B ộ YTÉ TRƯỜNG ĐẠI HỌC D ư ợ c HÀ NỘI PHẠM QUỲNH GIANG GÓP PHẦN NGHIÊN cứu ĐỊNH LƯỢNG TOBRAMYCIN NGUYÊN LIỆU BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG PHỔ HẤP THỤ KHẢ KIẾN. (KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP D ư ợ c SỸ KHÓA 2002-2007) Người hướng dẫn: PGS - TS TRẦN ĐỨC HẬU Nơi thực hiện: BỘ MÔN HÓA DƯỢC. Thời gian thực hiện: 10/2006-5/2007 \x (\l •/V HÀ NỘI, THÁNG 5 - 2007 'ì / LỜI CẢM ƠN Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS-TS TRÀN ĐỬC HẬU, người thầy trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên ở bộ môn Hóa Dược đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện cho tôi trong thời gian tôi làm thực nghiệm tại bộ môn. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thế giảng viên, cán bộ Trường Đại Học Dược Hà Nội vì sự dìu dắt, dạy bảo trong suốt năm năm tôi học tập tại đây. Cuối cùng, cho phép tôi được bày tỏ lòng biết 011 tới gia đình và bạn bè đã động viên, quan tâm, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận. Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2007 Sinh viên Phạm Quỳnh Giang MỤC LỤC Trang DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ĐẶT VẤN ĐÊ 1 PHẦN I : TỐNG QUAN 3 1.1. Vài nét về Tobramycin 3 1.2. Một số phương pháp được áp dụng để định lượng Tobramycỉn 5 1.2.1 .Phương pháp trong dược điển 5 1.2.2. Phương pháp ngoài dược điển 8 1.3. Phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis 11 1.3.1. Cơ sở lý thuyết của phương pháp định lượng bằng quang phổ hấp thụ UV-Vis 11 1.3.2. Các kỹ thuật định ỉượng bằng phương pháp quang phổ ƯV- Vis 13 1.3.3. ư u nhược điểm của phương pháp định lượng bằng quang phổ hấp thụ UV-Vis PHẦN 2: THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1. Nội dung, đổi tượng, phương pháp nghiên cứu 19 20 20 2.1.1. Nội dung nghiên cứu 20 2.1.2. Đối tượng nghiên cứu 20 2.1.3. Phương pháp nghiên cứu 20 2.2. Kết quả nghiên cứu 2.2.1. Khảo sát các điều kiện định lượng 21 21 2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến độ hấp thụ của dung dịch ở các nhiệt độ khác nhau 25 2.2.3. Theo dõi độ ổn định của dung dịch sản phẩm 28 2.2.4. Xây dựng phương pháp và ứng dụng 28 2.2.5. Đánh giá phương pháp 30 2.3. Bàn luận PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐÈ XUẤT 35 36 3.1 Kết luận 36 3.2. Đề xuất 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT U V -V is : Ultraviolet - Visible USP : United States Pharmacopoeia - Dược điển Mỹ BP : British Pharmacopoeia - Dược điển Anh JP : The Japanese Pharmacopoeia - Dược điển Nhật HPLC : High - períormance liquid chromatography - sắc ký lỏng hiệu năng cao EP : European Pharmacopoeia - Dược điển châu Âu ĐẶT VẤN ĐÈ Tobramycin là một kháng sinh thuộc nhóm aminoglycosid thu được từ môi trường nuôi cấy Streptomyces tenebrarỉus. Thuốc có tác dụng diệt khuẩn, có phổ tác dụng tương tự như Gentamycin nhưng hoạt tính mạnh hơn đối với phần lớn các chủng Pseudomonas aeruginosa, thường được chỉ định trong các b.ệnh nhiễm khuẩn nặng. Cơ chế tác dụng chính xác của thuốc chưa biết đầy đủ, có lẽ là do sự ức chế tổng hợp protein ở các vi khuẩn nhạy cảm bằng cách gắn không thuận nghịch với các tiểu đơn vị 30S của Ribosom. Hiện nay trên thị trường có rất nhiều dạng bào chế của Tobramycin như: Thuốc nhỏ mắt, mỡ tra mắt, thuốc tiêm, bột vô khuẩn pha tiêm...với nhiều biệt dược khác nhau. Vì vậy vấn đề kiểm tra chất lượng nguyên liệu làm thuốc cũng như thành phẩm là nhiệm vụ rất quan trọng. Cũng như các kháng sinh khác trong nhóm aminoglycosid, Tobramycin không có hấp thụ quang ở vùng tử ngoại - khả kiến, vì vậy phương pháp định lượng phổ biến vẫn là phương pháp vi sinh vật. Phương pháp này mất nhiều thời gian và có độ chính xác không cao. Dược điển Mỹ USP 28 đã áp dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector ƯV-Vis, tạo dẫn chất trước cột để định lượng Tobramycin, nhưng qui trình tạo dẫn xuất này rất phức tạp. Gần đây trong EP 2003 hay BP 2005, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector ampe kế đã được đưa vào sử dụng để thay thế phương pháp vi sinh vật. Phương pháp này tiến hành nhanh, kết quả tin cậy, song hầu 1 hết các cơ sở kiểm nghiệm trong nước hiện nay không đáp ứng được các điều kiện định lượng. Đe mở rộng thêm các phương pháp định lượng Tobramycin, góp phần làm eơ sở cho công tác kiểm nghiệm thuốc bằng một phương pháp kiểm nghiệm đơn giản và có độ chính xác cao thay thế phương pháp vi sinh vật chúng tôi đã tiến hành : “Nghiên cửu định lượng Tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ khả kiến” với những mục tiêu sau: > Khảo sát các điều kiện định lượng và xây dựng phương pháp định lượng Tobramycìn nguyên liệu. > Đánh giá phương pháp vừa xây dựng theo các chỉ tiêu: tỉnh đúng, tỉnh chính xác, tính tuyến tỉnh và tính đặc hiệu của phương pháp. 2 PHÀN I : TÔNG QUAN 1.1. VÀI NÉT VÈ TOBRAMYCIN : Tobramycin là một kháng sinh nhóm aminoglycosid thu được từ môi trường nuôi cấy Streptomyces tenebrarỉus hoặc bằng các phương pháp khác..[l],[12],[2 1 ] Tên khoa học: 4-0-(3-Amino-3-deoxy-a-D-glucopyranosyl)-2-deoxy6-0-(2,6-diamino-2,3,6-trideoxy-a-D-ribo-hexopyranosyl)-L-streptamine. [1],[12],[21] Công thức phân tử : C 18H 37N 5O9 Phân tử lượng : 467,5 Công thức cấu tạo : Tỉnh chất'. Bột trắng hoặc trắng ngà. Dễ tan trong nước, rất khó tan trong ethanol 96%, thực tế không tan trong cloroíòrm và ether. [a]D20từ +138 đến +148 (dung dịch 4% trong nước). [1],[6][,12]. Dược lý và cơ chế tác dụng: [1],[7]. 