BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI ự* Cũn LƯƠNG Q U Ố C HUY XÂY DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG IMIPENEM TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG HPLC KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ ĐẠI HỌC KHOÁ 2002 - 2007 Người hướng dẫn : Th.s Nguvẽn T rung Hiếu Nơi thực : Bộ môn hoá phân tích Phòng thí nghiệm trung tâm Viện kiểm nghiệm Thòi gian thực : 01/2007- 05/2007 \Ịị HÀ NỘI, THÁN í ; NAM 20(17 v; Ì'ị'j■-T• £Ờ Z< âcÁ M Ơ 0l Sau thời gian hoàn thành luận văn ,em xin bày tỏ lời biết ơn sâu sắc chân thành tơí Th.s Nguyễn Trung Hiếu, TS. Nguyễn Thị Kiều Anh, Th.s Nguyễn Thị Hồng Thủy người hướng dẫn giúp đỡ em việc thực luận văn. Em xin chân thành cảm ơn thầy cô cán môn hoá phân tích - độc chất,phòng thi nghiệm trung tâm giúp đỡ em tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thànhkhóa luận . Em xin bày tỏ lời cảm ơn tới cán phòng Dược lý - Viện kiểm nghiệm giúp đỡ hóa chất thiết bị cho em trình thực đề tài. Nhân dịp em xin gửi lời cảm ơn đến nhà trường phòng chức giúp đỡ em suốt năm năm học vừa qua, thời gian thực khóa luận . Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2007 Sinh viên Lương Quốc Huy MỤC LỤC Chữ viết tát Đặt vấn đề PHẨN 1: TỔNG Q U A N . 1.1. Đại cương Im ipenem .3 1.1.1 Đặc điểm hoá lý im ipenem . 1.1.2 Cơ chế tác dụng dược động học 1.1.3 Chỉ định . 1.1.4 Chống định 1.1.5 Liều lượng cách d ù n g 1.1.6 Tác dụng không mong muốn 1.1.7 Một số dạng bào chế 1.1.8 Những phương pháp định lượng imipenem HPLC . 1.2. Đại cương H P L C 10 1.2.1 Khái niệm b ả n 10 1.2.2 Nguyên tắc phương pháp H P L C . 10 1.2.3 Nguyên tắc cấu tạo máy sắc ký HPLC 10 1.2.4 Một số thông số đặc trưng HPLC 11 1.2.5 Pha tĩnh H P L C .12 1.2.6 Pha động HPLC 13 1.2.7 Cách tính kết q u ả .14 PHẨN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 16 2.1. Nguyên vật liệu, phương pháp thực nghiệm nội dung nghiên cứu . 16 2.1.1 Thiết bị, hóa chất . 16 2.1.2 Phương pháp, nội dung đối tượng nghiên cứu nghiên cứu 17 2.1.2.1 Nội dung nghiên cứu . 17 2.1.2.2 Đối tượng nghiên cứu 17 2.1.2.3 Phương pháp nghiên c ứ u 17 2.2. Kết thực nghiệm 20 2.2.1. Khảo sát xây dựng phương pháp để định lượng imipenem huyết tương . 20 2.2.1.1. Lựa chọn cột chạy sắc k ý .20 2.2.1.2. Lựa chọn thành phần pha đ ộ n g . 20 2.2.1.3. Lựa chọn tốc độ dòng 21 2.2.1.4 Lựa chọn detector u v 22 2.2.2. Thẩm định phương pháp sắc k ý . 23 2.2.2.ỉ. Xác định khoảng tuyến tính phương p h p . 23 2.2.2.2. Đánh giá độ phương p h p .25 2.2.2.3. Đánh giá độ xác phương pháp . 27 2.2.2.4. Giới hạn định lượng 28 2.2.2.5. Tính đặc hiệu phương p h áp 29 2.2.3 ứng dụng chương trình sắc ký để định lượng mipenem huyết tương bệnh nhân sau tiêm truyền Tienam 500m g . 31 2.3. Bàn luận 33 PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUÂT . 35 1. Kết luận . 35 2. Đề xuất . 