i LỜI CẢM ƠN Sau hơn 3 tháng nghiên cứu làm đề tài. Cuối cùng đồ án tốt nghiệp cũng đã hoàn thành. Lời đầu tiên em xin gửi tới Ban Giám hiệu và các Phòng Ban Trường Đại Học Nha Trang cùng toàn thể các thầy cô đang công tác tại trường lời chúc sức khỏe và niềm tự hào khi em được học tập trong ngôi trường này. Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong khoa Công nghệ Thực phẩm đã truyền đạt kiến thức quý báu để em có thể hoàn thành tốt đề tài. Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc nhất đến thầy TS. Huỳnh Nguyễn Duy Bảo đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình giúp đỡ em có thể hoàn thành bài báo cáo tốt nghiệp này. Xin cảm ơn các cán bộ các phòng thí nghiệm: Công nghệ Chế biến Thủy sản, Công nghệ Thực phẩm, phòng Hóa sinh-Vi sinh, phòng Hóa phân tích và phòng Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài. Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và các anh chị khóa trên đã động viên góp ý giúp em hoàn thành đề tài này. Nha Trang, ngày 14 tháng 3 năm 2015 Sinh viên thực hiện Phan Tấn Quyền ii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................i MỤC LỤC .................................................................................................................... ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................. v DANH MỤC HÌNH .....................................................................................................vi LỜI MỞ ĐẦU ..............................................................................................................vi CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ........................................................................................ 3 1.1. Giới thiệu về hải miên ....................................................................................... 3 1.1.1. Một số loài hải miên ................................................................................... 3 1.1.2. Đặc điểm sinh học của hải miên ................................................................. 9 1.1.3. Hình thức sinh sản của hải miên ................................................................. 9 1.1.4. Môi trường sống của hải miên .................................................................. 10 1.1.5. Ứng dụng của hải miên ............................................................................ 10 1.2. Tình hình nghiên cứu hải miên ....................................................................... 11 1.2.1. Tình hình nghiên cứu hải miên trên thế giới............................................. 12 1.2.2. Tình hình nghiên cứu hải miên tại Việt Nam ........................................... 14 1.3. Quá trình oxy hóa và chất chống oxy hóa ....................................................... 14 1.3.1. Quá trình oxy hóa ..................................................................................... 14 1.3.2. Chất chống oxy hóa .................................................................................. 17 1.3.3. biến Một số phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa được áp dụng phổ 19 1.4. Hoạt chất sinh học chống oxi hóa từ hải miên ................................................ 20 1.5. Đặc điểm của các nhóm hoạt chất sinh học chống oxi hóa có trong hải miên . 20 1.5.1. Nhóm các hợp chất phenol ....................................................................... 20 1.5.2. Nhóm hợp chất sterol ............................................................................... 20 1.5.3. Nhóm hợp chất flavonoid ......................................................................... 21 iii 1.5.4. Nhóm hợp chất saponin ............................................................................ 21 1.5.5. Nhóm hợp chất polypeptide ..................................................................... 22 1.5.6. Nhóm hợp chất glycoside ......................................................................... 22 1.6. Phương pháp chiết tách các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học .............. 22 1.6.1. Chiết xuất với sự hỗ trợ của siêu âm (Ultrasound-assisted extraction) ..... 22 1.6.2. Chiết xuất với sự hỗ trợ của vi sóng (Microwave-assisted extraction) ..... 23 1.6.3. Chiết xuất bằng chất lỏng siêu tới hạn (Supercritical fluid extraction) ..... 24 1.6.4. Chiết xuất bằng chất lỏng dưới áp suất cao (Pressurised liquid extraction) 25 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 27 2.1. Nguyên liệu và hóa chất .................................................................................. 27 2.1.1. Nguyên liệu .............................................................................................. 27 2.1.2. Hóa chất ................................................................................................... 27 2.2. Phương pháp nghiên cứu................................................................................. 27 2.2.1. 2.2.1.1. Bố trí thí nghiệm ...................................................................................... 27 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát .......................................................... 27 2.2.1.2. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của loại dung môi có hỗ trợ siêu âm đến khả năng chống oxi hóa và hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên............. 29 2.2.1.3. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của loại dung môi không có hỗ trợ siêu âm đến khả năng chống oxi hóa và hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên ...... 32 2.2.2. Các phương pháp phân tích ...................................................................... 35 2.2.2.1. Phương pháp phân tích khả năng khử gốc tự do DPPH ........................ 35 2.2.2.2. Phương pháp phân tích tổng năng lực khử ............................................ 35 2.2.2.3. Phương pháp phân tích hàm lượng protein ........................................... 35 2.3. Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm .......................................................... 35 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................................. 36 3.1. Ảnh hưởng của loại dung môi chiết có hỗ trợ siêu âm đến khả năng chống oxy hóa và hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên ................................................ 36 iv 3.1.1. Ảnh hưởng của loại dung môi chiết có hỗ trợ siêu âm đến khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ hải miên ............................................................................ 36 3.1.2. Ảnh hưởng của loại dung môi chiết có hỗ trợ siêu âm đến hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên ......................................................................................... 40 Kết quả ...................................................................................................................... 40 3.2. Ảnh hưởng của loại dung môi chiết không có hỗ trợ siêu âm đến khả năng chống oxy hóa và hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên .............................. 43 3.2.1. Ảnh hưởng của loại dung môi chiết không có hỗ trợ siêu âm đến khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ hải miên ................................................................. 43 Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết hải miên được đánh giá dựa trên khả năng 43 3.2.2. Ảnh hưởng của loại dung môi chiết không có hỗ trợ siêu âm đến hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên ............................................................................. 47 Kết quả ...................................................................................................................... 47 3.3. Mối tương quan giữa khả năng khử gốc tự do DPPH và hàm lượng protein có hỗ trợ siêu âm của dịch chiết từ hải miên. ................................................................. 50 3.4. Mối tương quan giữa khả năng khử gốc tự do DPPH và hàm lượng protein không có hỗ trợ siêu âm của dịch chiết từ hải miên .................................................. 51 3.5. Mối tương quan giữa tổng năng lực khử và hàm lượng protein có hỗ trợ từ siêu âm của dịch chiết từ hải miên.................................................................................... 52 3.6. Mối tương quan giữa tổng năng lực khử và hàm lượng protein không hỗ trợ từ siêu âm của dịch chiết từ hải miên ............................................................................ 54 3.7. Ảnh hưởng của siêu âm đến khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ hải miên 55 3.8. Ảnh hưởng của siêu âm đến hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên .... 58 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................... 60 1. Kết luận .............................................................................................................. 60 2. Kiến nghị ............................................................................................................ 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................... 61 MỤC LỤC v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT MĐC: Mẫu đối chứng UV-Vis ( Ultraviolet – Visite ): Tử ngoại - khả kiến TN: Thí nghiệm DM: Dung môi NL: Nguyên liệu DM/NL: Dung môi/Nghiên liệu PL: Pha loãng ĐLC: Độ lệch chuẩn vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Loài Gellius varius ......................................................................................... 3 Hình 1.2: Loài Dysidea cinerea...................................................................................... 3 Hình 1.3: Loài Haliclona sp............................................................................................ 4 Hình 1.4: Loài Mycale plumosa ..................................................................................... 4 Hình 1.6: Loài Amorphinopsis excavans ........................................................................ 5 Hình 1.7: Loài Cirathria vulpina .................................................................................... 6 Hình 1.8: Loài Petrosia nigricans .................................................................................. 6 Hình 1.9: Loài Xestospongia testudinaria ...................................................................... 7 Hình 1.10: Loài Niphates sp ........................................................................................... 7 Hình 1.11: Loài Styirissa flabelliformis.......................................................................... 8 Hình 1.12: Loài Ianthella sp ........................................................................................... 8 Hình 1.13: Loài ircinia sp .............................................................................................. 9 Hình 1.14: Gốc tự do .................................................................................................... 15 Hình 1.15: Nguồn gốc hình thành gốc tự do ................................................................. 16 Hình 1.16: Chất chống oxi hóa ..................................................................................... 18 Hình 2.1: Loài hải miên Spongia sp lấy mẫu ở vùng biển Phú Quốc ........................... 27 Hình 2.2: Sơ đồ quy trình dự kiến tách chiết chất chống oxy hóa từ Hải miên............. 28 Hình 2.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của loại dung môi có hỗ trợ siêu âm đến khả năng chống oxi hóa và hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên ................... 31 Hình 2.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của loại dung môi không có hỗ trợ siêu âm đến khả năng chống oxi hóa và hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên............. 34 Hình 3.1: Hoạt tính khử gốc tự do DPPH của dịch chiết từ hải miên (Spongia sp.) được chiết xuất bằng các dung môi khác nhau có hỗ trợ của siêu âm, (a) dịch chiết lần 1; (b) dịch chiết lần 2; (c) dịch chiết lần 3, (d) dịch chiết tổng 3 lần. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). ........................................................................................... 37 vii Hình 3.2. Tổng năng lực khử của dịch chiết từ hải miên (Spongia sp.) được chiết xuất bằng các dung môi khác nhau có hỗ trợ của siêu âm, (a) dịch chiết lần 1; (b) dịch chiết lần 2; (c) dịch chiết lần 3, (d) dịch chiết tổng 3 lần. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). ............................................................................................................... 39 Hình 3.3. Hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên (Spongia sp.) được chiết xuất bằng các dung môi khác nhau có hỗ trợ của siêu âm, (a) dịch chiết lần 1; (b) dịch chiết lần 2; (c) dịch chiết lần 3, (d) dịch chiết tổng 3 lần. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). ............................................................................................................... 41 Hình 3.4: Hoạt tính khử gốc tự do DPPH của dịch chiết từ hải miên (Spongia sp.) được chiết xuất bằng các dung môi khác nhau có hỗ trợ của siêu âm, (a) dịch chiết lần 1; (b) dịch chiết lần 2; (c) dịch chiết lần 3, (d) dịch chiết tổng 3 lần. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). ........................................................................................... 44 Hình 3.5 Tổng năng lực khử của dịch chiết từ hải miên (Spongia sp.) được chiết xuất bằng các dung môi khác nhau không có hỗ trợ của siêu âm, (a) dịch chiết lần 1; (b) dịch chiết lần 2; (c) dịch chiết lần 3, (d) dịch chiết tổng 3 lần. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). ..................................................................................................... 46 Hình 3.6. Hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên (Spongia sp.) được chiết xuất bằng các dung môi khác nhau không có hỗ trợ của siêu âm, (a) dịch chiết lần 1; (b) dịch chiết lần 2; (c) dịch chiết lần 3, (d) dịch chiết tổng 3 lần. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). ..................................................................................................... 48 Hình 3.7. Mối liên hệ giữa khả năng khử gốc tự do DPPH và hàm lượng protein có hỗ trợ siêu âm của (a) dịch chiếthải miên lần 1(b) dịch chiếthải miên lần 2 (c) dịch chiếthải miên lần 3 (d) dịch chiếthải miên tổng 3 lần chiết ........................................................ 51 Hình 3.8. Mối liên hệ giữa khả năng khử gốc tự do DPPH và hàm lượng protein không có hỗ trợ siêu âm của (a) dịch chiết hải miên lần 1(b) dịch chiết hải miên lần 2 (c) dịch chiết hải miên lần 3 (d) dịch chiết hải miên tổng 3 lần chiết. ....................................... 52 viii Hình 3.9. Mối liên hệ giữa tổng năng lực khử và hàm lượng protein có hỗ trợ siêu âm của (a) dịch chiết hải miên lần 1(b) dịch chiết hải miên lần 2 (c) dịch chiết hải miên lần 3 (d) dịch chiết hải miên tổng 3 lần chiết. .................................................................. 524 Hình 3.10. Mối liên hệ giữa tổng năng lực khử và hàm lượng protein không có hỗ trợ siêu âm của (a) dịch chiết hải miên lần 1(b) dịch chiết hải miên lần 2 (c) dịch chiết hải miên lần 3 (d) dịch chiết hải miên tổng 3 lần chiết. .................................................... 525 Hình 3.11. Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết từ hải miên (Spongia sp.) được chiết xuất với hỗ trợ siêu âm và không siêu âm tổng 3 lần chiết bằng, (a) dung môi nước cất; (b) dung môi methanol; (c) dung môi ethanol, (d) dung môi clorofrom. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05)...................................................................... 56 Hình 3.12. Tổng năng lực khử của dịch chiết từ hải miên (Spongia sp.) được chiết xuất với hỗ trợ siêu âm và không siêu âm tổng 3 lần chiết bằng, (a) dung môi nước cất; (b) dung môi methanol; (c) dung môi ethanol, (d) dung môi clorofrom. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). .................................................................................... 57 Hình 3.13. Hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên (Spongia sp.) được chiết xuất với hỗ trợ siêu âm và không siêu âm tổng 3 lần chiết bằng các dung môi khác nhau. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). ........................................................ 59 1 LỜI MỞ ĐẦU Đại dương là một nguồn tài nguyên vô cùng lớn, nơi chiếm tới 70% diện tích bề mặt trái đất . Đại dương cũng là nơi sinh sống của 34 trong 36 ngành sinh vật trên trái đất với hơn 300.000 loài thực động vật đã được biết đến. Đây chính là nguồn cung cấp vô số các sản phẩm tự nhiên quý giá từ các loài sinh vật biển. Sự đa dạng của các loài được thể hiện rất phong phú ở những bãi san hô, nơi mà có đến 1000 loài trên một đơn vị mét vuông. Trong đó, khu vực Ấn Độ Dương và Thái Bình Dương có một vùng đa dạng sinh vật biển nhiệt đới lớn nhất trên thế giới. Việt Nam nằm trong khu vực biển Thái Bình Dương, sở hữu hơn 1 triệu km2 vùng biển. Kết quả thống kê đến nay đã thông báo có trên 12.000 loài động thực vật biển ở Việt Nam, trong đó có rất nhiều loài có độc tố hay có hoạt tính sinh học tiềm tàng. Tuy vậy, nguồn tài nguyên phong phú này vẫn chưa thu hút được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học, đến nay mới chỉ có một số rất nhỏ những nghiên cứu về lĩnh vực này. Nghiên cứu, phát triển, khai thác những nguồn tài nguyên sinh vật biển hiện đang là vấn đề cấp bách không chỉ ở nước ta mà trên toàn thế giới. Trong các loài sinh vật biển hải miên đã được biết đến như một nguồn nguyên liệu dồi dào của các hợp chất có cấu trúc mới và hoạt tính sinh học đáng quan tâm cho thấy khả năng sản sinh các hợp chất có hoạt tính mạnh nhất. Điển hình như những nghiên cứu về hóa học của hải miên đã đem lại rất nhiều các hợp chất có giá trị. Cho đến nay, có tới 2/3 hợp chất đang được thử nghiệm lâm sàng hoặc có mặt trên thị trường là được phân lập từ hải miên. Các hợp chất này thể hiện các hoạt động dược học vô cùng phong phú đa dạng như chống ung thư, kháng sinh, kháng viêm, kháng virut, chống ôxy hóa, chống bệnh mất trí nhớ, chữa trị các vết thương, chữa đau dạ dày, chữa bệnh tự miễn... Hiện tại, các nghiên cứu, đánh giá cũng như ứng dụng các hoạt tính sinh học của hải miên ở Việt Nam vẫn còn rất khiêm tốt, chưa tận dụng được hết nguồn tài nguyên 2 biển vô cùng quý giá. Để khai thác hiệu quả nguồn tài nguyên quý giá này, việc nghiên cứu tách chiết các hoạt chất sinh học từ hải miên là rất cần thiết và đó là lý do tôi chọn đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của loại dung môi chiết và siêu âm đến hoạt tính chống oxy hóa và hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên”. Mục đích và ý nghĩa của đề tài: Mục đích đề tài: + Nghiên cứu ảnh hưởng của loại dung môi chiết đến hoạt tính chống oxi hóa và hàm lượng protein của hải miên. + Nghiên cứu ảnh hưởng của siêu âm đến hoạt tính chống oxi hóa và hàm lượng protein của hải miên. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn: +Là cơ sở để lựa chọn dung môi và phương pháp chiết thích hợp. +Thành công của đề tài sẽ tạo ra chất chống oxi hóa ứng dụng trong y học Trong quá trình thực hiện đề tài này mặc dù đã cố gắng hết mình tìm hiểu, song do bước đầu làm quen với công tác nghiên cứu khoa học, kiến thức còn hạn chế cũng như khó khăn về điều kiện thực nghiệm, vì vậy những sai sót mắc phải là điều không thể tránh. Kính mong sự chỉ bảo của quý thầy cô cũng như ý kiến đóng góp của các bạn sinh viên để đề tài được hoàn thiện hơn. Xin chân thành cảm ơn. 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về hải miên 1.1.1. Một số loài hải miên + Loài Gellius varius, thuộc họ Chalinidae. Mô tả: Dạng cành, màu xanh lục đậm khi còn sống, khi chết hoặc khi cố định bằng hoá chất thì chuyển màu xanh đen, chúng tạo thành khóm sống trên các khối san hô hoặc bám trên nền đáy cứng. Hình 1.1. Loài Gellius varius + Loài Dysidea cinerea, thuộc họ Dysideiade. Mô tả: Mọc thành dạng khối trên rạn san hô, màu sắc thany đổi rất nhiều phụ thuộc vào môi trường sống, từ màu nâu nhạt cho tới màu xám hoặc, mềm và dai, thường lẫn cả cát hoặc sạn bên trong cơ thể. Hình 1.2. Loài Dysidea cinerea 4 + Loài Haliclona sp, thuộc họ Chalinidae Mô tả: Thường có dạng cành, cấu trúc thay đổi tuỳ loài có thể mềm hoặc hơi cứng, màu sắc thay đổi rất nhiều, từ màu xám nhạt, hồng, tím hoặc xanh đâm, với lỗ mở trên bề mặt tương đối lớn Hình 1.3. Loài Haliclona sp + Loài Mycale plumosa,thuộc họ Mycalidae Mô tả: Có dạng cành đặc trưng và thường nối với nhau, màu sắc từ đỏ đậm cho tới màu tím nhạt, thường bị mất màu rất nhanh sau khi lấy ra khỏi môi trường sống, cấu trúc tương đối mềm Hình 1.4. Loài Mycale plumosa +Loài Ircinia echinata, thuộc họ Irciniidae Mô tả: Thường sống dạng khối có xẻ thuỳ, bề mặt được bao phủ bởi các mấu nhỏ, thường có màu nâu đen cho tới màu đen, cơ thể dẻo và đàn hồi giống như cao su 5 Hình 1.5. Loài Ircinia echinata + Loài Amorphinopsis excavans, thuộc họHalichondriidae Mô tả: Đây là loài đục lỗ vào trong các khối san hô hoặc nền đáy và chiếm cứ gần hết không gian bên trong, màu sắc thay đổi từ vàng cho tới vàng đâm, có lỗ mở trên bề mặt khá lớn. Khi để khô thường chuyển màu trắng ngà Hình 1.6. Loài Amorphinopsis excavans + Loài Cirathria vulpina,thuộc họMycalidae Mô tả: Cơ thể dạng cành, có màu vàng cam, bề mặt xù xì được tạo nên bởi nhiều núm gai nhỏ 6 Hình 1.7. Loài Cirathria vulpina + Loài Petrosia nigricans, thuộc họ Petrosiidae. Mô tả: Thường có dạng khối, giống hình núi lửa, cấu trúc cứng và dễ vỡ, dễ gãy, bề mặt tương đối nhẵn, thường có màu tím nhạt cho tới nâu đâm. Hình 1.8. Loài Petrosia nigricans + Loài Xestospongia testudinaria, thuộc họ Petrosiidae Mô tả: Hình dạng, màu sắc và kết cấu bề mặt thay đổi rất nhiều tuỳ thuộc vào môi trường sống, thường chúng có dạng cốc lớn với bề mặt nhiều các gờ và các rãnh, cấu trúc cứng và dễ vỡ vụn. 7 Hình 1.9. Loài Xestospongia testudinaria + Loài Niphates sp, thuộc họ Chalinidae. Mô tả: Cơ thể dạng cành phân nhánh, màu sắc thay đổi thừ màu trắng ngà cho tới màu hồng nhạt, bề mặt tường đối nhẵn, có một số lỗ mở nhỏ trên bề mặt. Hình 1.10. Loài Niphates sp + Loài Styirissa flabelliformis, thuộc họ Axinellidae. Mô tả: Mọc thành cụm trên rạn san hô, có màu vàng cam, bề mặt xù xù thường có nhiều mấu nhỏ hoặc có các đường gờ hoặc nếp gấp 8 Hình 1.11. Loài Styirissa flabelliformis + Loài Ianthella sp, thuộc họ Ianthellidae Mô tả: Cơ thể có dạng quạt, màu sắc thay đổi từ màu vàng nhạt, màu vàng cam đâm cho tới màu tím sẫm, khi tiếp xú vơi không khí thường chuyển màu tím sẫm Hình 1.12. Loài Ianthella sp + Loài ircinia sp, thuộc họ Irciniidae Mô tả: Thường có dạng xẻ thuỳ, có màu từ nâu đâm tới màu đen, đôi khi được bao phủ bởi các mâu thịt nhỏ, cấu trúc dẻo và dai giống cao su 9 Hình 1.13. Loài ircinia sp 1.1.2. Đặc điểm sinh học của hải miên Hải miên là động vật đa bào thấp, không tương đồng với cấu tạo cơ thể của các nhóm động vật đa bào khác: Cơ thể chưa có kiểu đối xứng ổn định, chưa có lỗ miệng, chưa có các mô phân hóa và chưa có tế bào thần kinh. Ngày nay, các nhà khoa học đã phát hiện hơn 5.000 loài hải miên, nhưng người ta cho rằng có hơn 8.000 loài hải miên trên Trái đất (Chairman và cộng sự, 2012). Phần lớn hải miên sống ở biển, chỉ có khoảng 150 loài sống ở nước ngọt. Màu sắc, hình dáng và kích thướt của cơ thể khác nhau tùy loài. Từ vài mm tới vài mét. Thân lỗ là nhóm sống bám tuy cũng quan sát thấy vài loài có thể di chuyển chỗ vài mm sau mỗi ngày, có thể do vận động của tế bào chất hoặc tế bào amip. Hải miên ăn bằng cách lọc. Hầu hết hải miên ăn các hạt hữu cơ nổi và sinh vật phù du nhỏ mà chúng lọc được từ các dòng nước chảy qua cơ thể của chúng. Nước đưa thức ăn và O2 vào cơ thể qua lỗ hút nước và theo ống dẫn nước trong thành cơ thể vào khoang trung tâm và từ đó theo lỗ thoát nước ra ngoài. 