3 Tobramycin là một kháng sinh nhóm aminoglycosid có tác dụng với nhiều vi khuẩn Gram âm hiếu khí và một số vi khuẩn Gram dương hiếu khí. Thuốc không có tác dụng với Chlamydia, nấm, virus và đa số vi khuẩn yếm khí. Tobramycin rất giống Gentamycin về tính chất vi sinh học và độc tính, tuy nhiên đặc điểm quan trọng nhất của Tobramycin là có hoạt tính đối với phần lớn các chủng Pseudomonas aeruginosa. Mặc dù cơ chế tác dụng chính xác chưa biết đầy đủ, nhưng có lẽ Tobramycin ức chế sự tổng họp protein ở các vi khuẩn nhạy cảm bằng cách gắn không thuận nghịch với các tiểu đơn vị 30S của Ribosom. C hỉđịnhịl] Được chỉ định trong các bệnh nhiễm khuẩn nặng đe dọa tới tính mạng, đặc biệt với các bệnh mà nguyên nhân chưa rõ ràng hoặc bị nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn Gram âm. Trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn nặng, Tobramycin được dùng phối hợp với 1 kháng sinh nhóm beta-lactam. Trong các bệnh nhiễm khuẩn toàn thân do Pseudomonas spp. gây ra, Tobramycin có thể dùng phối hợp với 1 kháng sinh nhóm beta-lactam chống Pseudomonas. Trong bệnh viêm nội tâm mạc do Streptococcus faecalis hoặc alpha- Streptococcus gây ra có thể dùng Tobramycin phối họp với ampicilin hoặc benzyl penicilin nhưng phải tiêm riêng rẽ. Dạng thuốc và hàm ỉượng:[7] Thuốc không hấp thu qua đường uống, thường được dùng dưới các dạng: Lọ 5ml 0,3% để nhỏ mắt. Tuýp 3,5g mỡ tra mắt 0,3%. Thuốc tiêm: Lọ 20mg/2ml; 60mg/6ml; 80mg/8ml; 80mg/2ml; l,2g/30ml. Lọ l,2g bột Tobramycin sulphat vô khuẩn để pha tiêm. 4 1.2. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP • Được ÁP DỤNG ĐẺ ĐỊNH LƯỢNG • • • TOBRAMY CIN: 1.2.1. Phương pháp trong dược điển: 1.2.1.2. Phương pháp vỉ sính vị?/: [13],[20] Xác định hoạt lực kháng sinh của Tobramycin bằng phương pháp vi sinh vật theo BP 2000 hay JP14. a. Chủng vỉ khuấn: Bacillus subtilis ATCC 6633. b. Môi trường nuôi cấy: Môi trường đặc c. Dung dịch chuẩn: Cân chính xác một lượng Tobramycin chuẩn, tương đương khoảng 25 mg (hiỷu lực), hòa tan trong dung dịch đệm phosphat 0,lmol/L, pH 8 thành chính xác 25ml và đó chính là dung dịch chuẩn gốc. Giữ dung dịch chuẩn gốc ở nhiệt độ từ 5° c đến 15° c và sử dụng trong vòng 30 ngày. Lấy chình xác một lượng dung dịch chuẩn thích hợp thêm dung dịch đệm phosphat 0,lmol/L, pH 8 để tạo thành dung dịch mà mỗi ml chứa 8|ig và 2(j,g (theo hiệu lực). Đó chính là những dung dịch chuẩn nồng độ cao và dung dịch chuẩn nồng độ thấp. d. Dung dịch thử: Cân chính xác một lượng Tobramycin, tương đương khoảng 25 mg (hiệu lực), hòa tan trong dung dịch đệm phosphat 0,lmol/L, pH 8 thành chính xác 25ml. Lấy c^ình xác một lượng dung dịch thử thích hợp thêm dung dịch đệm phosphat 0,lmol/L, pH 8 để tạo thành dung dịch mà mỗi ml chứa 8p,g và 2|ig (theo hiệu lực). Đó chính là những dung dịch thử nồng độ cao và dung dịch thử nồng độ thấp. 1.2.1.2. Phương pháp H PLC 1: [12] * Điểu kiện sãc ký: - Cột styren-divinylbenzen copolymer (4,6 X 250mm, 8|im). - Nhiệt độ cột: 55°c. 5 • - Pha động : Hỗn hợp pha trong nước đã loại cacbon dioxyd chứa 5,2g natri sulfat khan; l,5g natri octansulíònat; 3ml tetrahydroíuran và 50ml dung dịch kali dihydrophosphat 0,2M đủ 1 lít, đã được chỉnh pH về 3,0 bằng acid phosphoric loãng. - Tốc độ dòng: lml/phút. - Dung dịch thêm vào sau cột: Dung dịch natri hydroxyd 2% pha trong nước đã loại cacbon dioxyd. Tốc độ 0,3ml/phút. - Detector: Detector amper kế hoặc các thiết bị tương tự. Nhiệt độ detector đặt ở 35°c. - Thể tích tiêm: 20 ịj1. - Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: Khoảng 0,lmg/ml trong nước. * Tiến hành: Lần lượt tiêm các dung dịch chuẩn và thử. Dựa vào đáp ứng của píc Tobramycin trong các dung dịch chuẩn, thử và hàm lượng dung dịch chuẩn, tính lượng Tobramycin có trong chế phẩm. 1.2.1.3. Phương pháp HPLC 2\ [21] * Điều kiện sắc ký: - Cột RP 18 (3,9 mm X 30 cm). - Pha động : Hòa tan 2,0g tris(hydroxymethyl)aminomethan trong khoảng 800ml nước. Thêm vào dung dịch này 20ml dung dịch acid sulfuric IN, sau đó pha loãng bằng acetonitril tới 2000ml, lắc đều. Để nguội rồi lọc qua màng lọc 0,2|im. Có thể điều chỉnh nếu cần. - Thuốc thử 2,4-dinitroflourobenzen: Dung dịch 2,4-dinitroflourobenzen 1% trong ethanol 96%. Dung dịch này nếu bảo quản lạnh có thể sử dụng được trong vòng 5 ngày sau khi pha. - Thuốc thử tris(hydroxymethyl)aminomethan: Pha dung dịch gốc tris(hydroxymethyl)aminomethan 1,5% trong nước. Chuyển 40ml dung dịch 6 thuốc thử gốc này vào bình định mức 200 ml. Bổ sung dimethyl sulfoxid đến vạch bằng cách thêm từ từ dimethyl sulíòxid, vừa thêm vừa lắc đều. Dung dịch thuốc thử này được dùng trong vòng 4 giờ sau khi pha. Nếu bảo quản lạnh dưới 10° c , dung dịch này có thể được dùng trong vòng 8 giờ sau khi pha. (Với dung dịch thuốc thử gốc 1,5%, nếu bảo quản lạnh có thể sử dụng được trong vòng 1 tháng sau khi pha). - Tốc độ dòng: l,2ml/phút. - Detector ƯV: 365nm. - Thể tích tiêm: 20 ịil/phút. - Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: Khoảng 0,22 mg/ml trong dung dịch acid sulfuric 0,004 N. *Tiểnhành: - Các dung dịch chuẩn và thử phải được tạo dẫn xuất với các thuốc thử 2,4-dinitroflourobenzen và tris(hydroxymethyl)aminomethan trước khi tiêm sắc ký: Hút chính xác 4,0 ml dung dịch chuẩn, dung dịch thử và nước cất vào các bình định mức 50 ml riêng biệt. Thêm vào mỗi bình 10 ml dung dịch thuốc thử 2,4 - dinitroflourobenzen và 10 ml dung dịch thuốc thử tris(hydroxymethyl)aminomethan, lắc đều, đậy nút. Đặt các bình vào trong cách thủy ở nhiệt độ 60°c ± 2 °c trong 50 phút ± 5 phút. Sau thời gian trên, lấy các bình ra, để yên 10 phút. Thêm acetonitril vào các bình đến dưới vạch định mức khoảng 2 ml, để nguội xuống nhiệt độ phòng, sau đó pha loãng tiếp bằng acetonitril đến vạch, lắc đều: Thu được các dung dịch chuẩn, dung dịch thử đã tạo dẫn xuất và mẫu trắng. Chú ý phải tiến hành tạo dẫn chất trong cùng một thời gian và cùng điều kiện đối với tất cả các dung dịch thử nghiệm. - Lần lượt tiêm mẫu trắng, các dung dịch chuẩn và thử đã tạo dẫn xuất. Dựa vào đáp ứng của píc dẫn xuất Tobramycin trong các dung dịch chuẩn, 7 thử và hàm lượng dung dịch chuẩn, tính lượng Tobramycin có trong chế phẩm. 1.2.2. Phương pháp ngoài dược điển: I.2.2.I. Định lượng Tobramycin bằng phương pháp vì sình vật theo tiêu chuẩn cơ sở của một sỗ chế phẩm sản xuất trong nước: [8 ], [9] a. Chủng vi khuẩn'. Bacillus pumilus NCTC 8241. b. Dung dịch đệm phosphat pH 8,0 ±0,1: Dikali hydrophosphat 16,75 g. Kali dihydrophosphat 0,532g. Môi trường định lượng: Cao men bia 3,0 g Pepton 6,0 g Casein pancreatic 4,0 g Glucose 1,0 g Cao thịt 1,5 g Thạch 15,0 g 100 ml Nước cất 8,2 ± 0,2 pH sau khi tiệt trùng d. Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử: + Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 25,0 mg Tobramycin chuấn, hòa tan trong dung dịch đệm pH 8,0 để được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ chính xác khoảng 1000 IƯ/ml. Dung dịch gốc được bảo quản ở nhiệt độ dưới 25°c. Từ dung dịch chuẩn gốc này tiếp tục pha loãng với dung dịch đệm phosphat pH 8,0 để được các dung dịch chuẩn thí nghiệm có nồng độ Tobramycin chính xác khoảng 10 IU/ml, 20 IU/ml và 40 IU/ml. 8 + Dung dịch thử (chế phẩm): Hút chính xác 5,0 ml chế phẩm (tương ứng với khoảng 3mg Tobramycin), thêm lOml dung dịch đệm phosphat pH 8,0, được dung dịch thử gốc có nồng độ khoảng 1000 IƯ/ml. Tiếp tục pha loãng với dung dịch đệm phosphat pH 8,0 để được các dung dịch thử có nồng độ Tobramycin khoảng 10 IU/ml, 20 IƯ/ml và 40 IU/ml. + Tiến hành thử và tính toán kết quả theo phương pháp xác định hoạt lực kháng sinh - Dược điển Việt Nam III. L2.2.2. Phương pháp quang phổ tử ngoại 1 [19] Một phương pháp quang phổ rất nhạy và chính xác để định lượng cả dạng nguyên liệu và dạng thuốc tiêm. Phương pháp này dựa trên cơ sở tạo ra sản phẩm màu xanh với 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone hydrochloride và sắt (III) chloride. Sản phẩm có độ hấp thụ lớn nhất ở 645nm. Định luật Lambert - Beer được áp dụng trong khoảng nồng độ từ 50 - 500 miu/ml. 1.2.2.3. Phương pháp HPLC 3: [14] * Điều kiện sắc kỷ: - Cột Purospher® STAR RP-18e (4 X 55mm, 3ịj,m, Merck). - Pha động: Acetonitril - nước (50 : 50). - Tốc độ dòng: 1,3 ml/phút. - Dung dịch tạo dẫn xuất: Dung dịch 1-naphtyl isothiocyanat (NITC) trong pyridin. - Detector uv : 230 nm. - Thể tích tiêm: 10 [xl. - Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: khoảng 5|xg/ml trong nước. * Tiến hành: Dung dịch chuẩn và dung dịch thử được tạo dẫn xuất với dung dịch thuốc thử 1-naphtyl isothiocyanat trong pyridin ở 70°c. Lần lượt tiêm các 9 dung dịch chuẩn và thử đã được tạo dẫn xuất. Dựa vào đáp ứng của pic dẫn xuất Tobramycin trong các dung dịch chuẩn, thử và hàm lượng dung dịch chuẩn, tính lượng Tobramycin có trong chế phẩm. 1.2.2.4. Phương pháp HPLC 4: [17] * Điều kiện sắc ký: - Cột Xterra®RP-18 (2,1 X 250 mm, 5 |j.m). - Nhiệt độ cột: 30°c. - Pha động A: Thêm 0,7 ml dung dịch amoni hydroxid 28 - 30% vào 1 lít nước Milli-Q®. Sử dụng dung dịch natrỉ hydroxid 2,5 N để chỉnh pH của pha động A đến 11,0. - Pha động B: Acetonitril. - Tiếu hành sắc ký theo chương trình gradient dung môi như sau: Thời gian (phút) Pha động A (%) Pha động B (%) 0 100 0 10 0 100 - Tốc độ dòng: 0,2 ml/phút. - Detector khối phổ. - Thể tích tiêm: 4|il. - Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: khoảng 0,35 mg/ml trong nước muối 0,9%. * Tiến hành: Lần lượt tiêm các dung dịch chuẩn và thử. Dựa vào đáp ứng của pic Tobramycin trong các dung dịch chuẩn, thử và hàm lượng dung dịch chuẩn, tính lượng Tobramycin có trong chế phẩm. 10 Ngoài các phương pháp nêu trên, người ta cũng đã nghiên cứu phương pháp định lượng Tobramycin bằng sắc ký lỏng trao đổi anion với detector amper kế và định lượng một số kháng sinh nhóm aminoglycosid bằng sắc ký lỏng detector huỳnh quang tạo dẫn xuất sau cột. Các phương pháp định lượng Tobramycin nêu trên thường mất nhiều thời gian (phương pháp vi sinh vật) hoặc tiến hành rất phức tạp và đòi hỏi phải có trang thiết bị đặc biệt (các phương pháp HPLC). Dựa vào cấu trúc của Tobramycin có chứa các đường khử, chúng tôi nghiên cứu định lượng Tobramycin bằng phương pháp đo phổ hấp thụ vùng khả kiến. 1.3. PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ UV-VIS 1.3.1. Cơ sở lý thuyết của phương pháp định lượng bằng quang phổ hấp thụ ƯV-Vis. [2],[3],[4],[5],[11],[16],[18] 1.3.1.1. Định luật Lambert-Beer Chiếu một chùm tia sáng đon sắc có bước sóng X và cường độ I0 qua dung dịch đồng nhất có nồng độ c, bề dày lớp dung dịch là 1. Khi đi qua dung dịch, một phần ánh sáng bị hấp thụ, một phần bị phản xạ, phần còn lại (I) thì đi qua dung dịch. Mối quan hệ giữa I và I0 được thể hiện bằng định luật Lambert - Beer. I = I0 X 1 0'eCI Với 8 là hệ số hấp thụ riêng của dung dịch. Hệ số này không phụ thuộc vào nồng độ, chỉ phụ thuộc vào bản chất chất tan, vào bước sóng của ánh sáng chiếu vào dung dịch. 1.3.1.2. Điều kiện ứng dụng định luật Lambert - Beer + Chùm tia sáng phải đơn sắc + Dung dịch phải loãng (nằm trong khoảng nồng độ thích hợp). 11 + Dung dịch phải trong suốt (trừ chuẩn độ đo quang). + Chất thử phải bền trong dung dịch và phải bền dưới tác dụng của ánh sáng (ƯV-Vis). 1.3.1.3. Sự sai lệch đối với định luật Lambert-Beer • 0- • • • + Sai lệch do máy: (do bộ phận đơn sắc, bộ phận khuếch đại kém) như do tế bào quang điện, nhân quang quá già, độ nhạy kém. + Sai lệch do hóa học: • Do sự phân ly (ion hóa): thường gặp khi pha loãng dung dịch, phân tử chất tan bị phân li, mà độ hấp thụ của dạng phân tử và dạng ion phân li không như nhau. • Do tạo dimer, trimer: sản phẩm trùng hợp này lại có độ hấp thụ khác dạng đơn phân tử. + Do phản ứng các chất lạ: • Chất lạ có thể tạo phức với các ion trong dung dịch: để đề phòng hiện tượng này xảy ra, người ta dùng mẫu trắng có thành phần như dung dịch, chỉ thiếu chất cần định lượng. • Sự hấp thụ của chất lạ, thuốc thử cũng có thể ảnh hưởng tới kết quả định lượng. Vì vậy trong quá trình làm phản ứng “tạo màu” (tạo khả năng hấp thụ ánh sáng), phải chú ý tới điều kiện phản ứng và các thành phần tham gia phản ứng. 1.3.1.4. Một số đại lượng thông dụng + Đ ộ truyền qua (T-Transm ittance): Độ truyền qua (hay còn gọi là độ thấu quang) đặc trưng cho độ trong suốt (về mặt quang học) của dung dịch, được định nghĩa: _ ĩt ___ -ị ^ q ~ T o~ 12 - gC I Thường T tính ra phần trăm (%). Một chất có T = 1 (hay 100%), nghĩa là hoàn toàn