗi eppendorf để hòa tan tủa. o Giữ DNA ở tủ lạnh sâu (-200C) để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. 2.3.5.2. Kỹ thuật PCR với các mồi SSR - Các chu trình của phản ứng PCR với các mồi SSR, qua các bƣớc: o Bƣớc biến tính: ở chu kỳ đầu tiên biến tính mẫu DNA ở nhiệt độ 940C trong 5phút, 30 giây o Bƣớc gắn mồi: thực hiện ở 550C trong 30 giây o Bƣớc tổng hợp thực hiện ở nhiệt độ 720C trong 30 giây - Thành phần phản ứng Thành phần Thể tích (µl) H2O (nƣớc cất 2 lần) 5,5 Buffer 1 dNTPs 1 MgCl2 0,53 Primer 1 Taq Polymerase 0,1 DNA 1,2 Tổng số 10,26 40 Thực hiện các bƣớc trên với 35 chu kỳ, sau đó ở chu kỳ cuối cùng chạy thêm - 720C trong 7 phút sau đó bảo quản ở nhiệt độ 40C Sau khi chạy PCR xong, cất giữ mẫu ở nhiệt độ 40C. Trƣớc khi đem phân tích - phải đƣợc nhỏ thuốc nhuộm Ethidium Bromide vào các mẫu, sau đó đƣa vào máy PCR gây biến tính ở 940C trong 5phút sau đó để mẫu vào luôn khay đựng đá lạnh rồi tiến hành tra mẫu DNA vào bản gel điện di. 2.3.5.3. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose 0,8% Nguyên tắc : DNA tích điện âm không đổi nhờ khung phosphate vì thế khi đặt - trong điện trƣờng, các phân tử DNA dịch chuyển từ cực âm sang cực dƣơng và các phân tử DNA có khối lƣợng và điện tích khác nhau sẽ đƣợc phân tách. Mục đích : Nhằm phân tách các đoạn DNA có kích thƣớc khác nhau, xác định - đƣợc sự có mặt các đoạn DNA quan tâm 1. Chuẩn bị bản gel Cân 0,8g agarose cho vào 100 ml đệm TBE ở nhiệt độ phòng, khuấy đều trên - máy khuấy từ, để yên 1 phút, cho vào lò vi sóng – mục đích làm nóng chảy gel và không tạo bọt. - Làm nguội gel đến 50-55oC, thêm 1µl Ethidium Bromide vào. - Đổ gel vào khuôn gel và lắp lƣợc - Khi gel nguội, đặt khuôn gel vào buồng điện di, tháo lƣợc và đổ đệm chạy vào khay gel sao cho đệm cao hơn mặt gel khoảng 3-5mm 2. - Kỹ thuật điện di trên gel agarose Khi gel nguội, đặt khuôn gel vào buồng điện di, tháo lƣợc và đổ đệm chạy vào khay gel sao cho đệm cao hơn mặt gel khoảng 3-5mm - Nạp DNA mẫu và DNA chuẩn vào các giếng tƣơng ứng theo thứ tự mẫu - Đậy nắp, cắm điện cực - Điện di trong 30 phút với điện thế 100-120V - Lấy bản gel ra, cho vào máy chụp UV, chụp ở bƣớc sóng 254nm. 41 2.3.5.4. Phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide 4,5% Chuẩn bị bản gel 1. - Ngâm kính trong dung dịch NaOH (120g + 2000ml H2O) hòa tan - Rửa kính thật sạch bằng khăn miết sạch với xà phòng pha loãng rồi tráng qua nƣớc cất - Tấm kính nhỏ (tấm kính có mặt không bám): o Lau nhẹ bằng nƣớc cất, để khô o Lau tiếp bằng cồn 96% o Nhỏ 300 µl Rain-X (Sigma cord), xoa nhanh tay, nhẹ và đều - Tấm kính lớn (tấm kính bám gel) o Lau 3 lần với nƣớc cất, để khô o Lau tiếp 3 lần với cồn 96% o Nhỏ 300 µl Binding Solution đã pha trong eppendorf vào tấm kính (1ml cồn 96% + 5µl acid acetic 5% + 3µl Binding), xoa đều, nhanh khắp bề mặt của kính, để khô khoảng 5 phút - Đặt hai thanh nhựa lót vào 2 bên của tấm kính nhỏ, úp hai tấm kính vào nhau. - Pha dung dịch đổ gel (các hóa chất dùng để pha acrylamide đều phải để lạnh) gồm có: o Dung dịch Acryamide (thành phần xem trong phụ lục 1) o Dung dịch đổ gel (thành phần xem trong phụ lục 1) - Cho dung dịch đổ gel này vào cốc, lắc đều, sau đó đổ nhanh tay vào khe của 2 tấm kính đã ghép, cài lƣợc vào, dùng kẹp giữ lƣợc và mặt gel, lƣợc sẽ tạo thành các giếng để load - Ở mặt đặt lƣợc, đặt thêm giấy thấm nƣớc cất cho gel không bị khô - Dùng giấy bóng quấn quanh đầu gel đến khi kết thúc (1-2h) - Đánh dấu mặt gel khi rút lƣợc ra, dựng gel đứng, chạy gel trong dung dịch TBE 1X với 2000ml ở 30 phút cho nhiệt độ tăng lên 500C thì cài lƣợc vào nhƣ cũ, rồi load mẫu 42 - Khi load mẫu thì load theo thứ tự đã đánh dấu - Chạy gel trong 2h ở điện thế 50-60mA và 300W Kỹ thuật nhuộm bản gel (nhuộm bạc) 2. - Rút hết đồ cắm điện, đổ hết TBE 1X ra - Tách rời 2 tấm kính - Cho tấm kính lớn vào khay đã lau sạch - Chuẩn bị các dung dịch nhuộm (xem trong phụ lục 1): o Dung dịch cố định, dừng phản ứng (Fix Solution) o Dung dịch nhuộm (Staining Solution) o Dung dịch hiện (Developing Solution) - Tiến hành nhuộm: o Sau khi tiến hành chạy điện di xong, tháo lấy tấm kính lớn có bám gel để tiến hành nhuộm o Cố định gel:  Đổ dung dịch Fix Solution (cố định, dừng phản ứng) vào khay có chứa tấm kính lớn, sao cho mặt bám gel hƣớng lên trên, lắc nhẹ trong 30phút  Rửa tấm kính bằng nƣớc cất 3 lần, mỗi lần 2 phút (V=2000ml H2O) o Nhuộm Staining Solution  Đổ dung dịch Staining Solution vào khay có chứa tấm kính lớn, sao cho mặt bám gel hƣớng lên trên, lắc nhẹ trong 30phút  Rửa tấm kính bằng nƣớc cất 2 lần (V=2000ml H2O), mỗi lần không quá 10 giây o Nhuộm Developing Solution  Đổ dung dịch Developing Solution (có váng đá trên bề mặt dung dịch là tốt nhất) vào khay có chứa tấm kính lớn, sao cho mặt bám gel hƣớng lên trên, lắc nhiều lần để hiện băng DNA 43  Khi bang DNA đƣợc hiện rõ, đem ngâm tấm kính vào dung dịch Fix Solution trong 1 phút  Rửa lại bằng nƣớc cất cho hết mùi và dung dịch bám trên gel  Đặt tấm kính lên tấm giấy thấm ở dƣới cho khô  Score xác định băng gel  Đƣa tấm kính vào tủ sấy khô và sau đó là scan trên máy tính 2.3.5.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu - Thí nghiệm đồng ruộng đƣợc xử lý dữ liệu qua chƣơng trình Irristat 5.0, Excel 2010 - Đánh giá vật liệu bố mẹ sử dụng trong nghiên cứu bằng phƣơng pháp của IRRI và phƣơng pháp thanh lọc mặn của Yoshida và cs (1976). - Phân tích đánh giá đa hình DNA của các dòng giống bố mẹ của các tổ hợp lai triển vọng theo các chỉ thị đã lựa chọn qua thông tin đã công bố và các thông tin tự lựa chọn, thiết kế trên cơ sở bản đồ phân tử đã đƣợc công bố về các gen quan tâm. Chọn ra các chỉ thị cho đa hình giữa các dòng giống bố mẹ của tổ hợp lai. - Số liệu đƣợc ghi nhận trong Excel 2010 và xử lý thông qua phần mềm chuyên dụng Graphical Genotyper (Van Berloo, 2008) trong phân tích di truyền: dữ liệu của từng chỉ thị SSR đối với các alen đồng hợp tử giống nhận gen là “A”, đồng hợp tử giống cho gen là “B” và dị hợp tử là “H”, số % alen của cây nhận gen là “R”. 44 Chƣơng 3: KẾT QUẢ 3.1. Kết quả đánh giá xác định vật liệu bố mẹ trong nghiên cứu 3.1.1 Kết quả đánh giá khả năng chịu mặn của các giống lúa trong điều kiện nhân tạo Kết quả thanh lọc mặn của các giống lúa nghiên cứu có bổ sung NaCl 6‰ vào dung dịch Yoshida đƣợc thể hiện qua bảng 7: Bảng 7: Kết quả thanh lọc mặn sau 2 tuần của các giống Cấp hại sau 2 tuần xử lý NaCl 6‰ Tên giống TT Lặp 1 Lặp 2 Lặp 3 Trung bình 1 Pokkali (chống chịu) 1 1 3 1.7 2 IR29 (mẫn cảm 7 7 9 7.7 3 FL478 1 3 1 1.7 4 OM6976 5 7 7 6.3 Theo đánh giá tính chịu mặn của các giống lúa của IRRI, 1997 khi giống lúa IR29 có biểu hiện tổn thƣơng, tăng trƣởng bị ngƣng lại hoàn toàn, hầu hết các lá bị khô, một vài chồi bị chết (điểm 7) hoặc tất cả các cây đều bị chết khô (điểm 9) thì tiến hành quan sát, đánh giá theo tiêu chuẩn SES. Sau 2 tuần xử lý mặn ở nồng độ NaCl 6‰ giống IR29 sinh trƣởng bị ngƣng lại hoàn toàn, hầu hết các lá bị khô (điểm 7) trong khi đó giống Pokkali vẫn sinh trƣởng bình thƣờng, chỉ xuất hiện một vài lá có vết trắng, lá hơi cuốn lại (điểm 1-3) tƣơng đƣơng với giống FL478 (điểm 1-3). Trong khi đó, giống OM6976 không có khả năng chịu mặn nên sau 2 tuần, hầu hết các cây trong thí nghiệm đều bị khô lá. 3.1.2. Kết quả đánh giá xác định vật liệu bố mẹ trong nghiên cứu Từ việc đánh giá các đặc tính nông sinh học của vật liệu khởi đầu cũng nhƣ khả năng chống chịu của các giống lúa trong điều kiện mặn nhân tạo, chúng tôi đã rút ra một số kết luận đƣợc tổng hợp trong bảng 8 nhƣ sau: 45 Bảng 8: So sánh hai giống FL478 và OM6976 Chỉ tiêu Nguồn Giống FL478 Giống OM6976 Viện lúa Quốc tế IRRI Lai tạo từ tổ hợp lai IR68144/OM997 (đƣợc Cục Trồng trọt công nhận đặc cách chính thức gốc giống lúa thuần tại các tỉnh vùng ĐBSCL, theo quyết định số 711/QĐ-TT-CLT ngày 7 tháng 12 năm 2011) TGST 130 - 140 ngày (xuân 95-97 ngày đối với lúa sạ và 100-105 ngày muộn) và 105 – 110 ngày (mùa sớm) Cao cây 95 – 104 cm Năng suất Trung bình 100-110 cm Tiềm năng năng suất cao, có thể đạt 7- 9 tấn/ha (vụ Đông Xuân), đạt 5 – 6 tấn/ha (vụ Hè thu) Từ bảng thông tin trên cho thấy giống FL478 có thời gian sinh trƣởng dài hơn OM6976, do đó, để hai giống cùng trỗ trong khoảng thời gian nhất định, tạo điều kiện thuận lợi cho việc lai tạo giữa giống nhận và cho gen, đã tiến hành gieo FL478 trƣớc OM6976 từ 15 -20 ngày. Bên cạnh đó, từ việc đánh giá khả năng chống chịu mặn ở nồng độ muối NaCl 6‰ giữa các giống OM6976, FL478, IR29, Pokkali, đã thu đƣợc một số kết quả nhƣ sau: Các giống đều ngừng sinh trƣởng, hầu hết lá bị khô, và một vài chồi bị chết, đặc biệt là giống IR29, một giống chuẩn nhiễm, đƣợc nhập từ IRRI, bị chết hoàn toàn sau 2 tuần xử lý mặn. Tuy nhiên, giống lúa OM6976 trong cùng điều kiện đánh giá cũng bị ngƣng sinh trƣởng, các lá bị khô, thậm chí là vài chồi bị chết, do đó, chúng tôi nhận thấy giống OM6976 không có khả năng chống chịu mặn trong thí nghiệm. 46 Trong khi đó, giống FL478 có khả năng chịu mặn điểm 3 tƣơng đƣơng với giống chuẩn Pokali có khả năng chịu mặn tốt nhất, đây là giống hiện đang đƣợc trồng khá phổ biến tại một số nƣớc Nam và Đông Nam châu Á, trong đó có Việt Nam. Nhƣ vậy, từ việc thu thập và đánh giá các đặc điểm nông sinh học, tiềm năng năng suất cũng nhƣ tính chống chịu mặn của các giống lúa, đã xác định đƣợc vật liệu sử dụng trong nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn là giống FL478 làm nguồn cho QTL/Saltol và giống OM6976 làm nguồn nhận QTL/Saltol. 3.2. Kết quả chọn tạo dòng lúa chịu mặn từ tổ hợp lai OM6976/FL478 3.2.1. Kết quả tách chiết DNA bằng phương pháp CTAB Tách chiết DNA từ mẫu lúa là bƣớc quan trọng để thu nhận DNA đủ độ tinh sạch cho các nghiên cứu tiếp theo. Trong nghiên cứu này, đã sử dụng phƣơng pháp CTAB có cải tiến để tách chiết DNA từ lá của các dòng bố mẹ cũng nhƣ các cá thể trong thí nghiệm nhằm tối ƣu hóa lƣợng DNA chiết tách và giảm sự đứt gãy của DNA trong quá trình thực hiện. Lá non 3 tuần sau khi cấy của các giống lúa nghiên cứu đƣợc thu nhận và tách chiết DNA. Nồng độ và độ tinh sạch của DNA đƣợc kiểm tra bằng gel agarose 0,8% cùng với λ DNA chuẩn. Nhuộm gel bằng Ethidium bromide và ghi nhận kết quả trên máy UV Hình 7. Kết quả kiểm tra DNA tổng số trên gel agarose 0,8% Ghi chú: giếng số 1: giống lúa FL478, giếng số 2: λ DNA chuẩn, giếng số 3: giống lúa OM6976, các giếng số 4- 11: các cá thể của quần thể BC1F1 47 Dựa vào độ sáng và gọn của các băng DNA cho thấy phƣơng pháp tách chiết bằng CTAB cho hiệu quả cao, DNA thu đƣợc nguyên vẹn, không lẫn tạp chất, các băng hiển thị rõ và có nồng độ cao trong khoảng từ 200ng/µl. Từ kết quả thu nhận đƣợc chứng tỏ DNA đảm bảo đủ độ tinh sạch, đạt yêu cầu để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. 