1.1.3. Hình thức sinh sản của hải miên Có hai hình thức sinh sản: Vô tính và hữu tính Sinh sản vô tính bằng mọc chồi hoặc tạo mầm chồi đó là những múm nhỏ mọc trên thành cơ thể. Mầm là khối tế bào amip được một lớp vỏ kép cách nhiệt bọc ngoài. Sinh sản hữu tính: Phần lớn thân lỗ lưỡng tính. Tế bào sinh dục do tế bào amip hoặc tế bào cổ áo tạo thành, chúng ở tầng keo và nằm dưới các phòng roi, tinh trùng chin 10 lọt vào phòng roi theo dòng nước thoát ra ngoài, rồi tới thụ tinh noãn của một cá thể khác. Thân lỗ có khả năng tái sinh cao. Từ một mảnh cơ thể tách rời hoặc từ một đám tế bào sau khi nghiền nát hoặc sàn qua lưới vẫn có thể phát triển thành một cơ thể toàn vẹn. 1.1.4. Môi trường sống của hải miên Hải miên sống trong một loạt các môi trường sống đại dương, từ các vùng cực đến các vùng nhiệt đới. Hầu hết chúng sống trong vùng nước yên tĩnh bởi vì sóng hoặc các dòng nước sẽ khuấy động lớp trầm tích làm chặn các lỗ hút nước gây khó khăn cho chúng ăn và hô hấp Krautter, M. (1998). Phần lớn hải miên được tìm thấy trên bề mặt vững chắc như đá, một số loài hải miên gắn vào trầm tích mềm. Hải miên ở vùng biển ôn đới dồi dào nhưng ít đa dạng hơn hải miên ở vùng biển nhiệt đới, có thể vì nguồn thức ăn của hải miên ở vùng biển nhiệt đới có nhiều loại và phong phú hơn. 1.1.5. Ứng dụng của hải miên Sử dụng hải miên làm “bông tắm”, nhu cầu sử dụng hải miên làm “bông tắm” ngày càng tăng. “ bông tắm” từ hải miên có thể được định nghĩa là bất kì loài hải miên nào sở hữu sợi chỉ spongin- đó là các sợi đàn hồi làm từ collagen protein Chất lượng của miếng hải miên dựa trên chất lượng của bộ xương xốp. Các sợi mềm, bền và đàn hồi tốt sẽ có mức giá cao nhất Hải miên tắm hiện đang được sản xuất bằng cách sử dụng hải miên matthewsi Coscinoderma với sản lượng khoảng 12.000 miếng xốp/năm và được bán tại địa phương cho người dân và du khách ở Pohnpei , Micronesia . 100% hải miên sản xuất từ tự nhiên không có hóa chất mạnh thêm vào khi chế biến. 11 Việc sản xuất nuôi trồng thủy sản của hải miên C. matthewsi được thực hiện bởi Marine và Viện nghiên cứu môi trường của Pohnpei (MERIP). Sử dụng hoạt tính sinh học từ hải miên, với sự hiện diện của các chất chuyển hóa thứ cấp được sản xuất bởi các vi sinh vật cộng sinh trong các loài hải miên. Các chất chuyển hóa thứ cấp đã được phân lập thành công từ hải miên, với nhiều chất chuyển hóa có tính chất dược liệu tiềm năng, chẳng hạn như gây độc tế bào , chống viêm và hoạt tính kháng virus. Do đó, chúng có tiềm năng đáng kể trong ngành công nghiệp dược phẩm để tạo ra các loại thuốc mới. Vidarabine, một loại thuốc chống virus (dùng để chống lại các loại virus viêm não Herpes simplex), và Ara-C, một loại thuốc chống ung thư, cô lập khỏi hải miên Tethya crypta. Cả hai hợp chất được sử dụng lâm sàng trong nhiều năm. Halichondrin B được phân lập từ loài hải miên Halichondria okadai, nhưng cũng đã được tìm thấy trong các loài hải miên Lissodendoryx. Các hợp chất đã được đánh giá hoạt tính chống ung thư. Một chất tổng hợp của chúng được gọi là E7389, hiện đang trong thử nghiệm lâm sàng đối với bệnh ung thư phổi. Discodermolide, được tìm thấy trong các loài hải miên Discodermia dissolute, chúng đang trong các thử nghiệm lâm sàng đối với các khối u rắn. Agelasphins từ loài hải miên mauritianus Agelas có hoạt tính chống ung thư và kích thích miễn dịch. Hiện trong các thử nghiệm lâm sàng cho điều trị miễn dịch ung thư. Psammaplin A là một hợp chất lần đầu tiên được tìm thấy trong loài hải miên Psammaplysilla. Nó là một cấu trúc dẫn cho các hợp chất chống ung thư tổng hợp NVPLAQ824 và cho kháng sinh chống lại các vi khuẩn Staphylococcus aureus. Contignasterol được phân lập từ các loài hải miên Petrosia contignata. Các dẫn xuất tổng hợp của hợp chất này trong các thử nghiệm lâm sàng đối với bệnh hen suyễn và viêm da và mắt Newman &Cragg (2004). 1.2. Tình hình nghiên cứu hải miên 12 Hải miên (Porifera) là nhóm sinh vật đa bào nguyên thủy có cấu trúc cơ thể khá đơn giản có thể tìm thấy tại hầu hết các thủy vực, nhưng chủ yếu ở biển. Hiện nay, ước tính trên thế giới có khoảng 9000 loài. Hải miên dinh dưỡng bằng cách lọc nước biển, vì thế nó có khả năng làm sạch nước biển thông qua các hoạt động sống của mình. Trong quá trình dinh dưỡng đó hải miên cũng thu nhận một số chất có độc tính, được tiết ra bởi một số loại động, thực vật (các loại san hô sống trên cạn…). Thông qua quá trình sinh học phức tạp, các chất này sẽ được hấp thu và sử dụng như là “ kho hóa chất” cho những mục đích khác nhau của chúng ( dùng để chống lại các loài động vật ăn thịt, động vật ký sinh và ức chế các sinh vật khác trong việc cạnh tranh nguồn thức ăn và không gian sống). Hiện nay hải miên đang là đối tượng được quan tâm trong lĩnh vực tìm kiếm những nguồn dược liệu có nguồn gốc từ tự nhiên và đã thu được các kết quả tốt trong việc tìm ra các hợp chất chống ung thư và một số bệnh khác. Một số nơi như ở New Zealand đã tiến hành nuôi trồng một số hải miên có giá trị phục vụ cho mục đích thương mại cũng như cho việc nghiên cứu chiết xuất các chất có hoạt tính sinh học. 1.2.1. Tình hình nghiên cứu hải miên trên thế giới Hải miên đã từ lâu thu hút được sự chú ý của nhiều nhà khoa học, việc nghiên cứu khu hệ diễn ra từ khá sớm, có thể quá trình nguyên cứu thành một số giai đoạn sau. Giai đoạn 1: Cuối thế kỷ 18 đến giữa thế kỷ 19 Mẫu vật thu thập mang tính đơn lẻ, rải rác và các công trình công bố còn nghèo nàn và không rõ ràng về điệu kiện tự nhiên của khu vực nghiên cứu, điển hình là các công trình của các tác giả: Esper, 1797.1830: Grant, 1836 trình bày các vấn đề tổng quát về giới động vật. Gray, 1858.1870 mô tả một số chi mới trong lớp hải miên đá vôi (chi Aphroceras) tại quần đảo Malacca và một số chi tại vùng tây Australia. Bowerbank và Norman, 1969, Bowerbank, 1872, 1877 trình bày những vấn đề tổng quan về hải miên và mô tả 5 loài mới ở quần đảo Philipin, NewGuinea. Giai đoạn 2: Cuối thế kỷ 19 đến giữa thế kỷ 20 13 Mẫu vật được thu thập trong các cuộc thám hiểm của các nhà khoa học Châu Âu, các mô tả đã chi tiết hơn như: Carter, 1883,1887 nêu về sự phân bố và các kiến thức về hải miên, trong khoảng thời gian 1873-1876 có cuộc hành trình vòng quanh thế giới của tàu Challenger, trên tàu tập hợp đông đảo các nhà khoa học lúc bấy giờ. Mẫu vật thu thập được trong chiến hành trình này cung cấp khá nhiều thông tin cho các nhà khoa học và một loạt các báo cáo khoa học đã được công bố sau hành trình của tàu Challenger điển hình là các báo cáo như sau: Polesjaef , 1884 công bố về thành phần loài hải miên đá vôi Calcarea thu thập được trong chuyến hành trình. Ridley và Dendy, 1886,1887 công bố về nhóm hải miên Monaxonida; Sollas, 1886, 1888 công bố về nhóm hải miên Tetractinellidae ; ngoài ra còn có các công trình công bố khác như của Lindgren, 1897,1898 công bố về khu hệ hải miên tại quần đảo Malaysia; Topsent, 1897 công bố những nghiên cứu về hải miên tại vịnh Amboine; Sollas, 1902 công bố về hải miên tại vùng biển Malaysia; Vosmaer, 1902 mô tả chi tiết mới Placospongia và Spirastrella tại vùng biển Siboga; Wilson, 1925 công bố về nhóm hải miên silic thu thập trong chuyến thám hiểm tại quần đảo Philipin; Ijima, 1926 công bố về thành phần loài của hải miên Hexactinellida báo cáo tình hình mẫu vật về Hải miên sống tại các vùng nước nông và các vùng nước sâu trong bảo tàng Ấn Độ; De Laubenfels, 1935 công bố về các nghiên cứu về hải miên thu thập từ Puerto Galera Mindoro, Philipin. Giai đoạn 3: Từ cuối thế kỷ 20 đến nay Có rất nhiều mẫu vật được thu thập nhưng phần lớn các mẫu vật trên vẫn chưa định loại chính xác hoặc chưa định loại được, phần lớn các nghiên cứu đã chuyển sang nghiên cứu về các cơ chế trao đổi chất của hải miên, các công trình về định loại còn lại rất ít tiêu biểu là: Caberoy, 1979, 1981; Caberoy & Tahil, 1983 công bố nghiên cứu về khu hệ hải miên tại Philippin (vịnh Tayabas); Esmero, 1978; công bố về thành phần loài hải miên vùng triều sống trên các giá thể nhân tạo tại cảng Cebu - Philippin; Levis C., 1961 công bố nghiên cứu về hải miên tại vùng biển Nha Trang Việt Nam và vùng biển Philippin; Pulitzer-Finali, 1980 nêu một số nghiên cứu về hải miên tại các vùng nước 14 nông ở Hồng Kông; Van Soest, 1980, 1989, 1990 công bố nghiên cứu về khu hệ hải miên ở khu vực Inđônêxia. Hofman & Van Soest, 1995 mô tả các loài thuộc chi Lissodendroryx (bộ Poecilosclerida, họ Coelosphaeridae); Hooper, 1993 mô tả loài Oceanapia sagittaria (bộ Haplosclerida, họ Phloeodictyidae); Hooper, 1994 công bố danh mục các loài hải miên của Australia. Gần đây nhất trong dự án kéo dài 7 năm tập hợp gần 50 các chuyên gia về phân loại hải miên do Hooper &Soest chủ trì đã công bố cuốn sách “Systema Porifera” đây là hệ thống phân loại mới nhất đã được chỉnh sửa. 1.2.2. Tình hình nghiên cứu hải miên tại Việt Nam Ớ Việt Nam từ trước cho tới nay chưa có công trình nghiên cứu nào nghiên cứu một cách kỹ lưỡng khu hệ hải miên mà chủ yếu việc nghiên cứu đối tượng này được kết hợp với việc nghiên cứu nguồn lợi sinh vật. Các công trình nghiên cứu chỉ được đề cập tới trong các báo cáo về thành phần loài trong khu vực biển đông hoặc khu vực Ấn Độ Thái Bình Dương của một số tác giả, các báo cáo về thành phần loài hải miên điển hình có thể liệt kê (theo thứ tự thời gian) như sau: - Báo cáo của Lindgren N.G., 1897, 1898 công bố khoảng 20 loài hải miên tại khu vực quần đảo Malaysia và vùng biển Đông - Lévi. C. 1961 công bố 28 loài hải miên tại khu vực biển Nha Trang - Hooper J.N.A., Kennedy J.A. & van Soest R.W.M., 2000 công bố danh sách hon 1500 loài hải miên thuộc 102 họ của vùng biển Đông, trong đó có Việt Nam. - Năm 2002 các chuyên gia hoạt động trong dự án hợp tác Việt Nam - Italia về bảo tồn đa dạng sinh học dải ven biển Việt Nam khi nghiên cứu tại khu vực vịnh Hạ Long (Quảng Ninh) và khu đầm phá Tam Giang - Cầu Hai (Thừa Thiên Huế) đã phát hiện 161 loài hải miên thuộc 41 họ. 1.3. Quá trình oxy hóa và chất chống oxy hóa 1.3.1. Quá trình oxy hóa Sự oxy hóa là một quá trình sinh hóa xảy ra trong cơ thể sinh ra các gốc tự do khi có mặt của oxy phân tử. 15 Hình 1.14. Gốc tự do Theo định nghĩa, gốc tự do ( Free radical) là bất cứ phân tử hóa chất nào chỉ có một điện tử duy nhất ( electron mang điện âm) hay một số lẻ điện tử. Đôi khi, trong diễn tiến hóa học, một điện tử bị tách rời khỏi nhóm và phân tử đó trở thành một gốc tự do, với số lẻ điện tử. Do đó, nó không cân bằng, đầy đủ nên rất bất ổn, dễ tạo ra phản ứng. Nó luôn luôn tìm cách chiếm đoạt điện tử mà nó thiếu từ các phân tử khác, và lần lượt tạo ra một chuỗi những gốc tự do mới, gây rối loạn cho sinh học bình thường của tế bào. Chính do chứa điện độc thân mà gốc tự do có hoạt tính rất mạnh, nó luôn sẵn sàng thực hiện oxi hóa, nhận điện tử của chất mà nó tiếp xúc (để ghép đôi với điện tử độc thân của nó) và làm chất bị nó oxy hóa bị hủy hoại nặng nề. Năm 1954, bác sĩ Denham Harman thuộc Đại Học Berkeley, California, là khoa học gia đầu tiên nhận ra sự hiện hữu của gốc tự do trong cơ thể với nguy cơ gây ra những tổn thương cho tế bào. Trước đó, người ta cho rằng gốc tự do này chỉ có ở ngoài cơ thể. Tia tử ngoại, môi trường ô nhiễm, stress, chất phụ gia trong thức ăn, các chất có hại trong mỹ phẩm, thuốc lá, uống rượu quá đà, lạm dụng dược phẩm... là những tác nhân chính gây ra gốc tự do. 16 Hình 1.15. Nguồn gốc hình thành gốc tự do Gốc tự do có tác dụng không tốt cho cơ thể liên tục ngay từ lúc con người mới sinh ra và mỗi tế bào chịu sự tấn công của cả chục nghìn gốc tự do mỗi ngày. Ở tuổi trung niên, cơ thể mạnh, trấn áp được chúng, nhưng tới tuổi cao, sức yếu, gốc tự do lấn át, gây thiệt hại nhiều gấp mười lần ở người trẻ. Nếu không bị kiểm soát, kiềm chế, gốc tự do gây ra các bệnh thoái hóa như ung thư, xơ cứng động mạch, làm suy yếu hệ thống miễn dịch gây dễ bị nhiễm trùng, làm giảm trí tuệ, teo cơ quan bộ phận người cao niên. Nó phá rách màng tế bào khiến chất dinh dường thất thoát, tế bào không tăng trưởng, tu bổ, rồi chết. Nó tạo ra chất lipofuscin tích tụ dưới da khiến ta có những vết đồi mồi trên mặt, trên mu bàn tay. Nó tiêu hủy hoặc ngăn cản sự tổng hợp các phân tử chất đạm, đường bột, mỡ, enzyme trong tế bào. Nó gây đột biến ở gene, ở nhiễm thể, ở DNA, RNA. Nó làm chất collagen, elastin mất đàn tính, dẻo dai khiến da nhăn nheo, cơ khớp cứng nhắc. Theo các nhà nghiên cứu, gốc tự do hủy hoại tế bào theo diễn tiến sau đây: Trước hết, gốc tự do oxy hóa màng tế bào, gây trở ngại trong việc thải chất bã và tiếp nhận thực phẩm, dưỡng khí; rồi gốc tự do tấn công các ty lập thể, phá vỡ nguồn cung cấp năng lượng. Sau cùng, bằng cách oxy hóa, gốc tự do làm suy yếu kích thích tố, enzym khiến cơ thể không tăng trưởng được. 17 Trong tiến trình hóa già, gốc tự do cũng dự phần và có thể là nguy cơ gây tử vong. Hóa già được coi như một tích tụ những đổi thay trong mô và tế bào. Theo bác sĩ Denham Harman, các gốc tự do là một trong nhiều nguyên nhân gây ra sự hoá già và sự chết cuả các sinh vật. Ông cho rằng gốc tự do phản ứng lên ty lạp thể, gây tổn thương các phân tử bằng cách làm thay đổi hình dạng, cấu trúc, khiến chúng trở nên bất khiển dụng, mất khả năng sản xuất năng lượng. Do quan sát, người ta thấy gốc tự do có ít ở các sinh vật chết non, có nhiều hơn ở sinh vật sống lâu. Người cao tuổi có nhiều gốc tự hơn là khi người đó còn trẻ. Theo các nhà khoa học thì gốc tự do có thể là thủ phạm gây ra tới trên 60 bệnh, đáng kể nhất gồm có: Bệnh xơ vữa động mạch, ung thư, Alzheimer, Parkinson, đục thuỷ tinh thể, bệnh tiểu đường, cao huyết áp không nguyên nhân, xơ gan. Tuy nhiên, không phải là gốc tự do nào cũng phá hoại. Đôi khi chúng cũng có một vài hành động hữu ích. Nếu được kiềm chế, nó là nguồn cung cấp năng lượng cho cơ thể; tạo ra chất mầu melanine cần cho thị giác; góp phần sản xuất prostaglandins có công dụng ngừa nhiễm trùng; tăng cường tính miễn dịch; làm dễ dàng cho sự truyền đạt tín hiệu thần kinh, co bóp cơ thịt. Trong cơ thể có rất nhiều loại gốc tự do, mà các gốc nguy hiểm hơn cả là superoxide, ozone, hydrogen peroxide, lipid peroxy nhất là hydroxyl radical, một gốc rất phản ứng và gây ra nhiều tổn thương.. 