không có hấp thụ ánh sáng, người ta nói chất đó hoàn toàn trong suốt. + Đ ộ hấp thụ (A -A bsorbance): Độ hấp thụ (hay còn gọi là mật độ quang) được định nghĩa: A = l g i = s .c .l Đối với một chất xác định (có 8 xác định), thường đo trên một loại cốc đo (có bề dày thông thường là 1 = lcm), như vậy độ hấp thụ tỷ lệ thuận với nồng độ dung dịch: A = K . c (K = 8.1) + Hệ số hấp thụ phần trăm ( EỊ“' ): Theo công thức A = s.c.l, nếu 1 = lcm, c= 1% thì: A = e = EỊ“ ' Vậy E Ị™'chính là độ hấp thụ của dung dịch có nồng độ 1% , dùng cốc đo có bề dày lcm. Với một chất tan xác định, tại một X xác định, EỊồ™là một hằng số. + Hệ số hấp thụ phân tử (skl): Hệ số hấp thụ phân tử, hay còn gọi là hệ số tắt mol, là độ hấp thụ của dung dịch có nồng độ 1M/1, dùng cốc đo có bề dày lcm. Cũng như EỊ™, với một chất xác định, trong những điều kiện đo xác định (X, dung môi, nhiệt độ,...), Sụ, là một hằng số. Giữa EỊ™ và E ìcm có môi liên hệ: 8^ = —^~ X M Ở đây M là phân tử gam của chất tan. 1.3.2. Các kỹ thuật định lượng bằng phương pháp quang phổ UV- Vis. [2],[3] 13 1.3.2.1. Phương pháp đo phổ trực tiếp: Đo độ hấp thụ A của dung dịch, tính nồng độ c của dung dịch dựa vào giá trị EỊ™ biết trước (tra cứu). Trong phương pháp này, phải chú ý kiểm tra máy đo về bước sóng (X) và mật độ quang A bằng cách : • Dùng đèn thủy ngân, đèn D 2 (cho một vạch sáng có bước sóng xác định). • Dùng một mẫu chuẩn, đo và điều chỉnh để tìm sai số. • Dùng kính lọc Holmium (có các giá trị Xmax xác định cho trong tài liệu) để kiểm tra lại máy. • Dùng dung dịch K2C r0 4 , K 2Cr20 7 tinh khiết quang phổ pha thành dung dịch có nồng độ chính xác. Đo phổ tìm các giá trị Àroax và tìm Amax. 1.3.2.2. Phương pháp so sánh Đo độ hấp thụ Ax, Ac của dung dịch thử có nồng độ c x (chưa biết) và của dung dịch chuẩn có nồng độ Ac (đã biết). I I I r la có: j*l V _ C . ' V 1—1 _ ^'Í V t ^ _ = — —>•(Jx— — x(jc Ac Cc Ac Chú ý: nồng độ của dung dịch thử Cx và của dung dịch chuẩn Cc không được chênh lệch nhau quá nhiều. Nồng độ dung dịch này càng gần nhau, kết quả càng chính xác. 1.3.2.3. Phương pháp thêm chuẩn so sảnh Đo độ hấp thụ Ax của dung dịch cần tìm nồng độ cx. Thêm một lượng chất tan a (đã biết) vào dung dịch, đo độ hấp thụ A ’x của dung dịch tạo thành. Cx Ta có: Co + C x - G 14 Vậy nên: Cx = C0 A x X A X - - Ax 1.3.2.4. Phương pháp đường chuẩn Pha một dãy dung dịch chuẩn, đo A của chúng ở bước sóng đã chọn, lập đồ thị của A theo c. Đo Ax của dung dịch trên và xác định c x dựa vào đường chuẩn. (Hình 1.1) Trong trường hợp dung dịch không tuân theo định luật Lambert-Beer (đường chuẩn không thẳng) cần pha nhiều dung dịch chuẩn hơn với nồng độ gần nhau hơn (khác nhau không quá 10%). 6 c Hình 1.1. Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và độ hấp thụ quang theo phương pháp đường chuẩn Khi xây dựng đường chuẩn, người ta thường sử dụng đường chuẩn tuyến tính (thẳng) hoặc tìm một đoạn tuyến tính trên đường chuẩn để sử dụng trong định lượng nếu đường chuẩn cong (phi tuyến, không thẳng). Đường chuẩn được lập dựa vào các điểm thực nghiệm, bằng phương pháp bình phương tối thiểu; tìm phương trình hồi quy tuyến tính và hệ số 15 tương quan r. Trong định lượng, nếu khảo sát được một đoạn đường chuẩn có hệ số tương quan r > 0,9995 là tốt. 1.3.2.5. Phương pháp thêm đường chuẩn Đo mật độ quang của dung dịch cần định lượng, rồi thêm vào những lượng khác nhau và chính xác của chất chuẩn vào dung dịch cần định lượng, đo mật độ quang của các dung dịch đó. Vẽ đường chuẩn (đồ thị của độ hấp thụ A theo lượng chất thêm vào). Giao điểm của đường chuẩn với trục hoành (nồng độ) cho ta nồng độ của chất cần định lượng. (Hình 1.2) A Hình 1.2. Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ chuẩn thêm vào với độ hấp thụ quang theo phương pháp thêm đường chuẩn 1.3.2.6. Phươngphảp chuẩn độ đo quang + Nguyên tắc: Phát hiện điểm tương đương bằng phương pháp đo quang. 16 (chất cần định lượng) (thuốc thử) (sản phẩm) Trong 3 chất trên, ít nhất phải có một chất hấp thụ ánh sáng ở bước sóng khảo sát. Tại điểm tương đương, xuất hiện điểm gãy của đồ thị biểu diễn sự biến thiên của độ hấp thụ A của dung dịch. Trên đồ thị, trục tung chỉ độ hấp thụ A của dung dịch, trục hoành chỉ lượng thuốc thử cho vào dung dịch cần định lượng. (Hình 1.3). A -----------------* c Thể tích thuốc thử Điểm kết thúc Hình 1.3. Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa thể tích thuốc thử và độ hấp thụ quang theo phương pháp chuẩn độ đo quang. Điều quan trọng của phương pháp này là tìm được bước sóng thích hợp để xác định điểm tương đương. + Ưu điểm: phương pháp này có ưu điểm nổi bật là vẫn định lượng được trong một số trường hợp mà các phương pháp khác không áp dụng được: • Dung dịch có màu không quá đậm. • Dung dịch không quá đục. • Dung dịch không tìm được chỉ thị màu. • Dung dịch không định lượng được bằng phương pháp chuẩn độ đo thế. 1.3.2.7. Phương pháp định lượng hỗn hợp theo nguyên tắc cộng phổ Dựa trên tính chất cộng tính của độ hấp thụ ánh sáng ta có: At = Aj + A2 +... Với hỗn hợp có hai chất 1 và 2: At = Ai + A2 Lựa chọn các bước sóng Ằ,1 và x2, đo độ hấp thụ A /,, Ati của hỗn hợp ở hai bước sóng Ằ,1 và %2 đóTại X.ị: A^, = E) 1. Ci + E 2.1-C2 Tại %2- A-tĩ = Ei 2' Ci + E2.2-C2 Các hệ số là các hằng số đã biết, hoặc đã xác định được bằng thực nghiệm. Giảihệ hai phương trình hai ẩn số trên, ta tính được Ci, c 2. Với hỗn họp gồm có 3 chất: đo độ hấp thụ của hỗn hợp tại 3 bước sóng khác nhau, rồi giải hệ 3 phương trình 3 ẩn. Có thể đo mật độ quang (độ hấp thụ) tại nhiều bước sóng hơn số chất cần định lượng (ví dụ đo tại 4-5 bước sóng khi định lượng hỗn họp gồm 2-3 chất) rồi tính kết quả. Chú ý: Trong hỗn hợp 2 chất, tại bước sóng nào đó mà có một chất không hấp thụ ánh sáng hoặc hấp thụ không đáng kể thì ta có thể pha loãng dung dịch rồi đo A như khi đo một chất. Ví dụ: hỗn hợp Pethidin và Chlorocresol có: Pethidin: E 2 57 = 7,3 E 2 79 - 0 C hlorocresol: E 2 57 = 20 E 2 79 = 105 Với E257, E279 lần lượt là độ hấp thụ của Pethidin và Chlorocresol ở bước sóng 257nm và 279nm. Như vậy nếu ta đo A ở 279nm, xác định được hàm lượng chlorocresol, đo ở 257nm, tính hiệu, được hàm lượng Pethidin. 