3.2.2. Kết quả kiểm tra đa hình tại locus gen saltol giữa FL478 và OM6976. Kế thừa từ các kết quả, vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu các chỉ thị phân tử có liên quan trong nghiên cứu và chọn tạo giống lúa chịu mặn từ dự án “Tạo giống lúa chịu ngập chìm và chịu mặn thích nghi với điều kiện nước biển dâng cho các vùng bờ biển đồng bằng Việt Nam” do chính phủ Đan Mạch tài trợ giai đoạn 20102012, đã xác định đƣợc có 6 chỉ thị phân tử nằm trong khu vực QTL/Saltol từ AP3206 (tại vị trí 11,2Mb) đến RM10825 (tại vị trí 13,3Mb). Các chỉ thị này đƣợc sử dụng trong việc sàng lọc các cá thể mang gen đích trong quần thể FL478 và OM6976. Vị trí của các chỉ thị phân tử đa hình tại QTL/Saltol từ 11,2 Mb -13,3 Mb, cụ thể: AP3206 (11,2 Mb); RM3412b(11,6 Mb); RM10748(11,8 Mb); RM493 (12,3 Mb); RM140(12,3 Mb) và RM10825 (13,3 Mb). Trong khuôn khổ của luận văn này, chúng tôi sử dụng 2 chỉ thị RM3412b và RM493 là hai chỉ thị cho đa hình rõ nhất với giống OM6976 để sàng lọc các cá thể mang QTL/Saltol trong quần thể lai tạo. 3.2.3 Kết quả lai tạo con lai F1 của tổ hợp lai OM6976 và FL478 Để chọn lọc các cá thể mang kiểu locus gen Saltol chịu mặn, tiến hành lai tạo tạo con lai F1 giữa OM6976 và FL478, kết quả thu đƣợc 20 hạt lai. Hạt lai F1 đƣợc gieo trồng trong điều kiện nhà lƣới thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp. Khi lúa đƣợc 2 tuần tuổi, tiến hành thu nhận mẫu lá để phân tích DNA. Việc xác định chính xác con lai F1 là cần thiết để phát triển tạo quần thể BC1F1.Thí nghiệm này sử dụng chỉ thị đa hình RM3412b, RM493 giữa OM6976 và FL478 trên NST số 1 để kiểm tra các cá thể lai. 48 Kết quả thu đƣợc 16/20 cá thể F1 cho dị hợp tử tại các vị trí chỉ thị phân tử. Sau khi chọn đƣợc 16 cá thể lai mang kiểu gen dị hợp tử, tiến hành lai ngƣợc trở lại với OM6976 để thu nhận các cá thể của quần thể BC1F1. 3.2.4. Sử dụng chỉ thị phân tử xác định các cá thể mang locus gen chịu mặn trong quần thể BC1F1 Để xác định các cá thể có mang QTL/Saltol trong các thế hệ lai trở lại hay không, tiến hành kiểm tra bằng hai chỉ thị phân tử là RM493 và RM3412b Ở thế hệ BC1F1, đã sử dụng 20 cá thế BC1F1 từ hạt lai F1 giữa OM6976 và FL478. Khi lúa đƣợc 2 tuần tuổi, tiến hành thu nhận mẫu lá của 20 cá thể thuộc quần thể BC1F1 để phân tích DNA, kiểm tra sự có mặt của QTL/Saltol, mỗi cá thể đƣợc đeo thẻ theo số thứ tự các dòng và thứ tự cây thu mẫu. Hai chỉ thị phân tử RM493 và RM3412b đƣợc sử dụng để xác định các cá thể mang gen QTL/Saltol trong quần thể BC1F1. Kết quả xác định cá thể BC1F1mang QTL/Saltol bằng chỉ thị phân tử RM493 đƣợc thể hiện trên kết quả băng điện di hình 8. Hình 8: Kết quả điện di với chỉ thị RM493 trên20 cá thể BC1F1 P1: OM6976, P2: FL478, A: OM6976, H: dị hợp tử, 1-20: các cá thể BC1F1 Qua phân tích trên hình 8, đã chọn ra đƣợc các cá thể đƣợc đánh số lần lƣợt là 1, 3, 5, 6, 11, 14, 15, 17, 18, 19 là các cá thể mang QTL/Saltol (ký hiệu là H) và có băng DNA trên gel giống với FL478. Tƣơng tự, khi chạy điện di với chỉ thị RM3412b trên 20 cá thế BC1F1, chúng tôi cũng thu nhận đƣợc băng điện di nhƣ sau: 49 Hình 9: Kết quả điện di với chỉ thị RM3412b trên20 cá thể BC1F1 P1: OM6976, P2: FL478, A: OM6976, H: dị hợp tử, 1-20: các cá thể BC1F1 Trong 20 cá thể nghiên cứu, đã chọn ra đƣợc các cá thể mang số 1, 6, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 17, 19 là các cá thể mang QTL/Saltol nhờ vào sự hiển thị băng DNA giống với dòng bố mang gen Saltol (hình 9). Kết hợp hai chỉ thị RM493 và RM3412b đã sàng lọc đƣợc 6 cá thể mang QTL/Saltol có số thứ tự là 1, 6, 14, 15, 17, 19 cá thể này sẽ đƣợc chọn lọc để tiến hành lai tạo quần thể BC2F1. 3.2.5. Sử dụng chỉ thị phân tử xác định các cá thể mang locus gen chịu mặn trong quần thể BC2F1 Sau khi thu đƣợc 6 cá thể dị hợp tử mang QTL/Saltol ở thế hệ BC1F1, tiến hành lai trở lại với OM6976 để thu nhận các cá thể của quần thể BC2F1. Ở thế hệ BC2F1, đã tiến hành chạy điện di trên 18 cá thể để xác định cá thể mang gen dị hợp tử . Kết quả chạy điện di với hai chỉ thị RM493 và RM3412b nhƣ sau: Hình 10: Kết quả điện di với chỉ thị RM493 trên 18 cá thể BC2F1 P1: OM6976, P2: FL478, A: OM6976, H: dị hợp tử, 1-18: các cá thể BC2F1 Từ kết quả chạy điện di với chỉ thị RM493 trên hình 10, đã xác định đƣợc 9 cá thể mang gen dị hợp tử đƣợc mang số theo thứ tự là: 3, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 17 50 Hình 11: Kết quả điện di với chỉ thị RM3412b trên 18 cá thể BC2F1 P1: OM6976, P2: FL478, A: OM6976, H: dị hợp tử, 1-18: các cá thể BC2F1 Trong 18 cá thể nghiên cứu, đã chọn ra đƣợc các cá thể mang số 1, 3, 5, 6, 7, 10, 11, 14, 15 là các cá thể mang gen dị hợp tử (hình 11). Đây là các cá thể mang QTL/Saltol nhờ vào sự hiển thị băng DNA giống với dòng bố mang gen Saltol. Các cá thể còn lại chỉ mang băng giống với giống nhận gen OM6976 nên không đƣợc lựa chọn do không mang QTL/Saltol. Kết hợp hai chỉ thị RM493 và RM3412b đã sàng lọc đƣợc 5 cá thể mang QTL/Saltol có số thứ tự là 3, 7, 10, 11, 15. Số cá thể mang gen dị hợp tử này sẽ đƣợc chọn lọc để tiến hành lai tạo quần thể BC3F1. 3.2.6. Sử dụng chỉ thị phân tử xác định các cá thể mang locus gen chịu mặn trong quần thể BC3F1 Số cá thể mang gen dị hợp tử đƣợc chọn lọc từ BC2F1, đƣợc lai ngƣợc với OM6976 để thu nhận quần thể BC3F1. Sau đó chúng tôi cũng tiến hành gieo trồng, khi lúa đƣợc 14 ngày, tiến hành thu nhận mẫu lá để xác định các cá thể mang gen dị hợp tử nhờ vào việc sử dụng các chỉ thị phân tử. Kết quả sau khi chạy điện di trên gel polyacrylamide đƣợc thể hiện trên hình 12: Hình 12: Kết quả điện di với chỉ thị RM493 trên 22 cá thể BC3F1 P1: OM6976, P2: FL478, A: OM6976, H: dị hợp tử, 1-22: các cá thể BC3F1 51 Từ hình 12, chúng tôi đã xác định đƣợc các cá thể mang số 1, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 16, 17, 21, 22 là các cá thể mang gen dị hợp tử. Các cá thể này có băng DNA hiển thị trên bản điện di giống với của giống bố. Các cá thể khác có băng DNA hiển thị giống mẹ, không có locus gen Saltol nên không đƣợc lựa chọn. Tiếp tục sử dụng chỉ thị RM3412b để sàng lọc cá thể mang gen dị hợp tử, chúng tôi thu đƣợc kết quả sau: Hình 13: Kết quả điện di với chỉ thị RM3412b trên 22 cá thể BC3F1 P1: OM6976, P2: FL478, A: OM6976, H: dị hợp tử, 1-22: các cá thể BC3F1 Các cá thể mang số: 2, 5, 8, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 20, 22 là các cá thể đƣợc phát hiện là dị hợp tử nhờ vào băng DNA hiển thị trên bản gel giống với dòng bố (hình 13). Các cá thể còn lại không đƣợc chọn lọc do không chứa QTL/Salol và mang nền di truyền của dòng mẹ. Kết hợp hai chỉ thị RM493 và RM3412b để sàng lọc, chúng tôi thu đƣợc 6 cá thể mang gen dị hợp tử lần lƣợt mang số 5, 8, 9, 12, 16, 22. Các cá thể này đƣợc chọn lọc và lai tạo quần thể BC3F2 3.2.7. Sử dụng chỉ thị phân tử xác định các cá thể mang locus gen chịu mặn trong quần thể BC3F2 Từ 6 cá thể thu nhận đƣợc ở quần thể BC3F1, tiến hành tự thụ để tạo quần thể BC3F2. Các cá thể đƣợc gieo trồng và thu nhận mẫu lá để kiểm tra trên gel polyacrylamide nhằm xác định các cá thể mang gen đồng hợp tử nhờ vào việc sử dụng 2 chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen Saltol là RM493 vả RM3412b. Kết quả sau khi chạy điện di trên gel polyacrylamide đƣợc thể hiện trên hình 14: 52 Hình 14: Kết quả điện di với chỉ thị RM493 trên 32 cá thể BC3F2 P1: OM6976, P2: FL478, A: OM6976, H: dị hợp tử, B: FL478, từ 1-32: các cá thể BC3F2 Qua kết quả chạy điện di với 32 cá thể của quần thể BC3F2, chúng tôi đã xác định đƣợc 8 cá thể mang số 4. 7, 10, 11, 15, 16, 18, 26 là các cá thể đồng hợp tử theo FL478 (hình 14). Các cá thể này có băng DNA hiển thị trên bản điện di giống với của giống bố. Các cá thể đồng hợp tử với OM6976 (8 cá thể, với số thứ tự là 14, 19, 22, 23, 24, 29, 30, 32) và dị hợp tử (16 cá thể với số thứ tự tƣơng ứng là 1, 2, 3, 5, 6, 8, 9, 12, 13, 17, 20, 21, 25, 27, 28 và 31) không đƣợc chọn lọc. Tiếp tục sử dụng với chỉ thị RM3412b để sàng lọc cá thể mang gen đồng hợp tử, chúng tôi thu đƣợc kết quả sau: Hình 15: Kết quả điện di với chỉ thị RM3412b trên 32 cá thể BC3F2 P1: OM6976, P2: FL478, A: OM6976, B: FL478, H: dị hợp tử, từ 1-32: các cá thể BC3F2 Sau khi chạy điện di đã xác định đƣợc 8 cá thể đồng hợp tử với dòng mẹ, 8 cá thể đồng hợp tử với dòng bố và 16 cá thể dị hợp tử. Các cá thể đồng hợp tử theo dòng bố mang số: 1, 9, 10, 13, 17, 19 23, 26 đƣợc chọn lọc. Các cá thể dị hợp tử có số thứ tự tƣơng ứng là: 2, 3, 4, 5, 6, 8, 11, 14, 18, 20, 21, 22, 24, 25, 29 31 và các cá thể đồng hợp tử với dòng mẹ các cá thể này có số thứ tự lần lƣợt là: 7, 12, 15, 16, 27, 28, 30 và 32 không đƣợc chọn lọc (hình 15), 53 Kết hợp hai chỉ thị RM493 và RM3412b để sàng lọc, chúng tôi thu đƣợc 2 cá thể mang gen đồng hợp tử theo dòng bố mang số 10 và 26. Các cá thể này sẽ đƣợc cho tự thụ và dùng để nghiên cứu khả năng chịu mặn nhân tạo cũng nhƣ đánh giá ngoài đồng ruộng. 