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHỮ VIẾT TẮT B.p Bristish Phamacopoeia HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High perfomance liquid chromatography) MES Morphorlinoethanolsulforic acid(C6H 12N 4.H20) MOPS 3-[N-morpholino]propanesulfonic acid MeCN Acetonitril MeOH Methanol RSD% Độ lệch chuẩn X | 15 Giá trị trung bình PL Phụ lục PA Tinh khiết u.s.p The United states pharmacopoeia s Đô lêch chuẩn tương đối ĐẬT VÂN ĐỂ Sự đời kháng sinh tiên lớn y dược học giới điều trị bệnh nhiễm khuẩn. Song vl lợi ích mà việc sử dụng kháng sinh trở nên không mức lạm dụng nhiều dẫn đến tình trạnh kháng kháng sinh trở nên ngày cao[6]. Một số kháng sinh thông dụng penicillin, cloramphenicol, amoxicillin . bị nhiều vi khuẩn kháng lại.Trước tình trạng kháng kháng sinh ngày phổ biến, đòi hỏi nhà khoa học không ngừng nghiên cứu đưa loại kháng sinh có tác dụng mạnh vào sử dụng. Imipenem dẫn xuất N-formidoyl. Imipenem kháng sinh thuộc nhóm carbapenem xem kháng sinh có phổ tác dụng rộng tác dụng điều trị mạnh[8]. Trên giới có nhiều nghiên cứu sinh khả dụng, dược lâm sàng, dược động học chế phẩm imipenem. Đặc biệt người ta dựa vào nồng độ imipenem huyết tương bệnh nhân để điều chỉnh liều cho phù hợp với cá thể. Trong Việt Nam imipenem đưa vào sử dụng vãn hạn chế chưa đạt hiệu mong muốn. Nguyên nhân phần chưa điều chỉnh liều thích hợp với cá thể. Một số tài liệu nước BP 2001, USP 29 có chuyên luận định lượng imipenem chế phẩm. Trong thực tế, áp dụng phương pháp để định lương imipenem huyết tương pic imipenem khó tách khỏi tạp chất khác huyết tương. Xuất phát từ thực tế tiến hành thực khóa luận tốt nghiệp “Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng imipenem huyết tương HPLC ” với mục tiêu sau: 4- Xây dựng phương pháp địmh lượng imipenem huyết tương + Úng dụng phương pháp để định lượng imipenem huyết tương bệnh nhân lọc máu thận, điều trị Khoa điều trị tích cực bệnh viện Bạch Mai. PHẦN l:T ổ N G QUAN 1.1. Đại cương imipenem : 1.1.1. Đặc điểm hoá lý imipenem : * Cấu trúc hoá học imipenem: [6] , [8], [17]. - Công thức cấu tạo imipenem : OH [5R-[5a,6a(R*)]]-6-(l-Huydroxyethyl)[(iminomethyl)amino]ethyl]thio]-70X 0-1 -azabicyclo-[3.2.0]hept-2-ene-2-carboxylic acid monohydrate. Hình 1.1: Công thức cấu tạo Imipenem - Công thức phân tử : C | H | N S.H2 - Phân tử lượng :317,36 • Tính chất hoá lý: Bột tinh thể trắng tan nước ( l%o) methanol(2%o). Thực tế không tan ethanol. 1.1.2. Co chê tác dụng dược động học imipenem . 1.1.2.1. Co chê tác dụng.[8]. Imipenem kháng sinh có phổ rộng thuộc nhóm carbapenem •Imipenem có chế tác dụng giống với kháng sinh nhóm beta-lactam. Nó acyl hóa D-Analin-transpeptidase (enzym vận chuyển peptid), làm enzym tham gia tạo thành liên kết chéo peptid để tạo thàng cầu peptid (peptidoglycan) cần thiết cho vững cho thành tế bào vi khuẩn.Sự hình thành màng tế bào bị giám đoạn, vi khuẩn tồn phát triển.Các enzym gọi protein gắn penicilin (P.B.P). 1.1.2.2. Tác dụng dược lý. [1]. Về lâm sàng imipenem chứng minh có tác dụng với phần lớn vi khẩn Gram (+), Gram (-), vi khuẩn ưa khí kị khí. Thông thường Imipenem sử dụng phối hợp với cilastatin, chất ức chế phân huỷ imipenem enzym dehdropeptidase có ống thận tăng cường thu hồi thuốc này. Cilastatin tác dụng beta-lactamase. 