18 1.3.3. ư u nhược điểm của phương pháp định lượng bằng quang phổ hấp thụ UV-Vis 1.3.3.1. ưu điểm: + Độ chính xác của phương pháp khá cao. + Sai số tương đối của phương pháp nhỏ, thường vào khoảng 0,5-1%. + Độ nhạy của phương pháp giúp ta có thể phân tích được các dung dịch loãng cỡ 10'4 rất thích hợp cho các phép phân tích vết (phân tích độc chất). + Thời gian phân tích nhanh chóng, chỉ cần 5- 10 phút có thể cho biết ngay kết quả. + Kỹ thuật thao tác đon giản, máy móc ngày càng hoàn thiện, gọn nhẹ, trình độ tự động hóa, tin học hóa cao. + Với một số trường hợp hỗn họp 2 thành phần có khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại, có cực đại hấp thụ khác nhau và thành phần này không hấp thụ quang ở bước sóng hấp thụ cực đại của thành phần kia, ta có thể dùng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis để định lượng đồng thời hai thành phần mà không cần chiết tách. 13.3.2. Nhược điểm\ Với trường hợp hỗn họp nhiều thành phần không thể định lượng đồng thởi, cần quá trình chiết tách phức tạp mới đo quang từng thành phần riêng rẽ, quá trình này tốn kém dung môi, hóa chất, dễ xảy ra sai số, dung môi ít nhiều độc hại và yêu cầu người tiến hành có tay nghề ổn định. 19 PHẢN 2: T H ự C NGHIỆM VÀ KÉT QUÃ 2.1. NỘI DUNG, ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 2.1.1. Nội dung nghiên cứu Tiến hành nghiên cứu, khảo sát các điều kiện để xây dựng phương pháp định lượng Tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp đo độ hấp thụ khả kiến trên máy quang phổ thông thường. 2.1.2. Đối tượng nghiên cứu 2.1.2.1. Dụng cụ: - Cân phân tích hiện số Mettler AB 204 (Toledo - Thụy Sĩ) độ chính xác 0,1 mg. - Máy đo quang phổ UV/VIS Lambda EZ 210 (Perkin Elmer- Đức). - Bình định mức lOml, 20ml, lOOml. - Pipet chính xác các loại, ống đong. - Nồi đun cách thủy. - Cốc có m ỏ, ống nghiệm . 2.1.2.2. Hóa chất: - Tobramycin dạng nguyên liệu do bộ môn Hóa Dược cung cấp. - Dung dịch NaOH 0,1 N; 0,01 N. - Thuốc tím (KM n04) dạng bột nguyên liệu. - Nước cất 2 lần. 2.1.3. Phương pháp nghiên cứu * Khảo sát các điều kiện để xây dựng phương pháp định lượng Tobramycin. 20 + Thực nghiệm 2\ Tiến hành như phần thực nghiệm 1 nhưng thay NaOH 0,0IN bằng NaOH 0,1 N. Kết quả được ghi trong bảng 2. Bảng 2: Ảnh hưởng của dung dịch NaOH 0,1N đến độ hấp thụ của dung dịch sản phẩm. STT Thời gian Độ hâp thụ 1 Đo ngay 0,468 2 30 0,485 3 45 0,492 4 60 0,496 5 120 0,483 Nhận xét: Qua số liệu thu được ở bảng 1,2 chúng tôi thấy: Khi dùng dung dịch NaOH 0,1 N thì độ hấp thụ của dung dịch không ổn định. Nhưng khi chuyển sang dùng dung dịch NaOH 0,01 N thì độ hấp thụ của dung dịch sản phẩm ổn định hơn. Vì vậy chúng tôi chọn dung dịch NaOH 0,01 N để làm môi trường cho phản ứng. * Khảo sát ảnh hưởng của lương NaOH 0,01 N đến đô hấp thu của dung dich : Để tiến hành khảo sát này chúng tôi tiến hành thực nghiệm sau. Thực nghiệm 3: Cân chính xác lượng Tobramycin sulphat tương ứng với 0,3g Tobramycin vào bình định mức có dung tích lOOml. Thêm nước vừa đủ đến vạch. Lấy lml dung dịch trên cho vào bình định mứcỆOml, thêm 1 lượng dung dịch NaOH 0,0IN (lượng NaOH thay đổi từ 1 đến 10 ml); 1 ml dung dịch KMnƠ 4 0,1 N trộn đều, thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc đều. 23 Làm mẫu trắng tương tự mẫu thử nhưng không có Tobramycin. Tiến hành đo mật độ quang của các dung dịch ở bước sóng 425nm, cuvet dày lcm Ket quả thu được được trình bày trong bảng 3. Bảng 3: Ảnh hưởng của lượng NaOH 0,1 N đến độ hấp thu của dung dich. STT Lượng NaOH 0,01N(ml) Độ hâp thụ 1 1 0,468 2 2 0,472 3 3 0,456 4 4 0,480 5 5 0,483 6 6 0,482 7 7 0,475 8 8 0,468 9 9 0,480 10 10 0,465 Nhận xét: Từ kết quả trong bảng 3 chúng tôi thấy : Lượng NaOH thêm vào từ 4-6 ml thì độ hấp thụ của dung dịch đạt cực đại. Vì thế chúng tôi chọn thêm vào dung dịch phản ứng 5ml NaOH 0,01 N để tạo môi trường thích họp (pH khoảng 11,4). * Khảo sát ảnh hưởng của lương KMnOâ 0,1 N đến áô hấp thu của dung dich. Tiến hành thực nghiệm sau: 24 Thực nghiệm 4: Cân chính xác lượng Tobramycin sulphat tương ứng với 0,3g Tobramycin vào bình định mức có dung tích lOOml. Thêm nước vừa đủ đến vạch. Lấy lml dung dịch trên cho vào bình định mức 20ml, thêm 5ml dung dịch NaOH 0,0IN; thêm 1 lượng dung dịch KMnƠ 4 0,1N (lượng KM n0 4 thay đổi từ 1 đến 5 ml) trộn đều, thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc đều. Làm mẫu trắng tương tự mẫu thử nhưng không có Tobramycin. Tiến hành đo mật độ quang của các dung dịch ở bước sóng 425nm, cuvet dày lcm. Kết quả được ghi ở bảng sau: Bảng 4: Ảnh hưởng của lượng KM n04 đến độ hấp thụ của dung dịch. STT Lượng KM11O4 0,1N (ml) Độ hâp thụ 1 1 0,482 2 1,5 0,520 3 2 0.522 4 2,5 0,522 5 3 Không đo được Nhận xét: Khi lượng KMnƠ4 tăng lên từ 3 ml thì không thấy tạo thành ; sản phẩm màu xanh lá cây, mà tạo thành dung dịch màu tím và tủa chứng tỏ ' lượng KMnƠ 4 cao sẽ oxy hóa quá mức Tobramycin, Mn+7 không tạo thành Mn+6 mà oxy hóa thành Mn+4 (tủa) nên không thể tiến hành đo được. Do đó chúng tôi chọn lượng KM nơ 4 thêm vào phản ứng là 2ml. 2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến độ hấp thụ của dung dịch ờ các nhiệt độ khác nhau: Khi tăng nhiệt độ của phản ứng thì tốc độ của phản ứng oxy hóa nhanh hơn. Đe làm rõ điều này chúng tôi tiến hành thực nghiệm sau: Thực nghiệm 5: Cân chính xác lượng Tobramycin sulphat tương ứng với 0,3g Tobramycin vào bình định mức có dung tích lOOml. Thêm nước vừa đủ đến vạch. Lấy lml dung dịch trên cho vào bình định mức 20ml, thêm 5ml dung dịch NaOH 0,01N; thêm 2ml dung dịch KMĨ1O4 0,1N trộn đều, thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc đều. Làm mẫu trắng tương tự mẫu thử nhưng không có Tobramycin. Tiến hành đo mật độ quang của các dung dịch ở bước sóng 425nm, cuvetdày lcm. Ket