3.3. Đánh giá vật liệu sử dụng trong nghiên cứu và chọn tạo giống lúa chịu mặn 3.3.1. Đánh giá tính chịu mặn của các dòng lúa chọn tạo trong điều kiện nhân tạo Từ việc sử dụng hai chỉ thị phân tử RM493 và RM3412b đã xác định đƣợc 2 cá thể đồng hợp tử theo dòng bố mang số 10 và 26. Hai cá thể này đƣợc cho gieo trồng, cho tự thụ, thu đƣợc 22 cá thể. Các cá thể này đã đƣợc quy tụ QTL/Saltol, đồng thời để đánh giá QTL/Saltol có hoạt động hay không qua việc kiểm tra tính chịu mặn trong điều kiện nhân tạo. Kết quả thanh lọc mặn của các dòng lúa nghiên cứu có bổ sung NaCl 6‰ vào dung dịch Yoshida đƣợc thể hiện qua bảng 9: 54 Bảng 9: Kết quả thanh lọc mặn sau 2 tuần của các dòng Cấp hại sau 2 tuần xử lý NaCl 6‰ TT Tên dòng/giống Lặp 1 Lặp 2 Lặp 3 Trung bình 1 Dòng số 01 3 3 5 3.7 2 Dòng số 02 3 3 5 3.7 3 Dòng số 03 3 3 3 3.0 4 Dòng số 04 3 3 5 3.7 5 Dòng số 05 3 3 3 3.0 6 Dòng số 11 3 3 5 3.7 7 Dòng số 12 3 5 3 3.7 8 Dòng số 13 3 3 3 3.0 9 Dòng số 14 3 3 5 3.7 10 Dòng số 15 3 3 3 3.0 11 Dòng số 16 5 5 3 4.3 12 Dòng số 17 3 3 3 3.0 13 Dòng số 18 3 3 5 3.7 14 Dòng số 28 3 3 5 3.7 15 Dòng số 29 5 3 3 3.7 16 Dòng số 30 3 5 3 3.7 17 Dòng số 31 3 5 3 3.7 18 Dòng số 66 3 3 3 3.0 19 Dòng số 67 3 5 3 3.7 55 TT Tên dòng/giống Cấp hại sau 2 tuần xử lý NaCl 6‰ 20 Dòng số 68 3 3 5 3.7 21 Dòng số 69 5 3 3 3.7 22 Dòng số 70 3 5 3 3.7 23 Pokkali (chuẩn kháng) 1 1 3 1.7 24 IR29 (chuẩn nhiễm) 7 7 9 7.7 25 FL478 1 3 1 1.7 26 OM6976 5 7 7 6.3 Theo đánh giá tính chịu mặn của các giống lúa của IRRI, 1997 khi giống lúa IR29 có biểu hiện tổn thƣơng, tăng trƣởng bị ngƣng lại hoàn toàn, hầu hết các lá bị khô, một vài chồi bị chết (điểm 7) hoặc tất cả các cây đều bị chết khô (điểm 9) thì tiến hành quan sát, đánh giá theo tiêu chuẩn SES. Sau 2 tuần xử lý mặn ở nồng độ NaCl 6‰ giống IR29 sinh trƣởng bị ngƣng lại hoàn toàn, hầu hết các lá bị khô (điểm 7) trong khi đó giống Pokkali vẫn sinh trƣởng bình thƣờng, chỉ xuất hiện một vài lá có vết trắng, lá hơi cuốn lại (điểm 1-3) tƣơng đƣơng với giống FL478 (điểm 1-3). Nhóm dòng có số thứ tự từ 1 đến 22 không bị ảnh hƣởng và có khả năng chịu đƣợc mặn tƣơng đƣơng nhau ở mức 3-5. Các cây trong thí nghiệm sinh trƣởng đều chậm lại, lá bị khô. Trong khi đó, giống OM6976 không có khả năng chịu mặn nên sau 2 tuần, hầu hết các cây trong thí nghiệm đều bị khô lá. 56 Một số hình ảnh thí nghiệm thanh lọc mặn tại Viện Di truyền Nông nghiệp Hình 16: Mạ đƣợc 14 ngày tuổi, bắt đầu Hình 17: Mạ sau 7 ngày trong dung dịch mặn thí nghiệm thanh lọc mặn Hình 18: Mạ sau 12 ngày trong môi trƣờng mặn Sau khi tiến hành thí nghiệm thanh lọc mặn trong điều kiện nhân tạo với sự bổ sung của muối NaCl với nồng độ 6‰ sau 2 và 3 tuần xử lý vào dung dịch Yoshida cho thấy: sau 2 tuần xử lý mặn hầu hết các dòng/giống đều bị ảnh hƣởng, tuy nhiên mức độ ảnh hƣởng không nghiêm trọng, và chủ yếu dừng ở mức độ thƣơng tổn (điểm 3-5). Khi bổ sung NaCl nồng độ 6‰ sau 3 tuần và tiến hành quan sát, đánh giá, chúng tôi thấy các dòng/giống trong thí nghiệm đều bị ngƣng tăng trƣởng hoàn toàn, hầu hết các lá bị khô, một vài chồi bị chết (điểm 7) đặc biệt là IR29 và OM6976. Giống có khả năng chịu mặn tốt nhất trong thí nghiệm là FL478 đƣợc đánh giá là tƣơng đƣơng với giống Pokkali trong cùng điều kiện. 18 dòng đã đƣợc xác định có số thứ tự từ 1, 2, 3, 4, 5, 11, 12, 14, 15, 18, 29, 30, 31, từ 66 đến 70, chiếm 80% số cá thể tham gia thí nghiệm có mức độ thƣơng tổn ở điểm 3-5, 57 điều này chứng tỏ QTL/Saltol đã quy tụ thành công vào các dòng trên và có khả năng hoạt động trong môi trƣờng hoặc điều kiện bị xâm nhiễm mặn. 3.3.2. Đánh giá các đặc tính nông sinh học, yếu tố cấu thành năng suất và khả năng chịu mặn của các dòng được tạo ra mang QTL/Saltol trong vụ mùa 2012 3.3.2.1. Đánh giá khả năng sinh trƣởng, phát triển của một số dòng chịu mặn tại Giao Thủy, Nam Định trong vụ mùa năm 2012 Quá trình sinh trƣởng, phát triển của cây lúa phụ thuộc vào đặc tính di truyền của giống và điều kiện ngoại cảnh đặc biệt là điều kiện khí hậu của từng vùng, từng mùa vụ cụ thể. Theo dõi các đặc tính nông học của một giống có thể phản ánh mức độ chịu thâm canh cũng nhƣ phạm vi sản xuất của từng dòng/giống góp phần khai thác tiềm năng năng suất của giống. Trong vụ mùa 2012, thí nghiệm đƣợc tiến hành trong điều kiện tự nhiên tại Giao Thủy, Nam Định với các dòng chịu mặn đƣợc tuyển chọn từ thế hệ BC3F2. Kết quả đánh giá đặc điểm nông học của các dòng đƣợc thể hiện ở bảng 10: 58 Bảng 10: Một số đặc điểm nông học và hình thái của các dòng/giống lúa tham gia thí nghiệm tại Giao Thủy, Nam Định, năm 2012 Tên dòng/giống (ngày) Chiều cao cây (cm) Chiều dài lá đòng (cm) cổ bông (cm) Số gié/bông 1 Dòng 1 118,33 96 25.33 6.67 10.33 2 Dòng 2 118 94.67 23.67 4.67 10.67 3 Dòng 3 113,67 93 25 5 10 4 Dòng 4 116,33 98 21.17 4.33 10 5 Dòng 5 115,67 100 25.33 4.67 10.33 6 Dòng 6 119 95 27.67 5.67 10.67 7 Dòng 7 117 100.67 27 4.33 10.67 8 Dòng 8 120,33 94.33 25.33 4.67 10 9 Dòng 9 118 97 23.67 4.33 10.33 10 Dòng 10 115 96.67 23.67 3.67 9.67 11 Dòng 11 120,33 99 26 5 10 12 Dòng 12 113 95.33 23.33 4.67 10 13 Dòng 13 121 95.67 24.67 5.33 10 14 Dòng 14 125 96 24 4.33 9.33 15 Dòng 16 124 107.33 25.67 5.33 10.33 16 Dòng 18 125 95.33 26 6.33 9.33 17 Dòng 20 121,33 96 25.67 4.33 10 18 Dòng 22 115 91.67 25.33 4 9.67 19 Dòng 24 119 99.33 24 6.33 11.67 20 Dòng 26 119 102.67 26.67 4.33 10.33 21 OM6976 110 90.33 23.67 4.33 12.33 CV 4,7 5,02 7,72 6,39 7,35 LSD(5%) 5,62 4,92 5,07 6,13 5,99 TT TGST 59 Độ thoát Từ bảng 10 cho thấy: TGST của lúa đƣợc tính từ lúc hạt thóc nảy mầm cho đến khi chín. TGST dài hay ngắn phụ thuộc vào giống lúa, mùa vụ gieo trồng và kỹ thuật trồng trọt. Từ bảng số liệu trên chia ra thành 3 nhóm dòng: nhóm có TGST ngắn hơn đối chứng, nhóm có TGST tƣơng đƣơng đối chứng và nhóm có TGST dài hơn đối chứng. TGST ở giống đối chứng là 110 ngày. Nhóm dòng có TGST tƣơng đƣơng đối chứng là 1, 2, 3, 4,5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 20, 22, 24, 26. TGST ở nhóm dòng này chênh lệch không đáng kể so với đối chứng, dao động trong khoảng ±3 ngày. Tuy nhiên, trong cùng điều kiện thí nghiệm, có một số dòng có TGST dài hơn cả đối chứng từ 14 ngày, đạt mức 124 đến 125 ngày, các dòng này đƣợc đánh số là 14, 16 và 18. Về chỉ tiêu đánh giá chiều cao cây, kết quả nghiên cứu cho thấy không có sự biến động đáng kể nào về sự tăng trƣởng chiều cao cây giữa các dòng. Hầu hết các dòng đều có chiều cao lớn hơn so với đối chứng là giống OM6976. Nhóm dòng có chiều cao nhỏ nhất, tƣơng đối giống nhƣ OM6976 là dòng số 2, 3, 6, 8, 12, 13, 18, 22. Chiều cao của nhóm này cao hơn OM6976, dao động từ 1,34 đến 5,34 cm. Tiếp theo là nhóm dòng có chiều cao lớn hơn OM6976 ở mức trung bình. Các dòng trong nhóm này có số 1, 4, 5, 7, 10, 11, 14, 20, 24, với chiều cao biến động trong khoảng từ 96 – 100,67 cm, cao hơn giống đối chứng OM6976 từ 6 đến 10,67 cm. Trong khi đó, nhóm dòng có chiều cao lớn nhất, biến động trong khoảng từ 102,67 đến 107,33 cm. Đặc biệt, dòng số 16 có sự phát triển nhanh và tăng cao nhất là 107,33 cm, cao hơn giống đối chứng OM6976 là 17cm trong cùng điều kiện thí nghiệm. Về chỉ tiêu đánh giá lá đòng, kết quả nghiên cứu cho thấy có sự sai khác giữa các dòng với nhau. Trong đó, nhóm dòng có chiều dài cao nhất đều đạt từ 26 đến 27,67 cm và cao hơn rất nhiều so với đối chứng (đạt 23,67cm). Nhóm này gồm các dòng số 6, 7, 11, 18, 26. Nhóm có chiều dài cao hơn đối chứng không đáng kể, từ 0,33 – 2 cm là: 1, 3, 5, 8, 12, 13, 14, 16, 20, 22, 24. Nhóm có chiều dài tƣơng đƣơng với giống đối chứng là các dòng số 2, 9, 10 và đều bằng 23,67 cm, . Tuy 60 trong cùng điều kiện thí nghiệm, nhƣng vẫn có một dòng có chiều dài lá đòng thấp hơn so với đối chứng, đó là dòng số 4 và dòng số 12, với chiều dài lá đòng đo đƣợc là 21cm (sai khác ý nghĩa ở mức 5,07%) Về chỉ tiêu chiều dài cổ bông, theo kết quả đánh giá, không có sự sai khác giữa các dòng với giống đối chứng. Các dòng có chiều dài cổ bông không chênh lệch nhiều so với đối chứng, đó là các dòng số 2, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 20, 22, 26. Nhóm dòng này có chiều dài cao hơn không đáng kể với đối chứng, chỉ dao động từ 1- 2 cm. Các dòng thuộc nhóm này gồm có dòng số 3, 6, 11, 13 và 16. Đặc biệt, nhóm dòng có chiều dài cao nhất là 3 dòng số 1, 18 và 24 với số liệu đo đƣợc từ 6,33 đến 6,67cm trong cùng điều kiện. Từ số liệu đo đếm đƣợc, số gié/bông của các dòng đều ít hơn giống đối chứng. Tuy nhiên, sự chênh lệch này không nhiều. Có 4 dòng số 10, 14, 18, 22 có số gié/bông thấp nhất là 9,33 đến 9,67. Các dòng còn lại có số gié/bông từ 10 đến 11,67, tƣơng đƣơng với đối chứng trong cùng điều kiện đánh giá. Nhìn chung TGST của hầu hết các dòng chấp nhận đƣợc và không cách quá xa so với TGST của đối chứng. Chiều cao cây, chiều dài lá đòng cũng nhƣ cổ bông của các dòng không biến động so với đối chứng, chứng tỏ phƣơng pháp MAS đã chuyển gen hiệu quả. Tuy các đặc tính nông sinh học này còn phụ thuộc nhiều vào kỹ thuật canh tác và khí hậu nên cần phải tiếp tục tiến hành các thí nghiệm tiếp theo để đánh giá khách quan và chính xác nhất. 3.3.2.1. Đánh giá các yếu tố cấu thành năng suất của một số dòng chịu mặn tại Giao Thủy, Nam Định trong vụ mùa 2012 Song song với việc đánh giá các đặc điểm nông sinh học về sinh trƣởng và hình thái, tiến hành đánh giá các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng chịu mặn tuyển chọn từ thế hệ BC3F2 từ tổ hợp lai OM6976/FL478. Các chỉ tiêu theo dõi gồm: tổng số hạt/bông, số hạt chắc/bông, số hạt lép/bông. Đây chính là các chỉ tiêu đóng vai trò quan trọng trong việc quyết định năng suất của lúa. Kết quả đƣợc thể hiện trong bảng 11: 61 Bảng 11: Năng suất và các yếu tố cấu thanh năng suất của các dòng/giống tham gia thí nghiệm tại Giao Thủy, Nam Định, năm 2012 TT Tên dòng/giống Số bông/khóm Tổng số hạt Số hạt chắc/bông Số hạt lép/bông 1 Dòng 1 7.67 171 146.33 24.67 2 Dòng 2 6.67 140.67 121 19.67 3 Dòng 3 6.67 121 104.67 16.33 4 Dòng 4 6.67 133 115.67 17.33 5 Dòng 5 8.33 168 149.33 18.67 6 Dòng 6 7 143.67 124.67 19 7 Dòng 7 7 158 140.33 17.67 8 Dòng 8 6.33 148 131.67 16.33 9 Dòng 9 9 134.67 117.67 17 10 Dòng 10 7.33 119 102 17 11 Dòng 11 7 131 113.33 17.67 12 Dòng 12 7.33 134 111.33 22.67 13 Dòng 13 8.67 155.33 128.66 26.67 14 Dòng 14 7.67 106.67 89.67 17 15 Dòng 16 9 124.67 104.34 20.33 16 Dòng 18 8.33 113 95 18 17 Dòng 20 7.67 113.67 97 16.67 18 Dòng 22 8 118 101.67 16.33 19 Dòng 24 7.33 126.67 104 22.67 20 Dòng 26 8.67 119 99.67 19.33 21 OM6976 5.67 173.33 146 27.33 CV 4,47 4,48 4,52 4,32 LSD(5%) 5,34 12,79 12,91 6,75 62 Từ bảng 11 cho thấy: Số bông/khóm là một trong 4 yếu tố quyết định cấu thành năng suất. Số bông/khóm tùy thuộc vào mật độ cấy, điều kiện đất đai, thời tiết, lƣợng phân bón, chế độ nƣớc… Do đó, yếu tố này có ảnh hƣởng thuận tới năng suất. Từ số liệu trong bảng trên cho thấy, số bông/khóm của các dòng/giống không có sự sai khác nào đáng kể. Số bông/khóm của các dòng đều cao hơn giống đối chứng. Nhóm dòng có số bông/khóm tƣơng đối giống với đối chứng là các dòng số 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8,10, 11, 12, 14, 20 . Số bông/khóm của các dòng này chỉ lớn hơn đối chứng từ 0.66 đến 2 bông/khóm. Nhóm dòng còn lại đƣợc đánh giá là cao hơn đối chứng từ 2.33 đến 3.33 bông/khóm. Các dòng có số 5, 9, 13, 16, 18, 22, 26 đều có số bông/khóm dao động từ 8 đến 9 bông/khóm trong cùng điều kiện thí nghiệm. Số lƣợng hạt/bông nhiều hay ít tùy thuộc vào số gié, số hoa phân hóa cũng nhƣ thoái hóa. Toàn bộ quá trình này nằm trong giai đoạn sinh trƣởng từ làm đòng đến trỗ bông. Số gié và số hoa phân hóa đƣợc quyết định từ thời kỳ sớm của giai đoạn làm đòng. Về chỉ tiêu tổng số hạt/bông: kết quả nghiên cứu đƣợc chia làm 3 nhóm. Nhóm dòng có tổng số hạt tƣơng đƣơng với đối chứng đƣợc ghi nhận là hai dòng số 1 và số 5. Hai