TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN ====== KHƢƠNG THỊ BÍCH ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN TẬP ĐOÀN GIỐNG LÚA ƢU TÚ (NSC46 – NSC68) BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Di truyền phân tử Ngƣời hƣớng dẫn khoa học TS. KHUẤT HỮU TRUNG HÀ NỘI - 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu thực dƣới hƣớng dẫn TS. Khuất Hữu Trung, viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam. Nội dung nghiên cứu, trích dẫn có nguồn gốc rõ ràng, số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực, không chép từ tài liệu nào, toàn công trình nghiên cứu cá nhân qua trình tìm tòi, học tập nghiên cứu khoa học. Tôi xin chịu trách nhiệm đề tài nghiên cứu mình. Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Sinh viên Khƣơng Thị Bích LỜI CẢM ƠN Tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn, cảm kích sâu sắc đến TS. Khuất Hữu Trung dành nhiều thời gian, tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ động viên suốt trình học tập nghiên cứu đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới đội ngũ cán Bộ môn Kỹ thuật di truyền - viện Di truyền Nông nghiệp nhiệt tình bảo, hƣớng dẫn kỹ thuật, cung cấp cho thông tin tài liệu bổ ích giúp hoàn thành luận văn này. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới quý thầy giáo, cô giáo khoa Sinh – KTNN Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội tận tình giảng dạy, tâm huyết, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm cho suốt năm học qua. Lời cuối, xin bày tỏ lòng biết ơn tới ngƣời thân gia đình bên cạnh tôi, giúp đỡ, động viên tôi; cảm ơn ngƣời bạn giúp đỡ suốt trình học tập nghiên cứu để hoàn thành khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Sinh viên Khƣơng Thị Bích DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AFLP: Amplified fragment length polymorphism CTAB: Cetyl trimetyl amonium bromit DNA: Deoxyribonucleic acid dNTP: Dideoxyribo nucleozit triphosphat FAO: The World FoodOrganization IRRI: International Research RiceInstitute PCR: Polymerase chain reaction PIC: Polymorphic Information Content QTL: Quantitative trait loci RAPD: Random amplyfied polymorphic DNA RFLP: Restriction fragment length polymorphism RNA: Ribonucleic acid SSR: Simple sequence repeats TAE: Tris-acetat-acid EDTA TE: Tris EDTA DANH MỤC BẢNG BIỂU& HÌNH ẢNH Danh mục bảng Bảng 1.1: Sản lƣợng gạo xuất dự trữ gạo số nƣớc giới . Bảng 1.2: Diện tích trồng lúa tổng sản lƣợng lúa từ 1990-2012 10 Bảng 2.1. Danh sách 23 mẫu giống lúa ƣu tú nghiên cứu 18 Bảng 2.2. Thông tin cặp mồi nghiên cứu . 19 Bảng 2.3: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR sử dụng mồi SSR . 21 Bảng 3.1: Số alen thể hệ số PIC 26 cặp mồi 26 Bảng 3.2: Tỉ lệ khuyết số liệu (M%) tỉ lệ dị hợp tử (H%) 23 giống lúa nghiên cứu . 27 Bảng 3.3: Hệ số tƣơng đồng di truyền 23 mẫu giống lúa nghiên cứu 33 Danh mục hình Hình 3.1: Ảnh điện di DNA tổng số 23 mẫu giống lúa nghiên cứu . 24 Hình 3.2: Kết điện di sản phẩm SSR-PCR 23 mẫu giống lúa nghiên cứu với đoạn mồi RM21 (M: marker 20bp) . 29 Hình 3.3: Kết điện di sản phẩm SSR-PCR 23 mẫu giống lúa nghiên cứu với đoạn mồi RM224 (M: marker 20bp 29 Hình 3.4: Kết điện di sản phẩm SSR-PCR 23 mẫu giống lúa nghiên cứu với đoạn mồi RM515 (M: marker 20bp) . 30 Hình 3.5: Kết điện di sản phẩm SSR-PCR 23 mẫu giống lúa nghiên cứu với đoạn mồi RM1233 (M: marker 20bp) . 