quả được ghi ở bảng 5: Bảng 5: Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến độ hấp thụ của dung dịch Ở nhiệt độ thường STT Thời gian (phút) Độ hâp thụ 1 Đo ngay 0,493 2 30 0,500 3 45 0,515 4 60 0,520 5 120 0,521 6 180 0,520 Thực nghiệm 6: Làm lại thực nghiệm trên, nhưng đun nóng mẫu chuẩn và mẫu thử trong bình cách thủy ở nhiệt độ 40°c ngay sau khi tiến hành phản ứng. Kết quả được'ghi lại ở bảng 6 dưới đây: 26 Bảng 6: Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến độ hấp thụ của dung dịch Ở 40° c STT Thời gian (phút) Độ hâp thụ 1 Đo ngay 0,515 2 30 0,518 3 45 0,520 4 60 0,520 5 120 0,521 6 180 0,520 Thực nghiệm 7: Làm lại thực nghiệm 5 nhưng đun nóng dung dịch mẫu chuấn và mẫu thử ở 80°c. Kết quả được ghi lại trong bảng sau: Bảng 7: Ảnh hưởng của thòi gian phản ứng đến độ hấp thụ của dung dịch: Ở 80° c STT Thời gian (phút) Độ hâp thụ 1 Đo ngay 0,515 2 30 0,518 3 45 0,520 4 60 Không đo được 5 120 Không đo được 6 180 Không đo được Nhận xét: Khi thực hiện phản ứng ở nhiệt độ thường thì tốc độ phản ứng diễn ra rất chậm, lâu đạt đến ổn định. Nếu đun nóng nhẹ ở nhiệt độ 40°c , 27 tốc độ phản ứng tăng lên, độ hấp thụ của dung dịch cũng ổn định hơn. Còn khi đun nóng dung dịch ở nhiệt độ 80°c thì lại tạo thành tủa do Mn+7 oxy hóa thành Mn+4 (tủa màu nâu) nên không tiến hành đo được. Do đó, từ các kết quả trên chúng tôi chọn cách tiến hành như ở thực nghiệm 6. 2.2.3. Theo dõi độ ổn định của dung dịch sản phẩm: Từ số liệu ghi ở bảng 6, khi dùng 5ml dung dịch NaOH 0,0IN, 2ml dung dịch KMnƠ 4 0,1N, đun nóng ở nhiệt độ 40°c thì độ hấp thụ của dung dịch sản phẩm hầu như không thay đổi và ổn định từ phút thứ 45 cho đến phút thứ 120. Do đó, chúng tôi chọn thời gian đo độ hấp thụ của dung dịch là phút thứ 60 kể từ khi đun nóng dung dịch sản phẩm trong bình cách thủy. 2.2.4. Xây dựng phương pháp và ứng dụng: * Xây dựng phương pháp: Từ những kết quả khảo sát trên, chúng tôi xây dựng các bước tiến hành định lượng như sau: Cân một lượng Tobramycin sulphat tương ứng với khoảng 0,3g Tobramycin nguyên liệu, cho vào bình định mức có dung tích lOOml, bổ sung nước cất 2 lần vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lấy lml dung dịch này cho vào bình định mức có dung tích 20ml, thêm 5 ml dung dịch NaOH 0,0IN, 2ml dung dịch KMnƠ4 0,1N và thêm nước cất 2 lần vừa đủ đến vạch, trộn đều. Dung dịch vừa pha đem đun cách thủy ở 40°c trong 60 phút. Song song tiến hành làm một mẫu chuẩn bằng chất đối chiếu Tobramycin. Mau trắng tiến hành tương tự mẫu thử nhưng không có Tobramycin. Sau khi đun cách thủy ở 40°c, thời gian 60 phút, đem đo mật độ quang của các dung dịch này ở bước sóng 425nm, cuvet dày lcm. 28 / * Cách tính kết quả: Theo phương pháp so sánh, hàm lượng % được tính theo công thức: c%= Ac Xmt Xc Trong đó: c% : Hàm lượng % Tobramycin có trong mẫu thử. C: Hàm lượng % Tobramycin có trong mẫu chuẩn. At : Độ hấp thụ của dung dịch thử. Ac : Độ hấp thụ của dung dịch chuẩn. mt : Khối lượng tính bằng gam của Tobramycin trong bột nguyên liệu đã cân để pha dung dịch thử. mc : Khối lượng tính bằng gam của Tobramycin chuẩn đã cân để pha dung dịch chuẩn. * ứ n g dụng: Chúng tôi sử dụng phương pháp đã xây dựng ở trên để định lượng mẫu nguyên liệu Tobramycin do bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp và dùng chất đối chiếu hóa học Tobramycin hàm lượng 98,5% do bộ m ôn cung cấp. / Tiến hành định lượng 5 mẫu. Kết quả ghi trong bảng 8 . Bảng 8: Kết quả định lượng Tobramycỉn trong nguyên liệu. STT Khôi lượng cân ( g ) Độ hâp thụ c% 1 0,3002 0,523 98,84 2 0,2990 0,522 99,05 3 0,2992 0,519 98,42 4 0,3005 0,520 98,18 5 0,2988 0,518 98,36 Chuân 0.3001 0.521 98,5 29 Từ bảng 8: 'x = 98,57% s = 0,361 AX = 0,45 RSD (%) = 0,37 Vậy theo phương pháp định lượng chúng tôi xây dựng, hàm lượng Tobramycin trong bột nguyên liệu do Bộ môn Hóa dược - trường Đại Học Dược Hà Nội cung cấp là : 98,57% ± 0,45. 2.2.5. Đánh giá phương pháp * Xác định tính chính xác của phương pháp: Theo kết quả ở bảng 8 ta có: - Giá trị trung bình: X = 98,57% - Độ lệch chuẩn: s = 0,361 - Khoảng tin cậy của giá trị trung bình : X (%) = 98,57% ± 0,45 - Độ lệch chuẩn tương đối: RSD = 0,37% < 2% Vậy phương pháp là chính xác. * Xác định tính đúng của phương pháp : Cân 5 mẫu chất đối chiếu Tobramycin (nồng độ 98,5%) do bộ môn Hóa Dược -trường Đại Học Dược Hà nội cung cấp với khối lượng từ 0,2400g đến 0,3600g (khoảng 80 đến 120% so với lượng cân dùng trong khi định lượng ). Tiến hành theo phương pháp đã xây dựng. Ket quả thu được ghi ở bảng 9. 30 Bảng 9 : Kết quả khảo sát tính đủng của phương pháp. STT Lượng Tobramycin Lượng hoạt chât Lượng tìm lại Phân trăm cho vào (g) có thực (g) được (g) tìm lại (%) 1 0,2495 0,2458 0,2421 98,49 2 0,3007 0,2962 0,2915 98,41 3 0,3264 0,3215 0,3171 98,63 4 0,3677 0,3622 0,3563 98,37 5 0.3465 0,3413 0,3370 98,74 6 0,3046 0,3000 0,3000 100 Từ kết quả của bảng 9 ta có: - Phương trình hồi quy về mối tương quan giữa lượng hoạt chất ban đầu và lượng hoạt chất tìm lại là: y = 0,986 Ix - 0,0002 - Hệ số tương quan: r = 0,9999 - Trung bình % tìm lại: 98,53% „ - Độ lệch chuẩn của y_intercept: Sb= 0,021 - Khoảng tin cậy của y_intercept: Ab = 0,067 - 0,0672 < B < 0,0668 - Độ lệch chuẩn của độ dốc: Sa = 0,0066 - Khoảng tin cậy của độ dốc: ÀA= 0,021 0,9651 < A < 1,0071 Kết luận: - Không có sai số hệ thống hằng định vì khoảng tin cậy của y_intercept chứa 0 . 31 - Giá trị trung bình của tỷ lệ thu lại là 98,49% nghĩa là nằm trong khoảng từ 98% đến 102%. Như vậy, phương pháp đưa ra là đúng trong khoảng khảo sát. * Xác định tính tuyến tính của phuong pháp: Từ kết quả bảng 9 chúng tôi thiết lập sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ dung dịch để xây dựng tính tuyến tính của phương pháp. Kết quả này được trình bày ở bảng 10. Bảng 10 Sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ dung dịch STT 1 2 3 4 5 c (g/1) 0,123 0,148 0,161 0,171 0,181 A 0,426 0,513 0,558 0,593 0,627 At 0.7 0.6 0.5 I 0.4 j 0.3 1 0.2 ị ' 0.1 I 0 L 0 - - ..................................................... 