TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN =====***===== CHU THỊ THU HÀ PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN BA KÍCH TÍM (MORINDA OFFICINALIS HOW) QUẢNG NINH BẰNG CHỈ THỊ ISSR KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật Ngƣời hƣớng dẫn khoa học TS. LÂM ĐẠI NHÂN HÀ NỘI - 2015 i LỜI CẢM ƠN Sau một thời gian thực tập tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, được sự quan tâm, giúp đỡ và dìu dắt tận tình của các Thầy Cô giáo, các cán bộ tại phòng thí nghiệm của Viện, cùng với sự cố gắng và nỗ lực của bản thân, tôi đã hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình. Tôi xin cảm ơn tới các Ban Giám hiệu trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh –KTNN trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 trường đã tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn chân thành tới TS. Lâm Đại Nhân đã trực tiếp hướng dẫn tôi, luôn chỉ bảo tận tình trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin cảm ơn TS. Phạm Bích Ngọc, TS. Nguyễn Thị Thuý Hường và Th.S Hoàng Đăng Hiếu cùng các cán bộ phòng Công nghệ Tế bào Thực Vật thuộc Viện Công nghệ Sinh học đã tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi có thể hoàn thành khoá luận này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tận tình dạy bảo tôi trong suốt 4 năm học qua. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những người luôn bên cạnh động viên, quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài này. Tôi xin chân thành cảm ơn ! Hà Nội, ngày 13 tháng 05 năm 2015 Sinh viên Chu Thị Thu Hà ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan khóa luận này hoàn toàn được thực hiện bằng sự nghiên cứu của bản thân dưới sự hướng dẫn của TS. Lâm Đại Nhân và cán bộ phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học. Các hình ảnh, số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực, đã thu được trong quá trình nghiên cứu của mình và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Hà Nội, ngày 13 tháng 05 năm 2015 Sinh viên Chu Thị Thu Hà iii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Kí hiệu và địa điểm thu thập mẫu Ba kích ..................................... 19 Bảng 2.2: Tên và trình tự các mồi ISSR sử dụng trong nghiên cứu ............... 20 Bảng 2.3: Các thiết bị cơ bản dùng trong nghiên cứu..................................... 21 ảng 2.4: Hóa chất pha đệm rửa ..................................................................... 21 ảng 2.5: Hóa chất pha đệm chiết .................................................................. 22 Bảng 2.6: Thành phần phản ứng PCR-ISSR ................................................... 25 Bảng 3.1: Bảng giá trị độ tinh sạch và nồng độ DNA của các mẫu Ba kích .. 28 Bảng 3.2: Sản phẩm đa hình ISSR của mồi ISSR 56 nhận được sau khi chạy PCR với DNA tổng số của các mẫu Ba kích .................................................. 33 ảng 3.3: Giá trị PIC và t lệ băng đa hình của 39 mẫu a k ch với 6 mồi ISSR. ... 35 Bảng 3.4: Hệ số tương đồng 39 mẫu Ba kích nghiên cứu .............................. 38 iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cây Ba kích (Morinda officinalis How) [1]...................................... 4 Hình 1.2: Công thức của một số hợp chất có trong rễ Ba kích ......................... 5 Hình 2.1: Chu kỳ nhiệt chạy phản ứng PCR-ISSR ......................................... 26 Hình 3.1: Ảnh điện di DNA tổng số 18 mẫu Ba kích ..................................... 29 Hình 3.2 A, B, C: Ảnh điện di sản phẩm PCR-ISSR với mồi ISSR50 ........... 31 Hình 3.3 A, B, C: Ảnh điện di sản phẩm PCR-ISSR với mồi ISSR56 ........... 32 Hình 3.4: Sơ đồ hình cây biểu diễn mối liên kết di truyền giữa các mẫu Ba kích dựa vào chỉ thị ISSR................................................................................ 37 v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DNA Deoxyribonucleic acid RAPD Random Amplified Polymorphic DNA ISSR Inter Simple Sequence Repeat SSR Simple Sequence Repeat AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism PCR Polymerase chain reaction EtBr Ethidium Bromide Cs Cộng sự Bp Base pair CTAB Cetyltrimethyl amoniumbromide EDTA Ethylene Diamin Tetra Acetate dNTP Deoxynucleosid triphosphat TAE Tris Acetate EDTA vi MỤC LỤC MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề...................................................................................................... 1 2. Mục đ ch, yêu cầu ......................................................................................... 2 2.1. Mục đ ch ..................................................................................................... 2 2.2. Yêu cầu....................................................................................................... 2 3. Ý nghĩa của đề tài .......................................................................................... 2 3.1. Ý nghĩa lý luận ........................................................................................... 2 3.2. Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................ 2 NỘI DUNG....................................................................................................... 3 Chƣơng I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3 1.1. Giới thiệu chung về cây Ba kích (Morinda offcinalis How) ..................... 3 1.1.1. Phân loại .................................................................................................. 3 1.1.2. Mô tả ....................................................................................................... 3 1.1.3. Phân bố, sinh thái .................................................................................... 4 1.1.4. Hợp chất tự nhiên trong cây Ba kích (Morinda offcinalis How) ............ 4 1.1.5. Tác dụng dược lý của cây Ba kích (Morinda offcinalis How) ............... 5 1.1.6. Giá trị kinh tế của cây Ba kích (Morinda offcinalis How) ..................... 6 1.2. Một số chỉ thị phân tử thường dùng trong phân t ch đa dạng di truyền. .............. 7 1.2.1. Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) ................ 8 1.2.2. Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ........................ 9 1.2.3. Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeats) .............................................. 10 1.2.4. Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) ............... 11 1.2.5. Chỉ thị ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) ...................................... 12 1.3. Tình hình nghiên cứu Ba kích (Morinda offcinalis How) trên thế giới và trong nước ....................................................................................................... 13 vii 1.3.1. Tình hình nghiên cứu Ba kích (Morinda offcinalis How) trên thế giới ......................................................................................................................... 13 1.3.2. Tình hình nghiên cứu Ba kích (Morinda offcinalis How) trong nước.. 14 1.4. Tình hình nghiên cứu sản xuất Ba kích (Morinda offcinalis How) tại Việt Nam ................................................................................................................. 16 Chƣơng II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 19 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu............................................................ 19 2.2.Vật liệu ...................................................................................................... 19 2.2.1. Vật liệu thực vật .................................................................................... 19 2.2.2. Trình tự các mồi ISSR........................................................................... 20 2.2.3. Hóa chất và thiết bị ............................................................................... 21 2.3. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 21 2.3.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số................................................... 21 2.3.2. Phương pháp định lượng DNA bằng quang phổ kế .............................. 23 2.3.3. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose ........................................ 24 2.3.4. Phương pháp PCR-ISSR ....................................................................... 25 2.3.5. Phương pháp phân t ch số liệu .............................................................. 26 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 28 3.1. Kết quả tách chiết DNA ........................................................................... 28 3.2. Kết quả phân tích sự đa dạng di truyền Ba kích tím Quảng Ninh ........... 29 Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................... 40 4.1. Kết luận .................................................................................................... 40 4.2. Kiến nghị .................................................................................................. 