1.3.2. Chất chống oxy hóa Chất chống oxy hóa là một loại hóa chất giúp ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình oxi hóa chất khác. Sự oxy hóa là loại phản ứng hóa học trong đó electronđược chuyển sang chất oxy hóa, có khả năng tạo các gốc tự do sinh ra phản ứng dây chuyền phá hủy tế bào sinh vật. Chất chống oxy hóa ngăn quá trình phá hủy này bằng cách khử đi các gốc tự do, kìm hãm sự oxy hóa bằng cách oxy hóa chính chúng. Để làm vậy người ta hay dùng các chất khử (như thiol hay polyphenol) làm chất chống oxy hóa. 18 Hình 1.16. Chất chống oxi hóa Chất chống oxy hóa là những chất làm vô hiệu hóa tác động của gốc tự do. Cụ thể hơn, chất ôxy hóa có electron dư thừa để cung cấp cho gốc tự do, nhờ vậy làm vô hiệu hóa tác hại của gốc tự do. Cơ thể chúng ta có thể tự sản xuất các chất chống oxy hóa. Tuy nhiên khi tuổi tác càng cao hoặc trong điều kiện môi trường ô nhiễm, thức ăn chứa nhiều độc tố hoặc ăn uống không đủ chất dinh dưỡng, khoáng chất, vitamin v.v làm các gốc tự do xuất hiện quá nhiều nhưng cơ thể lại không sản xuất đủ chất chống oxy hóa. Do đó cần bổ sung chất chống oxy từ các sản phẩm hoặc thực phẩm bên ngoài. Các chất chống oxy hoá có thể bổ sung vào cơ thể như: beta-caroten, chất khoáng selen, các hợp chất flavonoid, polyphenols... Các chất oxy hoá ngoại sinh này thật không xa lạ, chúng có từ các nguồn thiên nhiên là thực phẩm như rau cải, trái cây tươi và một số loại dược thảo. Ngoài ra trong thực phẩm, các loại phụ gia vừa tạo mùi vị cho sản phẩm còn đóng vai trò là chất chống oxy hóa giúp ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình oxy hóa của các chất khác có trong thực phẩm. 19 1.3.3. Một số phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa được áp dụng phổ biến 1.3.3.1. Phương pháp phân tích hoạt tính khử gốc tự do DPPH Gốc tự do 2,2 diphenyl-1picrylhydrazine (DPPH) đã đượcGoldschmidt và Rern phát hiện ra vào năm 1992. Gốc tự do DPPH khá bền, không phản ứng với oxy, có màu tím như màu của dung dịch KMnO4, không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ như methanol hoặc ethanol. Dung dịch DPPH có độ hấp thụ cực đại ánh sáng tại bước sóng 517 nm, sản phẩm khử của nó là 2,2 diphenyl-1picrylhydrazine (DPPH – H) có màu vàng cam. Nguyên lý: Các chất có hoạt tính chống oxy hóa sẽ trung hòa gốc tự do DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thụ tại bước sóng 517 nm và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt. Dựa vào sự biến đổi độ hấp thụ ở bước song 517 nm của dung dịch phản ứng để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa theo cơ chế khử gốc tự do. 1.3.3.2. Phương pháp phân tích tổng năng lực khử Nguyên lý: Khi cho chất chống oxy hóa phản ứng với kali ferricyanide, acid trichloroacetic và clorua sắt III ở 50oC trong thời gian 20 phút sẽ tạo thành phức màu xanh làm tăng độ hấp thụ của hỗn hợp ở bước sóng 700nm. Hoạt tính chống oxy hóa tăng tỷ lệ thuận với độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng ở bước sóng 700nm 1.3.3.3. Phương pháp phân tích hoạt tính khử hydrogen peroxide Nguyên lý: Khi cho chất chống oxy hóa vào dung dịch hydrogen peroxide, chất chống oxy hóa sẽ khử gốc tự do hydroxyl tạo thành trong dung dịch làm giảm nồng độ hydrogen peroxide. Dựa vào sự thay đổi nồng độ hydrogen peroxide để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa. 20 1.4. Hoạt chất sinh học chống oxi hóa từ hải miên Trong số các nguồn hoạt chất sinh học chống oxy hóa từ tự nhiên, hải miên được xếp vào hạng có chứa hoạt chất sinh học chống oxy hóa cao. Một số chất chuyển hóa có nguồn gốc từ loài hải miên như polypeptide, saponin, sterol, flavonoid, glycoside và các hợp chất phenol cho thấy có khả năng chống oxy hóa mạnh so với vitamin E và vitamin C (Halliwell, 1994; Li và cộng sự, 1994; Chairman và Singh, 2012). Nghiên cứu của Li và cộng sự (1994) cho thấy các hoạt chất sinh học chiết xuất từ hải miên Aspergillus có khả năng chống oxy hóa cao hơn đáng kể so với hydroxytoluene butylated (BHT). Ngoài ra Sato và cộng sự (2006) cũng đã tìm thấy các hợp chất carotenoids, polyphenol, glutathione trong một số loài hải miên, đây là những hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa cao. 1.5. Đặc điểm của các nhóm hoạt chất sinh học chống oxi hóa có trong hải miên 1.5.1. Nhóm các hợp chất phenol Các hợp chất phenol là nhóm hợp chất hữu cơ có chứa một hay nhiều nhóm hydroxyl (-OH) gắn với một hay nhiều vòng thơm. Cấu trúc của chúng tương tự các hợp chất dạng rượu nhưng lớp phenol có các thuộc tính duy nhất chỉ chúng có (do nhóm hydroxyl không liên kết với nguyên tử cacbon no). Trong cấu trúc của chúng, vòng thơm kết hợp mạnh với nguyên tử oxy và liên kết tương đối lỏng lẻo giữa nguyên tử oxy này với nguyên tử hydro trong nhóm hydroxyl do đó dễ tách nguyên tử hydro ra khỏi nhóm nên chúng có tính acid tương đối cao. Một số polyphenol thực vật tiêu biểu như catechine, flavanone, anthocyanidin, flavones, flavonol, isoflavone, acid hydroxycinnamic, lignin, tachin. Polyphenol là những hợp chất phân cực nên thường dùng các dung môi phân cực để chiết tách chúng ra khỏi nguyên liệu, các dung môi thường dùng để tách chiết như nước cất, ethanol, methanol,… Trong đó, dung môi được sử dụng phổ biến là nước cất và ethanol do tính an toàn, có khả năng hòa tan tốt các polyphenol, cũng như giá thành rẻ. 1.5.2. Nhóm hợp chất sterol 21 Sterol là rượu đa vòng, no đơn chức và là dẫn xuất của steran. Các sterol là các chất kết tinh, dễ tan trong cloroform, ete, rượu nóng…, không tan trong nước. Đặc tính của sterol là không phân cực, nên rất kém tan trong nước nhưng tan trong dầu béo và các dung môi hữu cơ không phân cực như ete, dầu hỏa, benzen, cloroform, aceton,… nên thường dùng các dung môi này để chiết sterol ra khỏi nguyên liệu. Đối với các sterol glycoside có thể chiết bằng ethanol. Sản phẩm chiết bằng dung môi hữu cơ thường là hỗn hợp của sterol và các chất béo, các chất kém phân cực khác có trong nguyên liệu như lipid (đối với sterol động vật), caroten, leucithin (đối với sterol thực vật). Phải thực hiện phản ứng xà phòng hóa để tách các chất này ra khỏi sterol, sau đó chiết sterol bằng dung môi hữu cơ. Thực hiện sắc ký (cột, lớp mỏng, giấy,...) để phân lập hoặc kết tinh phân đoạn, tinh chế sterol. 1.5.3. Nhóm hợp chất flavonoid Flavonoid là một nhóm hợp chất tự nhiên lớn thường gặp trong thực vật, có ở phần lớn các bộ phận của các loại thực vật bậc cao. Flavonoid có khung cơ bản là C6C3-C6 gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 cacbon, cấu trúc có thể là vòng kín hoặc mở. Trong thực vật, flavonoid tồn tại chủ yếu ở hai dạng: dạng tự do (aglycol) và dạng liên kết với đường (glycoside). Trong đó, dạng aglycol thường tan trong các dung môi hữu cơ như ete, aceton, cồn nhưng hầu như không tan trong nước, còn dạng glycoside thì tan trong nước nhưng không tan trong các dung môi không phân cực như aceton, benzen, chloroform. 1.5.4. Nhóm hợp chất saponin Saponin là hợp chất hữu cơ được cấu tạo gồm phần đường (glucose, galactose, pentose, metyl pentose,...) và phần sapogenin (aglycol). Phân sapogenin có thể là steroid hay triterpenoid. Saponin có tính chất chung là khi hoà tan vào nước có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch tạo nhiều bọt, có tính chất phá huyết, độc đối với động vật máu lạnh nhất là đối với cá, tạo thành phức với cholesterol, có vị hắc và làm hắt hơi mạnh. Thường các steroid saponin thì tả truyền còn triterpenoid saponin thì hữu 22 truyền. Điểm nóng chảy của các sapogenin thường rất cao. Saponin là hợp chất phân cực nên thường sử dụng các dung môi phân cực để chiết xuất saponin. 1.5.5. Nhóm hợp chất polypeptide Polypeptide là hợp chất hữu cơ được cấu tạo từ các acid amin liên kết với nhau bằng liên peptide. Khác với protein, polypeptide có khối lượng phân tử dưới 10.000 Da trong khi protein có khối lượng phân tử lớn hơn. Nhiều nghiên cứu chứng minh rằng các polypeptide có hoạt tính chống oxy hóa in vitro như khử các gốc tự do diphenyl-1-picryhydradzyl (DPPH), superoxide, hydroxyl, tạo phức càng với ion kim loại, khử sắt và chống oxy hóa acid linoleic (Elias và cộng sự, 2008). Đặc tính chống oxy hóa của polypeptide phụ thuộc vào cấu trúc, thành phần acid amin và khối lượng phân tử của peptide (Tang và cộng sự, 2009; Udenigwe và Aluko, 2011). Nước và các dung môi phân cực hòa tan tốt polypeptide nên chúng được sử dụng để chiết xuất peptide. 1.5.6. Nhóm hợp chất glycoside Glycoside là hợp chất hữu cơ được cấu tạo gồm phần đường (glucose, ramnose, digitoxose, xymarose,...) và phần aglycol (steroid, sterol, acid mật, hormon,...). Tùy theo đặc điểm cấu tạo của aglycol mà glycoside có hoạt tính sinh học khác nhau. Hoạt tính chống oxy hóa của glycoside khác nhau phụ thuộc vào độ hòa tan và sự oxy hóa aglycon chứa monosaccharide hoặc disaccharide ở vị trí C3. Glycoside là hợp chất phân cực nên hòa được trong các dung môi phân cực như nước cất, methanol, ethanol,... Vì vậy, để chiết xuất glycoside thường sử dụng các dung môi phân cực. 1.6. Phương pháp chiết tách các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học 1.6.1. Chiết xuất với sự hỗ trợ của siêu âm (Ultrasound-assisted extraction) Trong quá trình chiết xuất, sóng siêu âm được áp dụng để tăng hiệu quả chiết nhờ tác dụng phá vỡ cấu trúc tế bào, tăng cường khả năng tiếp xúc giữa dung môi với các chất tan có trong nguyên liệu, làm tăng sự hòa tan của chất tan vào dung môi và tăng quá 23 trình khuếch tán chất tan. Sóng siêu âm thường được sử dụng trong chiết xuất có tần số từ 20 KHz đến 100MHz. Ưu điểm của phương pháp chiết xuất với sự hỗ trợ của siêu âm là rút ngắn đáng kế thời gian chiết, có thể áp dụng được cho hầu hết các loại dung môi có độ phân cực khác nhau, lượng dung môi sử dụng ít, chi phí thấp và giảm ô nhiễm môi trường. Phương pháp này không áp dụng được đối với những hợp chất dễ bị phân hủy hoặc có hoạt tính không ổn định dưới tác dụng của sóng siêu âm. Trong nghiên cứu hoặc chuấn bị mẫu phân tích thường chiết xuất với thế tích nhỏ nên có thế nhúng bình chiết vào một bế siêu âm có chứa nước, sóng siêu âm phát ra từ các đầu phát sẽ truyền qua môi trường nước và đi vào hỗn hợp chiết. Trong chiết xuất ở quy mô lớn hơn, đầu phát siêu âm thường được nhúng trực tiếp vào bình chiết chứa nguyên liệu và dung môi. Trong quá trình chiết với sự hỗ trợ của siêu âm, hỗn hợp chiết với dung môi phân cực sẽ nóng lên. Trong một số trường hợp có thể kết hợp gia nhiệt để tăng cường quá trình chiết xuất. Trong nghiên cứu các hoạt chất sinh biến, chiết xuất với sự hỗ trợ của siêu âm được áp dụng để chiết xuất các chất màu chllorophyll và carotenoid từ tảo (Hosikian và cộng sự, 2010; Pasquet và cộng sự, 2011), chiết xuất lipid giàu DHA từ tảo Crypthecodinium cohnii (Cravotto và cộng sự, 2008), gan cá thu và gan cá tuyết (Batista và cộng sự, 2001). 