1.1.2.3. Dược động học .[1], [2], [6]. Hấp thu Imipenem không hấp thu qua đường tiêu hoá, dùng tiêm tĩnh mạch tiêm bắp. Khi tiêm truyền tĩnh mạch 500 mg imipenem 30 phút cho người trẻ người trung niên, đạt đỉnh nồng độ huyết 30-40 mg/lít. Nồng độ lớn MIC 90 phần lớn vi khuẩn. Phân bô Imipenem khuyếch tán tốt vào nhiều mô thể, vào nước bọt, đờm, mô màng phổi, dịch khớp, dịch não tuỷ mô xương. Vì đạt nồng độ tốt dịch não tuỷ có tác dụng tốt chống liên cầu khuẩn beta nhóm B Li.st.eria nên imipenem có tác dụng tốt viêm màng não nhiễm khuẩn trẻ sơ sinh. Chuyển hoá Imipenem chuyển hoá chủ yếu qua thận. Thải trừ Imipenem thải trừ qua màng lọc cầu thận tiết ống thận -T|/2 khoảng giờ. Nhưng kéo dài trường hợp suy giảm cho chức thận. Người cao tuổi ( 70 tuổi ) thường bị giảm chức thận, nên dùng liều 50% liều bình thường. 1.1.3. Chỉ định .[1], [2], [6]. *Loại thuốc tiêm bắp - Bệnh đường hô hấp (viêm phế quản kịch p h t, viêm phổi) - Bệnh nội tâm(viêm ruột thừa hoại thư hay bị thủng ,viêm ruột thừa kèm theo màng bụng ) - Bệnh da cấu trúc da ( apxe,viêm tế bào ,loét da nhiễm khuẩn vết thương tụ cầu vàng ) - Bệnh phụ khoa (viêm nội tử cung ) *Loại thuốc tiêm tĩnh mạch (không dùng điều trị viêm màng não) - Bệnh đường hô hấp (tụ cầu vàng , E .co li) - Bệnh đường tiểu tiện (biến chứng hay không ) E.coli tụ cầu vàng - Bệnh nội tâm (tụ cầu vàng .) - Bệnh phụ khoa (tụ cầu vàng .) - Bệnh nhiễm trùng huyết (tụ cầu vàng .) - Bệnh xương khớp (tụ cầu vàng .) - Bệnh da cấu trúc da (tụ cầu vàng .) - Bệnh màng tim ( tụ cầu vàng sản sinh penicillinase .) 1.1.4 Chống định.[l], [2]. Qúa mẫn với imipenem thành phần khác. 1.1.5 Liều lượng, cách dùng.[l], [2], [6], [8]. 1.1.5.1. Liều lượng. *Người lớn • Tiêm truyền tĩnh mạch - Nhiễm khuẩn từ nhẹ đến vừa: 250 - 500 mg, - lần (1- g ngày ). - Nhiễm khuẩn nặng với vi khuẩn nhạy cảm mức độ vừa ; lg - lần . Liều tối đa hàng ngày 4g 50 mg/kg thể trọng. Tiêm truyền liều 250 - 500 mg 20 - 30 phút; tiêm truyền liều lg Bảng.2.5: Xác định độ phương pháp STT Tỷ lệ diện tích pic Imipenem huyết tương pha động l|Lig/ml HT Pha động 5|0,g/ml HT Pha động 10ụ.g/ml HT Pha động 146735 144243 730876 726879 1336214 1302342 145890 145354 741109 729974 1396642 1258532 147265 146365 730987 731008 1386211 1334573 149345 141832 729749 723674 1386515 1357235 147528 145237 729756 721812 1426383 1256332 x tb 147352,6 144606,2 732495,4 726669,4 1386413 1301802,8 s 1277,57 1723,3 4851.25 3948,2 45945,7 40216,5 RSD% 0,87% 1,20% 0,66% 0,54% 3,31% 3.08% % Tìm 98,,1% 99,2% 94-,1% lại *Nhận xét: Tại nồng độ l| .g/ml có độ 98.1%; Nồng độ 5|ng/ml có độ 99.2%; Nồng độ 10 I^g/ml có độ 94,1%. Điều chứng tỏ phương pháp có độ tốt áp dụng thực nghiệm để xác định nồng độ imipenem huyết tương. 