dòng này có tổng số hạt/bông lần lƣợt là 171 và 168 hạt trong khi đối chứng là 173,33 hạt. Tiếp sau là nhóm dòng có tổng số hạt trung bình, số lƣợng hạt chênh lệch so với đối chứng từ 15 – 30 hạt. Nhóm này đƣợc ghi nhận với các dòng số 2, 4, 6, 7, 8, 9, 11, 12 và 13. Tổng số hạt chỉ từ 131 đến 158 hạt/bông. Cuối cùng là nhóm dòng có tổng số hạt thấp nhất, chỉ từ 106,67 đến 126,67 hạt/bông. Trong cùng điều kiện thực hiện thí nghiệm, nhƣng các dòng số 3, 10, 14, 16, 18, 20, 24, 26 trong nhóm này có tổng số hạt khá thấp. Từ bảng 11 ta thấy số hạt lép/bông của dòng số 1, 12, 13, và 24 tƣơng đƣơng với đối chứng. Số hạt lép dao động từ 22,67 hạt (dòng số 12, 24) đến 26,67 hạt (dòng số 13), trong khi đối chứng là 27,33 hạt. Các dòng còn lại trong thí nghiệm đều có số hạt lép ít hơn đối chứng . Trong đó các dòng số 3, 8, 20 và 22 có số hạt 63 lép thấp nhất, và đạt từ 16,33 đến 16,67 hạt lép/bông trong cùng điều kiện thí nghiệm. Qua đánh giá vụ Mùa, cho thấy các dòng tham gia nghiên cứu có kiểu hình khá gần với đối chứng trong cùng điều kiện thí nghiệm, chiếm 83% tổng số các dòng trong thí nghiệm, chứng tỏ các cá thể mang phần lớn nền di truyền giống với đối chứng, QTL/Saltol chuyển vào không làm thay đổi đặc điểm hình thái của OM6976 3.3.3. Đánh giá đặc tính nông sinh học, yếu tố cấu thành năng suất và khả năng chịu mặn của các dòng được tạo ra mang QTL/Saltol trong vụ xuân 2013 3.3.3.1. Đánh giá khả năng sinh trƣởng, phát triển của một số dòng chịu mặn tại Giao Thủy, Nam Định trong vụ Xuân năm 2013 Trong năm 2013, chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng sinh trƣởng, phát triển của các dòng chịu mặn đƣợc tuyển chọn từ thế hệ BC3F2 từ tổ hợp lai OM6976/FL478 trong điều kiện tự nhiên tại Giao Thủy, Nam Định ở cả vụ xuân và vụ mùa. Kết quả trình bày trong bảng 12: 64 Bảng 12: Một số đặc điểm nông học và hình thái của các dòng chịu mặn trong thí nghiệm tại Giao Thủy, Nam Định trong năm 2013 TT Tên TGST Chiều cao Chiều dài lá Độ thoát Chiều dài dòng/giống (ngày) cây (cm) đòng (cm) cổ bông (cm) bông (cm) 1 D1 125 98,67 29 4.33 23.33 2 D2 133 94,67 23 4.67 34 3 D3 130 93,33 24 4 22.67 4 D4 133 98 23.67 5.33 22 5 D5 134,33 101,67 23 4 23 6 D6 130,33 96,33 23.67 3 22.33 7 D7 135 100 25 4.33 23 8 D8 131,33 94 25 4.33 22.67 9 D9 135 96 23.67 3.67 23 10 D10 130 96 24.67 5.33 23.33 11 D11 131,33 99,33 22 3.33 27 12 D12 130 96 23.33 3.33 22 13 D13 133 95 22.33 3.33 21.33 14 D14 133 99 21 4.33 21.67 15 D15 131 96 23 3.33 23.33 16 D16 126 108 24 3.67 21.67 17 D17 130 99 23.67 4.67 26.33 18 D18 135 94 23.67 4.33 26.67 19 D19 134,67 92,33 25 5 22.67 20 D20 135 108 23.67 5 23.67 21 D21 130 94 21.67 4 21 65 TT Tên dòng/giống TGST (ngày) Chiều cao cây (cm) Chiều dài lá đòng (cm) Độ thoát cổ bông (cm) Chiều dài bông (cm) 22 D22 133 94,67 29 4 22.33 23 D23 130,67 99,33 20.33 3.33 21.33 24 D24 135 100,67 21.33 3 21.67 25 D25 135 94,33 20.33 3 22.33 26 D26 130 99 20.33 3.33 21.33 27 D27 130,33 99,33 21.33 3.33 22 28 OM6976 126,67 95,33 22.67 4 22.33 CV 4,36 4,38 5.36 4,34 5,05 LSD(5%) 5,01 6,08 6.86 6,98 6,98 Từ bảng 12 cho thấy: Về chỉ tiêu TGST của lúa ở vụ Xuân 2013 cho thấy hầu hết các dòng nghiên cứu đều có TGST dài ngày hơn đối chứng. Trong khi TGST ở giống đối chứng trung bình chỉ đạt 126,67 ngày thì các dòng tham gia nghiên cứu đều dài hơn từ 1 đến 9 ngày, số liệu sai khác này có ý nghĩa ở mức 5,01%. Về chỉ tiêu đánh giá chiều cao cây giữa các dòng tham gia nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ các dòng có chiều cao tƣơng tự nhƣ đối chứng chiếm 50%. Các dòng này có chiều cao dao động trong khoảng ± 4cm so với đối chứng (trung bình là 95,33cm). Các dòng còn lại có chiều cao cao hơn đối chứng trong cùng điều kiện thí nghiệm, đạt mức từ 100 cm đến 108 cm. Các dòng này đƣợc đánh số là 5, 7, 16, 20 và 24. Về chỉ tiêu đánh giá chiều dài lá đòng, kết quả nghiên cứu cho thấy có sự sai khác đáng kể giữa các dòng với nhau. Trong đó, hai dòng D1 và D22 có chiều dài cao nhất (đều đạt 29cm) và cao hơn rất nhiều so với đối chứng (đạt 22,67cm). Nhóm có chiều dài cao hơn đối chứng từ 1,33 đến 2,33 cm là: D3, D7, D8, D10, 66 D16, D19. Nhóm có chiều dài tƣơng đƣơng với đối chứng OM6976, chênh lệch trong khoảng ± 1 cm là các dòng có số thứ tự lần lƣợt là: D2, 4, 5, 6, 9, 11, 12, 13, 15, 17, 18, 20, 21, 24 và 27. Tuy trong cùng điều kiện thí nghiệm, nhƣng vẫn có một số dòng có chiều dài lá đòng khá thấp, chỉ đạt từ 20,33 đến 21 cm so với đối chứng. Nhóm này gồm các dòng: D14, 23, 25, 26. Từ việc theo dõi độ thoát cổ bông có thể phản ánh mức độ trỗ thoát của dòng/giống. Nếu dòng/giống không thoát sẽ có một số hạt nằm ở bẹ lá đòng, các hạt này thƣờng hay bị bệnh hoặc bị lép lửng, gây ảnh hƣởng đến năng suất lúa. Dựa vào kết quả đánh giá, chúng tôi nhận thấy không có sự sai khác giữa các dòng về chỉ tiêu độ thoát cổ bông. Chiều dài độ thoát cổ bông chỉ chênh lệch trong khoảng ± 1cm so với đối chứng. Có 4 dòng có chiều dài cổ bông là từ 5 đến 5,33 cm và cao hơn đối chứng 1 cm là D4, D10, D19 và D20. Hầu hết các dòng còn lại đều có chiều dài độ thoát cổ bông tƣơng tự với đối chứng. Điều này là hoàn toàn phù hợp, do độ thoát cổ bông quá dài, có thể gây gãy bông. Tuy trong cùng điều kiện thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy có sự sai khác đáng kể về mặt phân tích thống kê cho chỉ tiêu chiều dài bông giữa các dòng chịu mặn đƣợc tuyển chọn từ thế hệ BC3F2. Cụ thể, nhóm có chiều dài bông lớn nhất, sai khác rất nhiều so với đối chứng là các dòng số D2, D11, D17, D18. Các dòng này có chiều dài bông trong khoảng từ 26,33 đến 34 cm. Đặc biệt ở dòng D2, chiều dài bông đạt cao nhất trong số các dòng nghiên cứu (đạt 34cm) cao hơn hẳn so với giống đối chứng (đạt 22,3cm). Các dòng còn lại chênh lệch chiều dài bông không đáng kể, mức chênh lệch chỉ dao động trong khoảng ±1,33cm. Tỷ lệ đƣợc phân chia đều nhau trong tổng số các dòng thuộc nhóm này, tức là có khoảng 50% trong tổng số các dòng trong nhóm có chiều dài bông thấp hơn đối chứng từ 0,67 đến 1cm. Nhìn chung, các dòng trong nghiên cứu có bông lúa dài, là yếu tố quan trọng có thể giúp tăng năng suất lúa. Qua đánh giá các chỉ tiêu sinh học các dòng tham gia nghiên cứu nhận thấy, hầu hết các dòng có kiểu hình tƣơng tự nhƣ đối chứng, tuy chỉ có một số dòng chiếm 10% tổng số các dòng trong thí nghiệm có chiều dài lá đòng thấp hơn 67 OM6976. Nhìn chung các dòng OM6976-Saltol trong vụ Xuân không chênh lệch nhiều so với đối chứng và có thể chấp nhận đƣợc trong điều kiện thời tiết miền Bắc 3.3.3.2. Đánh giá các yếu tố cấu thành năng suất của một số dòng chịu mặn tại Giao Thủy, Nam Định trong vụ Xuân năm 2013 Chọn giống có năng suất cao và ổn định là mục tiêu mà các nhà chọn giống phải thực hiện vì đó cũng chính là đòi hỏi cần thiết của sản xuất. Một giống mới đƣa vào thử nghiệm, đƣợc mở rộng sản xuất ở quy mô lớn, nhanh hay chậm, tồn tại trong sản xuất trong thời gian dài hay không là do năng suất quyết định. Giống có năng suất cao, phụ thuộc vào nhiều yếu tố, ngoài các điều kiện về ngoại cảnh nhƣ khí hậu, thời tiết, đất đai, nƣớc tƣới, sâu bệnh, các biện pháp kỹ thuật… còn phụ thuộc vào bản chất di truyền của giống. Năng suất của cây trồng là tính trạng tổng hợp chịu ảnh hƣởng của các yếu tố cấu thành năng suất nhƣ: số bông/khóm, số hạt chắc/bông, khối lƣợng 1000 hạt. Do đó, phải nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật phù hợp cho các yếu tố cấu thành nên năng suất có thể phát huy tiềm năng. Song song với việc đánh giá các đặc điểm nông sinh học về sinh trƣởng và hình thái, chúng tôi tiến hành đánh giá các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng chịu mặn tuyển chọn từ thế hệ BC3F2 từ tổ hợp lai OM6976/FL478. Các chỉ tiêu theo dõi gồm: số bông/khóm, số hạt/bông, số hạt chắc/bông, số hạt lép/bông. Đây chính là các chỉ tiêu đóng vai trò quan trọng trong việc quyết định năng suất của lúa. Kết quả đƣợc thể hiện trong bảng 13: 68 Bảng 13: Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng chịu mặn trong thí nghiệm tại Giao Thủy, Nam Định năm 2013 TT Tên dòng/giống Số bông/khóm Số gié/bông Tổng số hạt/bông Số hạt chắc/bông Số hạt lép/bông P1000 hạt (g) Bông/m2 NSLT tấn/ha NSTT tấn/ha 1 D1 5.67 10.33 190.67 156 34.67 24.42 198.45 7.56 7.33 2 D2 5 10 180.33 159.33 21 23.30 175.00 6.50 5.67 3 D3 5.33 10.33 186 160 26 23.55 186.55 7.03 6.67 4 D4 5.33 9.67 171 157.33 13.67 24.37 186.55 7.15 7.00 5 D5 4.33 10 177.67 163.33 14.34 23.69 151.55 5.86 6.67 6 D6 5.33 9.67 155.67 147.33 8.34 23.40 186.55 6.43 6.67 7 D7 5 10 192.67 174.33 18.34 23.62 175.00 7.21 7.00 8 D8 4.67 9.67 191 174.67 16.33 24.01 163.45 6.85 6.33 9 D9 5 9.33 158.67 148.67 10 23.21 175.00 6.04 6.00 10 D10 4 10 149 142.33 6.67 26.59 140.00 5.30 6.33 11 D11 5 9.33 162.67 145.33 17.34 24.71 175.00 6.28 6.53 12 D12 4.67 9.67 174.33 160.67 13.66 23.83 163.45 6.26 6.67 13 D13 4.33 10 161 145.33 15.67 23.88 151.55 5.26 6.67 14 D14 3.67 10 177.33 164.67 12.66 27.04 128.45 5.72 6.67 15 D15 4.67 9.33 171.67 162.67 9 23.95 163.45 6.37 6.67 69 TT Tên dòng/giống Số bông/khóm Số gié/bông Tổng số hạt/bông Số hạt chắc/bông Số hạt lép/bông P1000 hạt (g) Bông/m2 NSLT tấn/ha NSTT tấn/ha 16 D16 6.33 10 180.33 163.33 17 24.23 221.55 8.77 7.67 17 D17 5.33 10 177 160.67 16.33 25.01 186.55 7.50 6.67 18 D18 5 9 163.67 151.33 12.34 23.41 175.00 6.20 7.00 19 D19 6.33 10 135.67 119.67 16 24.01 163.45 4.70 6.67 20 D20 4 10.67 148 136.67 11.33 22.00 140.00 4.21 5.33 21 D21 4.67 9.67 167 156 11 23.50 163.45 5.99 6.00 22 D22 4.67 10.33 172 155.33 16.67 23.71 163.45 6.02 5.33 23 D23 4.33 10 171.33 156 15.33 23.62 151.55 5.58 5.33 24 D24 5 10 163.33 147.33 16 22.16 175.00 5.71 5.67 25 D25 4 10 150.67 138.33 12.34 24.11 140.00 4.67 5.67 26 D26 4.33 10 158.67 139 19.67 24.18 151.55 5.09 6.33 27 D27 4.67 10.33 176.67 153.33 23.34 22.34 163.45 5.60 5.33 28 OM6976 4.33 10.67 190 166 24 25.38 144.20 6.08 7.00 CV 4,37 5,3 4,31 4,68 5,65 4,38 7,8 3,8 2,8 LSD(5%) 5,04 6,85 12,21 13,27 6,67 2,09 12,9 5,9 3,9 70 Từ bảng 13 cho thấy: Số bông/khóm là một trong bốn yếu tố có tính chất quyết định và sớm nhất trong việc cấu thành năng suất lúa. Từ kết quả bảng đánh giá ở vụ Xuân 2013 tại Giao Thủy, Nam Định, tỷ lệ số bông/khóm giữa các dòng dao động trong khoảng 4- 6 bông/khóm. Dòng có tỷ lệ bông/khóm cao nhất là D16 và D19 (đạt 6.33cm) cao hơn đối chứng 2cm. Hầu hết các dòng còn lại đều có tỷ lệ số bông/khóm tƣơng đƣơng với đối chứng. Mức dao động trong khoảng ±1 và số liệu này