1.6.2. Chiết xuất với sự hỗ trợ của vi sóng (Microwave-assisted extraction) Chiết xuất với sự hỗ trợ của vi sóng được Ganzler và cộng sự mô tả lần đầu tiên vào năm 1986, nó được áp dụng để chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký. Nhiều nghiên cứu sau đó đã áp dụng kỹ thuật này để chiết xuất các hợp chất từ hạt giống, thức ăn,... Kết quả cho thấy chiết xuất với sự hỗ trợ của vi sóng hiệu quả hơn so vói các phương pháp cổ điển như Soxhlet hoặc ngâm chiết. Trong nhũng năm gần đây, kỹ thuật này được phát triến và ứng dụng rộng rãi để chiết tách các hợp chất tự nhiên từ các mẫu sinh học. 24 Vi sóng là sóng điện từ có tần số từ 300 MHz đến 300 GHz. Khi chiếu bức xạ điện từ vi sóng vào môi trường các chất phân cực, các phân tử sẽ chịu đồng thời 2 tác động: sự dẫn truyền ion và sự quay lưỡng cực dưới tác dụng của điện trường (Thuery, 1992; Demesmay và Olle, 1993; Sinquin và cộng sự, 1993), cả hai tác động này làm sinh ra nhiệt trong lòng khối vật chất. Ở tần số 2450 MHz hiện tượng này xảy ra 4,9 X 109 lần trong một giây (Ganzler và cộng sự, 1990; Sinquin và cộng sự, 1993; Barnabas và cộng sự, 1995; Onuska và Terry, 1995), làm cho việc gia nhiệt rất nhanh và hiệu quả hơn nhiều so vói phương pháp dẫn nhiệt truyền thống. Chính vì lẽ đó, hằng số điện môi và giá trị mô men lưỡng cực của dung môi tăng lên. Trong chiết xuất, khi chiếu bức xạ điện từ vi sóng vào hỗn hợp chiết (nguyên liệu có chứa hoạt chất sinh học và dung môi phân cực), các phân tử dung môi và các chất phân cực sẽ dao động và nóng lên nhanh chóng làm tăng khả năng hòa tan các chất vào dung môi. Thêm vào đó, vi sóng cũng làm phá hủy cấu trúc vách tế bào nguyên liệu, giải phóng các chất tan trực tiếp vào dung môi chiết, chuyển quá trình chiết thành quá trình hòa tan đơn giản. Điều này làm cho việc chiết xuất nhanh hơn nhưng cũng làm cho dịch chiết có nhiều tạp chất hơn. Việc sử dụng vi sóng hỗ trợ chiết xuất hoạt chất sinh học ở quy mô phòng thí nghiệm được áp dụng thay thế cho các phương pháp chiết xuất truyền thống, rút ngắn thời gian chiết xuống còn từ vài phút đến vài chục phút. Hiện nay, chiết xuất với sự hỗ trợ của vi sóng đã được áp dụng ở quy mô lớn. Nhược điểm chính của phưong pháp này là dịch chiết có chứa nhiều tạp chất hơn nên cần phải có phương pháp tách loại tạp chất. Chiết xuất với sự hỗ trợ của vi sóng đã được áp dụng trong nghiên cứu các hoạt chất sinh biển như chiết xuất carotenoid từ tảo Dunaliella tertiolecta và Cylindrotheca closterium (Pasquet và cộng sự, 2011), chiết xuất lipid giàu DHA từ tảo Criypthecodlnlum cohnii (Cravotto và cộng sự, 2008), gan cá thu và gan cá tuyết (Batista và cộng sự, 2001). 1.6.3. Chiết xuất bằng chất lỏng siêu tới hạn (Supercritical fluid extraction) 25 Phương pháp chiết xuất bằng chất lỏng quá siêu tới hạn được Hannay và Hogarth đưa ra đầu tiên vào năm 1879. Tuy nhiên, phải đến khoảng năm 1960 phương pháp chiết xuất này mới được nghiên cứu kỹ lưỡng (Hosikian và cộng sự, 2010) để áp dụng thay thế cho các phương pháp chiết xuất thông thường như chiết xuất lỏng - rắn và chiết xuất lỏng - lỏng nhằm làm giảm ô nhiễm do sử dụng quá nhiều hóa chất độc hại như các dung môi dẫn xuất của chlorin. Nguyên lý của phương pháp chiết xuất bằng chất lỏng quá tới hạn dựa trên việc sử dụng các dung môi ở nhiệt độ và áp suất trên điểm tới hạn của chúng. Ở điều kiện này, dung môi tồn tại ở trạng thái lỏng đặc biệt gọi là chất lỏng quá tới hạn. Chất lỏng này không giống với trạng thái lỏng thông thường mà mang cả đặc tính của cả chất khí và chất lỏng. Điếm ứng với nhiệt độ và áp suất mà một chất chuyển từ trạng thái hơi sang trạng thái lỏng này được gọi là điểm tới hạn (critical point) của chất đó. 1.6.4. Chiết xuất bằng chất lỏng dưới áp suất cao (Pressurised liquid extraction) Chiết xuất bằng chất lỏng dưới áp suất cao là một trong những kỹ thuật chiết hiện đại được áp dụng trong chiết xuất các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học. Nguyên lý của phương pháp này dựa vào đặc điểm là khả năng hòatan của các chất trong dung môi phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ. Khi nhiệt độ tăng, khả năng hòa tan các chất tăng. Vì vậy, xu huớng trong chiết xuất là tăng nhiệt độ để giảm lượng dung môi sử dụng và thời gian chiết. Tuy nhiên, trong điều kiện bình thường, khi tăng nhiệt độ chiết đến nhiệt độ sôi dung môi bị hóa hơi không còn khả năng hòa tan các chất nữa. Vì nhiệt độ sôi của dung môi phụ thuộc vào áp suất nên để tăng nhiệt độ sôi của dung môi phải thực hiện quá trình chiết dưới áp suất cao. Khi nhiệt độ chiết tăng, khả năng hòa tan của dung môi tăng lên. Trong chiết xuất dưới áp suất cao, dung môi chiết được đưa đến nhiệt độ và áp suất gần với vùng tới hạn. Ở điều kiện nhiệt độ và áp suất cao làm tăng khả năng hòa tan và khuếch tán của dung môi nên chiết xuất đạt hiệu quả hơn. Nhiệt độ có thể thay đổi từ 80 - 200°C và áp suất có thể lên đến 150 bar tùy theo loại dung môi và hợp chất cần chiết. 26 So với phương pháp chiết xuất bằng chất lỏng quá siêu tới hạn, phương pháp chiết xuất này có sự linh hoạt hơn trong việc lựa chọn dung môi nên có thể chiết xuất được các chất trong một giới hạn rộng hơn về độ phân cực. Thiết bị chiết cũng không cần đạt áp suất cao nghiêm ngặt như trong chiết xuất bằng chất lỏng quá siêu tới hạn nên dễ dàng áp dụng thực tế trên quy mô lớn. Trong nghiên cứu và sản xuất hoạt chất sinh học, chiết xuất bằng chất lỏng dưới áp suất cao đã được sử dụng đế chiết ở quy mô phòng thí nghiệm, chuẩn bị mẫu phân tích hay chiết các chất ở quy mô lớn. Một số hợp chất và điều kiện chiết xuất đã được nghiên cứu như: Chiết dioxin bằng toluen hoặc toluen có chứa 5% acid acetic ở nhiệt độ 150°C và áp suất 150 bar; chiết lipid bằng n-hexan ở nhiệt độ 100°C và áp suất 100 bar; chiết hypericin trong Hypericum perforatumbằng acetonitril ở nhiệt độ 100°C và áp suất 100 bar. Một biến thể của chiết xuất bằng chất lóng dưới áp suất cao cũng được áp dụng trong chiết xuất hoạt chất sinh học là chiết xuất bằng nước nóng dưới áp suất cao (pressurized hot water extraction). Do điểm tới hạn của nước khá cao nên phương pháp này được thường thực hiện ở áp suất thấp hơn nhiều (chỉ vào khoảng 20 bar) ở nhiệt độ thay đổi từ trên 100 - 200°C. Trong điều kiện này, độ phân cực của nước bị thay đổi rất nhiều nên có thể chiết được các chất kém phân cực. Trong chiết xuất bằng nước nóng dưới áp suất cao, có thể xảy ra sự phân hủy các chất. 27 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu và hóa chất 2.1.1. Nguyên liệu Hải miên (Spongia sp.) sử dụng trong nghiên cứu này được lấy mẫu ở vùng biển Phú Quốc vào tháng 12 năm 2014. Hình 2.1. Loài hải miên Spongia sp lấy mẫu ở vùng biển Phú Quốc Ngay sau khi lấy mẫu, hải miên được ướp lạnh và vận chuyển về phòng thí nghiệm Trường Đại học Nha Trang. Tại phòng thí nghiệm, hải miên được bảo quản đông ở nhiệt độ - 20oC để sử dụng cho nghiên cứu này. 2.1.2. Hóa chất 2,2 diphenyl-1picrylhydrazine (DPPH), Bovine serum albumin (BSA), Folin– Ciocalteu reagent được mua từ công ty Sigma-Aldrich, Hoa Kỳ. Các hóa chất còn lại là loại đạt tiêu chuẩn dùng cho phân tích hóa học, được mua từ công ty Loba Chemie, Ấn Độ và công ty Wako, Nhật Bản. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Bố trí thí nghiệm 2.2.1.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát Quy trình dự kiến chiết tách chất chống oxy hóa từ hải miên 28 a. Sơ đồ quy trình dự kiến Hải miên đã được cấp đông Rã đông Băm nhuyễn Các điều kiện thích hợp Ngâm chiết Lọc Dịch chiết Hình 2.2. Sơ đồ quy trình dự kiến tách chiết chất chống oxy hóa từ Hải miên b. Thuyết minh quy trình: Nguyên liệu hải miên đã bảo quản đông được đem đi rã đông bằng nước ở nhiệt độ phòng. Hải miên sau khi rã đông được băm nhuyễn và đưa đi tách chiết chất chống oxy hóa trong điều kiện chiết tách thích hợp (loại dung môi, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, thời gian, nhiệt độ). Tiến hành lọc thu được dịch chiết. 29 2.2.1.2. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của loại dung môi có hỗ trợ siêu âm đến khả năng chống oxi hóa và hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên + Sơ đồ bố trí thí nghiệm 30 Hải miên đã được bảo quản đông Rã đông Băm nhuyễn Siêu âm bằng ethanol Tỷ lệ DM/NL: 2/1 Thời gian: 10 phút Nhiệt độ: 300C Siêu âm bằng methanol Tỷ lệ DM/NL: 2/1 Thời gian: 10 phút Nhiệt độ: 300C Siêu âm bằng Nước cất Tỷ lệ DM/NL: 2/1 Thời gian: 10 phút Nhiệt độ: 300C Lọc 1 Siêu âm bằng Clorofrom Tỷ lệ DM/NL: 2/1 Thời gian: 10 phút Nhiệt độ: 300C Dịch chiết 1 Bã Siêu âm bằng ethanol Tỷ lệ DM/NL: 2/1 Thời gian: 10 phút Nhiệt độ: 300C Siêu âm bằng methanol Tỷ lệDM/NL: 2/1 Thời gian: 10 phút Nhiệt độ: 300C Siêu âm bằng Nước cất Tỷ lệ DM/NL: 2/1 Thời gian: 10 phút Nhiệt độ: 300C Siêu âm bằng Clorofrom Tỷ lệ DM/NL: 2/1 Thời gian: 10 phút Nhiệt độ: 300C 31 Lọc 2 Dịch chiết 2 Bã Siêu âm bằng ethanol Tỷ lệ DM/NL: 2/1 Thời gian: 10 phút Nhiệt độ: 300C Siêu âm bằng methanol Tỷ lệ DM/NL: 2/1 Thời gian: 10 phút Nhiệt độ: 300C Siêu âm bằng Nước cất Tỷ lệ DM/NL: 2/1 Thời gian: 10 phút Nhiệt độ: 300C Lọc 3 Siêu âm bằng Clorofrom Tỷ lệ DM/NL: 2/1 Thời gian: 10 phút Nhiệt độ: 300C Bã Dịch chiết 3 Phân tích khả năng chống oxi hóa: - Khả năng khử gốc tự do DPPH -Tổng năng lực khử Phân tích hàm lượng protein. Xử lý số liệu và lựa chọn dung môi cho dịch chiết có hoạt tính chống oxi hóa và hàm lượng protein cao nhất. Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của loại dung môi có hỗ trợ siêu âm đến khả năng chống oxi hóa và hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên 32 + Cách tiến hành Hải miên sau khi rã đông được đem đi băm nghuyễn .Chuẩn bị 4 lọ thủy tinh có nắp đậy cho vào mỗi cốc 10g hải miên đã được băm nghuyễn. Sau đó bổ sung mỗi cốc bằng các dung môi methanol, ethanol, nước cất và cloroform. Lượng dung môi bổ sung vào là 20ml theo đúng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/2 rồi đậy kín nắp lại. Ta tiến hành cho vào thiết bị siêu âm nhiệt độ 300C thời gian chiết 10 phút rồi tiến hành lọc dịch chiết bằng giấy lọc Whatman 01 thu lấy dịch chiết và bổ sung các dung môi methanol, ethanol, nước cất và clorofrom tương ứng vào chính xác đến thể tích 20ml như ban đầu. Bã chiết của lần 1 được đem đi chiết lần 2 và 3 với dung môi, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi, thời gian, nhiệt độ giống như lần 1. Sau khi chiết 3 lần ta lấy mỗi lần chiết ra 10 ml cho vào lọ thủy tinh. Các lần chiết 1, 2, 3 ta định mức đến thể tích 30 ml bằng các dung môi tương ứng. Dịch chiết thu được lần 1,2,3 và tổng 3 lần chiết đem đi phân tích khả năng chống oxy hóa và hàm lượng protein để xác định dung môi chiết thích hợp cho dịch chiết có hoạt tính chống oxy hóa và hàm lượng protein cao nhất. Từ đó, chọn dung môi thích hợp nhất. 2.2.1.3. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của loại dung môi không có hỗ trợ siêu âm đến khả năng chống oxi hóa và hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên + Sơ đồ bố trí thí nghiệm 33 Hải miên đã được bảo quản đông Rã đông Băm nhuyễn Ngâm chiết trong ethanol Tỷ lệ DM/NL: 2/1 Thời gian: 10 phút Nhiệt độ: 300C Ngâm chiết trong methanol Tỷ lệ DM/NL: 2/1 Thời gian: 10 phút Nhiệt độ: 300C Ngâm chiết trong Nước cất Tỷ lệ DM/NL: 2/1 Thời gian: 10 phút Nhiệt độ: 300C Lọc 1 Ngâm chiết trong Clorofrom Tỷ lệ DM/NL: 2/1 Thời gian: 10 phút Nhiệt độ: 300C Dịch chiết 1 Bã Ngâm chiết trong ethanol Tỷ lệ DM/NL: 2/1 Thời gian: 10 phút Nhiệt độ: 300C Ngâm chiết trong methanol Tỷ lệDM/NL: 2/1 Thời gian: 10 phút Nhiệt độ: 300C Ngâm chiết trong Nước cất Tỷ lệ DM/NL: 2/1 Thời gian: 10 phút Nhiệt độ: 300C Ngâm chiết trong Clorofrom Tỷ lệ DM/NL: 2/1 Thời gian: 10 phút Nhiệt độ: 300C 34 Lọc 2 Dịch chiết 2 Bã Ngâm chiết trong ethanol Tỷ lệ DM/NL: 2/1 Thời gian: 10 phút Nhiệt độ: 300C Ngâm chiết trong methanol Tỷ lệ DM/NL: 2/1 Thời gian: 10 phút Nhiệt độ: 300C Ngâm chiết trong Nước cất Tỷ lệ DM/NL: 2/1 Thời gian: 10 phút Nhiệt độ: 300C Lọc 3 Ngâm chiết trong Clorofrom Tỷ lệ DM/NL: 2/1 Thời gian: 10 phút Nhiệt độ: 300C Bã Dịch chiết 3 Phân tích khả năng chống oxi hóa: - Khả năng khử gốc tự do DPPH -Tổng năng lực khử Phân tích hàm lượng protein. Xử lý số liệu và lựa chọn dung môi cho dịch chiết có hoạt tính chống oxi hóa và hàm lượng protein cao nhất. Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của loại dung môi không có hỗ trợ siêu âm đến khả năng chống oxi hóa và hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên + Cách tiến hành: 35 Hải miên sau khi rã đông được đem đi băm nghuyễn .Chuẩn bị 4 lọ thủy tinh có nắp đậy cho vào mỗi cốc 10g hải miên đã được băm nghuyễn. Sau đó bổ sung mỗi cốc bằng các dung môi methanol, ethanol, nước cất và cloroform. Lượng dung môi bổ sung vào là 20ml theo đúng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/2 rồi đậy kín nắp lại. Ta tiến hành chiết ở nhiệt độ 300C thời gian chiết 10 phút rồi tiến hành lọc dịch chiết bằng giấy lọc Whatman 01 thu lấy dịch chiết và bổ sung các dung môi methanol, ethanol, nước cất và clorofrom tương ứng vào chính xác đến thể tích 20ml như ban đầu.Bã chiết của lần 1 được đem đi chiết lần 2 và 3 với dung môi, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi, thời gian, nhiệt độ giống như lần 1. Sau khi chiết 3 lần ta lấy mỗi lần chiết ra 10 ml cho vào lọ thủy tinh. Các lần chiết 1, 2, 3 ta định mức đến thể tích 30 ml bằng các dung môi tương ứng. Dịch chiết thu được lần 1,2,3 và tổng 3 lần chiết đem đi phân tích khả năng chống oxy hóa và hàm lượng protein để xác định dung môi chiết thích hợp cho dịch chiết có hoạt tính chống oxy hóa và hàm lượng protein cao nhất. Từ đó, chọn dung môi thích hợp nhất. 2.2.2. Các phương pháp phân tích 2.2.2.1. Phương pháp phân tích khả năng khử gốc tự do DPPH Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết từ hải miên được phân tích theo phương pháp của Fu và cộng sự (2002) được trình bày chi tiết ở phụ lục1. 2.2.2.2. Phương pháp phân tích tổng năng lực khử Tổng năng lực khử của dịch chiết từ hải miên được phân tích theo phương pháp Oyaizu (1986) được trình bày chi tiết ở phụ lục 1. 2.2.2.3. Phương pháp phân tích hàm lượng protein Hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên được phân tích theo phương pháp Lowry và cộng sự ( 1951) được trình bày chi tiết ở phụ lục 2 2.3. Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm Số liệu trình bày trong báo cáo này là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm. Tính giá trị trung bình, vẽ đồ thị và so sánh sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0,05) của các giá trị trung bình sử dụng phần mềm thống kê R phiên bản 3.2.1 và Microsoft Excel 2010 và SPSS 16.0. 36 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Ảnh hưởng của loại dung môi chiết có hỗ trợ siêu âm đến khả năng chống oxy hóa và hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên 3.1.1. Ảnh hưởng của loại dung môi chiết có hỗ trợ siêu âm đến khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ hải miên Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết hải miên được đánh giá dựa trên khả năng khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử. Kết quả phân tích hoạt tính khử gốc tự do DPPH của dịch chiết hải miên chiết xuất bằng các dung môi khác nhau có hỗ trợ của siêu âm được thể hiện trên đồ thị hình 3.1. 37 Hình 3.1. Hoạt tính khử gốc tự do DPPH của dịch chiết từ hải miên (Spongia sp.) được chiết xuất bằng các dung môi khác nhau có hỗ trợ của siêu âm, (a) dịch chiết lần 1; (b) dịch chiết lần 2; (c) dịch chiết lần 3, (d) dịch chiết tổng 3 lần. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Theo kết quả phân tích số liệu thực nghiệm (phụ lục 4) cho thấy dịch chiết tổng của 3 lần chiết từ hải miên bằng các loại dung môi khác nhau có khả năng khử gốc tự do DPPH khác nhau (Hình 3.1d) có ý nghĩa thống kê (P < 0,05), sự khác biệt này được sắp xếp theo thứ tự giảm dần như sau: nước cất > methanol > ethanol > chloroform. Trong đó, ảnh hưởng của loại dung môi chiết đến khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết hải miên lần 1 cũng tuân theo quy luật tương tự như dịch chiết tổng của 3 lần chiết (Hình 3.1a). Ở lần chiết thứ 2 (Hình 3.1b), dịch chiết hải miên bằng nước cất có khả năng khử gốc tự do DPPH cao nhất rồi đến dịch chiết hải miên bằng methanol. Dịch chiết hải miên lần 2 bằng ethanol và chloroform có khả năng khử gốc tự do DPPH thấp nhất và không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P > 0,05) giữa 2 loại dung môi này. Ở lần chiết thứ 3 (Hình 3.1c), khả năng khử gốc tự do DPPH của cả 3 dịch chiết hải miên bằng methanol, 38 ethanol và chloroform không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P > 0,05) và đều thấp hơn dịch chiết hải miên bằng nước cất. Hình 3.1 cho thấy dịch chiết từ hải miên bằng nước cất ở cả 4 trường hợp đều có hoạt tính khử gốc tự do DPPH cao nhất, điều này chỉ ra rằng các hợp chất có hoạt tính khử gốc tự do DPPH trong hải miên là những chất có độ phân cực cao nên hòa tan tốt trong nước cất, ít hòa tan trong các dung môi hữu cơ phân cực (ethanol và methanol) và hầu như không hòa tan trong dung môi cloroform. Kết quả phân tích tổng năng lực khử của dịch chiết hải miên chiết xuất bằng các dung môi khác nhau có hỗ trợ của siêu âm được thể hiện trên đồ thị hình 3.2. 39 Hình 3.2. Tổng năng lực khử của dịch chiết từ hải miên (Spongia sp.) được chiết xuất bằng các dung môi khác nhau có hỗ trợ của siêu âm, (a) dịch chiết lần 1; (b) dịch chiết lần 2; (c) dịch chiết lần 3, (d) dịch chiết tổng 3 lần. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Tương tự như khả năng khử gốc tự do DPPH kết quả phân tích số liệu thực nghiệm (phụ lục 4) cho thấy dịch chiết tổng của 3 lần chiết từ hải miên bằng các loại dung môi khác nhau có tổng năng lực khử khác nhau (Hình 3.2d) có ý nghĩa thống kê (P < 0,05), sự khác biệt này được sắp xếp theo thứ tự giảm dần như sau: nước cất > methanol > ethanol > chloroform. Tuy nhiên ở lần chiết thứ 1 và 2, tổng năng lực khử của dịch chiết hải miên bằng nước cất và bằng methanol không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P > 0,05) và cao hơn tổng năng lực khử của dịch chiết hải miên bằng ethanol và chloroform (Hình 3.2a và hình 3.2b). Trong đó, dịch chiết hải miên bằng chloroform có tổng năng lực khử thấp nhất. Ở lần chiết thứ 3, tổng năng lực khử của cả 3 dịch chiết hải miên bằng 40 methanol, ethanol và chloroform không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P > 0,05) và đều thấp hơn dịch chiết hải miên bằng nước cất (Hình 3.2c). Hình 3.2 cho thấy dịch chiết từ hải miên bằng nước cất ở cả 4 trường hợp đều có tổng năng lực khử cao nhất, điều này rõ ràng rằng các chất chống oxy hóa có trong hải miên là những chất có độ phân cực cao nên hòa tan tốt trong nước cất, ít hòa tan trong các dung môi hữu cơ phân cực (ethanol và methanol) và hầu như không hòa tan trong dung môi cloroform. Từ kết quả đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ hải miên dựa trên khả năng khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử cho thấy dịch chiết xuất bằng nước cất có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất , kế đó là methanol, rồi đến ethanol và thấp nhất là clorofrom. Điều này có lẽ là do trong hải miên có chứa các thành phần có hoạt tính sinh học như các hợp chất phenol, polypeptide, sponin, sterol…Đặc biệt, các polypeptide là những chất phân cực có hoạt tính chống oxy hóa cao nên hòa tan tốt trong các dung môi phân cực. Trong 4 loại dung môi trên, clorofrom là dung môi phân cực kém không hòa tan được các polypeptit nên dịch chiết hải miên bằng clorofrom có hoạt tính chống oxy hóa thấp nhất. Ba loại dung môi còn lại là nước cất, methanol và ethanol đều là những dung môi phân cực theo thứ tự tăng dần như sau: Ethanol (hằng số điện môi là 24,55) < Methanol (Hằng số điện môi là 33) < Nước cất (Hằng số điện môi là 80). Chính điều này nên dịch chiết hải miên bằng nước cất có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất rồi đến methanol và sau đó là ethanol. Như vậy, sử dụng nước cất với sự hỗ trợ của siêu âm là thích hợp để chiết xuất chất chống oxy hóa có trong hải miên. 3.1.2. Ảnh hưởng của loại dung môi chiết có hỗ trợ siêu âm đến hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên Kết quả phân tích hàm lượng protein của dịch chiết hải miên chiết xuất bằng các dung môi khác nhau có hỗ trợ của siêu âm được thể hiện trên đồ thị hình 3.3. 41 Hình 3.3. Hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên (Spongia sp.) được chiết xuất bằng các dung môi khác nhau có hỗ trợ của siêu âm, (a) dịch chiết lần 1; (b) dịch chiết lần 2; (c) dịch chiết lần 3, (d) dịch chiết tổng 3 lần. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). 42 Theo kết quả phân tích số liệu thực nghiệm (phụ lục 4) cho thấy dịch chiết tổng của 3 lần chiết (Hình 3.3d) hải miên bằng nước cất có hàm lượng protein cao nhất. Dịch chiết hải miên tổng 3 lần bằng methanol và ethanol có hàm lượng protein tiếp theo và không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P > 0,05).Dịch chiết hải miên tổng 3 lần chiết bằng clorofrom có hàm lượng protein thấp nhất. Trong đó, ảnh hưởng của loại dung môi chiết đến hàm lượng protein của dịch chiết hải miên lần 1 và 3 cũng tuân theo quy luật tương tự như dịch chiết tổng của 3 lần chiết (Hình 3.3a) và (Hình 3.3c). Tuy nhiên ở lần chiết thứ 2 cho thấy chiết từ hải miên bằng các loại dung môi khác nhau có hàm lượng protein khác nhau (Hình 3.3b) có ý nghĩa thống kê (P < 0,05), sự khác biệt này được sắp xếp theo thứ tự giảm dần như sau: nước cất > methanol > ethanol > chloroform. Hình 3.3 cho thấy dịch chiết từ hải miên bằng nước cất ở cả 4 trường hợp đều có hàm lượng protein cao nhất, điều này chỉ ra rằng hợp chất protein trong hải miên là chất có độ phân cực cao nên hòa tan tốt trong nước cất, ít hòa tan trong các dung môi hữu cơ phân cực (ethanol và methanol) và hầu như không hòa tan trong dung môi cloroform. Từ kết quả xác định hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên cho thấy dịch chiết xuất bằng nước cất có hàm lượng protein cao nhất , kế đó là methanol rồi đến ethanol và thấp nhất là clorofrom. Điều này là do trong hải miên có chứa các polypeptide là những chất phân cực có hoạt tính chống oxy hóa cao nên hòa tan tốt trong các dung môi phân cực. Trong 4 loại dung môi trên, clorofrom là dung môi phân cực kém không hòa tan được các polypeptit nên dịch chiết hải miên bằng clorofrom có hoạt tính chống oxy hóa thấp nhất. Ba loại dung môi còn lại là nước cất, methanol và ethanol đều là những dung môi phân cực theo thứ tự tăng dần như sau: Ethanol (hằng số điện môi là 24,55) < Methanol (Hằng số điện môi là 33) < Nước cất (Hằng số điện môi là 80). Chính điều này nên dịch chiết hải miên bằng nước cất có hàm lượng protein cao nhất rồi đến methanol và sau đó là ethanol. Như vậy, sử dụng nước cất với sự hỗ trợ của siêu âm là thích hợp để chiết xuất hàm lượng protein có trong hải miên. 43 3.2. Ảnh hưởng của loại dung môi chiết không có hỗ trợ siêu âm đến khả năng chống oxy hóa và hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên 3.2.1. Ảnh hưởng của loại dung môi chiết không có hỗ trợ siêu âm đến khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ hải miên Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết hải miên được đánh giá dựa trên khả năng khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử. Kết quả phân tích hoạt tính khử gốc tự do DPPH của dịch chiết hải miên chiết xuất bằng các dung môi khác nhau không có hỗ trợ của siêu âm được thể hiện trên đồ thị hình 3.4. 44 Hình 3.4. Hoạt tính khử gốc tự do DPPH của dịch chiết từ hải miên (Spongia sp.) được chiết xuất bằng các dung môi khác nhau có hỗ trợ của siêu âm, (a) dịch chiết lần 1; (b) dịch chiết lần 2; (c) dịch chiết lần 3, (d) dịch chiết tổng 3 lần. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Theo kết quả phân tích số liệu thực nghiệm (phụ lục 4) cho thấy dịch chiết tổng của 3 lần chiết ( Hình 3.4d) dịch chiết hải miên bằng nước cất có khả năng khử gốc tự do DPPH cao nhất có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) so với methanol, ethanol và clorofrom. Dịch chiết hải miên tổng 3 lần chiết bằng methanol và ethanollà tiếp theo và không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P > 0.05) giữa 2 loại dung môi này. Dịch chiết hải miên tổng 3 lần chiết từ hải miên bằng ethanol và clorofrom là thấp nhất và không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P > 0,05) giữa 2 loại dung môi này. Trong đó, ảnh hưởng của loại dung môi chiết đến khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết hải miên lần 2 cũng tuân theo quy luật tương tự như dịch chiết tổng của 3 lần chiết (Hình 3.4b). Ở lần chiết thứ 1 (Hình 3.4a), dịch chiết hải miên bằng nước cất có khả năng khử gốc tự do 45 DPPH cao nhất rồi đến dịch chiết hải miên bằng methanol. Dịch chiết hải miên lần 1 bằng ethanol và chloroform có khả năng khử gốc tự do DPPH thấp nhất và không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P > 0,05) giữa 2 loại dung môi này. Tuy nhiên ở lần chiết thứ 3 cho thấy chiết từ hải miên bằng các loại dung môi khác nhau có khả năng khử gốc tự do DPPH khác nhau (Hình 3.4c) có ý nghĩa thống kê (P < 0,05), sự khác biệt này được sắp xếp theo thứ tự giảm dần như sau: nước cất > methanol > ethanol > chloroform. Hình 3.4 cho thấy dịch chiết từ hải miên bằng nước cất ở cả 4 trường hợp đều có hoạt tính khử gốc tự do DPPH cao nhất, điều này chỉ ra rằng các hợp chất có hoạt tính khử gốc tự do DPPH trong hải miên là những chất có độ phân cực cao nên hòa tan tốt trong nước cất, ít hòa tan trong các dung môi hữu cơ phân cực (ethanol và methanol) và hầu như không hòa tan trong dung môi cloroform. Kết quả phân tích tổng năng lực khử của dịch chiết hải miên chiết xuất bằng các dung môi khác nhau không có hỗ trợ của siêu âm được thể hiện trên đồ thị hình 3.5. 46 Hình 3.5. Tổng năng lực khử của dịch chiết từ hải miên (Spongia sp.) được chiết xuất bằng các dung môi khác nhau không có hỗ trợ của siêu âm, (a) dịch chiết lần 1; (b) dịch chiết lần 2; (c) dịch chiết lần 3, (d) dịch chiết tổng 3 lần. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Kết quả phân tích số liệu thực nghiệm (phụ lục 4) cho thấy dịch chiết tổng của 3 lần chiết từ hải miên bằng các loại dung môi khác nhau có tổng năng lực khử khác nhau (Hình 3.2d) có ý nghĩa thống kê (P < 0,05), sự khác biệt này được sắp xếp theo thứ tự giảm dần như sau: nước cất > methanol > ethanol > chloroform. Trong đó, ảnh hưởng của loại dung môi chiết đến tổng năng lực khử của dịch chiết hải miên lần 1 và 2 cũng tuân theo quy luật tương tự như dịch chiết tổng của 3 lần chiết (Hình 3.5a) và (Hình 3.5b).Ở lần chiết thứ 3 (Hình 3.5c), dịch chiết hải miên bằng nước cất có tổng năng lực khử cao nhất rồi đến dịch chiết hải miên bằng methanol. Dịch chiết hải miên lần 2 bằng ethanol và chloroform tổng năng lực khử thấp nhất và không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P > 0,05) giữa 2 loại dung môi này. 47 Hình 3.5 cho thấy dịch chiết từ hải miên bằng nước cất ở cả 4 trường hợp đều có tổng năng lực khử cao nhất, điều này rõ ràng rằng các chất chống oxy hóa có trong hải miên là những chất có độ phân cực cao nên hòa tan tốt trong nước cất, ít hòa tan trong các dung môi hữu cơ phân cực (ethanol và methanol) và hầu như không hòa tan trong dung môi cloroform. Từ kết quả đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ hải miên dựa trên khả năng khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử cho thấy dịch chiết xuất bằng nước cất có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất , kế đó là methanol, rồi đến ethanol và thấp nhất là clorofrom. Điều này có lẽ là do trong hải miên có chứa các thành phần có hoạt tính sinh học như các hợp chất phenol, polypeptide, sponin, sterol…Đặc biệt, các polypeptide là những chất phân cực có hoạt tính chống oxy hóa cao nên hòa tan tốt trong các dung môi phân cực. Trong 4 loại dung môi trên, clorofrom là dung môi phân cực kém không hòa tan được các polypeptit nên dịch chiết hải miên bằng clorofrom có hoạt tính chống oxy hóa thấp nhất. Ba loại dung môi còn lại là nước cất, methanol và ethanol đều là những dung môi phân cực theo thứ tự tăng dần như sau: Ethanol (hằng số điện môi là 24,55) < Methanol (Hằng số điện môi là 33) < Nước cất (Hằng số điện môi là 80). Chính điều này nên dịch chiết hải miên bằng nước cất có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất rồi đến methanol và sau đó là ethanol. Như vậy, sử dụng nước cất không hỗ trợ siêu âm là thích hợp để chiết xuất chất chống oxy hóa có trong hải miên. 3.2.2. Ảnh hưởng của loại dung môi chiết không có hỗ trợ siêu âm đến hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên Kết quả phân tích hàm lượng protein của dịch chiết hải miên chiết xuất bằng các dung môi khác nhau không có hỗ trợ của siêu âm được thể hiện trên đồ thị hình 3.6. 48 Hình 3.6. Hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên (Spongia sp.) được chiết xuất bằng các dung môi khác nhau không có hỗ trợ của siêu âm, (a) dịch chiết lần 1; (b) dịch chiết lần 2; (c) dịch chiết lần 3, (d) dịch chiết tổng 3 lần. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). 49 Theo kết quả phân tích số liệu thực nghiệm (phụ lục 4) cho thấy dịch chiết tổng của 3 lần chiết hải miên bằng nước cất có hàm lượng protein cao nhất. Dịch chiết hải miên tổng 3 lần bằng methanol và ethanol có hàm lượng protein tiếp theo và không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P > 0,05).Dịch chiết hải miên tổng 3 lần chiết bằng clorofrom có hàm lượng protein thấp nhất ( Hình 3.6d). Trong đó, ảnh hưởng của loại dung môi chiết đến hàm lượng protein của dịch chiết hải miên lần 1 và 3 cũng tuân theo quy luật tương tự như dịch chiết tổng của 3 lần chiết (Hình 3.6a) và (Hình 3.6c). Tuy nhiên ở lần chiết thứ 2 cho thấy chiết từ hải miên bằng các loại dung môi khác nhau có hàm lượng protein khác nhau (Hình 3.6b) có ý nghĩa thống kê (P < 0,05), sự khác biệt này được sắp xếp theo thứ tự giảm dần như sau: nước cất > methanol > ethanol > chloroform. Hình 3.6 cho thấy dịch chiết từ hải miên bằng nước cất ở cả 4 trường hợp đều có hàm lượng protein cao nhất, điều này chỉ ra rằng hợp chất protein trong hải miên là chất có độ phân cực cao nên hòa tan tốt trong nước cất, ít hòa tan trong các dung môi hữu cơ phân cực (ethanol và methanol) và hầu như không hòa tan trong dung môi cloroform. Từ kết quả xác định hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên cho thấy dịch chiết xuất bằng nước cất có hàm lượng protein cao nhất , kế đó là methanol rồi đến ethanol và thấp nhất là clorofrom. Điều này là do trong hải miên có chứa các polypeptide là những chất phân cực có hoạt tính chống oxy hóa cao nên hòa tan tốt trong các dung môi phân cực. Trong 4 loại dung môi trên, clorofrom là dung môi phân cực kém không hòa tan được các polypeptit nên dịch chiết hải miên bằng clorofrom có hoạt tính chống oxy hóa thấp nhất. Ba loại dung môi còn lại là nước cất, methanol và ethanol đều là những dung môi phân cực theo thứ tự tăng dần như sau: Ethanol (hằng số điện môi là 24,55) < Methanol (Hằng số điện môi là 33) < Nước cất (Hằng số điện môi là 80). Chính điều này nên dịch chiết hải miên bằng nước cất có hàm lượng protein cao nhất rồi đến methanol và sau đó là ethanol. 50 Như vậy, sử dụng nước cất không sự hỗ trợ của siêu âm là thích hợp để chiết xuất hàm lượng protein có trong hải miên. 3.3. Mối tương quan giữa khả năng khử gốc tự do DPPH và hàm lượng protein có hỗ trợ siêu âm của dịch chiết từ hải miên. 51 Hình 3.7. Mối liên hệ giữa khả năng khử gốc tự do DPPH và hàm lượng protein có hỗ trợ siêu âm của (a) dịch chiết hải miên lần 1(b) dịch chiết hải miên lần 2 (c) dịch chiết hải miên lần 3 (d) dịch chiết hải miên tổng 3 lần chiết. Từ kết quả đồ thị hình 3.7 cho thấy mối liên hệ giữa khả năng khử gốc tự do DPPH và protein là một đường thẳng (Tuyến tính). Qua kết quả phân tích cho thấy mối liên hệ giữa khả năng khử gốc tự do DPPH và protein có ý nghĩa thống kê (P < 0.05). Qua đồ thị hình 3.7 cho thấy hàm lượng protein càng cao thì khả năng khử gốc tự do DPPH càng cao điều đó có thể chứng minh rằng protein có hoạt tính chống oxy hóa. 3.4. Mối tương quan giữa khả năng khử gốc tự do DPPH và hàm lượng protein không có hỗ trợ siêu âm của dịch chiết từ hải miên 52 Hình 3.8: Mối liên hệ giữa khả năng khử gốc tự do DPPH và hàm lượng protein không có hỗ trợ siêu âm của (a) dịch chiết hải miên lần 1(b) dịch chiết hải miên lần 2 (c) dịch chiết hải miên lần 3 (d) dịch chiết hải miên tổng 3 lần chiết. Từ kết quả đồ thị hình 3.8 cho thấy mối liên hệ giữa khả năng khử gốc tự do DPPH và protein là một đường thẳng (Tuyến tính). Qua kết quả phân tích cho thấy mối liên hệ giữa khả năng khử gốc tự do DPPH và protein có ý nghĩa thống kê (P < 0.05). Qua đồ thị hình 3.8 ta nhìn thấy hàm lượng protein càng cao thì khả năng khử gốc tự do DPPH càng cao điều đó có thể chứng minh rằng protein có hoạt tính chống oxy hóa. 3.5. Mối tương quan giữa tổng năng lực khử và hàm lượng protein có hỗ trợ từ siêu âm của dịch chiết từ hải miên 53 Hình 3.9: Mối liên hệ giữa tổng năng lực khử và hàm lượng protein có hỗ trợ siêu âm của (a) dịch chiết hải miên lần 1(b) dịch chiết hải miên lần 2 (c) dịch chiết hải miên lần 3 (d) dịch chiết hải miên tổng 3 lần chiết. 54 Từ kết quả đồ thị hình 3.9 cho thấy mối liên hệ giữa tổng năng lực khử và protein là một đường thẳng (Tuyến tính). Qua kết quả phân tích cho thấy mối liên hệ giữa tổng năng lực khử và protein có ý nghĩa thống kê (P < 0.05). Qua đồ thị hình 3.9 cho thấy hàm lượng protein càng cao thì tổng năng lực khử càng cao điều đó có thể chứng minh rằng protein có hoạt tính chống oxy hóa. 3.6. Mối tương quan giữa tổng năng lực khử và hàm lượng protein không hỗ trợ từ siêu âm của dịch chiết từ hải miên 55 Hình 3.10. Mối liên hệ giữa tổng năng lực khử và hàm lượng protein không có hỗ trợ siêu âm của (a) dịch chiết hải miên lần 1 (b) dịch chiết hải miên lần 2 (c) dịch chiết hải miên lần 3 (d) dịch chiết hải miên tổng 3 lần chiết. Từ kết quả đồ thị hình 3.10 cho thấy mối liên hệ giữa tổng năng lực khử và protein là một đường thẳng (Tuyến tính). Qua kết quả phân tích cho thấy mối liên hệ giữa tổng năng lực khử và protein có ý nghĩa thống kê (P < 0.05). Qua đồ thị hình 3.10 cho thấy hàm lượng protein càng cao thì tổng năng lực khử càng cao điều đó có thể chứng minh rằng protein có hoạt tính chống oxy hóa. 3.7. Ảnh hưởng của siêu âm đến khả năng chống oxy hóa của dịch chiết từ hải miên Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết hải miên được đánh giá dựa trên khả năng khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử. Kết quả phân tích hoạt tính khử gốc tự do DPPH của dịch chiết hải miên chiết xuất bằng các dung môi khác nhau tổng 3 lần chiết có hỗ trợ siêu âm và không hỗ trợ siêu âm được thể hiện trên đồ thị hình 3.9. 56 Hình 3.11. Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết từ hải miên (Spongia sp.) được chiết xuất với hỗ trợ siêu âm và không siêu âm tổng 3 lần chiết bằng, (a) dung môi nước cất; (b) dung môi methanol; (c) dung môi ethanol, (d) dung môi clorofrom. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Theo kết quả phân tích số liệu thực nghiệm (phụ lục 4) cho thấy dịch chiết hải miên bằng nước cất có hỗ trợ siêu âm có khả năng khử gốc tự do DPPH cao hơn không hỗ trợ siêu âm (Hình 3.11a) có ý nghĩa thống kê (P < 0,05).Trong đó, ảnh hưởng của siêu âm đến khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết hải miên bằng dung môi methanol và ethanol cũng tuân theo quy luật tương tự như dịch chiết bằng dung môi nước (Hình 3.11b) và (Hình 3.11c). Tuy nhiên, khi chiết bằng dung môi clorofrom khả năng khử gốc tự do DPPH không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P > 0,05) giữa siêu âm và không siêu âm. Hình 3.11 cho thấy dịch chiết từ hải miên bằng nước cất, methanol và ethanol có hỗ trợ siêu âm có khả năng khử DPPH cao hơn không hỗ trợ siêu âm. 57 Kết quả phân tích tổng năng lực khử của dịch chiết hải miên chiết xuất bằng các dung môi khác nhau tổng 3 lần chiết có hỗ trợ và không có hỗ trợ của siêu âm được thể hiện trên đồ thị hình 3.12. Hình 3.12. Tổng năng lực khử của dịch chiết từ hải miên (Spongia sp.) được chiết xuất với hỗ trợ siêu âm và không siêu âm tổng 3 lần chiết bằng, (a) dung môi nước 58 cất; (b) dung môi methanol; (c) dung môi ethanol, (d) dung môi clorofrom. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Tương tự như khả năng khử gốc tự do DPPH theo kết quả phân tích số liệu thực nghiệm (phụ lục 4) cho thấy dịch chiết hải miên bằng nước cất có hỗ trợ siêu âm có tổng năng lực khử cao hơn không hỗ trợ siêu âm ( Hình 3.12a) có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Trong đó, ảnh hưởng của siêu âm đến khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết hải miên bằng dung môi methanol và ethanolvà clorofrom cũng tuân theo quy luật tương tự như dịch chiết bằng dung môi nước (Hình 3.12b), (Hình 3.12c) và (Hình 3.12d). Tuy nhiên khi chiết bằng dung môi clorofrom khả năng khử gốc tự do DPPH không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P > 0,05) giữa siêu âm và không siêu âm. Hình 3.12 cho thấy dịch chiết từ hải miên bằng nước cất, methanol và ethanol và clorofrom có hỗ trợ siêu âm có tổng năng lực khử cao hơn không hỗ trợ siêu âm. Từ kết quả đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ hải miên dựa trên khả năng khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử cho thấy dịch chiết xuất có hỗ trợ siêu âm cao hơn không hỗ trợ siêu âm . Điều này là do trong quá trình chiết xuất, sóng siêu âm được áp dụng để tăng hiệu quả chiết nhờ tác dụng phá vỡ cấu trúc tế bào, tăng cường khả năng tiếp xúc giữa dung môi với các chất tan có trong nguyên liệu, làm tăng sự hòa tan của chất tan vào dung môi và tăng quá trình khuếch tán chất tan. Như vậy, sử dụng nước cất với sự hỗ trợ của siêu âm là thích hợp để chiết xuất chất chống oxy hóa có trong hải miên. 3.8. Ảnh hưởng của siêu âm đến hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên Kết quả phân tích hàm lượng protein của dịch chiết hải miên chiết xuất bằng các dung môi khác nhau tổng 3 lần chiết có hỗ trợ và không hỗ trợ siêu âm được thể hiện trên đồ thị hình 3.11. 59 . Hình 3.13. Hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên (Spongia sp.) được chiết xuất với hỗ trợ siêu âm và không siêu âm tổng 3 lần chiết bằng các dung môi khác nhau. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Theo kết quả phân tích số liệu thực nghiệm (phụ lục 4) cho thấy dịch chiết hải miên bằng nước cất, methanol, ethanol có hỗ trợ siêu âm hàm lượng protein cao hơn không hỗ trợ siêu âm có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Tuy nhiên, khi chiết bằng dung môi clorofrom hàm lượng protein không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P > 0,05) giữa siêu âm và không siêu âm (Hình 3.13). 60 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận Qua 3 tháng thực hiện đồ án em đã rút ra một số kết luận như sau: + Sử dụng dung môi nước cất để chiết hải miên spongia sp sẽ có hoạt tính chống oxy hóa và hàm lượng protein cao nhất trong các dung môi nước cất, methanol, ethanol, clorofrom. + Sử dụng chiết có hỗ trợ siêu âm thì dịch chiết từ hải miên spongia sp sẽ có hoạt tính tính oxy hóa và hàm lượng protein cao hơn không có hỗ trợ siêu âm. 2. Kiến nghị Mặc dù đã cố gắng trong quá trình làm đề tài, song do thời gian và điều kiện nghiên cứu có giới hạn nên đề tài vẫn còn nhiều hạn chế và thiếu sót. Do vậy em xin đề xuất một số ý kiến như sau: + Nghiên cứu quy trình tách chiết hoạt tính chống oxy hóa của hải miên bằng dung môi nước + Nghiên cứu thêm các phương pháp chiết tách như chiết bằng chất lỏng quá tới hạn, chiết với sự hỗ trợ vi sóng, chiết với áp suất cao.. + Nghiên cứu khả năng ứng dụng rộng rãi của chế phẩm vào trong các lĩnh vực: y học, thực phẩm, dược phẩm…. + Nguyên cứu quy trình tách chiết hoạt tính chống oxy hóa áp dụng cho nguyên liệu khô. 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Thái Trần Bái ( 2007 ), Động vật học không xương sống, Nhà xuất bản giáo dục. 2. Huỳnh Nguyễn Duy Bảo ( 2003 ) Xây dựng phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào phản ứng Fenton trong hệ Lipid/ myoglobin/ H2O2, Báocáo đề tài khoa học cấp trường, Trường Đại Học Nha Trang 3. Lê Thi Quỳnh Nga ( 2014), Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chiết xuất đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ rễ cây mật nhân, Đồ án tốt nghiệp, Đại học Nha Trang 4. Phan Thị Kim Ngân (2012),Nghiên cứu tách chiết và khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ tim sen,Đồ án tốt nghiệp, Đại học NhaTrang 5. GS.TS Châu Văn Minh ( 2009) Nghiên cứu sàng lọc các chất có hoạt tính sinh học theo định hướng kháng sinh, gây độc tế bào và chống oxy hóa từ sinh vật biển nhằm tạo các sản phẩm có giá trị dược dụng, Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học câp nhà nước, Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện khoa học và công nghệ Việt Nam. Tiếng Anh. 6. Bergquist, PR (2001). "Porifera (Sponges)". Encyclopedia of Life Sciences . John Wiley & Sons, Ltd. doi : 10.1038/npg.els.0001582 7. Chairman, K., Singh, A. J. A. R., Alagumuthu, G. (2012). Cytotoxic and antioxidant activity of selected marine sponges. Asian Pacific Journal of Tropical Disease, 2(3): 234–238. 8. "Ecology of siliceous sponges: Application to the environmental interpretation of 62 the Upper Jurassic sponge facies (Oxfordian) from Spain" (PDF). Cuadernos de Geología Ibérica 24 : 223–239. Archived from the original on March 19, 2009 . Retrieved November 10, 2008 9. Elias, R. J., Kellerby, S. S., Decker, E. A., (2008). Antioxidant Activity of Proteins and Peptides. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 48(5): 430-441 10. Fu, H. Y., Shieh, D. E., Ho, C. T., (2002). Antioxidant and free radical scavenging activities of edible mushrooms. Journal of Food Lipids, 9: 35-46 11. Gage, JD, and Tyler, PA (1996). Deep-sea Biology: A Natural History of Organisms at the Deep-Sea Floor . Cambridge University Press . pp. 91–93. . 12. Halliwell H. Free radicals, antioxidants, and human disease: curiosity, cause or consequence.Lancet1994; 344: 721. 13. Harborne J.B., ed., 1998,Phytochemical Methods: A guide to modern techniques of plant analysis, 2nded. London, Chapman and Hall, pp. 54-84 14. Li H, Shigeki S, Fusetani N. Simple antifungal metabolites from a marine sponge, Halichondria sp. Comp Biochem Physiol Part B: Comp Biochem1994; 107: 2614. 15. Longeon, A., Copp, B. R., Quévrain, E., Roué, M., Kientz, B., et al. (2011). Bioactive indole derivatives from the South Pacific marine sponges Rhopaloeides odorabile and Hyrtios sp. Marine Drugs, 9: 879-888. 16. Mayer AM, Glaser KB, Cuevas C, Jacobs RS, Kem W, et al. (2010) The odyssey of marine pharmaceuticals: a current pipeline perspective. Trends Pharmacol Sci 31: 255-265. 17. M.Donia and M.T.Hamann- Marine Natural Products and Their Potential 63 Applications as Anti-infective Agents, the lancet Infect. Dis. 3 (2003) 338-348. 18. Rothmeier AS, Schneiders UM, Wiedmann RM, Ischenko I, Bruns CJ, et al. (2010) The marine compound spongistatin 1 targets pancreatic tumor progression and metastasis. Int J Cancer 127: 1096-1105. [...]... việc nghiên cứu tách chiết các hoạt chất sinh học từ hải miên là rất cần thiết và đó là lý do tôi chọn đề tài Nghiên cứu ảnh hưởng của loại dung môi chiết và siêu âm đến hoạt tính chống oxy hóa và hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên Mục đích và ý nghĩa của đề tài: Mục đích đề tài: + Nghiên cứu ảnh hưởng của loại dung môi chiết đến hoạt tính chống oxi hóa và hàm lượng protein của hải miên + Nghiên. .. chất chống oxy hóa sẽ khử gốc tự do hydroxyl tạo thành trong dung dịch làm giảm nồng độ hydrogen peroxide Dựa vào sự thay đổi nồng độ hydrogen peroxide để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa 20 1.4 Hoạt chất sinh học chống oxi hóa từ hải miên Trong số các nguồn hoạt chất sinh học chống oxy hóa từ tự nhiên, hải miên được xếp vào hạng có chứa hoạt chất sinh học chống oxy hóa cao Một số chất chuyển hóa có... + Nghiên cứu ảnh hưởng của siêu âm đến hoạt tính chống oxi hóa và hàm lượng protein của hải miên Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn: +Là cơ sở để lựa chọn dung môi và phương pháp chiết thích hợp +Thành công của đề tài sẽ tạo ra chất chống oxi hóa ứng dụng trong y học Trong quá trình thực hiện đề tài này mặc dù đã cố gắng hết mình tìm hiểu, song do bước đầu làm quen với công tác nghiên cứu khoa học,... tác dụng của sóng siêu âm Trong nghiên cứu hoặc chuấn bị mẫu phân tích thường chiết xuất với thế tích nhỏ nên có thế nhúng bình chiết vào một bế siêu âm có chứa nước, sóng siêu âm phát ra từ các đầu phát sẽ truyền qua môi trường nước và đi vào hỗn hợp chiết Trong chiết xuất ở quy mô lớn hơn, đầu phát siêu âm thường được nhúng trực tiếp vào bình chiết chứa nguyên liệu và dung môi Trong quá trình chiết. .. nhiệt độ sôi của dung môi phụ thuộc vào áp suất nên để tăng nhiệt độ sôi của dung môi phải thực hiện quá trình chiết dưới áp suất cao Khi nhiệt độ chiết tăng, khả năng hòa tan của dung môi tăng lên Trong chiết xuất dưới áp suất cao, dung môi chiết được đưa đến nhiệt độ và áp suất gần với vùng tới hạn Ở điều kiện nhiệt độ và áp suất cao làm tăng khả năng hòa tan và khuếch tán của dung môi nên chiết xuất... nguồn gốc từ loài hải miên như polypeptide, saponin, sterol, flavonoid, glycoside và các hợp chất phenol cho thấy có khả năng chống oxy hóa mạnh so với vitamin E và vitamin C (Halliwell, 1994; Li và cộng sự, 1994; Chairman và Singh, 2012) Nghiên cứu của Li và cộng sự (1994) cho thấy các hoạt chất sinh học chiết xuất từ hải miên Aspergillus có khả năng chống oxy hóa cao hơn đáng kể so với hydroxytoluene... có khối lượng phân tử dưới 10.000 Da trong khi protein có khối lượng phân tử lớn hơn Nhiều nghiên cứu chứng minh rằng các polypeptide có hoạt tính chống oxy hóa in vitro như khử các gốc tự do diphenyl-1-picryhydradzyl (DPPH), superoxide, hydroxyl, tạo phức càng với ion kim loại, khử sắt và chống oxy hóa acid linoleic (Elias và cộng sự, 2008) Đặc tính chống oxy hóa của polypeptide phụ thuộc vào cấu... chất mạnh thêm vào khi chế biến 11 Việc sản xuất nuôi trồng thủy sản của hải miên C matthewsi được thực hiện bởi Marine và Viện nghiên cứu môi trường của Pohnpei (MERIP) Sử dụng hoạt tính sinh học từ hải miên, với sự hiện diện của các chất chuyển hóa thứ cấp được sản xuất bởi các vi sinh vật cộng sinh trong các loài hải miên Các chất chuyển hóa thứ cấp đã được phân lập thành công từ hải miên, với nhiều... amip Hải miên ăn bằng cách lọc Hầu hết hải miên ăn các hạt hữu cơ nổi và sinh vật phù du nhỏ mà chúng lọc được từ các dòng nước chảy qua cơ thể của chúng Nước đưa thức ăn và O2 vào cơ thể qua lỗ hút nước và theo ống dẫn nước trong thành cơ thể vào khoang trung tâm và từ đó theo lỗ thoát nước ra ngoài 1.1.3 Hình thức sinh sản của hải miên Có hai hình thức sinh sản: Vô tính và hữu tính Sinh sản vô tính. .. peroxide, lipid peroxy nhất là hydroxyl radical, một gốc rất phản ứng và gây ra nhiều tổn thương 1.3.2 Chất chống oxy hóa Chất chống oxy hóa là một loại hóa chất giúp ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình oxi hóa chất khác Sự oxy hóa là loại phản ứng hóa học trong đó electronđược chuyển sang chất oxy hóa, có khả năng tạo các gốc tự do sinh ra phản ứng dây chuyền phá hủy tế bào sinh vật Chất chống oxy hóa ngăn quá ... tài: + Nghiên cứu ảnh hưởng loại dung môi chiết đến hoạt tính chống oxi hóa hàm lượng protein hải miên + Nghiên cứu ảnh hưởng siêu âm đến hoạt tính chống oxi hóa hàm lượng protein hải miên Ý... lượng protein dịch chiết từ hải miên 43 3.2.1 Ảnh hưởng loại dung môi chiết hỗ trợ siêu âm đến khả chống oxy hóa dịch chiết từ hải miên 43 Hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết hải miên. .. NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hưởng loại dung môi chiết có hỗ trợ siêu âm đến khả chống oxy hóa hàm lượng protein dịch chiết từ hải miên 3.1.1 Ảnh hưởng loại dung môi chiết có hỗ trợ siêu âm