26 2.2.2.3 Khảo sát độ xác phương pháp Trong đánh giá độ xác phương pháp chọn tiêu đánh giá độ lặp lại diện tích pic thời gian lưu imipenem huyết tương. Chuẩn bị mẫu thử huyết tương trắng người có chứa imipenem chuẩn nồng độ l,0|Lig/ml 10 |0 .g/ml. Tiến hành xử lý mẫu theo sơ đồ hình 2.1 sắc ký theo điều kiện xác định. Khảo sát độ lặp lại diện tích pic thời gian lưu cách xử lý mẫu nồng độ trên. Kết trình bày bảng 2.6. Bảng 2.6: Kết xác định độ xác phương pháp thể qua lặp lại diện tích pic Mẫu Diện tích pic Kết thống kê Diện tích pic mẫu có Của mẫu có nồng độ nồng độ l,0|ig/m l 10ng/ml 148768 147234 144435 146375 149008 stb 147164 s = 1878,9 1420932 Kết thống kê s =42884,4 1335742 RSD% = 1,27% 1363632 RSD% = 3,14% 1315365 sx=840,2 1395323 s x=19 , 1366198,8 e% = 1,58% 27 - 3,89% Bảng 2.7. Kết xác định độ xác phương pháp thể qua lặp lại thời gian lưu. Mẫu Thời gian lưu Kết qủa thống kê Thời gian lưu (phút) (phút) mẫu có nồng mẫu có nồng độ l,0|dg/ml độ 10|j,g/ml Kết qủa thống kê 4,138 =3,26 4,237 —1,4% 4.005 s x =48,8 4,321 sx= 4,257 s =10,9 4,325 s = 4,8 4,163 RSD% =2,63% 4,185 RSD% =1,13% 4,206 x tb= 4,154 4,275 x,b= 4,269 21,0 *Nhận xét: Kết cho thấy :Tại nồng độ l,0|j,g/ml diện tích pic có RSD% = 1,27, thời gian lưu có RSD% = 2,63;Tại nồng độ 10|LXg/ml diện tích pic có RSD% = 3,14%, thời gian lưu có RSD% = 1,4%. Điều chứng tỏ phương pháp sắc ký có độ lặp lại cao. 2.2.2.4 Giới hạn định lượng. Chuẩn bị mẫu huyết tương trắng người thêm Imipenem chuẩn có nồng độ thấp dần để mẫu thử có nồng độ 0,01;0,02;0,04 |J,g/ml. Mỗi nồng độ làm mẫu. x lý mẫu theo hình 2.1 tiến hành chạy sắc ký theo điều kiện khảo sát.Kết trình bày bảng 2.8 28 Bảng 2.8: Xác dịnh giới hạn định lượng củaimipenem Mẫu Diện tích pic thu ứng vơí nồng độ khảo sát 0,01 ỊL-ig/ml 0,02ụ.g/ml 0,04|ug/ml 1253 3765 7342 1974 3365 7598 1462 2998 7098 xtb s 1563 3376 7346 370,96 383,5 315,88 RSD% 23,73% 11,36% 4,43% *Nhận xét: Qua kết phân tích cho thấy với nồng độ 0.01|ag/ml RSD % = 23,73% giá trị lớn 20%.Trong nồng độ 0,02|ag/ml RSD% = 11,36% nhỏ 20%. Như giới hạn định lượng phương pháp : 0,02|ig/ml.Với giới hạn định lượng hoàn toàn áp dụng để định lượng imipenem huyết tương bệnh nhân. 2.2.2.5 Tính đặc hiệu phương pháp Để khảo sát tính đặc hiệu phương pháp tiến hành sau: - Mẫu : 1,0 ml huyết tương + 1,0ml MES sau xử lý mẫu hình 2.1, chạy sắc ký theo điều kiện khảo sát. - Mãu 2: Hút 10jul Imipenem chuẩn nồng độ 20jug/10)Lil vào ống teflon chứa 1,0ml huyết tương + 1,0 ml MES sau tiếp tục xử lý theo sơ đồ hình 2.1 để chạy sắc ký. Kết thu sau: 29 1500 H h 1500 1000 - 1000 500 - ■500 Hînh 2. 5: Mâu Minutes Hînh .6 : Mâu 30 *Nhận xét: Sắc ký đồ hình 2.5 (huyết tương imipenem) cho thấy thời gian từ phút phút pic.Trong thời diểm 4,208 phút mẫu có imipenem, xuất pic rõ ràng cân đối. Điều chứng tỏ phương pháp xây dựng có tính đặc hiệu cho phân tích Imipenem huyết tương . * Kết luận Qua trình thẩm định phương pháp nhận thấy phương pháp có độ cao: + Nồng độ l|ig/m l có độ tìm lại: 98,1%. + Nồng độ 5,0|ig/ml có độ tìm lại: 99,2%. + Nồng độ 10,0|j.g/ml có độ tìm lại: 94,1%. Độ xác cao: + Nồng độ l|ig/m l có RSD% = 1,27%. + Nồng độ 10|Lig/ml có RSD% = 3,14%. Tính đặc hiệu tốt, khoảng nồng độ tuyến tính rộng (0.1 - 20|Lig/ml), giới hạn định lượng cao 0,02|ig/ml. Như phương pháp xây dựng ứng dụng để định lượng imipenem huyết tương người. 