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 41 viii MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Cây Ba kích (Morinda officinalis How) thuộc họ Cà phê (Rubiaseae) là loại thảo dược quý, nơi phân bố của a k ch chủ yếu mọc hoang ở những vùng đồi, núi thấp tỉnh trung du và miền núi ph a bắc Việt Nam như: Quảng Ninh, Lạng Sơn, ắc Giang, Cao ằng, Hà Giang, Tuyên Quang… Ngoài ra còn có rải rác ở các nước khác như: Trung Quốc, Lào, Triều Tiên. Ba k ch là một loài thảo được quý, theo nhiều nghiên cứu cho thấy củ của cây a k ch được sử dụng rộng rãi như một loại dược liệu có tác dụng bổ thận âm, bổ thận dương, tăng cường gân cốt, tăng sức đề kháng, sức dẻo dai, khử phong thấp [20]. Dịch chiết từ củ a k ch có tác dụng giảm huyết áp, tác dụng nhanh với các tuyến cơ năng, bổ tr não giúp ăn và ngủ ngon [38]. Do có giá trị y học cao, đặc biệt là khả năng bổ thận tráng dương tăng cường sinh l ở nam giới nên cây a k ch rất được ưa chuộng và có giá trị kinh tế cao, giá bán rễ cây a k ch dao động từ 200.000 đến 600.000/1kg. Do nhu cầu sử dụng rễ a k ch ngày càng tăng dẫn đến khai thác quá mức bên cạnh đó các dự án cải tạo đất trồng rừng đã làm cho a k ch không còn điều kiện tự nhiên th ch hợp để phát triển. Ch nh vì vậy a k ch rơi vào tình trạng gần như tuyệt chủng và được đưa vào sách đỏ Việt Nam cần phải được bảo vệ (Nghi định số 48/2002/NĐ-CP). Ở Việt Nam, tỉnh Quảng Ninh có số lượng a k ch lớn nhất. Nhưng chỉ còn rất t thuộc các huyện vùng sâu, vùng xa, vùng hải đảo, nơi ở sâu trong rừng, nơi mà con người vẫn chưa tìm kiếm đến. Đây là loại a k ch cực tốt có giá trị dược liệu cao, nhưng số lượng rất hạn chế. Để góp phần đẩy mạnh việc sử dụng có hiệu quả nguồn dược liệu trong nước và khai thác vốn quý của y học dân tộc. Với mục đ ch góp phần bảo tồn nguồn gen của cây Ba kích và hỗ trợ cho công tác chọn tạo giống Ba kích chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân tích đa dạng di truyền nguồn 1 gen Ba kích tím (Morinda officinalis How) Quảng Ninh bằng chỉ thị ISSR”. 2. Mục đích, yêu cầu 2.1. Mục đích Phân t ch đa dạng di truyền nguồn gen Ba kích tím Quảng Ninh. 2.2. Yêu cầu Thu thập và tách chiết được DNA của các mẫu Ba kích. Thực hiện các phản ứng PCR-ISSR và điện di sản phẩm PCR-ISSR trên gel agarose. Xử lý số liệu thống kê và đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen Ba kích tím tại Quảng Ninh bằng phần mềm NTSYSpc 2.1. 3.Ý nghĩa của đề tài 3.1. Ý nghĩa lý luận Nhằm góp phần đánh giá mức độ đa dạng nguồn gen và bổ sung thêm các nghiên cứu về cây Ba kích ở Việt Nam. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Đánh giá mức độ đa dạng nguồn gen của quần thể Ba kích từ đó ứng dụng vào công tác chọn tạo giống. Từ kết quả nghiên cứu có thể ứng dụng trong công tác chọn lọc những nguồn giống cây trồng khác nhau nhân rộng vào sản xuất, nhằm bảo tồn và phát triển các nguồn gen quý. 2 NỘI DUNG Chƣơng I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về cây Ba kích(Morinda offcinalis How) 1.1.1. Phân loại Bộ: Gentianales (Long đởm) Họ: Rubiaseae (Cà phê) Chi: Mirinada (Nhàu) Loài: Morinda officinalis How 1.1.2. Mô tả Cây Ba kích là cây thảo, sống lâu năm, leo bằng thân quấn. Ngọn có cạnh, màu tím, có lông, khi già thì nhẵn. Lá mọc đối, hình mác hoặc hình bầu dục, thuôn nhọn, cứng, dài 6-14 cm, rộng 2,5-6 cm, cuống ngắn, lúc non màu xanh lục, khi già màu trắng mốc, phiến lá cứng có lông tập trung ở mép và ở gân, khi già ít lông hơn. Lá kèm mỏng ôm sát thân. Hoa nhỏ, lúc non có màu trắng, sau hơi vàng, tập trung thành tán ở đầu cành, dài 0,3-0,5 cm, đài hoa hình chén hoặc hình ống gồm những lá đài nhỏ phát triển không đều. Tràng hoa dính liền ở ph a dưới thành ống ngắn.Mùa ra hoa vào tháng 5-6. Quả hình cầu, khi ch n màu đỏ, mang đài còn lại ở đỉnh. Mùa tạo quả vào tháng 7-10. Rễ cong queo, nhiều đoạn thắt nghẹt như ruột già, dài 15-20 cm có khi hơn, to 1-2 cm chia ra nhiều đoạn chỗ phình to, chỗ teo lại rất đều đặn. Vỏ ngoài màu nâu nhạt hoặc hồng nhạt, có vân dọc. Bên trong là thịt màu hồng hoặc tím, vị hơi ngọt. 3 Hình 1.1: Cây Ba kích (Morinda officinalis How)[1] 1.1.3. Phân bố, sinh thái Cây a k ch thường mọc hoang ở vùng rừng thứ sinh, trung du và miền núi các tỉnh ph a ắc, dưới tán một số kiểu rừng nhiệt đới ẩm lá rộng thường xanh, nay trở nên thứ sinh gồm cây bụi và dây leo chằng chịt hoặc ở bờ nương rẫy. Độ cao phân bố khoảng 100 m so với mặt biển. Càng lên cao cây càng thưa dần, đến độ cao khoảng 1000 m thì hầu như hiếm gặp. Cây mọc nhiều nhất ở các tỉnh Quảng Ninh, Phú Thọ, Hoà ình, Hà Giang, Lạng Sơn. Ngoài ra nó còn có ở 1 số nước như Trung Quốc, Lào, Triều Tiên… a k ch sinh trưởng và phát triển tốt ở những vùng có đặc trưng kh hậu nhiệt đới ẩm, độ ẩm trung bình năm trên 80% và tổng lượng mưa cả năm đạt 1100 - 2000 mm. a k ch sống th ch hợp trên các loại đất ẩm mát và thoát nước tốt, thành phần cơ giới trung bình (cát pha đến thịt), tầng đất dày trên 1m, nhiều mùn, tơi xốp. 1.1.4. Hợp chất tự nhiên trong cây Ba kích (Morinda offcinalis How) Củ Ba kích có chứa các thành phần hoạt chất ch nh như: Gentianine, Carpaine, Choline, Trigonelline, Diogenin, Yamogenin, Gitogenin, Tigogenin, Vitexin, Orientin, Quercetin, Luteolin, Vitamin B1,Morindin, Vitamin C. Trong rễ Ba kích còn chứa Antraglycozid, đường, nhựa, Acid hữu cơ, Phytosterol và t tinh dầu, Morindin. Rễ tươi có sinh tố C [1]. 4 Ngoài ra trong Ba kích còn có Rubiadin, Rubiadin-1-Methylether, Palmitic acid, Nanodecane [8]. Trong rễ củ a k ch có thành phần của 24- Ethylcholesterol. Các thành phần hóa học các hợp chất tự nhiên đã được xác định ở rễ a k ch gồm: flavonoid, tannin, alkloid, glicoside và polyphenol [6]. Hình 1.2: Công thức của một số hợp chất có trong rễ Ba kích 1.1.5. Tác dụng dược lý của cây Ba kích (Morinda offcinalis How) Theo y học hiện đại thì Ba kích có tác dụng: Tăng sức đề kháng của cơ thể đối với các yếu tố độc hại, chống viêm, điều hòa hệ thống nội tiết. Các thí nghiệm trên chuột lớn và chuột nhắt cho thấy Ba kích không có tác dụng kiểu Androgen nhưng có thể có khả năng tăng cường hiệu lực của Androgen hoặc tăng cường quá trình chế tiết hormon Androgen. Đối với nam giới có hoạt động sinh lý yếu Ba kích có tác dụng làm tăng khả năng giao hợp (đặc biệt đối với những trường hợp giao hợp yếu, ít). Ba kích còn có tác dụng tăng cường sức dẻo dai, mặc dù nó không làm tăng nhu cầu sinh lý, không thấy có tác dụng kiểu Androgen. Tuy không làm thay đổi tinh dịch đồ nhưng trên thực tế có tác dụng hỗ trợ và cải thiện hoạt động sinh lý cũng như điều trị vô sinh cho nam giới có biểu hiện vô sinh tương đối và suy nhược cơ thể. Đối với các trường hợp tinh dịch ít, tinh trùng chết nhiều, không có tinh trùng, không xuất tinh khi giao hợp thì sử dụng Ba kích chưa thấy có kết quả [2]. Đối với người 5 già hoặc những bệnh nhân không biểu hiện mệt mỏi, ăn kém, ngủ ít, gầy yếu mà không thấy có những yếu tố bệnh lý gây nên và một số trường hợp có đau mỏi các khớp, Ba kích có tác dụng tăng lực rõ rệt thể hiện qua những cảm giác chủ quan như giảm mệt mỏi, ăn ngon, ngủ ngon và những dấu hiệu khách quan như tăng cân nặng, tăng cơ lực. Đối với bệnh nhân đau mỏi các khớp thì sau khi dùng Ba kích dài ngày cho thấy có hiệu quả [2]. Nước sắc Ba kích có tác dụng tương tự như ACTH (adrenocorticotropic hormone). Rễ Ba kích chiết xuất bằng rượu có tác dụng giảm áp huyết, có tác dụng nhanh đối với các tuyến cơ năng, tăng cường não. Ngoài ra Ba kích không có tính độc, LD50 của Ba kích được xác định trên chuột nhắt trắng bằng đường miệng là 193g/kg (Trung dược dược lý, Độc lý dữ lâm sàng) [6]. Theo y học cổ truyền, cây Ba kích có tác dụng bổ thận tráng dương, mạng gân cốt, khử phong thấp. Từ xưa nhân dân ta đã biết sử dụng rễ Ba kích trong nhiều bài thuốc dân gian để chữa bệnh, Ba kích là vị thuốc bổ trí não và tinh khí, dùng trong các bệnh liệt dương, sớm xuất tinh, di mộng tinh, phụ nữ kinh nguyệt không đều, phong thấp, huyết áp cao [1], [7]. Ở những nơi có cây a k ch người dân thường đào củ về nấu với thịt gà, ăn để bồi bổ sức khỏe. 1.1.6. Giá trị kinh tế của cây Ba kích(Morinda offcinalis How) Ba kích là loại dược liệu có giá trị kinh tế cao. Trên thị trường hiện nay giá của a k ch tươi là 200.000 nghìn/kg, giá Ba kích khô là 600.000 nghìn/kg. Chính vì vậy nhiều tỉnh ở nước ta đã triển khai trồng Ba kích nhằm bảo tồn và phát triển cây a k ch, tăng nguồn thu nhập cho con người, tránh tình trạng người dân phải mua Ba kích từ Trung Quốc mà Ba kích Trung Quốc thường đã bị người dân Trung luộc lấy hết dược liệu, chỉ còn bã đem phơi khô và bán cho người Việt Nam. 6 1.2. Một số chỉ thị phân tử thƣờng dùng trong phân tích đa dạng di truyền. Có nhiều phương pháp nghiên cứu khác nhau trong phân loại và xác định loài ở động, thực vật và hầu hết các phương pháp này đều dựa trên nguyên tắc như những loài có chung nguồn gốc, có những tính chất giống nhau, càng gần nhau thì tính chất giống nhau càng nhiều. Sự giống nhau có