0.05 0.1 0.15 0.2 C(g/ml) Hình 1.4. Đồ thi biểu diễn sư phu thuôc của • • 1 • • mật độ quang vào nông độ của dung dịch - Phương trình hồi quy về mối tương quan giữa mật độ quang và nồng độ dung dịch là: y = ~23$ 'x - 0,0005 - Hệ số tương quan: r = 0,‘>73é - Độ lệch chuẩn của y_intercept: SB= 0,001 - Khoảng tin cậy của y intercept: AB= 0,00318 - 0,00368 < B < 0,00258 .Từ kết quả trên cho thấy, hệ số tương quan của đường hồi quy vượt quá 0,99....Tất cả các giá trị đo được nằm trên đường hồi quy hoặc phân bố đồng đều cả 2 phía của đường hồi quy. Khoảng tin cậy của y_intercept chứa 0. Vậy phương pháp này là tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 80% đến 120% nồng độ làm việc. * Xác định tính đặc hiệu của phương pháp: Đe khảo sát ảnh hưởng của tạp chất chúng tôi tiến hành như sau: .Chuẩn bị hai mẫu: Mau 1: Chuẩn bị một khối lượng nguyên liệu Tobramycin (m = 0,3g ) sau đó tiến hành như 2.2.4. Mầu 2: Làm như mẫu 1 nhưng không có Tobramycin. Được kết quả như bảng 11: 33 Bảng 11: Tính đặc hiệu của phương pháp Mau D425 1 0,520 2 0,001 Như vậy tạp chất không ảnh hưởng tới kết quả định lượng của phương pháp. 34 2.3. BÀN LUẬN: Hiện nay, đã có rất nhiều phương pháp khác nhau được ứng dụng để định lượng Tobramycin. Chủ yếu là định lượng bằng phương pháp vi sịnh ^ vật và phương pháp HPLC. Phương pháp vi sinh vật tốn nhiều thời gian và độ chính xác không cao. Các phương pháp HPLC trong BP 2005 và USP 28 có độ chính xác cao nhưng quy trình thực hiện phức tạp và đòi hỏi các điều kiện định lượng mà hầu hết các cơ sở kiểm nghiệm trong nước không đáp ứng được. Ngoài ra trong một số tài liệu nước ngoài còn đưa ra một số phương pháp mới đế định lượng kháng sinh nhóm Aminoglycosid nói chung và Tobramycin nói riêng. Như phương pháp đo quang phổ tử ngoại, dựa trên phản ứng tạo cặp ion của các kháng sinh aminoglycosid và xanh Bromothymol [24], hoặc ílouro hóa nhóm amino của các kháng sinh aminoglycosid sau đó đo cường độ huỳnh quang của sản phẩm để định lượng [22], hay sử dụng phương pháp điện di mao quản [23]. Tuy nhiên phương pháp định lượng bằng phương pháp quang phổ uv -Vis mà chúng tôi xây dựng có độ chính xác cao, tiến hành đon giản, không yêu cầu máy móc quá phức tạp, hóa chất thông dụng và có thể áp dụng định lượng ở các cơ sở kiểm nghiệm trong cả nước. Nhược điểm của phương pháp là không áp dụng được với những chế phẩm Tobramycin có chứa những chất khác có khả năng hấp thụ quang phổ tử ngoại - khả kiến ví dụ như chế phẩm thuốc nhỏ mắt Tobramycin có chứa chất bảo quản benzalkonium clorid. Nhưng phương pháp hoàn toàn có thể áp dụng với chế phẩm không chứa chất có khả năng hấp thụ ánh sáng như các chế phẩm thuốc tiêm. Do đó mở ra khả năng ứng dụng của phương pháp là rất lớn. 35 PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐÈ XUẤT 3.1 Kết luân .Sau một thời gian làm khóa luận tại bộ môn Hóa Dược, khóa luận đã đạt được những kết quả sau: + Khảo sát được điều kiện định lượng Tobramycin nguyên liệu trong môi trường kiềm bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ khả kiến ở bước sóng 425nm, sử dụng thuốc thử KM 11O4. + Xây dựng được quy trình định lượng và công thức tính toán nồng độ Tobramycin có trong chế phẩm. + Đã tiến hành đánh giá phương pháp và các kết quả cho thấy phương pháp là chính xác, tuyến tính, đúng trong khoảng nồng độ khảo sát và đặc hiệu.. Kết luận: Có thể áp dụng phương pháp này để định lượng Tobramycin nguyên liệu. 3.2. Đề xuất Do điều kiện thời gian có hạn, chúng tôi chỉ mới tiến hành định lượng được Tobramycin nguyên liệu. Tuy nhiên từ những kết quả thu được trong khóa luận, chúng tôi có những đề xuất sau: + Áp dụng phương pháp định lượng mới xây dựng để định lượng Tobramycin nguyên liệu thay thế các phương pháp khác như phương pháp vi sinh vật, phương pháp HPLC. + Tiếp tục nghiên cứu để ứng dụng phương pháp này vào định lượng chế phẩm có chứa Tobramycin. 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Bộ môn Hóa Dược (2004), Hóa Dược, Trường Đại Học Dược Hà Nội, tập 2. trang 210-211. 2. Bộ môn Hóa Phân tích (2004), Kiểm nghiệm thuốc, Trường Đại Học Dược Hà Nội, trang 68-79. 3. Bộ môn Hóa Phân tích (2002), Hóa phân tích, Trường Đại Học Dược Hà Nội, tập 2, trang 17-22. 4. Bộ môn Vật lý-Toán (2000), Vật lý đại cương, Trường Đại Học Dược Hà Nội, trang 282-288. 5. Bộ Y tế (2002), Dược điển Việt Nam III, Nhà xuất bản Y học Hà Nội, trang 178-179, phụ lục 3 (PL-75,76). 6. Bộ Y Tế (2002), Dược điển Việt Nam III, Nhà xuất bản Y học Hà Nội. 7. Bộ Y Tế (2002), Dược thư Quốc gia Việt Nam, Nhà xuất bản Y học Hà Nội. 8. Công ty cổ phần Dược phẩm Hà Tây, Tiêu chuẩn cơ sở thuốc nhỏ mắt Tobs - Dex. 9. Công ty cổ phần Dược phẩm Hà Tây, Tiêu chuẩn cơ sở thuốc nhỏ mắt Tobramycin. 10. Trần Thúy Hạnh (2006), Nghiên cứu định lượng Tobramycin trong một số thuốc nhỏ mắt bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với deíector huỳnh quang -tạo dẫn xuất sau cột, Luận văn thạc sỹ Dược học. 11. Nguyễn Đình Triệu (2001), Các phương pháp phân tích vật lý và hóa lỷy Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, tập 1, trang 9-28, 169-246. Tiếng Anh 12. British Pharmacopoeia 2005, Volume 1& 2. 13. British Pharmacopoeia 2002. 14. Chia - Hsien Feng, Shun - Jin Lin, Hsin - Jung Wu, Su - Hwei Chen (8/8/2002), Trace analysỉs o f Tobramycỉn in human plasma by derìvatization and high - performance liquid chromatography yvith ultraviolet detection, www.elsevier.com./locate/chromb. 15. European Pharmacopoeia 2003, Supplement 4.3. . 16. Feng CH, Lin SJ, Wu HL, Chen SH (25/11/2002), “Journal Chromatogr B Analyt Technol Bìomed”, Life Sciences 780(2). 