2.2.3 ứng dụng chương trình sắc ký xây dựng để định lượng imipenem huyết tương bệnh nhân sau tiêm truyền Tienam 500mg. Lấy máu bệnh nhân có truyền Tienam500mg bệnh viện Bạch Mai tiến hành xử lý mẫu theo sơ đồ hình 2.2 tiến hành sắc ký theo điều kiện chọn. Qúa trình lấy máu sau: Bệnh nhân X điều trị Tienam500mg. Bệnh nhân định dùng thước vào buổi sáng vào khoảng 6h. Chúng tiến hành lấy mẫu thời điểm: Ogiờ; 1giờ; 4giờ; 6giờ 8giờ (tính từ thời điểm sáng. 31 Dưới pic Imipenem thu mẫu thời điểm giờ: Minutes Hình 2.7. Sắc ký đồ imipenem huyết tương bệnh nhân thời điêm Minutes Hình 2.8: sắc kỷ đồ imipenem huyết tương bệnh nhân thời điểm 32 Bảng 2.9: Kết định lượg Imipenem huỵêí tươnạ bệnh nhân Mẫu phân tích tích lấy thời điểm l Mẫu phân tích tích lấy thời điểm Diên tích pic Nồng độ Imipenem Diên tích pic Nồng độ Imipenem 766935 5,52 |Lig/ml 700198 5,02|Lig/ml 743722 5,34 |ig/ml 729327 5,24ịig/ml 779275 5,60 ỊUg/ml 678309 4,86jug/ml 778275 5,60 |ug/ml 688509 4,93|ig/ml 759275 5,46 |dg/ml 718314 5,15|ig/ml Kết thống kê RSD% = 2,00% Hàm lượng trung x tb = 765496,4 bình: 8% = 4.01% bình: 5,504|ig/ml s x = 10155 5,040|ig/ml s = 15326,9 Hàm lượng trung sx = 6854 s - 22708 8% = 2,48% x tb= 702931.4 RSD% = 3,23% *Nhận xét: sắc ký đồ định lượng imipenem huyết tương người bệnh cân xứng, rõ ràng, tách hoàn toàn khỏi pic khác. Có thể xác định xác nồng độ imipenem thời điểm lấy mẫu, từ điều chỉnh liều cho phù hợp với bệnh nhân, đặc biệt bệnh nhân lọc máu thận. 2.3 BÀN LUẬN Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) phương pháp phân tích đại ứng dụng phổ biến ngành dược. 33 Để xây dựng phương pháp định lượng imipenem huyết tương HPLC, tiến hành khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký tiến hành thẩm địmh phương pháp xây dựng. Phương pháp mà khảo sát có ưu điểm bật sau: - Phương pháp có độ cao:Với nồng độ lng/m l có độ tìm lại 98.1%; Với nồng độ 5|LLg/ml có độ tìm lại 99.2%; Nồng độ 10 |Lig/ml có độ tìm lại 94,1%. - Phương pháp có khoảng tuyến tính rộng từ 0,l|Lig/m l - 20|Lig/ml, tương quan chặt chẽ r = 0,9997 . Điều cho phép định lượng imipenem huyết tương bệnh nhân, cá thể có trình phân b ố , chuyển hóa thải trừ khác nhau. - Chương trình sắc ký lựa chọn để phân tích imipenem huyết tương đơn giản, hóa chất, dụng cụ thông dụng. Có thể áp dụng bệnh viện trang bị hệ thống HPLC. Qúa trình thực nghiệm cho thấy imipenem chất dễ bị phân hủy đó, đòi hỏi huyết tương người bệnh phải bảo quản tiêu chuẩn thêm chất bảo quản MES. Đối với bệnh nhân khoa điều trị tích cực , thông thường dùng nhiều loại thuốc trình định lượng phải xem xét kỹ bệnh án , tránh sai số định lượng imipenem thuốc khác. 34 PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUÂT Kết luận Qua thời gian thực khóa luận tốt nghiệp thu số kết sau: * Vê mặt nhận thức : - Biết cách tiến hành nghiên cứu hoàn thành đề tài , biết cách tiến hành tra cứu tìm hiểu tài liệu để tham khảo phục vụ cho trình thực nghiên cứu khoa học. - Hiểu