thể về đặc điểm hình thái, giải phẫu, sinh lý sinh hoá, phôi sinh học. Đối với thực vật, đặc điểm hình thái học của các loài thực vật qua nhận biết hình thái lá, hoa, quả, cách thức phân cành…có ưu điểm dễ quan sát trực tiếp bằng trực quan nhưng chỉ dựa vào thống kê phân tích một hoặc nhiều tính trạng được thể hiện ra bên ngoài nên hiệu quả thấp. Điều này thật sự gặp nhiều khó khăn khi các mẫu vật cần giám định không còn nguyên vẹn, mất hình thái bên ngoài. Do vậy, việc định danh dựa trên quan sát hình thái và kinh nghiệm dân gian sẽ được hỗ trợ chính xác hơn nếu sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại. Để đánh giá bản chất di truyền của các cá thể dựa vào hệ gen của chúng, các chỉ thị DNA đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu của sinh học phân tử như: Xây dựng thư viện bộ gen, xác định phát sinh chủng loại, đánh giá đa dạng di truyền, xác định quan hệ họ hàng... Chỉ thị DNA là một đoạn DNA dùng để phân biệt hai cá thể, hai dòng hay hai giống khác nhau. Chỉ thị DNA phong phú, đa dạng, ổn định cao, có thể nghiên cứu ở bất kỳ giai đoạn phát triển nào của cá thể. Chỉ thị DNA cung cấp một công cụ mạnh mẽ để đánh giá di truyền và mức độ sinh sản của cây trồng, đặc biệt là xác định các loài và giống cây trồng [40], đánh giá phát sinh loài [34], giúp hỗ trợ đánh dấu các gen quy định các đặc tính nông học quan trọng [25], xây dựng bản đồ liên kết và bản đồ xác định vị trí của các vùng của bộ gen có chứa các gen liên quan đến xác định một đặc điểm định lượng (bản đồ QTL Quantitative Traits Loci) [13]. 7 Ở thực vật, có nhiều loại chỉ thị phân tử đã được ứng dụng trong các nghiên cứu. Các chỉ thị DNA phổ biến trong nghiên cứu sinh học phân tử ở thực vật là: RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), Microsatellite (hay SSR-Simple Sequence Repeat ), RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) và ISSR (Inter - Simple Sequence Repeat) (Semagn và cs, 2006). Trong đó chia thành hai nhóm ch nh là: Chỉ thị dựa trên các trình tự nhận biết của enzyme giới hạn (RFLP), các chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản DNA bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) như: AFLP, RAPD, SSR, ISSR. Mỗi chỉ thị đều có những ưu điểm và nhược điểm nhất định, không có loại chỉ thị nào đáp ứng được tất cả các chỉ tiêu nhưng có thể bổ sung cho nhau để hoàn thiện kết quả nghiên cứu. 1.2.1. Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Kỹ thuật RFLP là một kỹ thuật quan trọng trong nghiên cứu vật liệu di truyền.Nguyên lý của kỹ thuật này là dùng các enzyme hạn chế cắt các mẫu DNA cần phân tích tại những trình tự nhận biết đặc trưng, tạo ra hàng ngàn đoạn DNA có độ dài xác định khác nhau. Số lượng của những đoạn này tuỳ thuộc vào số điểm nhận biết của enzyme cắt hạn chế có trong DNA bộ gen [39]. Chỉ thị RFLP là chỉ thị đồng trội và được thừa nhận là chỉ thị di truyền mạnh nhất, hiệu quả trong nghiên cứu biến dị di truyền, phân tích liên kết, chọn giống, lập bản đồ, đa dạng di truyền... [16]. Các kết quả có độ chính xác cao nên có thể tiến hành lặp lại ở các phòng thí nghiệm khác nhau. Kỹ thuật này không đòi hỏi việc đọc trình tự song chỉ thị này cũng có mặt hạn chế do phải tuyển chọn một quần thể lớn các mẫu dò và đòi hỏi phải chuẩn hoá một thư viện các đoạn DNA được phân lập vào một số vector, vì vậy kỹ thuật này cần có sự đầu tư đáng kể về trang thiết bị kỹ thuật phòng thí nghiệm, giá thành cao, khi thực hiện đòi hỏi sự thành thạo về kỹ thuật. 8 Sự ứng dụng của chỉ thị RFLP còn gặp một trở ngại nữa đó là một chỉ thị cho một đa hình, đây là vấn đề nghiêm trọng đặc biệt trong các phép lai giữa các dòng có quan hệ gần. 1.2.2. Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Cho đến nay đã có nhiều chỉ thị sinh hoá và chỉ thị phân tử được sử dụng để xác định sự đa dạng di truyền thực vật. Trong số đó, kỹ thuật RAPD đã được sử dụng để phân t ch đa dạng di truyền của số lượng lớn các giống cây trồng [15], [23], [11]. Kỹ thuật này đã được ứng dụng rất thành công trong những nghiên cứu về sự khác biệt di truyền trong các quần thể thực vật [21], [36], [28]. Kỹ thuật RAPD đã cung cấp những tiếp cận hữu hiệu cho việc đánh giá sự sai khác di truyền, đặc biệt trong những loài t được biết về đặc tính di truyền. Chỉ thị RAPD dựa trên cơ sở phản ứng PCR do sự nhân bội những đoạn DNA trong hệ gen, sử dụng những đoạn mồi đơn lẻ, ngẫu nhiên (random primer) dài khoảng 10 nucleotit dưới nhiệt độ kết cặp thấp (khoảng 370C). Khi sử dụng một mồi đơn lẻ, ngẫu nhiên có k ch thước ngắn khoảng 10 nucleotit để thực hiện phản ứng PCR cho một DNA bất kỳ, mồi sẽ bắt cặp ngẫu nhiên và quá trình nhân bản sẽ xảy ra (ở một đoạn nào đó) khi hai mồi bắt cặp đúng chiều (vào đầu 3’ của mỗi sợi) và khoảng cách giữa hai mồi không quá 1-3 kb. Đồng thời trong quá trình nhân bản sẽ xảy ra ở nhiều vị tr và cho các đoạn DNA có k ch thước khác nhau. Kết quả chạy điện di cho các băng vạch khác nhau và qua đó sẽ đánh giá được sự khác biệt về DNA giữa các mẫu nghiên cứu. Đồng thời cho thấy sự đồng dạng (số băng trùng nhau) của DNA giữa các cá thể đem phân t ch. Ưu điểm của kỹ thuật RAPD là thực hiện nhanh dễ làm, ít tốn kém nên được ứng dụng rộng rãi trong việc phát hiện t nh đa dạng của sinh vật. Những thay đổi trong gen, đột biến nhiễm sắc thể... đều làm thay đổi k ch thước của 9 đoạn nhân bản. Kỹ thuật này phù hợp với phân t ch đa dạng di truyền, lập bản đồ gen. Một trong những ứng dụng quan trọng nhất của kỹ thuật RAPD là xác định nguồn gốc di truyền, mối quan hệ họ hàng của động vật, thực vật và vi sinh vật nên kỹ thuật này còn được gọi là phương pháp phân loại học phân tử. Tuy nhiên, kỹ thuật này còn có những hạn chế như: Số băng thu được sau khi sử dụng các mồi ngẫu nhiên còn rất lớn và không chắc chắn khi có băng AND giống nhau thể hiện cùng k ch thước trên bản gel có thực sự là ở cùng một vị trí trên hệ genom hay không [4]. 1.2.3. Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeats) Kĩ thuật còn được gọi là kĩ thuật microsatellies ( vi vệ tinh). Kỹ thuật này được Litt và Luty phát triển năm 1989 dựa trên nguyên tắc của PCR[19]. Trong cấu trúc của sinh vật nhân chuẩn tồn tại một loạt các trình tự nucleotide lặp lại , chúng đặc trưng cho loài. SSR gồm 2-5 nucleotide lặp lại nhiều lần. Ví dụ: (AT)n, (AG)n, (AGTC)n. SSR nằm rải rác trong hệ gen của thực vật bậc cao. Đoạn mồi được thiết kế trên vùng bảo thủ ở hai đầu của đoạn SSR. Số lần lặp lại nhiều lần làm cho các phân đoạn DNA được nhân có độ dài ngắn khác nhau. Các trình tự lặp lại thường có vùng dị nhiễm sắc trên mỗi nhiễm sắc thể. Chúng có vai trò điều hòa hoạt động của các gen, góp phần làm tăng t nh ổn định cơ học của nhiễm sắc thể trong phân bào, nó có thể mang thông tin di truyền liên quan đến sự xác định giới tính của động vật và thực vật. Do sự khác nhau về số lượng các nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại mà số đơn vị lặp lại xuất hiện sự đa hình về độ dài của SSR được nhân bản. Mức độ đa hình được xác định sau khi điện di trên gel agarose và gel polyacrylamide. SSR được phân tích trên nhờ PCR nên chỉ đòi hỏi một lượng mẫu DNA rất nhỏ. SSR là một công cụ hữu ích trong phân tích hệ gen và chọn giống cây trồng vì đây là chỉ thị đồng trội có khả năng phát hiện ra tính đa hình rất cao. Trong thực tế chỉ thị này đã được sử dụng nghiên cứu một số 10 tính trạng liên quan đến năng suất, bệnh dại, xác định giới tính, phân tích quan hệ di truyền, lập bản đồ gen… Song nhược điểm của chỉ thị này làcần nhiều thao tác khi tiến hành,thiết kế mồi cho phản ứng nhân các đoạn SSR phức tạp, thực hiện chỉ thị SSR tương đối tốn kém. 1.2.4. Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) Kỹ thuật AFLP dựa trên nguyên tắc là sử dụng kỹ thuật PCR để nhân bản các đoạn DNA đã bị cắt bởi enzym cắt giới hạn. Khâu then chốt của kỹ thuật này là việc thiết kế các mồi đặc trưng. Để thiết kế được các mồi đặc trưng, trước hết phải cắt các mẫu DNA cần nghiên cứu bằng enzyme cắt giới hạn. Người ta thường dùng đồng thời 2 enzym giới hạn để cắt DNA. Sau khi xử lý với các enzym giới hạn, DNA bị cắt thành nhiều đoạn có k ch thước khác nhau nhưng trình tự các nucleotit ở hai đầu đoạn cắt giống nhau và đã được xác định. Dựa vào trình tự đã biết ở hai đầu cắt, có thể thiết kế các đoạn Oligonucleotit ngắn (gọi là các adaptor) và gắn chúng vào hai đầu cắt. Dựa vào trình tự adaptor có thể thiết kế mồi PCR gồm hai phần: Phần có trình tự bổ sung với adaptor và phần có một đến ba nucleotide tùy ý. Với mồi thiết kế như vậy chỉ có các đoạn DNA có trình tự 2 đầu bắt cặp bổ sung với trình tự mồi mới được nhân bản.  