31 Hình 3.6: Kết điện di sản phẩm SSR-PCR 23 mẫu giống lúa nghiên cứu với đoạn mồi RM7102 (M: marker 20bp) . 32 Hình 3.7: Sơ đồ hình mối quan hệ di truyền mẫu giống lúa nghiên cứu . 34 MỤC LỤC MỞ ĐẦU . 1. Lí chọn đề tài 2. Mục đích nghiên cứu . 3. Nội dung nghiên cứu . 4. Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn 4.1. Ý nghĩa khoa học . 4.2. Ý nghĩa thực tiễn CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Nguồn gốc, phân loại lúa . 1.1.1. Nguồn gốc lúa . 1.1.2. Phân loại lúa . 1.2. Giá trị kinh tế lúa Việt Nam . 1.3. Tình hình sản xuất lúa giới Việt Nam 1.3.1. Tình hình sản xuất lúa giới 1.3.2. Tình hình sản xuất lúa Việt Nam . 1.4. Nghiên cứu đa dạng di truyền thông qua thị phân tử SSR ( Simple Sequence Repeats) . 10 1.5. Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền lúa giới Việt Nam12 1.5.1. Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền lúa giới . 12 1.5.2. Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền lúa Việt Nam . 14 CHƢƠNG II. VẬT LIỆU, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 18 2.1. Vật liệunghiên cứu . 18 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 20 2.2.1. Tách chiết DNA tổng số 20 2.2.2. Phản ứng PCR đánh giá đa dạng di truyền thị SSR . 21 2.2.3. Chu trình PCR . 21 2.2.4. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR 22 2.2.5. Phân tích kết xử lí số liệu 22 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU . 24 3.1. Kết tách chiết DNA . 24 3.2. Kết sử dụng thị SSR phân tích đa dạng di truyền 25 3.2.1. Hệ số PIC, số alen tổng số băng DNA thể cặp mồi . 25 3.2.2. Tỉ lệ khuyết số liệu (M) tỉ lệ di hợp tử (H) giống lúa ƣu tú . 26 3.2.3. Kết phân tích đa dạng di truyền mối quan hệ di truyền 23 giống lúa ƣu tú . 28 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 37 MỞ ĐẦU 1. Lí chọn đề tài Lúa gạo lƣơng thực lâu đời có tầm quan trọng đặc biệt nửa dân số giới. Lúa gạo đƣợc trồng nhiều nơi giới, có diện tích gieo trồng đứng thứ hai sau lúa mì. Tổng sản lƣợng lúa đứng thứ ba sau lúa mì ngô. Hiện nay, diện tích trồng lúa chiếm 1/10 diện tích đất trồng thế giới phân bố chủ yếu khu vực Châu Á (chiếm 13 nƣớc tổng số 15 nƣớc trồng lúa với diện tích triệu ha). Ở Việt Nam, với vị trí địa lí điều kiện khí hậu thuận lợi nƣớc ta nƣớc có truyền thống lúa nƣớc cổ xƣa giới. Dân số nƣớc ta có 80 triệu ngƣời 100% ngƣời Việt sử dụng lúa gạo làm lƣơng thực chính. Nông nghiệp trồng lúa nƣớc vừa đảm bảo an ninh lƣơng thực quốc gia, vừa sở kinh tế sống đất nƣớc. Vì vậy, lúa có vai trò vô quan trọng kinh tế quốc dân. Với lịch sử lâu đời trồng lúa, nƣớc ta có nguồn gen lúa tự nhiên vô phong phú đa dạng từ loài lúa trồng lúa hoang dại (Trần Thị Hòa, Triest, 1999)[3]. Để khai thác sử dụng cách có hiệu nguồn gen này, chọn giống cần phải có hiểu biết thiết yếu mức độ đa dạng di truyền giống. Sự phát triển thành tựu đạt đƣợc sinh học phân tử cung cấp công cụ thích hợp cho nghiên cứu đa dạng di truyền, cho phép ta xác định khoảng cách di truyền cách nhanh chóng xác. Trong số thị thị SSR đƣợc đánh giá có nhiều ƣu điểm so với thị khác, đơn giản phân tích di truyền, có khả cho đa hình cao, có chất đồng trội, có độ xác cao, di truyền theo quy luật Menden. Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa có ý nghĩa to lớn việc đánh giá, phân loại sử dụng nguồn gen chọn tạo giống lúa. Do vậy, xuất phát từ hiểu biết đa dạng di truyền, để khai thác đƣợc nguồn gen quý phục vụ cho chọn giống tiến hành thực nghiệm đề tài nghiên cứu: “Đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn giống lúa ưu tú (NSC46 – NSC68) thị phân tử SSR”. 2. Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu đa dạng di truyền giống lúa nghiên cứu,xác định alen đặc trƣng, alen để nhận dạng xác nguồn gen ƣu tú phục vụ cho nghiên cứu chọn lai tạo giống định hƣớng phát triển giống lúa suất cao, chất lƣợng tốt. Đánh giá đa dạng di truyền kết hợp với phân tích di truyền giống lúa chức gen, đặc tính sinh lý, sinh hóa, trao đổi chất…nhằm mục đích bảo tồn, trì nguồn gen quý, phục vụ cho chọn tạo giống ƣu tú có suất cao, chất lƣợng tốt, có khả chống chịu với điều kiện bất lợi môi trƣờng, sẵn sàng đối phó với biến đổi điều kiện khí hậu. 3. Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn giống lúa ƣu tú NSC46 – NSC68 thị phân tử SSR. - Thu mẫu lúa NSC - Xử lí mẫu, tách chiết DNA - Phản ứng PCR - Điện di sản phẩm PCR 4. Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn 4.1. Ý nghĩa khoa học Cung cấp thêm nhiều liệu, thông tin khoa học hữu ích cho công tác nghiên cứu phân tích đa dạng di truyền giống lúa ƣu tú. Hiểu biết đa dạng di truyền nguồn gen lúa tạo sở lý luận cho việc chọn lọc, phục tráng để nâng cao tiềm di truyền giống lúa việc chọn tạo giống mới. Phân tích đa dạng di truyền có ý nghĩa quan trọng việc xác định alen hiếm, alen đặc trƣng để nhận dạng xác nguồn gen ƣu tú phục vụ nghiên cứu lai tạo giống định hƣớng cho công tác thu thập bảo tồn đa dạng nguồn gen lúa mức phân tử. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn Nghiên cứu đa dạng di truyền thông qua thị phân tử góp phần nâng cao hiệu công tác bảo tồn chọn tạo giống lúa có phẩm chất tốt, suất cao, phù hợp với điều kiện khí hậu, môi trƣờng sống cấu sản xuất lúa vùng Việt Nam. CHƢƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Kết tách chiết DNA Tách chiết DNA công việc đóng vai trò quan trọng công nghệ DNA. Hiện có nhiều phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số mẫu thực vật. Mỗi đối tƣợng DNA đƣợc tách chiết có phƣơng pháp khác phù hợp với chúng. Trong nghiên cứu này, lựa chọn phƣơng pháp CTAB Obara Kako (1998) có bổ sung Natribisunfit PVP để tiến hành tách chiết DNA tổng số 23 mẫu lúa nghiên cứu. Kết tách chiết DNA tổng số 23 mẫu lúa đƣợc kiểm tra phƣơng pháp điện di gel agarose 1%. Hình 3.1: Ảnh điện di DNA tổng số 23 mẫu giống lúa nghiên cứu Qua kết điện di gel agarose 1% cho thấy băng DNA thu đƣợc mẫu lúa gọn đồng chứng tỏ chất lƣợng DNA mẫu tốt, không bị lẫn tạp chất. Mặt khác không thấy xuất vệt sáng RNA phía dƣới, điều chứng tỏ RNA đƣợc loại bỏ khỏi dịch chiết DNA. Kết điện di cho thấy DNA có nồng độ tƣơng đối cao, chất lƣợng tốt đủ tiêu chuẩn thực nghiên cứu tiếp theo. 24 3.2. Kết sử dụng thị SSR phân tích đa dạng di truyền Để nghiên cứu đa dạng di truyền dòng/giống lúa ƣu tú tiến hành sử dụng sản phẩm DNA tách chiết đƣợc làm khuôn cho phản ứng PCR lần lƣợt với 26 mồi nghiên cứu. Sản phẩm PCR mồi đƣợc điện di gel acrylamide (điện di đứng). 