sở lý thuyết phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) biết cách vận hành máy thiết bị liên quan. * kết thực nghiệm: - Xây dựng quy trình kỹ thuật định lượng imipenem huyết tương với điều kiện cụ thể sau: + Xử lý mẫu: Xây dựng quy trình chiết xuất imipenem từ huyết tương . + Chương trình HPLC định lượng imipenem: • Cột: Novapak c,g (4,6mm X 150mm), đưòng kính hạt 5|0,m • Detector u v , bước sóng 298nm • Pha động: Methanol: Acid boric 0,2 M (5 : 95), pH 7,2.điều chỉnh NaOH 0,1M. • Lưu lượng dòng:0,8 ml/phút • Thể tích tiêm:50 |Lil • Nhiệt độ phòng. Với điều kiện sắc ký trên, pic imipenem huyết tương tách hoàn toàn khỏi chất khác, pic cân xứng thời gian lưu hợp lý tr=4,208 phút. Phương pháp thẩm định cho thấy độ lặp lại, độ cao. Khoảng tuyến tính rộng, hệ số tương quan diện tích píc nồng độ chặt chẽ (r = 0,9997). Kỹ thuật tiến hành đơn giản dễ dàng áp dụng cho sỏ' 35 có trang bị HPLC. ứng dụng chương trình sắc ký để định lượng imipenem huyết tương bệnh nhân cho kết xác. Bác sỹ dựa vào kết định lượng để điều chỉnh liều hợp lý cho bệnh nhân. 2. Đề xuất - Do thời gian làm khóa luận ngắn chưa tiến hành khảo sát độ ổn định imipenem huyết tương dó mong muốn vấn đề tiếp tục nghiên cứu. - V ẽ đường cong dược động học imipenem huyết tương bệnh nhân lọc máu thận. - Xây dựng chương trình sắc ký để định lượng đồng thời hai thành phần: Imipenem Cilastatin huyết tương. 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO * TIẾNG VIỆT 1. Bộ y tế (2002), Dược thư quốc gia Việt Nam, Hội đồng dược điểm Việt Nam, trang 559 - 561. 2. Bộ y tê (2002), Dược điểm Việt Nam IIItậ p II, Hội đồng dược điểm Việt Nam, trang 1774. 3. Đỗ Lan Phương: “ Xây dựng phương pháp định lượng A m oxicilin K aliclavulanat huyết tương Khóa luận tốt nghiệp đại học 2000 -2 0 . 4. Phan Thị Thanh Hà: “Xây dựng quy trình kỹ thuật định lượng Carbamazepin huyết tương người p hục vụ cá th ể hóa điều trị bệnh động kinh Luận văn thạc sỹ. 5. PGS.TS Trần Tử An cộng (2006), Đánh giá tương đương sinh học ch ế phẩm hai thành phần Am oxicilỉn A cid clavunanỉc,Trường Đại Học Dược Hà Nội, trang -4 . 6. Mai Tất Tố, Vũ Thị Trâm, Đào Thị Vui, Lê Phan Tuấn(2004), Dược lý 2,Trường Đại Học Dược Hà Nội, trang 112-126,trang 158 - 159. 7. Trần Tử An, Thái Nguyễn Hồng Thu, Hóa Phân Tích 2, Trường Đại Học Dược Hà Nội, trang 55 - 98. 8. Trần Đức Hậu, Thái Duy Thìn, Nguyễn Đình Hiển, Nguyễn Văn Thục, (2004), Hoá Dược 2, Trường Đại Học Dược Hà Nội, trang 193-195. 9. Trần Tử An, Trần Tích, Nguyễn Văn Tuyền, Chu Thị Lộc, Nguyễn Thị Kiều Anh (2004), Kiểm Nghiêm Thuốc, Trường Đại Học Dược Hà Nội, trang 72 - 98. 10. PGS.TS.Hoàng Thị Kim Huyền (2006), Dược Lâm Sàng, Nhà Xuất Bản Y Học, trang 32 -35;42- 45; 66-72. *TIENG ANH 11. Bristish Phamacopoeia 2005 vol 7, pp 1030 - 1031. 12. Daud Harvey (2000), Modern Analytical chemistry, pp 578 - 589. 13. Douslas A.Skoog, James J .Leary, (1992), Principles o f intrumental analysis fo u rth edition, pp 579 - 604. 