Các bước tiến hành kỹ thuật AFLP ước 1: Tách chiết, tinh sạch DNA. ước 2: Cắt các phân tử DNA bằng các enzyme giới hạn. Có thể dùng 2 enzym giới hạn để xử lý. ước 3: Nối các đoạn DNA đã cắt với các adaptor. ước 4: Nhân bản có chọn lọc các đoạn được nối ở trên bằng kỹ thuật PCR. ước 5: Phân tích kết quả sản phẩm PCR bằng điện di và xử lý kết quả bằng các phần mềm thông dụng để đánh giá sự khác biệt di truyền và đa dạng sinh học của các mẫu nghiên cứu. 11  Những ưu, nhược điểm của kỹ thuật AFLP:  Ưu điểm: Kỹ thuật AFLP có thể phân tích với bất kỳ hệ gen nào từ đơn giản đến phức tạp. Phân tích sự đa dạng di truyền, đánh dấu các gen và ứng dụng để lập bản đồ gen. Kỹ thuật AFLP ít phức tạp hơn RFLP và phát hiện được một số lượng lớn DNA đa hình trong thời gian ngắn và vì thế là một kỹ thuật hữu ích trong nghiên cứu di truyền.  Nhược điểm: Đối với các hệ genom lớn, phức tạp thì số phân đoạn DNA là quá lớn, khó phân tích, do vậy cần phải tìm biện pháp hạn chế số phân đoạn sao cho đủ để phân tích. Kỹ thuật thực hiện qua nhiều bước, phức tạp, đòi hỏi phải có kỹ thuật phòng thí nghiệm cao, chi phi tốn kém. 1.2.5. Chỉ thị ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) Kỹ thuật ISSR là kỹ thuật sử dụng mồi có trình tự là các đoạn lặp lại, tạo ra chỉ thị đa locus. Kỹ thuật ISSR sử dụng phương pháp ch nh là PCR, bao gồm sự khuếch đại của các đoạn DNA nằm giữa hai trình tự lặp lại liền kề nhau. Sản phẩm PCR có thể được phân tách trên gel polyacrylamide hoặc gel agarose và sau đó sẽ được chụp ảnh phóng xạ. Những nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng phương pháp ISSR cho mức độ đa hình cao hơn so với phương pháp RFLP hoặc RAPD. Kỹ thuật này đã được sử dụng rộng rãi trong đánh giá sự đa dạng quần thể như: dó bầu [5], thầu dầu [35], Rauvolfia serpentina L [22], A. sinensis (Lour.) Gilg và các giống sầu riêng [33], Diarsia brunnea [18]. Ngoài ra phương pháp này đã được sử dụng thành công để mô tả dạng tứ bội hình thành từ lai tế bào soma của bưởi [29] và quýt[32] và nhận biết cây tam bội 12 trong việc chọn tạo các giống quýt tam bội không hạt[12]. Bên cạnh đó ISSR còn được dùng để xây dựng bản đồ liên kết của nhóm cây ăn quả có múi[27].  Các bước tiến hành kỹ thuật ISSR ước 1: Tách chiết DNA. DNA được tách chiết phải có chất lượng tốt (tương đối sạch và không bị gãy nhiều). ước 2: Tiến hành phản ứng PCR. Tiến hành phản ứng PCR với các đoạn có trình tự bổ sung với các đoạn DNA ở giữa 2 trình tự lặp lại liền kề nhau. ước 3: Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose, sau đó nhuộm gel bằng Ethidium bromide. ước 4: Chụp ảnh phổ điện di và phân tích số liệu.  Những ưu điểm của kỹ thuật Chỉ thị ISSR không cần biết trước thông tin về trình tự nhân để thiết kế mồi. Phương pháp ISSR chỉ cần một lượng nhỏ DNA để tiến hành [17], [35]. Kĩ thuật PCR-ISSR đơn giản và nhanh chóng, dễ thực hiện. Chỉ thị ISSR có sự đa hình cao và được sử dụng để nghiên cứu đa dạng di truyền, đa dạng loài, lập bản đồ gen và nghiên cứu sự tiến hóa của sinh vật. 1.3. Tình hình nghiên cứu Ba kích(Morinda offcinalis How) trên thế giới và trong nƣớc 1.3.1. Tình hình nghiên cứu Ba kích (Morinda offcinalis How) trên thế giới Trên thế giới cây Ba kích có phạm vi phân bố hẹp nên có ít công trình nghiên cứu về loài cây này, chỉ có một số công trình nghiên cứu điển hình ở Australia, New Guinea và Trung Quốc. Ở Trung Quốc, a k ch cũng được nhiều nhà khoa học nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý, theo nghiên cứu Ba kích có tác dụng tăng cường năng lực nam giới, chữa bệnh liệt dương, vô sinh và chữa trị thấp khớp, điều hòa kinh nguyệt ở nữ giới. Tác dụng hạ đường huyết của cây Ba 13 k ch cũng được Soon và cs nghiên cứu trên mô hình chuột gây đái tháo đường typel bằng steptozotocin và tác giả kết luận rằng rễ Ba kích có tác dụng hạ đường huyết đối với chuột cống gây đái tháo đường typel bằng steptozotocin [31]. Cùng với đó, đặc điểm hình thái và di truyền của loài cây này cũng được các nhà khoa học Trung Quốc nghiên cứu. Sự đa dạng đi truyền Ba kích được Ding và cs nghiên cứu, để phân tích sự đa dạng di truyền Ba kích tác giả đã sử dụng chỉ thị RAPD, trong cả quá trình nghiên cứu tác giả sử dụng 40 mồi RAPD thì 14 mồi cho sản phẩm đa hình, qua phân t ch kết quả tác giả đưa ra kết luận có sự đa dạng mức loài ở cây Ba kích ở mức độ phân tử [14]. Ngoài ra còn những công trình nghiên cứu nuôi cấy mô và nhân nhanh cây a k ch như công trình nghiên cứu của Wei và cs(2006) và công trình nghiên cứu của Ning-Zhen Huang và cs (2007) [20],[38]. 1.3.2. Tình hình nghiên cứu Ba kích (Morinda offcinalis How)trong nước Ở Việt Nam cây Ba kích còn có tên gọi khác là Ba kích thiên, Chẩu phóng xì (tên gọi của dân tộc tày), Chày kiềng đòi (Dao) … và có tên khoa học là Morinda officinalis How, 1858. Trong dân gian còn gọi là cây ruột gà. Hiện nay cây a k ch đã bị khai thác nhiều và liên tục trong nhiều năm nên phạm vi phân bố tự nhiên bị thu hẹp dần và bị suy gảm cả về chất lượng cũng như số lượng. Loài cây này đang đối diện với nguy cơ tuyệt chủng, nên đã được đưa vào Sách Đỏ Việt Nam (1996) và Danh lục Đỏ cây thuốc Việt Nam (1996, 2001 và 2006) nhằm khuyến cáo và bảo vệ. Cho đến nay có rất nhiều nghiên cứu về Ba kích tuy nhiên vẫn chưa có công trình nào về nghiên cứu bảo tồn nguồn gen cũng như t nh đa dạng sinh học ở loài cây này. Năm 1972, để bảo tồn, khôi phục và phát triển, cây a k ch bắt đầu được gây trồng trên địa bàn Trung tâm Nghiên cứu Thực nghiệm lâm sinh Cầu Hai nay là Trung tâm Khoa học Lâm nghiệp vùng Trung tâm ắc ộ và một số địa phương khác. Viện Khoa học lâm nghiệp Việt nam cũng đã có những đề tài nghiên cứu thăm dò về gây trồng, bảo quản hạt và dược t nh của 14 cây a k ch như: Nghiên cứu gây trồng a k ch bằng hom dâm dưới tán rừng và ngoài đất trống có dàn che của Nguyễn Đình Cầm (1972 - 1977) tại Trung tâm Nghiên cứu Thực nghiệm lâm sinh Cầu Hai. Nghiên cứu thăm dò về bảo quản hạt a k ch và phương thức gieo ươm của Lê Đình Khả (1977). Tìm hiểu về tác dụng của dịch chiết củ a k ch của Thái Nguyễn Minh Tâm (1975-1977)[42]. Ngoài ra còn có các nghiên cứu của Viện dược liệu và các trung tâm nghiên cứu khác như: + Nghiên cứu tác dụng hướng sinh dục nam của Ba kích của Trần Mỹ Tiên và cs(2012). Tác giả đã sử dụng cao chiết cồn 45% của rễ Ba kích và tiến hành thí nghiệm trên chuột nhắt trắng bình thường và bị năng sinh dục. Kết quả cho thấy trên cơ địa động vật, giảm năng sinh dục cao a k ch đều thể hiện tác dụng làm tăng nồng độ testosteron huyết, tăng trọng lượng của cơ quan sinh dục đực và cơ hậu môn, tăng nồng độ toàn phần protein trong huyết tương và không làm tăng thể trọng trong cơ thể. Tác dụng này cũng thể hiện rõ trên động vật bình thường ở liều cao. Qua đó kết luận Ba kích thể hiện tác dụng kiểu andorogen trên chuột đực bình thường và chuột đực giảm năng sinh dục ở 2 liều thử nghiệm 50 mg/kg và 100 mg/kg. Ở 2 liều này trọng lượng tinh hoàn không đổi sau thời gian thử nghiệm [9]. + Nghiên cứu nhân giống in vitro cây a k ch của Võ Châu Tuấn và cs (2010). Ở nghiên cứu này tác giả đã tái sinh chồi in vitro trên môi trường cơ bản MS bổ sung 0,25 mg/L kinetin. Đoạn thân (khoảng 1 cm) của cây Ba kích in vitro được nuôi cấy trên môi trường cơ bản MS bổ sung các chất kích sinh trưởng khác nhau cho cảm ứng nhân nhanh chồi. Số chồi in vitro đạt lớn nhất trên môi trường cơ bản MS bổ sung 3,5 mg/L BA + 0,2 mg/L IBA (với 15,00 chồi/mẫu cấy). Chồi được tạo rễ trên môi trường MS bổ sung IBA hoặc NAA, hình thành rễ tốt nhất trên môi trường MS bổ sung 0,2 - 0,25 mg/L 15 IBA. Cây in vitro đưa ra nhà lưới, 97,9% cây sống và thích nghi với điều kiện tự nhiên [10]. + Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống và trồng vườn giống a k chtrong mô hình vườn gia đình, vườn trang trại (Công trình nghiên cứu khoa học tạo nguồn nguyên liệu làm thuốc (1998 - 2008)) [42]. + Nghiên cứu nhân giống a k ch in vitro giai đoạn vườn ươm (Công trình nghiên cứu khoa học tạo nguồn nguyên liệu làm thuốc (1998 - 2008)) [42]. 1.4. Tình hình nghiên cứu sản xuất Ba kích(Morinda offcinalis How) tại Việt Nam Ba kích là loài thảo dược quý và có giá trị kinh tế cao nhưng hiện nay Ba k ch trong nước ta đang rơi vào tình trạng gần như tuyệt chủng, do vậy người dân phải mua Ba kích của Trung Quốc. Để giải quyết thực trạng trên chính quyền nhà nước đã có những ch nh sách để bảo vệ rừng, ngăn chặn nạn khai thác rừng bừa bãi. Các dự án bảo tồn và phát triển cây Ba kích nhằm đem lại một nguồn dược liệu chữa bệnh và tăng nguồn thu nhập cho con người. Đã có nhiều công trình nghiên cứu đưa a kích từ hoang dại thuần hoá trở thành cây trồng trọt và Ba k ch được trồng ở các mô hình khác nhau như trồng a k ch dưới tán rừng thứ sinh, trồng xen với các cây nông nghiệp như ngô, sắn trên các nương rẫy hoặc vườn hộ gia đình. Một số dẫn liệu về nghiên cứu trồng Ba kích nhằm sản xuất dược liệu qua các công trình nghiên cứu như: Nghiên cứu trồng a k ch dưới tán rừng thứ sinh ở Hoành Bồ (Quảng Ninh) có độ che phủ khác nhau, không thấy chênh lệch về năng suất củ, nhưng kém xa so với trồng a k ch ngoài đất trống không có tán che. Và sau 7 năm trồng Ba kích, khối lượng củ mỗi bụi chỉ đạt 47 - 55 gam (tươi) tương ứng với khối lượng thân. Nếu trồng a k ch có phân bón vô cơ và phân bón hữu cơ thì sau 6 năm khối lượng củ cho mỗi bụi chỉ đạt dưới 100 gam. Như vậy, trồng Ba 16 k ch