sai khác là không đáng kể. Trong cùng điều kiện thí nghiệm, nhƣng mức độ sai khác có ý nghĩa giữa các dòng đạt 5,04% so với đối chứng, điều này chứng tỏ các dòng đƣợc tuyển chọn không sai khác nhiều so với đối chứng ban đầu. Số lƣợng hạt/bông nhiều hay ít tùy thuộc vào số gié, số hoa phân hóa cũng nhƣ thoái hóa. Toàn bộ quá trình này nằm trong giai đoạn sinh trƣởng từ làm đòng đến trỗ bông. Số gié và số hoa phân hóa đƣợc quyết định từ thời kỳ sớm của giai đoạn làm đòng. Từ bảng trên, số gié/bông của OM6976 đạt trung bình là 10,67. Trong số các dòng nghiên cứu chỉ có D1, D3, D20, D22, D27 là có số gié/bông gần tƣơng tự với đối chứng, đạt trung bình là 10,33. Các dòng còn lại đều ít hơn so với đối chứng, dao động trong khoảng từ 9 đến 10 trong cùng điều kiện theo dõi đánh giá. Từ bảng 13 chúng tôi chia làm 3 nhóm. Nhóm dòng có tổng số hạt tƣơng đƣơng với đối chứng đƣợc ghi nhận là các dòng D1, D3, D7, D8. Trong đó, 3 dòng D1, D7, D8 thậm chí lớn hơn đối chứng 3 hạt/bông. Các dòng thuộc nhóm này đạt từ 186 đến 192,67 hạt/bông trong khi ở giống đối chứng, trung bình đạt 190,67 hạt/bông. Nhóm dòng có tổng số hạt trung bình, số lƣợng hạt chênh lệch so với đối chứng từ 10 – 30 hạt/bông. Nhóm này đƣợc ghi nhận với các dòng số D2, D4, D5, D11, D12, D13, D14, D15, D18, D21, D22, D23, D24, D27. Các dòng còn lại có số lƣợng hạt/bông khá thấp, chỉ từ 135,67 đến 158,67 hạt/bông trong cùng điều kiện tác động. Tỷ lệ hạt chắc/bông là một yếu tố quan trọng, phụ thuộc nhiều vào bản chất di truyền của dòng bố mẹ cũng nhƣ điều kiện canh tác. Vụ Xuân 2013 thời tiết khá thuận lợi cho việc làm đòng của lúa. Nhờ điều kiện thời tiết thuận lợi, lúa có khả 71 năng quang hợp, tích lũy và vận chuyển các chất tƣơng đối mạnh, cấu tạo mô cơ giới vững chắc, không bị đổ gãy sớm, nên thời gian trỗ và tạo hạt khá thuận lợi, dinh dƣỡng đầy đủ, nên nhìn chung, tỷ lệ hạt chắc/bông khá cao. Từ kết quả thu đƣợc có sự sai khác đáng kể giữa các dòng tuyển chọn và đối chứng. Trong khi đối chứng OM6976 thu đƣợc 166 hạt/bông thì các dòng tuyển chọn phân chia làm 3 nhóm theo tổng số hạt. Nhóm dòng có tỷ lệ hạt chắc/bông tƣơng đƣơng với đối chứng đƣợc ghi nhận từ 151,33 đến 165 hạt/bông. Các dòng thuộc nhóm này gồm có: D1, D2, D3, D4, D5, D12, D14, D15, D16, D17, D18, D21, D22, D23, D27. Nhóm có tỷ lệ hạt chắc cao hơn so với đối chứng là D7 và D8. Hai dòng này có số hạt chắc/bông nhiều hơn so với đối chứng là 8 hạt/bông. Các dòng còn lại có cho số hạt chắc/bông thấp nhất, dao động trong khoảng từ 120 đến 148,67 hạt/bông trong cùng điều kiện theo dõi đánh giá. Bên cạnh việc đánh giá các yếu tố cấu thành năng suất, chúng tôi nhận thấy tỷ lệ hạt lép của các dòng tuyển chọn đƣợc nghiên cứu thấp hơn so với đối chứng OM6976. Hai dòng là D1 và D3 có tỷ lệ hạt lép cao hơn, tuy nhiên số hạt lép không chênh lệch nhiều so với đối chứng, số hạt chênh lệch từ 2 -10 hạt lép/bông. Trong khi đó, ở cùng điều kiện thí nghiệm, một số dòng có tỷ lệ hạt lép rất thấp, gồm có D6, D9, D10, D15. Các dòng này chỉ có từ 6,67 đến 10 hạt lép/bông. Khối lƣợng 1000 hạt phụ thuộc vào bản chất di truyền của mỗi giống là chủ yếu và tƣơng đối ít biến động. khối lƣợng 1000 hạt của giống OM6976 là 25.38gram. Các dòng OM6976-Saltol còn lại dao động trong khoảng 22,00 gram (dòng 20) đến 27.04 gram (dòng 14). Song song với việc chuyển thành công QTL/Saltol vào giống OM6976 một dòng OM6976-Saltol có P1000 lớn hơn so với giống gốc OM6976 nhƣ dòng số 10 (26.59 g) và dòng 14 (27.04 g). Năng suất lý thuyết (NSLT) của giống OM6976 là 6.08 tấn/ha. Các dòng OM6976-Saltol còn lại dao động từ 4.21 Tấn/ha (dòng 20) đến 8.77 Tấn/ha (dòng 16).Trong đó có nhiều OM6976-Saltol có NSLT cao hơn giống OM6976. Năng suất thực thu (NSTT) của giống OM6976 là 7.00 tấn/ha. Các dòng OM6976-Saltol còn lại dao động trong khoảng từ 5.33 Tấn/ha đến 7.67 Tấn/ha. Có 72 2 dòng có năng suất thực thu cao hơn với giống đối chứng là: dòng số 16 là 7.67 Tấn/ha và dòng 1 là 7.33 Tấn/ha. Điều này chứng tỏ, việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống đã có kết quả khả quan, năng suất của các dòng đƣợc đánh giá khá tốt. Sau 2 vụ đánh giá các đặc điểm sinh trƣởng, phát triển, và các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng đƣợc tạo từ thế hệ BC3F2 bƣớc đầu cho thấy các dòng đều sinh trƣởng và phát triển tốt, một số dòng đƣợc đánh số D1, D4, D7, D8, D16 và D18 có tiềm năng năng suất cao hơn các dòng khác và đối chứng trong cùng điều kiện thí nghiệm. Các dòng này sẽ tiếp tục đƣợc lựa chọn để phục vụ trong chƣơng trình chọn giống chịu mặn tiếp theo. 73 KẾT LUẬN 1. Kết luận 1.1. Đã xác định vật liệu bố mẹ trong nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn là OM6976 và FL478. Trong đó, giống FL478 đƣợc dùng làm giống cho QTL/Salol, có đặc điểm nông sinh học và khả năng thích ứng tốt trong điều kiện vùng có khả năng chịu mặn (điểm 3). Giống lúa OM6976 làm giống nhận gen. 1.2. Sử dụng 2 chỉ thị phân tử RM493 và RM3412b trong nghiên cứu đã xác định đƣợc 2 cá thể có kiểu gen đồng hợp tử trong quần thể chọn tạo giống BC3F2. 1.3. Kết quả thử mặn trong điều kiện nhân tạo cho thấy: Các cá thể BC3F2 của tổ hợp OM6976/FL478 có khả năng chịu mặn (điểm 3) ở mức tƣơng đƣơng với giống Pokkali hoặc FL478 trong cùng điều kiện thí nghiệm. Qua việc đánh giá khả năng chịu mặn trong điều kiện nhân tạo của các dòng đƣợc tuyển chọn từ quần thể BC3F2 bằng việc kết hợp sử dụng chỉ thị phân tử và chọn lọc truyền thống, chúng tôi nhận thấy các dòng OM6976/Saltol có khả năng chịu mặn tại điểm 3 tƣơng đƣơng với FL478. 1.4. Thí nghiệm đánh giá khả năng sinh trƣởng và phát triển của các cá thể đƣợc tạo ra cho thấy hầu hết đều có đặc điểm nông sinh học tƣơng tự giống OM6976 trong cùng điều kiện thí nghiệm, đặc biệt các dòng D1, D4, D7, D8, D16 và D18 có tiềm năng năng suất vƣợt trội so với giống đối chứng OM6976. 2. Kiến nghị 2.1. Tiếp tục trồng thử nghiệm và đánh giá khả năng thích ứng của các dòng D1, D4, D7, D8, D16 và D18 đƣợc chọn tạo với nhiều mùa vụ ở các vùng sinh thái khác nhau để đánh giá khả năng thích nghi ứng phó với điều kiện BĐKH ở các tỉnh ven biển ĐBSH. 2.2. Nghiên cứu một cách có hệ thống về các đặc điểm sinh lý, sinh hóa cũng nhƣ đánh giá khả năng chịu mặn của các dòng/giống đƣợc tạo ra nhằm phát triển mở rộng trong sản xuất. 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Bộ Nông Nghiệp và Phát triển Nông thôn (2009), Quy hoạch sử dụng đất lúa cho từng vùng trên cả nước. 2. Bùi Chí Bửu - Nguyễn Thị Lang (2004), Di truyền phân tử, Nhà xuất bản Nông nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh. 3. Bùi Chí Bửu - Nguyễn Thị Lang, Cơ sở di truyền tính chống chịu đối với thiệt hại do môi trường của cây lúa. 4. Đinh Văn Lữ (1978), Giáo trình cây lúa, H.Nông nghiệp. 5. Kịch bản biến đổi khí hậu, nƣớc biển dâng cho Việt Nam (2012), Nhà xuất bản Tài nguyên – Môi trƣờng và Bản đồ Việt Nam. 6. Kịch bản biến đổi khí hậu, nƣớc biển dâng cho Việt Nam(2009), Bộ Tài Nguyên và Môi trƣờng. 7. Lã Tuấn Nghĩa, Lê Thị Thu Trang (2011), Nghiên cứu sự thay đổi hàm lượng chlorophyll, carotenoid và xác định alen kháng mặn ở một số giống lúa trong điều kiện mặn, Tạp chí CNSH. 8. Lã Tuấn Nghĩa, Vũ Đức Quang, Trần Duy Quý (2004), Cơ sở lý thuyết và ứng dụng công nghệ gen trong chọn tạo giống cây trồng, NXB Nông nghiệp. 9. Lê Thị Thu Trang (2011), Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen liên quan đến tính chịu mặn ở lúa Việt Nam, Tạp chí Khoa học công nghệ. 10. Ngô Đính Thức (2006), “Nghiên cứu phát triển giống lúa chống chịu mặn cho vùng đồng bằng song Cửu Long,” luận án tiến sĩ nông nghiệp, trƣờng Đại học Nông lâm Tp.HCM. 11. Nguyễn Thị Lang (2002), Những phương pháp cơ bản trong công nghệ sinh học, NXB Nông nghiệp, TP.HCM. 12. Nguyễn Thị Lang, Hoàng Thị Ngọc Minh, Viện nghiên cứu Lúa ĐBSCL (2006), Ứng dụng marker phân tử cho gen chống chịu mặn trên bộ giống lúa 75 cải tiến. 13. Nguyễn Thị Ngọc Hoàn, Nguyễn Phƣơng Dung, Nguyễn Minh Phƣợng (2007), tổng luận: “Tác động của biến đổi khí hậu toàn cầu và sự dâng cao nước biển”, Trung tâm thông tin KH&CN Quốc gia. 14. Phạm Chí Thành (1986), Phương pháp thí nghiệm đồng ruộng, NXB Nông nghiệp Hà Nội. 15. Tăng Thị Hạnh, Dƣơng Thị Hồng Mai, Trần Văn Luyện, Phạm Văn Cƣờng, Lê Khả Tƣờng, Phạm Thị Nga (2011), Nghiên cứu khả năng chịu mặn của một số nguồn gen lúa lưu giữ tại ngân hàng gen cây trồng quốc gia. 16. Trần Văn Đạt (2005), Sản xuất lúa gạo thế giới: Hiện trạng và khuynh hướng phát triển trong thế kỷ 21. NXB Nông nghiệp, TP.HCM. 17. Võ Tòng Xuân (1984), Đất và cây lúa, H.Giáo dục. 18. Vƣơng Đình Tuấn, Fukutu Y, Yano M và Ban T (2000), “Lập bản đồ xác định vị trí của gen di truyền số lượng ảnh hưởng đến tính chống chịu mặn của cây lúa (Oryza satica) Omon Rice”, 8, 27 – 35. Tài liệu tiếng Anh 19 Abrol IP. (1986), “Salt-affected soils: problems and prospects in developing countries”. In: Global Aspects of Food production. Oxford, 1986, pp. 283-305 20 Akbar M, GS Khush, D HilleRisLambers. (1985), “Genetics of salt tolerance”. In: Rice Genetics, IRRI Philippines, pp. 399-409. 21 Akbar M, IE Gunawardena, FN Ponnamperuma (1986), “Breeding for soil stress”, page 263 – 272 in Progress in rainfed lowland rice. International Rice Research Institute, Los Banos, Philippines. 22 Akita S. (1986), Physiological bases of differential response to salinity in rice cultivars, Paper presented in Project Design Workshop for Developing a Collaborative Research Program for the Improvement of Rice Yields in Problem Soils. IRRI, Los Banos, Philippines 76 23 B. C. Y. Collard and D. J. Mackill, “Marker-assisted selection: an approach for precision plant breeding in the twenty-first century,” Philosophical Transactions of the Royal Society B, vol. 363, no. 1491, pp. 557–572, 2008. 24 Baloch, A.W, A.M. Soomro, M.A Javed, H.R Bughio and S.M Alam et al. (2003), “Induction of salt tolerance in rice through mutation breeding”. Asian J., Plant Sci., 2, 273 – 276 25 Bhuiyan, M.A.R (2005), “Efficiency in evaluating salt tolerance in rice using phenotypic and marker assisted selection”, M.Sc, Thesis. Bangladesh Agricultural University, Mymensingh, Bangladesh, 96 26 Bonilla P., Dvorak J., Mackill D.J., Deal K. and Gregorio G. (2002), “RFLP and SSLP mapping of salinity tolerance genes in chromosome 1 of rice (Ozyza sativa L.) using recombinant inbred lines”, Philipp. Agric. Sci, 85, 64-76 27 Boyer JS (1982), “Plant productivity and environment”, Science 218:443-448 28 C. N. Neeraja, R. Maghirang-Rodriguez, A. Pamplona et al., “A marker-assisted backcross approach for developing submergence-tolerant rice cultivars,” Theoretical and Applied Genetics, vol. 115, no. 6, pp. 767–776, 2007 29 Causse MA, Fulton TM, Cho Y G, Ahn SN, Chunwongse J, Wu K, Xiao J, Yu Z, Ronald PC, Harring ton SE, Second G, McCouch SR, Tanksley S. (1994), “Saturated molecular map of rice genome based on an interspecific backcross population” Genetics 138(4): 1251-1271. 