17. Michele Xuemei Gou, Loren Wrisley, Eshwar Maygioo (27/4/2006), Measurement o f Tobramycỉn by reversed - phase high performance liquid chromatography wỉth mass spectrometry detectíon, http://www.sciencedirect.com. 18. ư v and Visible spectrophotometry in Organic chemistry, http://www.inembers.aol.com/iogan20/uv.html. 19. Srinivasulu c, Vidyasagar G, Sastry BS(2003), “Spectrophotometric method fo r the determinatỉon o f tobramycin in pharmaceutìcal /ormulations”, Indian joumal of pharmaceutical sciences, volum 65, page 80-82 20. The Japanese Pharmacopoeia Fourteenth Edition Supplement I. 21. The United States Pharmacopoeia 28, Volume II, 2005. (2003), 22. Taylor & Prancis (1/2002), “Fluorimetric detecminatiơn oj' amiítoglycosìd antìbìotics in phtưmaceutìcal preparatUms ítmỉ bioỉogical ýhiiíỉs”. ịournal Spectroscopy Letters, volume 35. 23. Wai Siang L aw , Pavel Kubári , U n g U n g Yuan , Jian Honn /.lu;: , Sam Fong Yau Li , Peter c. Hauser( 18/4/2006), DeterminatUm ĩĩí tobramycin ỉn hmnim serum by capUlary electrophoresis wiỉẩì contactless conductivlty detecíìon, Wilev ĩnterScience .ỉounui Abstract, volume 27, page 1932-1938. 24. p. R. Bontchev, p. Papazova 9/1984), “pectrophotometrìc method fo r determination o f tobramycin, apramycin and kanamycin in /ormulations”, Microchimica Act, volume 84. [...]... bằng phương pháp đo phổ hấp thụ vùng khả kiến 1.3 PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ UV-VIS 1.3.1 Cơ sở lý thuyết của phương pháp định lượng bằng quang phổ hấp thụ ƯV-Vis [2],[3],[4],[5],[11],[16],[18] 1.3.1.1 Định luật Lambert-Beer Chiếu một chùm tia sáng đon sắc có bước sóng X và cường độ I0 qua dung dịch đồng nhất có nồng độ c, bề dày lớp dung dịch là 1 Khi đi qua dung dịch, một phần ánh sáng bị hấp thụ, ... kiện để xây dựng phương pháp định lượng Tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp đo độ hấp thụ khả kiến trên máy quang phổ thông thường 2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 2.1.2.1 Dụng cụ: - Cân phân tích hiện số Mettler AB 204 (Toledo - Thụy Sĩ) độ chính xác 0,1 mg - Máy đo quang phổ UV/VIS Lambda EZ 210 (Perkin Elmer- Đức) - Bình định mức lOml, 20ml, lOOml - Pipet chính xác các loại, ống đong - Nồi đun cách... thuật thao tác đon giản, máy móc ngày càng hoàn thiện, gọn nhẹ, trình độ tự động hóa, tin học hóa cao + Với một số trường hợp hỗn họp 2 thành phần có khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại, có cực đại hấp thụ khác nhau và thành phần này không hấp thụ quang ở bước sóng hấp thụ cực đại của thành phần kia, ta có thể dùng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis để định lượng đồng thời hai thành phần mà không cần... thị của độ hấp thụ A theo lượng chất thêm vào) Giao điểm của đường chuẩn với trục hoành (nồng độ) cho ta nồng độ của chất cần định lượng (Hình 1.2) A Hình 1.2 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ chuẩn thêm vào với độ hấp thụ quang theo phương pháp thêm đường chuẩn 1.3.2.6 Phươngphảp chuẩn độ đo quang + Nguyên tắc: Phát hiện điểm tương đương bằng phương pháp đo quang 16 (chất cần định lượng) (thuốc... và định lượng một số kháng sinh nhóm aminoglycosid bằng sắc ký lỏng detector huỳnh quang tạo dẫn xuất sau cột Các phương pháp định lượng Tobramycin nêu trên thường mất nhiều thời gian (phương pháp vi sinh vật) hoặc tiến hành rất phức tạp và đòi hỏi phải có trang thiết bị đặc biệt (các phương pháp HPLC) Dựa vào cấu trúc của Tobramycin có chứa các đường khử, chúng tôi nghiên cứu định lượng Tobramycin bằng. .. xác định, trong những điều kiện đo xác định (X, dung môi, nhiệt độ, ), Sụ, là một hằng số Giữa EỊ™ và E ìcm có môi liên hệ: 8^ = —^~ X M Ở đây M là phân tử gam của chất tan 1.3.2 Các kỹ thuật định lượng bằng phương pháp quang phổ UV- Vis [2],[3] 13 1.3.2.1 Phương pháp đo phổ trực tiếp: Đo độ hấp thụ A của dung dịch, tính nồng độ c của dung dịch dựa vào giá trị EỊ™ biết trước (tra cứu) Trong phương pháp. .. thực nghiệm, bằng phương pháp bình phương tối thiểu; tìm phương trình hồi quy tuyến tính và hệ số 15 tương quan r Trong định lượng, nếu khảo sát được một đo n đường chuẩn có hệ số tương quan r > 0,9995 là tốt 1.3.2.5 Phương pháp thêm đường chuẩn Đo mật độ quang của dung dịch cần định lượng, rồi thêm vào những lượng khác nhau và chính xác của chất chuẩn vào dung dịch cần định lượng, đo mật độ quang của... Tobramycin có trong mẫu chuẩn At : Độ hấp thụ của dung dịch thử Ac : Độ hấp thụ của dung dịch chuẩn mt : Khối lượng tính bằng gam của Tobramycin trong bột nguyên liệu đã cân để pha dung dịch thử mc : Khối lượng tính bằng gam của Tobramycin chuẩn đã cân để pha dung dịch chuẩn * ứ n g dụng: Chúng tôi sử dụng phương pháp đã xây dựng ở trên để định lượng mẫu nguyên liệu Tobramycin do bộ môn Hóa Dược - trường... có m ỏ, ống nghiệm 2.1.2.2 Hóa chất: - Tobramycin dạng nguyên liệu do bộ môn Hóa Dược cung cấp - Dung dịch NaOH 0,1 N; 0,01 N - Thuốc tím (KM n04) dạng bột nguyên liệu - Nước cất 2 lần 2.1.3 Phương pháp nghiên cứu * Khảo sát các điều kiện để xây dựng phương pháp định lượng Tobramycin 20 + Thực nghiệm 2\ Tiến hành như phần thực nghiệm 1 nhưng thay NaOH 0,0IN bằng NaOH 0,1 N Kết quả được ghi trong bảng... hệ số là các hằng số đã biết, hoặc đã xác định được bằng thực nghiệm Giảihệ hai phương trình hai ẩn số trên, ta tính được Ci, c 2 Với hỗn họp gồm có 3 chất: đo độ hấp thụ của hỗn hợp tại 3 bước sóng khác nhau, rồi giải hệ 3 phương trình 3 ẩn Có thể đo mật độ quang (độ hấp thụ) tại nhiều bước sóng hơn số chất cần định lượng (ví dụ đo tại 4-5 bước sóng khi định lượng hỗn họp gồm 2-3 chất) rồi tính kết ... Nghiên cửu định lượng Tobramycin nguyên liệu phương pháp đo quang phổ hấp thụ khả kiến với mục tiêu sau: > Khảo sát điều kiện định lượng xây dựng phương pháp định lượng Tobramycìn nguyên liệu. .. thuyết phương pháp định lượng quang phổ hấp thụ UV-Vis 11 1.3.2 Các kỹ thuật định ỉượng phương pháp quang phổ ƯV- Vis 13 1.3.3 u nhược điểm phương pháp định lượng quang phổ hấp thụ UV-Vis PHẦN... đặc biệt (các phương pháp HPLC) Dựa vào cấu trúc Tobramycin có chứa đường khử, nghiên cứu định lượng Tobramycin phương pháp đo phổ hấp thụ vùng khả kiến 1.3 PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ UV-VIS