dưới tán rừng thứ sinh tuy có củ nhưng năng suất củ kém hơn nhiều so với trồng ngoài đất được cải tạo trắng. Nghiên cứu trồng thử nghiệm Ba kíchtrên đất đồi trống tại xã Chân Mộng, Đoan Hùng, Phú Thọ. Cây con có k ch thước cao trung bình 9 cm, đường kính gốc 0,3 cm. Sau 18 tháng trồng cây ở độ chiếu sáng 100%, đường kính gốc 0,8 cm, cây đã ra củ và có đường kính cổ rễ 0,5-1,5 cm. Nhưng do là cây dài ngày nên dự án không đủ kinh ph để tiếp tục theo dõi. Qua đó có thể thấy ở điều kiện khí hậu Bắc Bộ, cũng có thể trồng Ba kích không cần tán che vẫn có thể tạo được dược liệu. Khi trồng Ba kích xen với cây chè cho thấy Ba kích sinh trưởng phát triển rất kém, có lẽ do đất trồng chè nhiều năm đã nghèo kiệt. Năm 1993, khi trồng Ba kích xen ngô (khi ngô đã cao 30-40 cm, Ba kích giống đã 1 năm tuổi) nhưng a k ch cũng bị chết nhiều không thể phát triển được. Trồng Ba kích của nông dân: Qua điều tra, khảo sát tại gia đình à Lê Thị Phú, xã Chân Mộng, Đoan Hùng, Phú Thọ, cho thấy gia đình à Phú (1989) đã đưa a k ch từ hoang dại vào trồng dưới vườn tán vườn mít, cây có giá leo, khoảng cách trồng giữa các cây là 3-4 m. Khi cây 5 - 6 năm tuổi, đã thu hoạch được từ 6 - 8 kg dược liệu tươi trên một bụi, tương đương 1,5 - 1,7 kg dược liệu khô. Thành công này vượt xa so với công bố của Trung Quốc. Trồng Ba kích ở Thanh Hoá: Tại Thanh Hóa đã trồng thăm dò a k ch dưới tán cây vườn tạp tại Xã Thành Tiến – Huyện Thạch Thành có tọa độ vĩ độ bắc 105,7o, kinh độ đông 20o ( Lần đầu tiên trong Tỉnh trồng Ba kích). Kết quả, khi cây 3 - 4 năm tuổi, cho năng suất mỗi bụi 150 – 200 gam dược liệu (khô).Đáng chú ý là những cây được trồng sâu thấy không có củ, rễ. Ba kích chỉ ăn nông trên mặt đất. Ở những khu đất thấp, khi mưa lớn gây ngập úng cục bộ, rễ rất nhanh bị hỏng. Nếu trồng Ba kích sâu (cổ rễ a k ch dưới mặt đất trồng 10 cm) thì rễ không to phình ra được, do vậy năng suất dược liệu rất thấp. Từ năm 2003 - 2005, nghiên cứu trồng a k ch dưới tán vải thiều 25 năm tuổi tại xã Thành Vân, huyện Thạch Thành, tỉnh Thanh Hoá với độ che 17 bóng 70 - 75%, trên sườn đồi có độ dốc 15 - 200. Kết quả bình quân mỗi gốc có thể thu hoạch từ 0,35 - 0,5 kg dược liệu (khô) khi cây 4 năm tuổi. Sau khi chế biến dược liệu theo Dược điển Việt Nam 3 thấy dược liệu đẹp giống như dược liệu Trung Quốc về hình thái củ tím, dần dần chuyển đen sẫm. Tuy nhiên màu sắc vỏ ngoài của dược liệu còn khác nhau, cụ thể dược liệu Thanh Hoá có màu vàng sẫm, Trung Quốc có màu vàng thổ như là có kĩ thuật làm màu làm bóng vỏ dược liệu. Ngoài ra còn nhiều tỉnh, thành phố đã triển khai xây dựng mô hình trồng thử nghiệm giống cây a K ch như Quảng Ninh, Vĩnh Phúc, ắc Giang, Thái Nguyên, Phú Thọ, Quảng Nam… Mặc dù Việt Nam quan tâm nghiên cứu bảo tồn và phát triển Ba kích rất sớm, nhưng do chưa tập trung nên kết quả chỉ ở bước đầu. Quy trình trồng Ba kích vẫn chưa được hoàn thiện, vùng sản xuất dược liệu vẫn chưa được hình thành. Đầu tư nghiên cứu khoa học còn manh mún, hạn chế về thời gian nghiên cứu so với vòng đời cây Ba kích.Vì vậy không tạo ra được thế mạnh có tính so sánh với các nước trong khu vực về dược liệu Ba kích. 18 Chƣơng II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thí nghiệm được tiến hành vào 9/2014 đến 4/2015 tại phòng thí nghiệm của Viện Công nghệ sinh học, trực thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.2.Vật liệu 2.2.1. Vật liệu thực vật Các mẫu lá a k ch được thu ngoài tự nhiên ở khu vực tỉnh Quảng Ninh. Sau khi mẫu được thu thập ngoài tự nhiên được sẽ được bảo quản trong tủ - 20oC để phục vụ cho tiến hành th nghiệm. Bảng 2.1: Kí hiệu và địa điểm thu thập mẫu Ba kích Stt Kí hiệu Stt Địa điểm thu thập K hiệu Địa điểm thu thập 1 Bk1 Quảng Ninh 21 Bk21 Đạp Thanh 2 Bk2 Quảng Ninh 22 Bk22 Đạp Thanh 3 Bk3 Quảng Ninh 23 Bk23 Đạp Thanh 4 Bk4 Quảng Ninh 24 Bk24 Đạp Thanh 5 Bk5 Quảng Ninh 25 Bk25 Đạp Thanh 6 Bk6 Quảng Ninh 26 Bk26 Đạp Thanh 7 Bk7 Quảng Ninh 27 Bk27 Đạp Thanh 8 Bk8 Quảng Ninh 28 Bk28 Đạp Thanh 9 Bk9 Quảng Ninh 29 Bk29 Đạp Thanh 10 Bk10 Quảng Ninh 30 Bk30 Đạp Thanh 11 Bk11 Quảng Ninh 31 Bk31 Đạp Thanh 12 Bk12 Quảng Ninh 32 Bk32 Đạp Thanh 13 Bk13 Quảng Ninh 33 Bk33 Đạp Thanh 14 Bk14 Quảng Ninh 34 Bk34 Đạp Thanh 19 (có nguồn gốc từ Phú Thọ) Quảng Ninh 35 Bk35 Đạp Thanh 36 Bk36 Đạp Thanh Thanh Lâm 37 Bk37 Đạp Thanh Bk18 Thanh Lâm 38 Bk38 Đạp Thanh `19 Bk19 Đạp Thanh 39 Bk39 Đạp Thanh 20 Bk20 Đạp Thanh 15 Bk15 16 Bk16 17 Bk17 18 (có nguồn gốc từ Phú Thọ) Quảng Ninh (có nguồn gốc từ Phú Thọ) 2.2.2. Trình tự các mồi ISSR Bảng 2.2: Tên và trình tự các mồi ISSR sử dụng trong nghiên cứu STT Tên mồi Trình tự mồi 1 ISSR46 (AG)8T 2 ISSR50 TT(CA)8 3 ISSR51 (GA)8A 4 ISSR52 (CT)8G 5 ISSR53 (CA)8A 6 ISSR54 (TC)8G 7 ISSR56 (AC)8G 8 ISSR58 (CT)8T 9 ISSR59 (GA)8CT 10 ISSR64 ACA(GT)7 20 2.2.3. Hóa chất và thiết bị Hóa chất Một số hóa chất thông dụng dùng trong sinh học phân tử của các hãng Sigma, Merck,... như CTAB, Tris base, Boric acid, NaCl, HCl, Na2HPO4, MgCl2, dNTPs, EDTA, Taq Polymeraza, Chloroform, Isoamyalcohol, Isopropanol, Sodium thiosunfate, Agarose, Ethidium bromide, β-Mercapto ethanol, các mồi ISSR. Thiết bị Bảng 2.3: Các thiết bị cơ bản dùng trong nghiên cứu Máy li tâm (Eppendorf, Đức) Máy Vortex (Rotolab OSI) Máy đo pH (Hanna, Thuỵ Sĩ) Tủ lạnh sâu (Sanyo, Nhật) Máy soi gel Hoefer Bể ổn nhiệt (Memmert) Máy PCR (Eppendorf, Đức) Pipetman các loại (Gilson) Máy đo Nanodrop Bộ điện di ADN Cân phân tích 10-4 g Bộ điện di ngang Cân điện 10-1 g Tủ hút 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số Tách chiết và tinh sạch DNA các mẫu Ba k ch theo phương pháp CTAB của Doyle và cs có cải tiến. a. Pha hóa chất i) Đệm rửa Bảng 2.4: Hóa chất pha đệm rửa STT Hoá chất 1 Tris-HCl pH 8 2 EDTA pH 8 Nồng độ stock Nồng độ sử dụng Thể tích 1M 100 mM 5 ml 0,5 M 5 mM 0,5 ml 21 3 Sorbitol Bột 0,35 M 3,1885 g 4 Na2HPO4 Bột 0,4% 0,5 g Thêm nước đến thể tích cuối cùng 50 ml 50 ml Để ở 4oC cho đến khi sử dụng và nên sử dụng trong 1 tháng. ii) Đệm tách chiết Bảng 2.5: Hóa chất pha đệm chiết Nồng độ stock Nồng độ sử STT Hoá chất 1 CTAB Bột 6% 1,5 g 2 NaCl 5M 1,4 M 7 ml 3 EDTA pH 8 0,5 M 20 mM 2 ml 4 Tris-HCl pH 8 1M 100 mM 2,5 ml 5 -Mercapto Ethanol 0,1% 25 l dụng Thêm nước đến thể tích cuối cùng 25 ml Thể tích 25 ml Trước khi sử dụng để trong bể 65oC cho đệm chiết tan hoàn toàn, lấy thể tích cần dùng, cho thêm -Mercapto Ethanol 0,1% sau đó để lại bể 65oC đến khi sử dụng. b) Các bƣớc tách chiết DNA:  Ngiền nhanh 0,2 g lá bằng cối chầy sứ trong nitơ lỏng cho đến khi tạo thành bột thật mịn, sau đó chuyển ngay vào ống eppendorf 2ml, giữ trong đá.  Bổ sung 1ml đệm rửa, lắc mạnh trong 40 giây, ly tâm (12000 vòng/phút, 4oC, 7 phút).  Loại dịch nổi và lặp lại bước này từ 1 đến 2 lần. 22  Bổ sung 800 l đệm chiết, lắc đều và giữ ở 65oC trong thời gian 30 phút đến 1 tiếng (cứ 15 phút đảo đều 1 lần).  Giữ mẫu ở nhiệt độ phòng trong thời gian 10 phút.  Bổ sung 800 l Chloroform/isoamyl alcohol (24:1) vào mẫu, lắc đều trong thời gian 10 phút.  Ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút trong thời gian 15 phút ở 4oC (tuỳ từng loại mẫu, làm sao cho phần cặn lắng xuống).  Dùng pipet chuyển dịch nổi sang ống eppendorf 1,5 ml.  Bổ sung một thể t ch tương đương Isopropanol (lạnh) và đảo nhẹ, giữ mẫu trong đá 30 phút.  Ly tâm 12000 vòng/phút trong thời gian 15 phút ở 4oC.  Loại dich nổi, rửa DNA bằng cách thêm 500 l cồn 80%, ly tâm 12000 vòng/phút trong thời gian 4 phút ở 4oC (bước này thực hiện 2 lần), sau đó nhẹ nhàng loại bỏ ethanol (tránh để các cuộn DNA rơi ra ngoài)  Làm khô DNA bằng quạt gió, máy hút chân không..  Hoà tan trong 100 l H2O khử ion.  Sau khi DNA được hoà tan hoàn toàn thì bổ sung 3 l RNase (10mg/ml). Giữ sản phẩm ở 37oC trong thời gian 1 giờ.  Điện di kiểm tra DNA tổng số trên gel agarose 0,8%. 2.3.2. Phương pháp định lượng DNA bằng quang phổ kế Nguyên lý Các axit nucleic trong dung dịch sẽ hấp thụ ánh sáng tia cực tím (UV) trong dải từ 210 nm đến 300 nm với độ hấp thụ cực đại ở 260 nm. Vì các DNA và RNA và các nucleotide cùng có độ hấp thụ cực đại ở 260 nm, nên DNA không thể xác định bằng máy đo quang phổ trong vùng cực tím khi dung dịch bị nhiễm nucleotide và RNA. Do vậy RNA cần được loại bỏ bằng phương pháp thu phân với enzyme RNase. Các nucleotide và 23 oligonucleotide thu được từ thu phân RNA cũng cần được loại bỏ, nếu không loại bỏ sẽ dẫn đến đánh giá thừa hàm lượng DNA của mẫu thử. Ngoài ra DNA xoắn kép hấp thụ ánh sáng UV t hơn DNA xoắn đơn nên cần lưu ý đến hệ số hấp thụ khi tính toán nồng độ. Giá trị mật độ quang phổ ở bước sóng 260 nm (OD260nm – Optican density 260 nm) của các mẫu đo được dựa vào tương quan sau: 1 đơn vị OD260nm tương đương với nồng độ là: + 50 µg/ml DNA mạch kép + 40 µg/ml RNA + 33 µg/ml DNA mạch đơn Tỉ lệ OD260nm/OD280nm~1,8-2,0 thì DNA được coi là sạch protein. 2.3.3. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose Nguyên lý Các phân tử axit nucleic t ch điện âm, do đó khi đặt chúng trong điện trường ổn định với hiệu điện thế thích hợp thì chúng di chuyển từ cực âm sang cực dương của điện trường. Tốc độ di chuyển phụ thuộc vào điện tích, k ch thước, cấu trúc không gian của phân tử và nồng độ cấu thành gel. Việc chọn nồng độ gel tùy thuộc vào k ch thước trung bình của các đoạn DNA cần phân tách. Đoạn DNA có k ch thước càng nhỏ đòi hỏi hàm lượng agarose trong gel càng lớn và ngược lại. Trong điện di trên gel agarose, các đoạn DNA được hiện hình dưới tia tử ngoại (UV) nhờ Ethidium bromide (EtBr) có khả năng gắn xen giữa các base của DNA và phát huỳnh quang dưới tác dụng của UV. Sau khi điện di, gel được nhuộm với Ethidium bromide và soi bằng UV, các đoạn DNA hiện thành vạch sáng màu trên bản gel. Để ước lượng k ch thước các trình tự DNA trong gel agarose, người ta dùng “yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử” (molecular weight marker - MWM), đó là một tập hợp các trình tự DNA có k ch thước đã biết (thang DNA - Marker) [3]. 24 Các bƣớc thực hiện:  Chuẩn bị khay đổ gel và lược tạo các giếng điện di.  Chuẩn bị gel agarose 0,8%: cân 0,8g agarose sau đó bổ sung 100ml TAE 1X. Đun agarose trong lò vi sóng cho đến khi tạo thành dung dịch đồng nhất.  Để dung dịch nguội khoảng 50-60oC.  Đổ dung dịch vào khay sao cho không có bọt khí.  Sau 1h rút lược và đưa gel vào bể chạy điện di. Cho đệm TAE 1X ngập gel 2 mm.  Cho 5 µl loading dye vào mẫu, tra vào giếng, tra thang chuẩn DNA 1kb ở giếng cuối cùng và điện di ở hiệu điện thế 90V, thời gian chạy điện di từ 2h-2h30phút. Sau khi điện di xong sẽ tiến hành nhuộm bản gel. Bản gel được lấy ra khỏi khuôn, ngâm trong 20-30 phút trong dung dịch EtBr 0,5µg/ml, rửa lại bằng nước cất và quan sát dưới tia UV (254 nm) trên máy soi DNA (Minitransllumminatior, ioRad, Mỹ), ảnh được chụp bằng máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia iotech, Thụy Điển). 2.3.4. Phương pháp PCR-ISSR Phương pháp PCR với các mồi ISSR được thực hiện trên máy PCR PTC - 100 (MJ Research Inc, Mỹ), với tổng thể t ch là 25 l/mẫu gồm những thành phần được nêu ở bảng 2.6. Bảng 2.6: Thành phần phản ứng PCR-ISSR STT Thành phần Thể t ch (µl) 1 H2O 13,8 µl 2 dNTP (2,5 mM) 2,5 µl 3 Đệm 10× PCR 2,5 µl 4 MgCl2 (25 mM) 2 µl 25 5 Mồi ISSR (10 ng/μl) 2 µl 6 Enzyme Taq Sigma polymerase (5 UI/μl) 0,2 µl 7 DNA tổng số (25 ng/µl) 3 µl Tổng thể t ch (µl) 25 µl Trộn đều các thành phần của hỗn hợp rồi chuyển vào máy PCR sau đó chạy theo chương trình đã cài đặt sẵn với 40 chu kỳ như sau: 40 chu kỳ 94oC 5 phút 94oC 72 oC 72 oC 1 phút 10 phút 30 giây 50oC 15oC 50 giây ∞ Hình 2.1: Chu kỳ nhiệt chạy phản ứng PCR-ISSR 2.3.5. Phương pháp phân tích số liệu Các băng DNA được ghi nhận dựa trên sự có mặt hay vắng mặt của chúng ở các mẫu nghiên cứu và tính toán theo DNA thang chuẩn (DNA marker). Nếu một băng DNA (có k ch thước cụ thể) xuất hiện ở mẫu A nhưng không xuất hiện ở mẫu B hoặc đồng thời xuất hiện ở cả A và nhưng không xuất hiện ở các mẫu khác thì băng DNA này gọi là băng đa hình. Ngược lại, nếu băng DNA này xuất hiện ở tất cả các mẫu nghiên cứu thì gọi là băng đơn hình. Các băng được mã hóa bằng số tự nhiên 0 và 1. Nếu mẫu nào có băng thì ký hiệu là 1, còn không có thì ký hiệu là 0. Các số liệu này được nhập trực tiếp vào Excel và sau đó được xử lý theo chương trình NTSYS 2.1 để tính ma trận tương đồng giữa các cặp mẫu [26]. Trong nghiên cứu này chúng tôi đã sử dụng hệ số tương đồng di truyền Jaccard và phương pháp t nh UPGMA trong chương trình NTSYS 2.1 để phân tích mối quan hệ di truyền giữa các mẫu Ba kích. 26 Hệ số tương đồng di truyền được tính theo công thức của Nei và Li (1979). Theo Nei và Li thì công thức tính hệ số tương đồng di truyền là: S= 2.N AB NA  NB Trong đó: S là hệ số tương đồng di truyền NAB là số băng DNA có ở cả mẫu A và NA là số băng DNA có ở mẫu A NB là số băng DNA có ở mẫu Ngoài ra, để đánh giá hiệu quả sử dụng mồi thì các nhà khoa học còn đưa ra một thông số nữa, đó là hàm lượng thông tin t nh đa hình (PIC Polymorphic Information Content) hay hệ số đa hình di truyền cho mỗi locus (i) được tính theo công thức [37]. Hệ số PIC là thước đo của sự đa dạng alen ở từng locus. Hệ số này có thể được tính bằng phần mềm PIC calculator. Hệ số PIC được xác định dựa vào tần suất xuất hiên các bằng DNA hay các alen trên mỗi locus ISSR. Giá trị PIC cao tương ứng với locus đó có những alen và số alen xuất hiện cao. Tổng số các băng DNA có cùng k ch thước (được coi là cùng một allen) sẽ được nhập vào phần mềm này và sẽ đưa ra được hệ số PIC. PIC (i) = 1 – Σ Pij2 Trong đó: Pijlà tần suất allen thứ j với locus thứ i 27 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tách chiết DNA Sau khi thực hiện tách chiết DNA, chúng tôi tiến hành kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ của DNA trên máy đo quang phổ. Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.1. Bảng 3.1: Bảng giá trị độ tinh sạch và nồng độ DNA của các mẫu Ba kích Stt Tên mẫu OD260/280 Hàm lượng DNA ng/μl Stt Tên mẫu OD260/280 Hàm lượng DNA ng/μl 1 Bk1 1,83 304,8 21 Bk21 1,85 456,7 2 Bk2 1,85 507,4 22 Bk22 1,91 487,3 3 Bk3 1,84 166,2 23 Bk23 1,85 584,6 4 Bk4 1,79 335,6 24 Bk24 1,87 387,4 5 Bk5 1,80 157,3 25 Bk25 1,90 200,1 6 Bk6 1,88 368,1 26 Bk26 1,99 401,2 7 Bk7 1,95 372,4 27 Bk27 1,84 305,4 8 Bk8 1,82 270,3 28 Bk28 1,95 378,4 9 Bk9 1,90 414,0 29 Bk29 1,93 452,8 10 Bk10 1,87 458,8 30 Bk30 1,86 515,7 11 Bk11 1,80 613,9 31 Bk31 2,20 344,8 12 Bk12 1,82 566,4 32 Bk32 1,86 365,9 13 Bk13 1,88 431,1 33 Bk33 1,87 356,7 14 Bk14 1,87 501,2 34 Bk34 2,10 407,4 15 Bk15 1,97 302,4 35 Bk35 1,98 286,2 16 Bk16 1,85 478,4 36 Bk36 1,86 345,6 17 Bk17 1.93 552,8 37 Bk37 2,16 467,3 18 Bk18 1,86 245,7 38 Bk38 1,99 358,1 19 Bk19 1,99 234,8 39 Bk39 1,86 412,4 20 Bk20 1,81 376,9 28 Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy các mẫu DNA có giá trị OD260nm/280nm biến thiên từ 1,79 – 2,2. Trong 39 mẫu chỉ có 4 mẫu không nằm trong khoảng giới hạn cho phép độ tinh sạch DNA OD260nm/280nm~1,8-2,0. Kết quả này phù hợp với yêu cầu của sản phẩm tách chiết DNA để phục cho các bước tiếp theo của thí nghiệm. Ngoài ra chúng tôi còn kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA tổng số bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả điện di thể hiện trên hình 3.1. Bk1 Bk2 Bk3 Bk4 Bk5 Bk6 Bk7 Bk8 Bk9Bk10 Bk11 Bk12 Bk13 Bk14 Bk15 Bk16Bk17 Bk18 Hình 3.1: Ảnh điện di DNA tổng số 18 mẫu Ba kích Từ hình 3.1 cho thấycác băng DNA tổng số của 18 mẫu a k ch thu được đều sáng, băng gọn cũng như không xuất hiện vệt sáng kéo dài ở ph a dưới. Điều đó cho thấy DNA tổng số của các mẫu Ba kích sau khi tách chiết có độ nguyên vẹn và tinh sạch cao (các mẫu còn lại cũng cho kết quả tương tự) 3.2. Kết quả phân tích sự đa dạng di truyền Ba kích tím Quảng Ninh Để nghiên cứu quan hệ di truyền Ba kích, chúng tôi đã sử dụng các mồi ISSR có tên và trình tự tại bảng 2.2. DNA tinh sạch được pha loãng để làm khuôn cho phản ứng ISSR. Sau khi hoàn thành phản ứng PCR, sản phẩm được điện di trên gel agarose 1,5% để phân t ch đa hình DNA của các mẫu nghiên cứu. Từ hình ảnh điện di, chúng tôi tiến hành phân tích dựa trên sự có mặt hay vắng mặt của các băng DNA có k ch thước giống nhau ở các mẫu nghiên cứu. Ở hình ảnh đó, nếu có băng DNA hiện ở 1 giếng thì ký hiệu là 1, còn không có thì ký hiệu là 0. Dựa 29 vào mức độ đa hình của các băng này chúng ta có thể đánh giá sự đa dạng di truyền của các mẫu Ba kích. Trong quá trình nghiên cứu thì đã sử dụng 10 mồi ISSR, nhưng chỉ có 6 mồi cho sản phẩm đa hình.Sau đó, 6 mồi ISSR này được sử dụng để đánh giá đa dạng 39 mẫu Ba kích. Sau đây là hai kết quả trong một số kết quả thu được của việc sử dụng chỉ thị ISSR trong phản ứng PCR. Hình ảnh điện di và đa hình các băng DNA thu được của sản phẩm PCR-ISSR khi sử dụng mồi ISSR 50, ISSR 56. 30 (A) (B) (C) Hình 3.2 A, B, C: Ảnh điện di sản phẩm PCR-ISSR với mồi ISSR50 31 (A) (B) (C) Hình 3.3 A, B, C: Ảnh điện di sản phẩm PCR-ISSR với mồi ISSR56 Dựa trên kết quả điện di thu được, tiến hành lập bảng thống kê kết quả với từng mồi nghiên cứu, với 2 chỉ số 0 (không có sự xuất hiện của băng vạch 32 quan tâm), 1 (có sự xuất hiện của băng vạch quan tâm). Bảng 3.2 là kết quả thống kê của mồi ISSR 56 với 39 mẫu Ba kích nghiên cứu.Các mồi còn lại cũng được tiến hành tương tự. Bảng 3.2: Sản phẩm đa hình ISSR của mồi ISSR 56 nhận đƣợc sau khi chạy PCR với DNA tổng số của các mẫu Ba kích K ch thước(bp) Tên mẫu 450 600 650 750 1000 1200 1400 1700 2000 Bk1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 Bk2 0 0 1 0 0 0 0 0 0 Bk3 0 0 1 0 0 1 0 0 0 Bk4 0 1 0 0 0 0 0 0 0 Bk5 0 0 1 0 0 1 0 0 0 Bk6 0 0 0 0 0 1 0 1 0 Bk7 0 0 1 1 0 0 0 0 0 Bk8 1 1 0 0 0 0 0 0 0 Bk9 0 1 0 1 0 0 0 0 0 Bk10 0 0 0 0 0 1 0 0 0 Bk11 0 0 1 1 0 0 0 0 0 Bk12 1 0 1 0 0 0 0 0 0 Bk13 1 1 0 0 0 0 0 0 0 Bk14 0 0 0 1 0 0 1 1 0 Bk15 0 1 1 1 0 0 1 1 1 Bk16 0 0 0 1 0 0 1 1 1 Bk17 0 1 1 1 0 0 0 0 0 Bk18 0 1 1 0 0 0 0 0 0 Bk19 0 0 0 0 0 1 1 1 1 Bk20 0 0 1 0 0 1 1 1 1 33 Bk21 0 0 1 0 0 1 1 1 1 Bk22 0 0 1 1 1 1 1 1 0 Bk23 0 0 0 0 0 0 1 1 0 Bk24 0 1 1 1 1 1 1 1 1 Bk25 0 1 1 1 1 0 0 1 1 Bk26 0 0 0 0 0 1 0 0 1 Bk27 0 0 1 0 0 0 0 0 0 Bk28 0 0 1 0 0 0 0 0 0 Bk29 0 0 1 0 0 0 0 0 0 Bk30 0 0 1 0 0 0 1 1 0 Bk31 0 0 1 0 1 0 0 1 0 Bk32 0 0 1 1 1 1 0 1 0 Bk33 0 1 1 0 1 0 0 0 0 Bk34 0 0 1 0 0 0 0 1 1 Bk35 0 0 1 0 0 1 1 1 1 Bk36 0 0 0 0 0 1 1 1 1 Bk37 0 0 1 0 0 0 1 1 1 Bk38 0 0 1 0 0 0 1 1 0 Bk39 0 0 1 0 0 1 1 1 1 Từ bảng 3.2 ta thấy các băng vạch phân bố từ 450 bp đến 2000 bp, trong đó có 119 băng xuất hiện thì có 119 băng đa hình. Số lượng băng đa hình xuất hiện là 100%. Nên mồi ISSR 56 có giá trị cao trong việc đánh giá đa dạng di truyền Ba kích. Phân tích tổng hợp các băng DNA thu được trên hình ảnh điện di sản phẩm PCR-ISSR của các mồi và sử dụng phần mềm PIC calculator ta có thể m m đưa ra kết quả ở bảng 3.3. 