30 Clarkson DT, JB Hanson (1980), “The mineral nutrition of higher plant”, Ann Rev Plant Physiol 31:239 31 D.J Mackill, “Molecular markers and marker – assisted selection in rice”. In VArshney, R.K., Tuberosa, R. (Eds.), Genomic Assisted Crop Improvement, vol.2, Genomics Applications in Crops. Springer, New York, 2007, 147 32 Devitt D, WM Jarreli, KL Stevens (1981), “Sodium-potassium ratios in soil solution and plant response under saline conditions”, Soil Sci Soc Amer J 45:8086 77 33 E. Francia, G.T., C. Crosatti, D.Barabschi, D. Bulgarelli, E. Dall, Aglio and G. Vale (2005), “Marker assisted selection in crop plants”, Plant cell, Tissue and Organ Culture 82, 317 -342 34 Greenway and Munns (1980), Mechanisms of salt tolerance in nonhalophytes, Department of Agronomy, University of Western Australia. 35 Gregorio G.B, Senadhira D., Mendoza R.D, NL Manigbas, JP Rosxas, CQ Guerta (2002), “Progress in breeding for salinity tolerance and associated abiotic stresses in rice”, Field crio Research. Elsevier 36 Gregrio GB (1997), “Tagging salinity tolerance gene in rice (Oryza sativa) using amplified fragment length polymorphism (AFLP)”, PhD dissertation, University of the Phillipines Los Banos. 37 Gregrio GB and D Senadhira. (1993), “Genetics analysis of salinity tolerance in rice”, Theor. Appl. Gen. 86: 333-338. 38 Hospital F., C.C.a.M.P (1992), “Using markers in gene introgression breeding programs”, Genetics 132, 1119 – 1210. 39 Ikehashi H, FN Ponnaperuma (1978), “Varietal tolerance of rice to adverse soils”, In: Soils and Rice/ IRRI, Philippiens, pp. 801 – 803 40 Islam MM (2004), “Mapping salinity tolerance gene in rice (Oryza sativa) at reproduction stage”. PhD dissertation, University of the Phillipines Los Banos. 41 Iwaki S, K Ota, T Ogo. (1953), “Studies on the salt injury in rice plant. IV. The effects on growth, heading and ripening of rice plant under varying concentration of sodium chloride”, Proc Crop Sci Jpn 22:13-14 42 J.U. Jeung, H.G. Hwang, H.P Moon, K.K Jene (2005), “Fingerprinting temperate Japonica and tropical Indica rice genotypes by comparative analysis of DNA markers” Euphytica, 146 – 239 43 K.Zheng, P.K. Subudhi, J. Domingo, G. Magpantay, N.Huang (1995), “Rapid NA isolation fof marker assisted selection in rice breeding”, Rice Genetics News letter, 12, 255 78 44 Kim, D. M., Ju, H. G., Kwon, T. R., Oh, C. S., and Ahn, S. N. (2009), “Mapping QTLs for salt tolerance in an introgression line population between japonica cultivars in rice” J. Crop Sci. Biotech. 12, 121 – 128. 45 Knapp SJ and WC Bridges (1990), “Using molecular markers to estimate quantitative trait locus parameters powers and genetic variances for unreplicated progeny”, Genetics 126, 769 – 777 46 Korkor SA, and RM Abdel – Aal. (1974), “Effect of total salinity and type of salts on rice crop” Agric Res Rev 52 (5): 73-78 47 Lang NT, S Yanagihara, BC Buu (2001), “A microsatellite marker for a gene conferring salt tolerance on rice at the vegetative and reproductive stages”, SABRAO 33 (1), 1 – 10. 48 M.J Thomson, M. Ocampo, J. Egdane, M.A Rahman, A.G Saiise, D.L Adorada, E.T. Raiz (2010), “Characterrizing the Saltol quantitative trait locus for salinity tolerance in rice”, Rice 3, 148. 49 Maas EV, GJ Hoffman (1977), “Crop salt tolerance current assessment”, ASCE J Irrig and Drainage Div 103:115-134 50 Maas EV, GJ Hoffman. (1977), Crop salt tolerance current assessment. ASCE J Irrig and Drainage Div 103: 115 -134 51 Mishra B, M Akbar, DV Seshu, D Senadhira (1996), “Genetics of salinity tolerance and ion uptake in rice”, IRRI 21: 38-39 52 Moeljopawiro S, H Ikehashi. (1981), “Inheritance of salt tolerance in rice”. Euphytica 30: 291- 300. 53 Munns R (2002), “Comparative physiology of salt and water stress”, Plant Cell and Envriron 25, 239 – 250. 54 Murty KS, KV Janardhan (1971), “Physiological consideration for selection and breeding of varieties for saline and alkaline tracts”, Oryza 8 [Supp. 2]: 85-100 55 Nagamiya K, Motohashi T, Nakao K, Prodhan SH, Hattori E, Hirose S, Ozawa K, Ohkawa Y, Takabe T (2007), “Enhancement of salt tolerance in transgenic 79 rice expressing an Escherichia coli catalase gene”, Kat E. Plant Biotech. Rep.1, 49-55 56 Negrao et al (2012), “Recent updates on salinity stress in rice: From physiological to molecular responses”, Critical Reviews in Plant Science, 30, 329 – 377. 57 Niones JM (2004), “Fine mapping of the salinity tolerance gene on chromosome 1 of rice (Oryza sativa L.) using near-isogenic lines”, MS dissertation. Laguna: University of the Philippines Los Baños. 58 Ota K, T Yasue. (1958), “Studies on salt injury in crops. XII. The effect of sodium chloride solution on the germination capacity of paddy seed”, Proc Crop Sci Soc Jpn 27(2):223-225 59 Pearson GA, SD Ayers, DL Eberhard (1966), “Relative salt tolerance of rice during germination and early seedling development”, Soil Sci 102:151-156 60 Ponnamperuma, F. N. (1984), “Role of cultivar tolerance in increasing rice production on saline lands. Strategies for crop improvement”, John Wiley and sons, New York, 443p. 61 Roberto Tuberosa and Silvio Salvi (2007), “Dissecting QTLs for Tolerance to Drought and Salinity”, Advances in Molecular Breeding Toward Drought and Salt tolerant Crops, 381 – 412 62 Shimose N. (1963), “Physiology of salt injury in crops. I. Effect of iso-osmotic pressure due to sodium chloride and sodium sulfateon the growth and absorption of mineral element by rice plants”, Jpn Soil Sci. Tokyo 34:107-111 63 Tagawa T, N Ishizaki. (1963), “Physiological studies on the tolerance of rice plants to salinity”, Proc Crop Sci Soc Japan 31(3):249-252 64 Teng S. (1994), “Gene tagging for salt tolerance in rice (Oryza sativa L.)”, The University of the Phillipines, Los Banos, Lagnuna, Phillipine, 118. 65 Xu D, X Duan, B Wang, B Hong, THD Ho, R Wu. (1996), “Expression of a late embryogenesis abundant protein gene, HVA1, from barley confers tolerance to water deficit and salt stress in transgenic rice”, Plant Physiol 110:249-257 80 66 Yoshida, S., D.A. Forno, J.H. Cock and K.A. Gomez (1976), “Laboratory Manual for Physiological Studies of Rice”, International Rice Research Insitute (IRRI), Los Banos, Laguna, Phillipines, 61 – 66. 67 Z.Ren, J. Gao, L. Li, X. Cai, W. Huang, D. Chao, M. Zhu, Z. Wang, S. Luan, H. Lin (2005), “A rice quantitative trait locus for salt tolerance encodes a sodium transporter”, Nature Genetics 37, 1141. 68 Zeng L et al (2004), “Genetic diversity analyzed by microsatellite among rice (Oryza sativa L. ) genotypes with different adaptations to saline soils”, Plant Sci, 166 (5), 1275 – 1285 69 Zhou PH, Tan YF, He YQ, Xu CG Zhang Q (2003), “Simuntaneous improvement for four quanlity traits of Zhengshan 97, an elite parent of hybrid rice, by molecular assisted selection”, Theo, Appl Genet 106, 326 – 331. Internet 70. http://gramene.org 71. http://agroviet.gov.vn 72. http://nature.com 73. http://ricegenetics.com 74. http://gso.gov.vn 75. http://fao.org.vn 76. http://fao.org 81 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Danh sách hóa chất và thành phần các dung dịch Bảng 17: Hóa chất và thành phần các dung dịch Thành phần Thể tích Đơn vị tính dH2O 70 Ml Tris HCl 1M, pH = 8 10 Ml NaCl 5M 10 Ml EDTA 0,5M, pH = 8 10 Ml β- Metacaptoethanol 7 TT 1 2 3 Đệm chiết EB Đệm CTAB CTAB 10 G Tris HCl 1M, pH = 7,5 100 Ml NaCl 5M 200 Ml EDTA 0,5M, pH = 8 50 Ml dH2O 150 Ml 1000 Ml 20 µl 98,8 Ml Đệm TE (Tris EDTA, 10:0,1) Tris HCl 1M, pH = 7,5 EDTA 0,5M, pH = 8 dH2O 4 Dung dịch SDS (10%) Ethanol 96% Ethanol 70% Isopropanol alcohol Chloroform: isomyl alcohol (24:1) RNase (10mg/ml) 5 Gel agarose 0,8% Agarose 0,8 G TBE 100 Ml Ure 50,4 Gram Bis Acrylamide (38L2), 45% 13,5 Ml TBE 10X 12 Ml Thêm nƣớc cất khử trùng đến thể tích 120 Ml Acrylamide 55 Ml APS10% 400 µl TEMED 60 µl Acid acetic 100 Ml H2 O 900 Ml 1 gói Silvernitrate 1,5 G H2 O 1,5 L Ethydium Bromide 10mg/ml 4 5 6 Dung dịch acrylamide Dung dịch đổ gel acrylamide Dung dịch cố định, dừng phản ứng (Fix Solution) 7 Dung dịch nhuộm (Staining Solution) Formaldehyd 8 2250 Ml 60 G 2000 Ml 3 Ml 400 µl 5,5 µl Buffer 1 µl dNTPs 1 µl MgCl2 0,53 µl Primer 1 µl Taq Polymerase 0,03 µl DNA 1,2 µl Dung dịch hiện (Developing Solution) Sodium Carbonate Nƣớc cất (để lạnh 40C) Formaldehyd (trƣớc khi sử dụng mới cho vào) Sodium Thiosulfate (trƣớc khi sử dụng mới cho vào) 9 Thành phần phản ứng PCR H2O (nƣớc cất 2 lần) Bảng 18: Chuẩn bị dung dịch mẹ của môi trƣờng Yoshida (Yoshida và ctv, 1976) TT Nguyên tố Tên hóa chất Công thức hóa Lƣợng cần học (g/2L) Đa lƣợng 1 N Ammonium nitrate NH4NO3 91,4 2 P Sodium phosphate NaH2PO4.H2O 35.6 3 K Potassium sulphate K2SO4 71,39 4 Ca Calcium chloride, CaCl2.2H2O 117,35 MgSO4.7H2O 324 MnCl3.4H2O 1,5 (NH4- 0,074 dihydrate 5 Mg Magnesium sulphate, 7 hydrate Vi lƣợng 1 Mn Manganous chloride, 4 -hydrate 2 Mo Ammonium molybdate, 4- hydrate 3 Zn Zinc sulphate, 7- )6Mo7O24.4H2O ZnSO4.7H2O 0,035 H3BO3 0,934 CuSO4.5H2O 0,031 FeCl3.6H2O 7,7 C6H8O7.H2O 11,9 H2SO4 50ml hydrate 4 B Boric acid 5 Cu Cupric sulphate, 5hydrate 6 Fe Ferric chloride, 6hydrate 7 Citric acid, monohydrate 8 Sulphuric acid Bảng 19: Chuẩn bị môi trƣờng dinh dƣỡng Yoshida cho thanh lọc mặn (Yoshida và ctv, 1976) TT Nguyên tố Công thức hóa học mLdd stock/100L Lƣợng có trong môi trƣờng dinh môi trƣờng (6L) dƣỡng Đa lƣợng 1 N NH4NO3 125 7,5 2 P NaH2PO4.H2O 125 7,5 3 K K2SO4 125 7,5 4 Ca CaCl2.2H2O 125 7,5 5 Mg MgSO4.7H2O 125 7,5 Vi lƣợng 1 Mn MnCl3.4H2O 125 7,5 2 Mo (NH4)6Mo7O24.4H2O 125 7,5 3 Zn ZnSO4.7H2O 125 7,5 4 B H3BO3 125 7,5 5 Cu CuSO4.5H2O 125 7,5 6 Fe FeCl3.6H2O 125 7,5 7 C6H8O7.H2O 125 7,5 8 H2SO4 100 ml Chú ý: Dung dịch dùng để thanh lọc mặn đƣợc điều chỉnh pH = 5 hàng ngày, với 1M NaOH/HCl Phụ lục 2: Phân tích chỉ tiêu hình thái và các chỉ tiêu cấu thành năng suất các dòng chịu mặn trong vụ mùa 2012 tại Giao Thủy, Nam Định BALANCED ANOVA FOR VARIATE TGST FILE MUA12 25/12/13 15: 