14. Douglas N.Fish, Isaac Teitelbaum, and Edward Abraham : “Pharmacokinetics and Pharmacodynamiccs of imipenem during continuous R enal Replacement Therapy in Critically I I I Patients ” ; Antimicrobial Agents and chemotherapy, June 2005, p2421 - 2428. 15. Lunn George and Chmuff Norman (1998), H PLC M ethod fo r pharmaceutical analysis, A Wiley_Interscience Publication, John Wley Sows, Inc, pp317 - 329. 16. Tegeder, F.Bremer and G.Geisslinger : “Pharmacokinetics of Imipenem-Cilastatin in Critically I I I Patients Undergoing Continuous Venovennous H e m o f i l t r a t i o n Antimicrobial Agents and chemotherapy, Dec 1997, p 2640 - 2645. 17. The United states pharmacopoeia(2005),The natonal formulacy, official from January 1; United states phamacopoiea convention, INC, pp 1110 — 1111 . 18. The M erck Index (1996), An encyclopedia of chemicals, Drugs, and biologicals, pp 381; 845. PHỤ LỤ C Sắc ký đồ khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính huyết tương Minutes PL1: Sắc ký đồ mẫu trắng thêm Imipenem chuẩn nồng độ 0,l|ag/ml l,0ml Minutes PL2: Sắc ký đồ mẫu trắng thêm imipenem chuẩn nồng độ l,0|Lig/ml l,0m l Minutes PL3 : Sắc ký đồ mẫu trắng thêm imipenem chuẩn nồng độ 5,0|Lig/ml MES PL4: Sắc ký đồ mẫu trắng thêm imipenem chuẩn nồng độ 10|Lig/ml Minutes PL5 : Sắc ký đồ mẫu trắng thêm Imipenem chuẩn nồng độ 20|ig/ml [...]... phần chuẩn bị mẫu huyết tương trắng để xác định độ tìm lại trong huyết tương người Tiến hành sắc ký theo điều kiên đã khảo s á t Độ tìm lại của imipenem trong mẫu thử huyết tương người là phần trăm giá trị đáp ứng của imipenem trong huyết tương và trong pha động 25 Bảng.2.5: Xác định độ đúng của phương pháp STT Tỷ lệ diện tích pic Imipenem trong huyết tương và trong pha động l|Lig/ml HT Pha động 5|0,g/ml... 10|Lig/ml có RSD% = 3,14% Tính đặc hiệu tốt, khoảng nồng độ tuyến tính rộng (0.1 - 20|Lig/ml), giới hạn định lượng cao 0,02|ig/ml Như vậy phương pháp đã xây dựng có thể ứng dụng để định lượng imipenem trong huyết tương người 2.2.3 ứng dụng chương trình sắc ký đã xây dựng để định lượng imipenem trong huyết tương bệnh nhân sau khi tiêm truyền Tienam 500mg Lấy máu của bệnh nhân có truyền Tienam500mg ở bệnh... 94,1% Điều đó chứng tỏ phương pháp có độ đúng tốt có thể áp dụng thực nghiệm để xác định nồng độ imipenem trong huyết tương 26 2.2.2.3 Khảo sát độ chính xác của phương pháp Trong đánh giá độ chính xác của phương pháp chúng tôi chọn chỉ tiêu đánh giá độ lặp lại của diện tích pic và thời gian lưu của imipenem trong huyết tương Chuẩn bị mẫu thử là huyết tương trắng của người có chứa imipenem chuẩn ở các... trị này lớn hơn 20% .Trong khi đó tại nồng độ 0,02|ag/ml RSD% = 11,36% nhỏ hơn 20% Như vậy giới hạn định lượng của phương pháp là : 0,02|ig/ml.Với giới hạn định lượng này hoàn toàn có thể áp dụng để định lượng imipenem trong huyết tương bệnh nhân 2.2.2.5 Tính đặc hiệu của phương pháp Để khảo sát tính đặc hiệu của phương pháp chúng tôi đã tiến hành như sau: - Mẫu 1 : 1,0 ml huyết tương + 1,0ml MES sau... trình sắc ký • Giới hạn định lượng 2.1.2.2 Đối tượng nghiên cứu Huyết tương của bệnh nhân