34 Bảng 3.3: Giá trị PIC và t lệ b ng đa hình của 3 mẫu Ba kích với 6 mồi ISSR. Số băng quan Số băng đa T lệ băng sát được hình đa hình(%) 0,7619 67 67 100 ISSR50 0,7422 118 118 100 3 ISSR51 0,7521 101 62 61 4 ISSR52 0,7553 74 74 100 5 ISSR53 0,8051 94 94 100 6 ISSR56 0,8628 119 119 100 573 534 STT Tên mồi PIC 1 ISSR46 2 Tổng Trung bình 0,7799 93,5 Qua bảng 3.3 nhận thấy giá trị PIC của các mồi ISSR biến động trong khoảng 0,7422 đến 0,8628. Giá trị PIC trung bình là 0,7799. Các chỉ thị ISSR đều có giá trị PIC lớn hơn 0,5 chứng tỏ các mồi ISSR đã sử dụng có giá trị cao trong việc đánh giá mối quan hệ di truyền Ba kích. Mồi ISSR 50 cho giá trị PIC nhỏ nhất là 0,7422. Mồi ISSR 56 cho giá trị PIC lớn nhất là 0,8628. Chứng tỏ mồi ISSR 56 có khả năng rất cao trong việc đánh giá sự đa dạng di truyền Ba kích. Các băng DNA được nhân lên gồm có hai loại: Loại đơn hình (monomorphic) là loại băng DNA có cùng một k ch thước, có ở tất cả các giống nghiên cứu và loại đa hình (polymorphic) không có mặt ở mẫu này nhưng lại có mặt ở mẫu khác. Trong tổng số 573 băng thu được thì có 39 băng đơn hình xuất hiện ở tất cả các mẫu nghiên cứu (chiếm 6,8%) và 534 băng đa hình (chiếm 93,2%). Mồi ISSR 56 nhân lên được số băng nhiều nhất (119 băng). Mồi ISSR 46 nhân lên được số băng t nhất (67 băng). Có 5 mồi cho t lệ đa hình là 100% (mồi ISSR 46, ISSR 50, ISSR 52, ISSR 53, ISSR 35 56) và mồi còn lại cho t lệ đa hình cao (lớn hơn 50%). Khi sử dụng mồi ISSR, nhận thấy số băng đa hình trung bình trên một mồi là khoảng 89 băng. T lệ đa hình cao cho thấy các mồi ISSR sử dụng có ý nghĩa cao trong phân tích, nghiên cứu đa dạng di truyền Ba kích. Số liệu thu được từ kết quả PCR–ISSR được đưa vào xử lý bằng phần mềm NTSYSpc 2.1 để tính hệ số tương đồng di truyền và xây dựng biểu đồ quan hệ di truyền giữa các mẫu a k ch. Sau đó dựa vào hệ số tương đồng di truyền chúng tôi xây dựng cây phát sinh chủng loại được thể hiện trên hình 3.4. 36 Hình 3.4: Sơ đồ hình cây biểu diễn mối liên kết di truyền giữa các mẫu Ba kích dựa vào chỉ thị ISSR 37 Bảng 3.4: Hệ số tƣơng đồng 39 mẫu Ba kích nghiên cứu 38 Quan sát bảng hệ số tương đồng (Bảng 3.4) nhận thấy hệ số tương đồng các mẫu nghiên cứu dao động trong khoảng 0,14 đến 0,88. Cặp giống có hệ số tương đồng thấp nhất là Bk17 và Bk6, cặp giống có hệ số tương đồng cao nhất là Bk14 và Bk16. Dựa trên biểu đồ hình cây (Hình 3.4) và chúng tôi chia 39 mẫu nghiên cứu làm 2 nhóm chính. - Nhóm 1: gồm 16 mẫu Ba kích: Bk1, Bk11, Bk2, Bk12, Bk3, Bk5, k6, k10, k4, k8, k9, k13, k17, k18, k28, k7. Được chia làm 2 phân nhóm. + Phân nhóm 1: gồm 12 mẫu Ba kích: Bk1, Bk11, Bk2, Bk12, Bk3, Bk5, Bk6, Bk10, Bk4, Bk8, Bk9, Bk13. + Phân nhóm 2: gồm 4 mẫu Ba kích: Bk7, Bk18, Bk28, Bk17. - Nhóm 2: gồm 23 mẫu Ba kích: Bk14, Bk15, Bk16, Bk36, Bk37, Bk19, Bk20, Bk21, Bk22, Bk23, Bk26, Bk24, Bk25, Bk32, Bk30, k35, k29, k34, k38, k39, k27, k31, k33.Được chia làm 3 phân nhóm + Phân nhóm 1: gồm 20 mẫu Ba kích: Bk14, Bk15, Bk16, Bk36, Bk37, Bk19, Bk20, Bk21, Bk22, Bk23, Bk26, Bk24, Bk25, Bk32, Bk30, Bk35, Bk29, Bk34, Bk38,Bk39. + Phân nhóm 2: gồm 3 mẫu Ba kích: Bk27, Bk31, Bk33. Từ kết quả trên có thể khẳng định có sự đa dạng mức loài ở cây Ba kích tím ở mức độ phân tử (kết luận này cũng được khẳng định ở nghiên cứu phân t ch đa dạng di truyền Ba kích bằng chỉ thị RAPD của Ding và cs (2006)). Trên cây phân loại 3 mẫu Ba kích tím có nguồn gốc từ Phú Thọ thuộc cùng một nhánh phân loại mức độ tương đồng từ 0,68 đến 0,88. Điều này khẳng định một điều ngoài mức độ đa dạng của những cá thể ở cùng một vùng địa lí còn có sự đa dạng giữa các cá thể thuộc các vùng địa lí khác nhau. Đây ch nh là một thuận lợi cho công tác chọn tạo giống, nhằm bảo tồn và phát triển nguồn gen Ba kích. 39 Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận - Đã thu thập được 39 mẫu Ba kích tự nhiện và tách chiết DNA từ các mẫu Ba kích thu thập. DNA a k ch được tách chiết có chất lượng tốt và độ tinh sạch cao. - Đã sàng lọc 10 mồi ISSR và chọn được 6 mồi ISSR để tiến hành nghiên cứu đa dạng di truyền Ba kích. - Khi phân t ch đa dạng di truyền Ba kích bằng phương pháp PCRISSR thì thấy t lệ băng đa hình là 93,2%, giá trị PIC trung bình là 0,7799, điều này chứng tỏ 6 mồi ISSR đang sử dụng có ý nghĩa cao trong phân t ch, nghiên cứu đa dạng di truyền Ba kích. - Thông qua số liệu phân t ch thu được khi sử dụng chỉ thị ISSR thì các mẫu a k ch được nghiên cứu chia thành 2 nhóm. Hệ số tương đồng di truyền dao động trong khoảng 0,32 đến 0,88. Từ kết quả có thể khẳng định có sự đa dạng mức loài ở cây Ba kích tím ở mức độ phân tử. 4.2. Kiến nghị Do thời gian có hạn và khó khăn khi thu thập mẫu trong rừng tự nhiên nên chúng tôi chỉ phân t ch đa dạng đi truyền Ba kích tím Quảng Ninh bằng chỉ thị ISSR với 39 mẫu Ba kích và 6 mồi ISSR. Vì vậy chúng tôi có kiến nghị: - Cần phân t ch đa dạng đi truyền Ba kích với số lượng mồi ISSR và số lượng mẫu ở mỗi quần thể nhiều hơn để thu được kết quả có độ ch nh xác cao hơn. - Thử nghiệm phân t ch đa dạng đi truyền Ba kích trên nhiều chỉ thị khác nhau để có sự so sánh giữa các chỉ thị, chỉ thị nào cho độ ch nh xác hơn trong phân t ch đa dạng di truyền Ba kích thì sử dụng để nghiên cứu. 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Võ Văn Chi (1999), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nxb Y Học. 2. Đỗ Huy Bích (1993), Tài nguyên cây thuốc Việt Nam, Nxb Khoa học và Kỹ thuật. 3. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2008), Sinh học phân tử, Nxb Giáo dục. 4. Trịnh Đình Đạt (2010), Công nghệ sinh học- Tập 4- Công nghệ di truyền, Nxb Giáo dục. 5. Chu Hoàng Hà, Phạm Bích Ngọc, Hoàng Đăng Hiếu, Vũ Huyền Trang (2014), “Đánh giá đa dạng quần thể dó bầu (Aquilaria crassna Pierre) tại Việt Nam bằng chỉ thị phân tử ISSR”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 4(30): 58-65. 6. Nguyễn Thị Thu Hương (2008), “ Nghiên cứu đặc t nh sinh dược học của một số hợp chất tự nhiên từ dịch chiết rễ a k ch”, Luận văn thạc sĩ sinh học,Đại học Sư phạm Hà Nội 2. 7. Đỗ Tất Lợi (2003), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb Khoa học Kỹ thuật. 8. Vương Yến Phương (1986), Thực Vật Học Báo cáo, 28(5): 566. 9. Trần Mỹ Tiên và Nguyễn Mai Thanh Tâm, Trần Công Luận, Nguyễn Thị Thu Hương (2012), “ Nghiên cứu tác dụng hướng sinh dục nam của a k ch”, Tạp chí Y Học TP. Hồ Chí Minh, 1(16). 10.Võ Châu Tuấn, Huỳnh Minh (2010), “ Nghiên cứu nhân giống in vitro cây a k ch”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, Đại học Đà Nẵng, 5(40): 191-196. 41 Tài liệu tiếng Anh 11. Alkhalifah N and Askari E (2003), “Molecular phylogeny of date palm (Phoenix dactylifera L.) cultivars from Saudi Arabia by DNA fingerprinting”, Theor Appl Genet, 107: 1266-1270. 12.Bosco, Siragusa M, Abbate L, Lucretti S, Tusa N (2007), “Production and characterization of new triploid seedless progenies for mandarin improvement”,Scientia Horticulturae, 114: 258-262. 13.Debener T and Mattiesch L (1999),“Construction of a genetic linkage map for roses using RAPD and AFLP markers”, Theoretical and Applied Genetics,99(5): 891-899. 14.Ding P, Xu J.Y, Chu T.L (2006),“RAPD analysis on germplasm resources of different farm races of Morinda officinalis”, Zhong Yao, 29(1):1-3. 15.Galderisi U, Cipollaro M, Bernardo G.D, Masi L.D, Galano, Cascino A(1999), “Identification of hazelnut (Corylus avellana) cultivars by RAPD analysis”,Plant Cell Rep, 18: 652-655. 16.Kartel N.A and Malyshev S.V (1997), “Molecular marker in mapping of plant genomes, Molecular Biology”, 31: 163 - 171. 17.Liu L, Zhao L, Gong Y, Wang M, Chen L, Yang J, Wang Y, Yu E, Wang L (2008), “DNA fingerprinting and genetic diversity analysis of late-bolting radish culivars whith RAPD, ISSR and SRAP marker”, Sci. Hortic, 116: 240-247. 18.Luque C, Legal L, Machkour-M’Rabet S, Winterton P, Gers C, Wink M (2009), “Apparent influences of host-plant distribution on the structure and the genetic variability of local populations of purple clay (Diarsa brunea)”, Biochemical Systematics and Ecology, 37: 6-15. 42 19. Miranda O.K, Rios L.P, Augusto F.G.A, Zagatto P.M.E, De S.A.P (2004),“Evaluating genetic relationships between tropicalmaize inbred lines by means of AFLP profiling”, Hereditas,140(1):24-33. 