1 ------------------------------------------------------------------ :PAGE Phan tich so lieu vu Mua 2012 1 VARIATE V003 TGST LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 TENDONG$ 20 688.190 34.4095 35.54 0.000 2 * RESIDUAL 42 40.6667 .968255 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 62 728.857 11.7558 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE CAOCAY FILE MUA12 25/12/13 15: 1 ------------------------------------------------------------------ :PAGE Phan tich so lieu vu Mua 2012 2 VARIATE V004 CAOCAY LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 TENDONG$ 20 861.714 43.0857 13.71 0.000 2 * RESIDUAL 42 132.000 3.14286 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 62 993.714 16.0276 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE SB/KHOM FILE MUA12 25/12/13 15: 1 ------------------------------------------------------------------ :PAGE Phan tich so lieu vu Mua 2012 3 VARIATE V005 SB/KHOM LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 TENDONG$ 20 49.7143 2.48571 3.73 0.000 2 * RESIDUAL 42 28.0000 .666667 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 62 77.7143 1.25346 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE LADONG FILE MUA12 25/12/13 15: 1 ------------------------------------------------------------------ :PAGE Phan tich so lieu vu Mua 2012 4 VARIATE V006 LADONG LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 TENDONG$ 20 131.079 6.55397 4.14 0.000 2 * RESIDUAL 42 66.5000 1.58333 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 62 197.579 3.18676 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE COBONG FILE MUA12 25/12/13 15: 1 ------------------------------------------------------------------ :PAGE Phan tich so lieu vu Mua 2012 5 VARIATE V007 COBONG LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 TENDONG$ 20 38.9841 1.94921 4.09 0.000 2 * RESIDUAL 42 20.0000 .476191 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 62 58.9841 .951357 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE GIE/BONG FILE MUA12 25/12/13 15: 1 ------------------------------------------------------------------ :PAGE Phan tich so lieu vu Mua 2012 6 VARIATE V008 GIE/BONG LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 TENDONG$ 20 29.0794 1.45397 3.98 0.000 2 * RESIDUAL 42 15.3333 .365079 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 62 44.4127 .716334 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE TONGHAT FILE MUA12 25/12/13 15: 1 ------------------------------------------------------------------ :PAGE Phan tich so lieu vu Mua 2012 7 VARIATE V009 TONGHAT LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 TENDONG$ 20 23985.1 1199.25 19.88 0.000 2 * RESIDUAL 42 2534.00 60.3334 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 62 26519.1 427.727 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE HATLEP FILE MUA12 25/12/13 15: 1 ------------------------------------------------------------------ :PAGE Phan tich so lieu vu Mua 2012 8 VARIATE V010 HATLEP LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 TENDONG$ 20 694.889 34.7444 6.67 0.000 2 * RESIDUAL 42 218.667 5.20635 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 62 913.556 14.7348 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE HATCHAC FILE MUA12 25/12/13 15: 1 ------------------------------------------------------------------ :PAGE Phan tich so lieu vu Mua 2012 9 VARIATE V011 HATCHAC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 TENDONG$ 20 19890.9 994.543 16.19 0.000 2 * RESIDUAL 42 2580.00 61.4286 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 62 22470.9 362.433 ----------------------------------------------------------------------------TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE MUA12 25/12/13 15: 1 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 10 Phan tich so lieu vu Mua 2012 MEANS FOR EFFECT TENDONG$ ------------------------------------------------------------------------------TENDONG$ NOS TGST CAOCAY SB/KHOM LADONG Dòng 1 3 118.333 96.0000 7.66667 25.3333 Dòng 2 3 118.000 94.6667 6.66667 23.6667 Dòng 3 3 113.667 93.0000 6.66667 25.0000 Dòng 4 3 116.333 98.0000 6.66667 21.1667 Dòng 5 3 115.667 100.000 8.33333 25.3333 Dòng 6 3 119.000 95.0000 7.00000 27.6667 Dòng 7 3 117.000 100.667 7.00000 27.0000 Dòng 8 3 120.333 94.3333 6.33333 25.3333 Dòng 9 3 118.000 97.0000 9.00000 23.6667 Dòng 10 3 115.000 96.6667 7.33333 23.6667 Dòng 11 3 120.333 99.0000 7.00000 26.0000 Dòng 12 3 113.000 95.3333 7.33333 23.3333 Dòng 13 3 121.000 95.6667 8.66667 24.6667 Dòng 14 3 125.000 96.0000 7.66667 24.0000 Dòng 16 3 124.000 107.333 9.00000 25.6667 Dòng 18 3 125.000 95.3333 8.33333 26.0000 Dòng 20 3 121.333 96.0000 7.66667 25.6667 Dòng 22 3 115.000 91.6667 8.00000 25.3333 Dòng 24 3 119.000 99.3333 7.33333 24.0000 Dòng 26 3 119.000 102.667 8.66667 26.6667 OM6976 3 119.000 90.3333 5.66667 23.6667 SE(N= 5%LSD 3) 42DF TENDONG$ Dòng 1 Dòng 2 Dòng 3 Dòng 4 Dòng 5 Dòng 6 Dòng 7 Dòng 8 Dòng 9 Dòng 10 Dòng 11 Dòng 12 Dòng 13 Dòng 14 Dòng 16 Dòng 18 Dòng 20 Dòng 22 Dòng 24 Dòng 26 OM6976 SE(N= 5%LSD 3) 42DF NOS 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 4.568112 5.62128 5.02353 4.92097 4.471404 5.34530 7.726483 5.07324 COBONG 6.66667 4.66667 5.00000 4.33333 4.66667 5.66667 4.33333 4.66667 4.33333 3.66667 5.00000 4.66667 5.33333 4.33333 5.33333 6.33333 4.33333 4.00000 6.33333 4.33333 4.33333 GIE/BONG 10.3333 10.6667 10.0000 10.0000 10.3333 10.6667 10.6667 10.0000 10.3333 9.66667 10.0000 10.0000 10.0000 9.33333 10.3333 9.33333 10.0000 9.66667 11.6667 10.3333 12.3333 TONGHAT 171.000 140.667 121.000 133.000 168.000 143.667 158.000 148.000 134.667 119.000 131.000 134.000 155.333 106.667 124.667 113.000 113.667 118.000 126.667 119.000 173.333 HATLEP 24.6667 19.6667 16.3333 17.3333 18.6667 19.0000 17.6667 16.3333 17.0000 17.0000 17.6667 22.6667 26.6667 17.0000 20.3333 18.0000 16.6667 16.3333 22.6667 19.3333 27.3333 6.398410 6.13698 7.348845 5.995538 4.48454 12.7980 4.31736 7.75951 TENDONG$ Dòng 1 Dòng 2 Dòng 3 Dòng 4 Dòng 5 Dòng 6 Dòng 7 Dòng 8 Dòng 9 Dòng 10 Dòng 11 Dòng 12 Dòng 13 Dòng 14 Dòng 16 Dòng 18 Dòng 20 Dòng 22 Dòng 24 Dòng 26 OM6976 NOS 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 HATCHAC 146.333 121.000 104.667 115.667 149.333 124.667 140.333 131.667 117.667 102.000 113.333 111.333 128.667 89.6667 104.333 95.0000 97.0000 101.667 104.000 99.6667 146.000 SE(N= 3) 4.52506 5%LSD 42DF 12.9137 ------------------------------------------------------------------------------ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE MUA12 25/12/13 15: 1 ------------------------------------------------------------------ :PAGE Phan tich so lieu vu Mua 2012 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE TGST CAOCAY SB/KHOM LADONG COBONG GIE/BONG TONGHAT HATLEP HATCHAC GRAND MEAN (N= 63) NO. OBS. 63 118.71 63 96.857 63 7.5238 63 24.897 63 4.8730 63 10.270 63 135.83 63 19.444 63 116.38 STANDARD DEVIATION C OF V |TENDONG$| -------------------- SD/MEAN | | BASED ON BASED ON % | | TOTAL SS RESID SS | | 3.4287 0.98400 5.62 0.0000 4.0035 1.7728 4.8 0.0000 1.1196 0.81650 10.9 0.0002 1.7852 1.2583 5.1 0.0001 0.97538 0.69007 14.2 0.0001 0.84637 0.60422 5.9 0.0001 20.682 7.7675 5.7 0.0000 3.8386 2.2817 11.7 0.0000 19.038 7.8376 6.7 0.0000 11 Phụ lục 3: Phân tích chỉ tiêu hình thái và các chỉ tiêu cấu thành năng suất các dòng chịu mặn trong vụ xuân 2013 tại Giao Thủy, Nam Định BALANCED ANOVA FOR VARIATE TGST FILE XUAN2013 25/12/13 15:44 ------------------------------------------------------------------ :PAGE Phan tich so lieu vu Xuan 2013 1 VARIATE V003 TGST LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 TENDONG$ 27 645.333 23.9012 62.74 0.000 2 * RESIDUAL 56 21.3334 .380953 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 83 666.667 8.03213 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE CAOCAY FILE XUAN2013 25/12/13 15:44 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 Phan tich so lieu vu Xuan 2013 VARIATE V004 CAOCAY LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 TENDONG$ 27 1201.90 44.5150 101.06 0.000 2 * RESIDUAL 56 24.6667 .440477 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 83 1226.57 14.7780 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE SB/KHOM FILE XUAN2013 25/12/13 15:44 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 Phan tich so lieu vu Xuan 2013 VARIATE V005 SB/KHOM LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 TENDONG$ 27 33.6548 1.24647 3.08 0.000 2 * RESIDUAL 56 22.6667 .404762 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 83 56.3214 .678571 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE LADONG FILE XUAN2013 25/12/13 15:44 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 4 Phan tich so lieu vu Xuan 2013 VARIATE V006 LADONG LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 TENDONG$ 27 368.000 13.6296 2.44 0.002 2 * RESIDUAL 56 312.667 5.58333 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 83 680.667 8.20080 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE COBONG FILE XUAN2013 25/12/13 15:44 ------------------------------------------------------------------ :PAGE Phan tich so lieu vu Xuan 2013 5 VARIATE V007 COBONG LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 TENDONG$ 27 39.9524 1.47972 4.14 0.000 2 * RESIDUAL 56 20.0000 .357143 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 83 59.9524 .722318 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE DAIBONG FILE XUAN2013 25/12/13 15:44 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 6 Phan tich so lieu vu Xuan 2013 VARIATE V008 DAIBONG LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 TENDONG$ 27 551.476 20.4250 6.13 0.000 2 * RESIDUAL 56 186.667 3.33333 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 83 738.143 8.89329 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE GIE/KHOM FILE XUAN2013 25/12/13 15:44 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 7 Phan tich so lieu vu Xuan 2013 VARIATE V009 GIE/KHOM LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 TENDONG$ 27 12.2381 .453263 1.66 0.056 2 * RESIDUAL 56 15.3333 .273810 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 83 27.5714 .332186 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE TONGHAT FILE XUAN2013 25/12/13 15:44 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 8 Phan