lọc máu ngoài thận, sử dụng imipenem, đang điều trị tại Khoa điều trị tích cực ở bệnh viện Bạch Mai 2.1.2.3 Phương pháp nghiên cứu a Định lương Imipenem trong huyết tương Sử dụng phương pháp HPLC b Phương pháp xử lý mẫu Imipenem dễ bị thủy phân trong dung dịch hòa tan do đó cần thêm chất ổn định MES với nồng độ... quan trọng trong định lượng imipenem trong huyết tương người bệnh 22.2.2 Đánh giá độ đúng của phương pháp Chuẩn bị mẫu thử là huyết tương trắng của người có chứa imipenem chuẩn ở các nồng độ 1; 5; 10 (n-g/ml) Tiến hành xử lý mẫu theo sơ đồ hình 2.1 và sắc ký theo điều kiện đã xác định Chuẩn bị mẫu chuẩn là các dung dịch imipenem chuẩn trong pha động ở các nồng độ như phần chuẩn bị mẫu huyết tương trắng... V số tương đối ta X n S L X 100 • (% ) X Trong đó a là hệ số tin cậy , Xị là kết quả xác định lần thứ i; n là số lần xác đinh 19 2.2 KẾT QUẢ THựC NGHIỆM 2.2.1 Khảo sát và xây dựng điều kiện sắc ký để định lượng imỉpenem trong huyết tương - Pha dãy dung dịch imipenem chuẩn Cân chính xác khoảng 500g Imipenem chuẩn pha thành 25ml trong bình định mức bằng nước cất siêu sạch ta sẽ được dung dịch Imipenem. .. gian từ 4 phút cho đến 5 phút không có pic .Trong khi đó tại thời diểm 4,208 phút của mẫu có imipenem, xuất hiện pic rõ ràng cân đối Điều đó chứng tỏ phương pháp được xây dựng trên có tính đặc hiệu cho phân tích Imipenem trong huyết tương * Kết luận Qua quá trình thẩm định phương pháp chúng tôi nhận thấy phương pháp có độ đúng cao: + Nồng độ l|ig/m l có độ tìm lại: 98,1% + Nồng độ 5,0|ig/ml có độ tìm... = 21992 Sx = 16914,4 Phương trình hồi quy: y =134714 X + 23888 Hệ số tương quan: r = 0,9997 24 Hình2 4: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộcdiện tích pic và nồng độ imipenem trong huyết tương *Nhận xét: Như vậy, nồng độ imipenem và diện tích pic có tương quan rất chặt chẽ (r=0,9997) trong khoảng nồng độ khảo sát 0,1 |Lig/ml đến 20|uig/ml Điều kiện sắc ký đã xây dựng đảm bảo định lượng imipenem có khoảng dao... (Imipenem/ cilastatin) Lọ bột pha tiêm bắp (Imipenem/ cilastatin) Lọ bột pha tiêm tĩnh mạch (Imipenem/ cilastatin) Lọ bột pha tiêm tĩnh mạch (Imipenem/ cilastatin) 8 1.1.8 Một sô phương pháp định lượng Imipenem bằng HPLC [11], [14], [15], [17], [16] Bảng 1.2 Những phương pháp định lượng Imipenem bằng HPLC STT Tài liệu Dung dịch hoà tan 1 BP2001 [11] Detector Thành phần pha động trích dãn Cột sắc ký uv Acetonnitril - Acetonnitril . bằng HPLC ” với các mục tiêu sau: 4- Xây dựng phương pháp địmh lượng imipenem trong huyết tương + Úng dụng phương pháp để định lượng imipenem trong huyết tương bệnh nhân lọc máu ngoài thận,. luận định lượng imipenem trong chế phẩm. Trong thực tế, nếu áp dụng những phương pháp này để định lương imipenem trong huyết tương thì pic của imipenem rất khó tách ra khỏi các tạp chất khác trong. khác trong huyết tương. 1 Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi đã tiến hành thực hiện khóa luận tốt nghiệp “Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng imipenem trong huyết tương bằng HPLC ”