20.Ning-Zhen Huang, Chuan-Ming Fu, Zhi-Guo Zhao, Feng-Luan Tang, Feng Li (2007), “Tissue culture and rapid proliferation of Morinda officinalis How”, Botany, Guangxi Zhuangzu Autonomous Region and the Chinese Academy of Sciences, Guilin 541006, China. 21.Nesbitt K.A, Potts B.M , Vaillancourt R.E, West A, Reid J.B (1995), “Partitioning and distribution of RAPD variation in a forest tree species, Eucalyptus globulus (Myrtaceae)”, Heredity, 74(6): 628-637. 22.Padmesh P.P, Jayakumari S.S, Kuttapetty M.M, Kuttanappilly S.P.J, Apian S (2012), “ISSR analysis reveals high intraspecific variation in Rauvolfia serpentina L. – A high value medicinal plant”, Biochemical Systematics and Ecology, 40: 192–197. 23.Palombi M and Damiano C (2002), “Comparison between RAPD and SSR molecular markers in detecting genetic variation in kiwifruit (Actinidia deliciosa A. Chev)”, Plant Cell Rep, 20: 1061-1066. 24.Reddy M.P, Sarla N, Siddiq E.A (2002), “Inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism and its application in plant breeding”, Euphytica, 128(1): 9-17. 25.Ratnaparkhe M.B, Tekeoglu M,Muehlbauer F.J (1998), “Intersimple-sequence-repeat (ISSR) polymorphisms are useful for finding markers associated with disease resistance gene clusters”, Theoretical and Applied Genetics, 97(4): 515-519. 26.Rohlf F.J (2000) NTSYS-pc: Numerical taxonomy and multivariate analysis system, ver. 2.1. Exeter Publishing, Setauket, NY. 43 27.Sankar A and Moore G.A(2001), “Evaluation of inter-simple sequence repeat analysis for mapping in Citrus and extension of the genetic linkage map”, Theor. Appl. Genet, 102: 206-214. 28.Sale M.M, Potts B.M, WestA.K, RiedJ.B(1996), “Molecular differentiation within and between Eucalyptus risdonii, E. amygdalina and their hybrids using RAPD makers”, Australian Journal of Botany, 44: 559-569. 29.Scarano M.T, Abbate L, Ferrante S, Lucretti S (2002), “ISSR-PCR technique: a useful method for characterizing new allotetraploid somatic hybrids of mandarin”, Plant Cell Rep, 20: 1162-1166. 30.Semagn K,Bjornstad A, Ndjiondjop M.N(2006), “An overview of molecular marker methods for plants”, African Journal of Biotechnology, 5(25): 2540-2568. 31.Soon Y.Y, Tan .K.H (2002), “ Evaluation of the hypoglycemic and antioxydiant activities of Morinda officinalis in streptozotocininduced diabetic rats”, Singapore Med.J, 43(2): 77-85. 32.Tusa N, Abbate L, Ferrante S, Lucretti S, Scarano M.T (2002), “Identification of zygotic and nucellar seedlings in Citrus interploid crosses by means of isozymes, flow cytometry and ISSR-PCR”, Cell. Mol. Biol. Lett,7: 703-708. 33.Vanijajiva O (2012), “The application of ISSR markers in genetic variance detection among Durian (Durio zibethinus Murr.) cultivars in the Nonthaburi province”, Thailand, Proc, 32: 155–159. 34.Wang G, Mahalingam R, Knap H.T (1998), “(C-A) and (G-A) anchored simple sequence repeats (ASSRs) generated polymorphism insoybean, Glycine max (L.) Merr”, Theoretical and Applied Genetics, 96(8): 1086-1096. 44 35.Wang Z, Liao L, Yuan X, Guo H, Guo A, Liu J (2013), “Genetic diversity analysis of Cynodon dactylon (bermudagrass) accessions and cultivars from different countries based on ISSR and SSR markers”, Biochemical Systematics and Ecology, 46: 108-115. 36.Wachira F.N, Waugh R, Hackett C.A, Powell W (1995), “Detection of genetic diversity in tea (Camellia sinensis) using RAPD markers”. Genome, 38: 201-210. 37.Weir .S (1996), “Genetic data analysis II, 2nd ed”, Sunderland, Massachusetts, Sinauer Associates: 377. 38.Wei L.J, Lu P and Su W.P (2006), “Tissue culture and rapid propagation of Morinda officinalisHow”,Plant Physilogy Comunication, 42 (3): 475. 39.Winter P and Kalh G. (1995). “Molecular marker technologies for plant improverment”, Worl Journal of Microbiology and Biotechnology, 11: 438 - 448. 40.Yamagishi M, Abe H, Nakano M, NakatsukaA(2002), “PCR-based molecular markers in Asiatic hybrid lily”, Scientia Horticulturae, 96(1–4): 225-234. Tài liệu từ Internet 41.http://vienduoclieu.org.vn/tin-chi-tiet/-/chi-tiet/muc-luc-cac-congtrinh-nghien-cuu-cay-thuoc-tren-cac-xuat-ban-pham-hien-co-tai-vien612-606.html 42.http://hoilamnghiep-pto.com/vi/spct/id387/CAY-BA-KICHMORINDA-OFFICINALIS-HOW----LOAI-CAY-DUOC-LIEUNHIEU-CONG-DUNG/ 45 [...]... thái và di truyền của loài cây này cũng được các nhà khoa học Trung Quốc nghiên cứu Sự đa dạng đi truyền Ba kích được Ding và cs nghiên cứu, để phân tích sự đa dạng di truyền Ba kích tác giả đã sử dụng chỉ thị RAPD, trong cả quá trình nghiên cứu tác giả sử dụng 40 mồi RAPD thì 14 mồi cho sản phẩm đa hình, qua phân t ch kết quả tác giả đưa ra kết luận có sự đa dạng mức loài ở cây Ba kích ở mức độ phân. .. nhuộm gel bằng Ethidium bromide ước 4: Chụp ảnh phổ điện di và phân tích số liệu  Những ưu điểm của kỹ thuật Chỉ thị ISSR không cần biết trước thông tin về trình tự nhân để thiết kế mồi Phương pháp ISSR chỉ cần một lượng nhỏ DNA để tiến hành [17], [35] Kĩ thuật PCR -ISSR đơn giản và nhanh chóng, dễ thực hiện Chỉ thị ISSR có sự đa hình cao và được sử dụng để nghiên cứu đa dạng di truyền, đa dạng loài,... 25 Bk25 Đạp Thanh 6 Bk6 Quảng Ninh 26 Bk26 Đạp Thanh 7 Bk7 Quảng Ninh 27 Bk27 Đạp Thanh 8 Bk8 Quảng Ninh 28 Bk28 Đạp Thanh 9 Bk9 Quảng Ninh 29 Bk29 Đạp Thanh 10 Bk10 Quảng Ninh 30 Bk30 Đạp Thanh 11 Bk11 Quảng Ninh 31 Bk31 Đạp Thanh 12 Bk12 Quảng Ninh 32 Bk32 Đạp Thanh 13 Bk13 Quảng Ninh 33 Bk33 Đạp Thanh 14 Bk14 Quảng Ninh 34 Bk34 Đạp Thanh 19 (có nguồn gốc từ Phú Thọ) Quảng Ninh 35 Bk35 Đạp Thanh 36... thuật PCR ước 5: Phân tích kết quả sản phẩm PCR bằng điện di và xử lý kết quả bằng các phần mềm thông dụng để đánh giá sự khác biệt di truyền và đa dạng sinh học của các mẫu nghiên cứu 11  Những ưu, nhược điểm của kỹ thuật AFLP:  Ưu điểm: Kỹ thuật AFLP có thể phân tích với bất kỳ hệ gen nào từ đơn giản đến phức tạp Phân tích sự đa dạng di truyền, đánh dấu các gen và ứng dụng để lập bản đồ gen Kỹ thuật... hạn chế có trong DNA bộ gen [39] Chỉ thị RFLP là chỉ thị đồng trội và được thừa nhận là chỉ thị di truyền mạnh nhất, hiệu quả trong nghiên cứu biến dị di truyền, phân tích liên kết, chọn giống, lập bản đồ, đa dạng di truyền [16] Các kết quả có độ chính xác cao nên có thể tiến hành lặp lại ở các phòng thí nghiệm khác nhau Kỹ thuật này không đòi hỏi việc đọc trình tự song chỉ thị này cũng có mặt hạn... cây Ba kích (Morinda offcinalis How) Củ Ba kích có chứa các thành phần hoạt chất ch nh như: Gentianine, Carpaine, Choline, Trigonelline, Diogenin, Yamogenin, Gitogenin, Tigogenin, Vitexin, Orientin, Quercetin, Luteolin, Vitamin B1,Morindin, Vitamin C Trong rễ Ba kích còn chứa Antraglycozid, đường, nhựa, Acid hữu cơ, Phytosterol và t tinh dầu, Morindin Rễ tươi có sinh tố C [1] 4 Ngoài ra trong Ba kích. .. sinh học phân tử hiện đại Để đánh giá bản chất di truyền của các cá thể dựa vào hệ gen của chúng, các chỉ thị DNA đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu của sinh học phân tử như: Xây dựng thư viện bộ gen, xác định phát sinh chủng loại, đánh giá đa dạng di truyền, xác định quan hệ họ hàng Chỉ thị DNA là một đoạn DNA dùng để phân biệt hai cá thể, hai dòng hay hai giống khác nhau Chỉ thị DNA... mua Ba kích từ Trung Quốc mà Ba kích Trung Quốc thường đã bị người dân Trung luộc lấy hết dược liệu, chỉ còn bã đem phơi khô và bán cho người Việt Nam 6 1.2 Một số chỉ thị phân tử thƣờng dùng trong phân tích đa dạng di truyền Có nhiều phương pháp nghiên cứu khác nhau trong phân loại và xác định loài ở động, thực vật và hầu hết các phương pháp này đều dựa trên nguyên tắc như những loài có chung nguồn. .. Amplified Polymorphic DNA) Cho đến nay đã có nhiều chỉ thị sinh hoá và chỉ thị phân tử được sử dụng để xác định sự đa dạng di truyền thực vật Trong số đó, kỹ thuật RAPD đã được sử dụng để phân t ch đa dạng di truyền của số lượng lớn các giống cây trồng [15], [23], [11] Kỹ thuật này đã được ứng dụng rất thành công trong những nghiên cứu về sự khác biệt di truyền trong các quần thể thực vật [21], [36], [28]... Đạp Thanh 15 Bk15 16 Bk16 17 Bk17 18 (có nguồn gốc từ Phú Thọ) Quảng Ninh (có nguồn gốc từ Phú Thọ) 2.2.2 Trình tự các mồi ISSR Bảng 2.2: Tên và trình tự các mồi ISSR sử dụng trong nghiên cứu STT Tên mồi Trình tự mồi 1 ISSR4 6 (AG)8T 2 ISSR5 0 TT(CA)8 3 ISSR5 1 (GA)8A 4 ISSR5 2 (CT)8G 5 ISSR5 3 (CA)8A 6 ISSR5 4 (TC)8G 7 ISSR5 6 (AC)8G 8 ISSR5 8 (CT)8T 9 ISSR5 9 (GA)8CT 10 ISSR6 4 ACA(GT)7 20 2.2.3 Hóa chất và thiết ... tích đa dạng di truyền nguồn gen Ba kích tím (Morinda officinalis How) Quảng Ninh thị ISSR Mục đích, yêu cầu 2.1 Mục đích Phân t ch đa dạng di truyền nguồn gen Ba kích tím Quảng Ninh 2.2 Yêu... khẳng định có đa dạng mức loài Ba kích tím mức độ phân tử (kết luận khẳng định nghiên cứu phân t ch đa dạng di truyền Ba kích thị RAPD Ding cs (2006)) Trên phân loại mẫu Ba kích tím có nguồn gốc... có đa dạng mức loài Ba kích tím mức độ phân tử 4.2 Kiến nghị Do thời gian có hạn khó khăn thu thập mẫu rừng tự nhiên nên phân t ch đa dạng truyền Ba kích tím Quảng Ninh thị ISSR với 39 mẫu Ba kích