tich so lieu vu Xuan 2013 VARIATE V010 TONGHAT LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 TENDONG$ 27 16958.1 628.079 11.26 0.000 2 * RESIDUAL 56 3124.00 55.7857 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 83 20082.1 241.954 ----------------------------------------------------------------------------BALANCED ANOVA FOR VARIATE HATLEP FILE XUAN2013 25/12/13 15:44 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 9 Phan tich so lieu vu Xuan 2013 VARIATE V011 HATLEP LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 TENDONG$ 27 2830.23 104.823 12.85 0.000 2 * RESIDUAL 56 456.667 8.15476 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 83 3286.89 39.6011 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE HATCHAC FILE XUAN2013 25/12/13 15:44 ------------------------------------------------------------------ :PAGE Phan tich so lieu vu Xuan 2013 10 VARIATE V012 HATCHAC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 TENDONG$ 27 11778.3 436.234 6.63 0.000 2 * RESIDUAL 56 3684.67 65.7976 ----------------------------------------------------------------------------* TOTAL (CORRECTED) 83 15463.0 186.301 ----------------------------------------------------------------------------TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE XUAN2013 25/12/13 15:44 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 11 Phan tich so lieu vu Xuan 2013 MEANS FOR EFFECT TENDONG$ ------------------------------------------------------------------------------TENDONG$ D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 D13 D14 D15 D16 D17 D18 D19 D20 D21 D22 D23 D24 D25 D26 D27 OM6976 SE(N= 5%LSD NOS 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3) 56DF TENDONG$ D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 D13 D14 D15 D16 D17 NOS 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 TGST 125.000 133.000 130.000 133.000 134.333 130.333 135.000 131.333 135.000 130.000 131.333 130.000 133.000 133.000 131.000 126.000 130.000 135.000 134.667 135.000 130.000 133.000 130.667 135.000 135.000 130.000 130.333 126.667 CAOCAY 98.6667 94.6667 93.3333 98.0000 101.667 96.3333 100.000 94.0000 96.0000 96.0000 99.3333 96.0000 95.0000 99.0000 96.0000 108.000 99.0000 94.0000 92.3333 108.000 94.0000 94.6667 99.3333 100.667 94.3333 99.0000 99.3333 95.3333 SB/KHOM 5.66667 5.00000 5.33333 5.33333 4.33333 5.33333 5.00000 4.66667 5.00000 4.00000 5.00000 4.66667 4.33333 3.66667 4.66667 6.33333 5.33333 5.00000 6.33333 4.00000 4.66667 4.66667 4.33333 5.00000 4.00000 4.33333 4.66667 4.33333 LADONG 29.0000 23.0000 24.0000 23.6667 23.0000 23.6667 25.0000 25.0000 23.6667 24.6667 22.0000 23.3333 22.3333 21.0000 23.0000 24.0000 23.6667 23.6667 25.0000 23.6667 21.6667 29.0000 20.3333 21.3333 20.3333 20.3333 21.3333 22.6667 4.356349 5.00946 4.383178 6.08546 4.367315 5.04052 5.36423 6.86455 COBONG 4.33333 4.66667 4.00000 5.33333 4.00000 3.00000 4.33333 4.33333 3.66667 5.33333 3.33333 3.33333 3.33333 4.33333 3.33333 3.66667 4.66667 DAIBONG 23.3333 34.0000 22.6667 22.0000 23.0000 22.3333 23.0000 22.6667 23.0000 23.3333 27.0000 22.0000 21.3333 21.6667 23.3333 21.6667 26.3333 GIE/KHOM 10.3333 10.0000 10.3333 9.66667 10.0000 9.66667 10.0000 9.66667 9.33333 10.0000 9.33333 9.66667 10.0000 10.0000 9.33333 10.0000 10.0000 TONGHAT 190.667 180.333 186.000 171.000 177.667 155.667 192.667 191.000 158.667 149.000 162.667 174.333 161.000 177.333 171.667 180.333 177.000 D18 D19 D20 D21 D22 D23 D24 D25 D26 D27 OM6976 SE(N= 5%LSD 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3) 56DF TENDONG$ D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 D13 D14 D15 D16 D17 D18 D19 D20 D21 D22 D23 D24 D25 D26 D27 OM6976 NOS 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 4.33333 5.00000 5.00000 4.00000 4.00000 3.33333 3.00000 3.00000 3.33333 3.33333 4.00000 26.6667 22.6667 23.6667 21.0000 22.3333 21.3333 21.6667 22.3333 21.3333 22.0000 22.3333 9.00000 10.0000 10.6667 9.66667 10.3333 10.0000 10.0000 10.0000 10.0000 10.3333 10.6667 163.667 135.667 148.000 167.000 172.000 171.333 163.333 150.667 158.667 176.667 190.000 5.345033 6.977401 5.05409 6.98601 5.302109 6.855808 4.31222 12.2156 HATLEP 34.6667 21.0000 26.0000 13.6667 14.3333 8.33333 18.3333 16.3333 10.0000 6.66667 17.3333 13.6667 15.6667 12.6667 9.00000 17.0000 16.3333 12.3333 16.0000 11.3333 11.0000 16.6667 15.3333 16.0000 12.3333 19.6667 23.3333 24.0000 HATCHAC 156.000 159.333 160.000 157.333 163.333 144.667 174.333 174.667 148.667 142.333 145.333 160.667 145.333 164.667 162.667 163.333 160.667 151.333 119.667 136.667 156.000 155.333 156.000 147.333 138.333 139.000 153.333 166.000 SE(N= 3) 5.64871 4.68322 5%LSD 56DF 6.67044 13.2665 ------------------------------------------------------------------------------ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE XUAN2013 25/12/13 15:44 ------------------------------------------------------------------ :PAGE Phan tich so lieu vu Xuan 2013 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE TGST CAOCAY SB/KHOM LADONG COBONG DAIBONG GIE/KHOM TONGHAT HATLEP HATCHAC GRAND MEAN (N= 84) NO. OBS. 84 131.67 84 97.571 84 4.8214 84 23.333 84 3.9762 84 23.214 84 9.9286 84 169.79 84 16.036 84 153.65 STANDARD DEVIATION C OF V |TENDONG$| -------------------- SD/MEAN | | BASED ON BASED ON % | | TOTAL SS RESID SS | | 2.8341 0.61721 6.97 0.0000 3.8442 0.66368 6.98 0.0000 0.82375 0.63621 13.2 0.0002 2.8637 2.3629 10.1 0.0025 0.84989 0.59761 15.0 0.0000 2.9822 1.8257 7.9 0.0000 0.57636 0.52327 5.3 0.0561 15.555 7.4690 4.4 0.0000 6.2929 2.8557 17.8 0.0000 13.649 8.1116 5.3 0.0000 12 [...]... tài Ứng dụng chỉ thị phân tử kết hợp với phƣơng pháp chọn giống truyền thống để tạo giống lúa chịu mặn năng suất cao đáp ứng nhu cầu về giống cho sản xuất, đặc biệt là cho các vùng ven biển ĐBSH nơi chịu nhiều ảnh hƣởng của BĐKH 3 Ý nghĩa của đề tài 3.1.Ý nghĩa khoa học Ứng dụng phƣơng pháp chọn giống bằng chỉ thị phân tử để chọn tạo giống lúa chịu mặn giúp chọn lọc nhanh và chính xác nguồn gen chịu mặn. .. kinh tế 1.4 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn trong và ngoài nƣớc 1.4.1 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn ở nước ngoài 1.4.1.1 Nghiên cứu theo phƣơng pháp truyền thống Trên Thế giới, việc chọn tạo giống lúa chịu mặn đáp ứng với biến đổi khí hậu đã đƣợc các nhà khoa học chú trọng nghiên cứu từ lâu Đánh giá khả năng chịu mặn ở lúa: kiểu gen chịu ảnh hƣởng của các chất dinh... tác chọn tạo giống nói chung, không chỉ với đặc tính chịu mặn mà còn đối với nhiều đặc tính nông sinh học quý khác - Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ là vật liệu khởi đầu rất tốt trong nghiên cứu và chọn tạo giống lúa chịu mặn đặc biệt cho các vùng đồng bằng ven biển của Việt Nam nơi chịu ảnh hƣởng nặng nề của biến đối khí hậu - Bổ sung thêm cơ sở lý luận trong công tác chọn tạo giống lúa bằng chỉ thị. .. hiện tính chịu mặn vƣợt trội cao hơn cả Pokkali và Nona Bokra [43] 1.4.1.2 Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử Việc nghiên cứu, ứng dụng chỉ thị phân tử trong di truyền chọn giống cây trồng đƣợc rất nhiều phòng thí nghiệm trên Thế giới thực hiện và đạt đƣợc những thành tựu đáng kể Các nhà khoa học tại trƣờng Đại học Cornel (Mỹ) đã định vị hàng loạt các chỉ thị phân tử RFLP trên bản đồ di truyền ở lúa Hiện... tạo của thế kỷ 21 [42] 1.4.2 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn trong nước 1.4.2.1 Chọn giống theo phƣơng pháp truyền thống Giai đọan 2009-2013 Viện Lúa ĐBSCL đã thực hiện chọn tạo bộ giống lúa chịu mặn bƣớc đầu đã xác định đƣợc 30 dòng lúa có triển vọng chịu mặn đó là những dòng kế thừa, đƣợc phát hiện chịu mặn qua nhiều lần thanh lọc trong phòng thí nghiệm và nhà lƣới Các dòng này đang... lúa để tạo ra các biến dị soma chống chịu mặn cho thấy, từ giống Pokkali đã thu đƣợc dòng biến dị soma TCCP226-2-49-B-B-3 là giống lúa cao sản, thấp cây, sinh trƣởng mạnh, chống chịu mặn cao nhƣ Pokkali, gạo có màu trắng và phẩm chất gạo tốt hơn giống gốc, cho năng suất cao hơn Pokkali Giống lúa này đƣợc sử dụng nhiều trong các chƣơng trình chọn tạo giống lúa mặn tại nhiều trung tâm nghiên cứu lúa trên... động cụ thể nhằm ứng phó kịp thời Tại các vùng ven biển Việt Nam sẽ phải chịu ảnh hƣởng nhiều nhất do biến đổi khí hậu gây ra nhƣ bão, lũ lụt, xói lở bờ biển và xâm nhập mặn và đây là nguyên nhân làm chậm tốc độ tăng trƣởng kinh tế của khu vực, tăng tỷ lệ nghèo đói và làm giảm khả năng ứng phó đối với các thiên tai do biến đổi khí hậu gây ra Đối với nƣớc ta, các tác động của biến đổi khí hậu ban đầu có... trạng khác của cây lúa nhƣ gen chịu mặn, khô hạn, ngập chìm, chịu độc tố nhôm, chịu thiếu phosphor… cũng đã đƣợc phát hiện và lập bản đồ di truyền phân tử để đƣa vào sử dụng chọn tạo giống Do có thể xác định đƣợc kiểu gen tại bất kỳ giai đoạn nào, ở bất kỳ cơ quan (mô, cơ quan, toàn cơ thể…) nên việc chọn tạo giống bằng chỉ thị phân tử đƣợc dự đoán là phƣơng pháp chủ yếu trong việc lai tạo của thế kỷ 21... path rất cao trong môi trƣờng mặn Chính ba tính trạng này đóng góp phần lớn trong việc tăng năng suất lúa trong môi trƣờng mặn, nhất là khối lƣợng bông và số hạt chắc trên bông Narayanan và ctv (1990) cho rằng, số hạt chắc trên bông, chiều dài bông là tính trạng chính đóng góp vào năng suất của các giống lúa trong những vùng đất bị nhiễm mặn 1.3 .Chỉ thị phân tử và ứng dụng trong chọn tạo giống cây trồng... thể phân định sự sai khác giữa các giống trong cùng một loài phụ do khả năng cho phép đánh giá mức độ alen của cùng một locus Để xác định sự có mặt của gen Saltol trong quần thể BC1F1, BC2F1, BC3F1, BC3F2 chúng tôi lựa chọn sử dụng chỉ thị SSRs liên kết với QTL/Saltol 1.3.3 Ứng dụng phương pháp MAS(Marker Assisted Selection) trong chọn tạo giống Từ lâu các nhà chọn giống đã quan tâm đến các chỉ thị ... Ứng dụng thị phân tử chọn tạo giống lúa chịu mặn ứng phó với biến đổi khí hậu Mục tiêu nghiên cứu đề tài Ứng dụng thị phân tử kết hợp với phƣơng pháp chọn giống truyền thống để tạo giống lúa. .. HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ HUẾ ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG CHỌN TẠO GIỐNG LÚA CHỊU MẶN ỨNG PHÓ VỚI BIẾN ĐỔI KHÍ HẬU Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng... nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn - Ứng dụng thị phân tử xác định cá thể mang locus gen Saltol - Đánh giá trồng thử nghiệm dòng chịu mặn đƣợc chọn tạo phƣơng pháp chọn giống nhờ thị phân tử Xác