3.2.1. Hệ số PIC, số alen tổng số băng DNA thể cặp mồi Theo Smith (1997), hệ số PIC (Polymorphic Information Content) đƣợc coi thƣớc đo tính đa dạng di truyền alen locus SSR. Weir (1996) cho rằng, giá trị PIC đƣợc hiểu nhƣ đa dạng di truyền locus gen nghiên cứu. Kết phân tích tập đoàn dòng/giống lúa ƣu tú Công ty giống trồng Trung ƣơng kí hiệu NSC46 đến NSC68 đƣợc bảng 3.1 cho thấy: Giá trị PIC 26 locus nghiên cứu thay đổi từ 0,08 (ở cặp mồi xuất alen RM190 RM6308) đến 0,76 (ở cặp mồi xuất alen RM224). Hệ số PIC trung bình 26 cặp mồi nghiên cứu 0,45. Kết tƣơng tự số công trình nghiên cứu đƣợc công bố giới Việt Nam (Malik et al., 2010; Rajet al., 2006; Khuất Hữu Trung cs., 2010)[9]. Qua kết thu đƣợc (bảng 3.1) thấy với 26 cặp mồi SSR, tổng số alen thống kê đƣợc 26 cặp mồi SSR 74 loại alen, trung bình 2,85 alen/cặp mồi. Các mồi cho alen đa hình: - Số mồi thể alen: mồi (RM224, RM8213) - Số mồi thể alen: mồi (AP5926, RM21, RM19429, RM463, RM1223) - Số mồi thể alen: mồi (RM585, RM3726, RM6997, PTA248, RM6320, MP1-MP2) - Số mồi thể alen: 13 mồi (ARO1, RM13, RM190, RM208, RM212, RM6308, RM3134, RM6506, RM28561, RM463, RM527, RM7102, RM261. 25 Bảng 3.1: Số alen thể hệ số PIC 26 cặp mồi Tên cặp Số alen Tên cặp Số alen mồi thể mồi thể RM5926 16 RM6506 0,49 0,45 16 RM19429 0,52 0,29 17 RM28561 0,49 RM21 0,71 18 RM463 0,29 RM190 0,08 19 RM515 0,58 RM208 0,39 20 RM527 0,29 RM212 0,48 21 RM1223 0,59 RM224 0,76 22 RM7102 0,34 RM585 0,42 23 RM261 0,38 10 RM3726 0,47 24 PTA248 0,47 11 RM6308 0,08 25 RM6320 0,58 12 RM6997 0,48 26 MP1-2 0,66 13 RM8213 0,67 Tổng số 74 11,8 14 RM3134 0,23 Trung bình 2,85 0,45 STT PIC STT 0,72 ARO1 RM13 PIC 3.2.2. Tỉ lệ khuyết số liệu (M) tỉ lệ di hợp tử (H) giống lúa ưu tú Theo hƣớng dẫn AMBIONET- CIMMYT giá trị M% phải nhỏ 15% đảm bảo đƣợc độ tin cậy cho phép tiến hành bƣớc xử lý số liệu tiếp theo. Trƣớc đánh giá mức độ đa dạng di truyền 23 dòng lúa nghiên cứu, tiến hành tính tỷ lệ khuyết số liệu thí nghiệm dựa vào số mẫu giống không đƣợc khuếch đại mồi. Kết đƣợc trình bày bảng 3.2: 26 Bảng 3.2: Tỉ lệ khuyết số liệu (M%) tỉ lệ dị hợp tử (H%) 23 giống lúa nghiên cứu STT Tên Số mồi khuyết Tỉ lệ khuyết Số mồi xuất dòng số liệu NSC46 NSC47 3,85 NSC48 NSC49 3,85 NSC50 NSC51 3,85 NSC52 NSC53 NSC54 11,5 10 NSC55 11 NSC56 12 NSC57 13 NSC58 14 NSC59 15 NSC60 7,69 16 NSC61 17 NSC62 18 NSC63 15,4 19 NSC64 3,85 20 NSC65 21 NSC66 22 NSC67 3,85 23 NSC68 7,69 số liệu (M%) dị hợp tử 27 Tỉ lệ di hợp tử (H%) Tỷ lệ dị hợp tử (H) tỷ lệ số liệu khuyết (M) giống lúa ƣu tú nghiên cứu dựa kết phân tích với 26 cặp mồi SSR đƣợc trình bày (bảng 3.2) cho thấy: Có hai giống (NSC49, NSC51) khuyết tổng số 26 cặp mồi nghiên cứu với tỷ lệ 3,85%. Các giống lại không bị khuyết số liệu. Tỷ lệ khuyết số liệu trung bình 23 giống lúa thấp 0,33; giống có tỷ lệ khuyết số liệu lớn 15%. Nhƣ vậy, 23 giống lúa ƣu tú có ý nghĩa phân tích thống kê để đánh giá đa dạng di truyền. Tỷ lệ dị hợp tử (H) cao mẫu giống lúa NSC63 15,4%; tiếp đến mẫu giống lúa NSC54 có tỉ lệ dị hợp tử 11,5%; hai giống lúa NSC60 NSC68 có tỷ lệ dị hợp tử 7,69%; hai mẫu giống NSC49, NSC51 có tỷ lệ dị hợp tử 4%; ba giống lúa NSC47, NSC64 NSC67 có tỷ lệ dị hợp tử 3,85%. Các giống lại có tỷ lệ dị hợp 0% (đồng hợp 26 locus nghiên cứu). Từ kết nghiên cứu cho thấy: cần làm dòng/giống có tỉ lệ di hợp tử cao (NSC63, NSC60, NSC68, NSC49, NSC51, NSC54 NSC47, NSC64 NSC67) trƣớc khai thác, sử dụng 3.2.3. Kết phân tích đa dạng di truyền mối quan hệ di truyền 23 giống lúa ưu tú  Kết phân tích với mồi RM21 Kết điện di sản phẩm PCR với RM21 thu đƣợc loại băng. Trên tổng số 23 mẫu nghiên cứu cho thấy xuất băng DNA từ khoảng 130bp đến 180bp, có mẫu giống nghiên cứu xuất alen có tổng số 24 băng DNA. Mồi RM21 có mẫu giống dị hợp NSC54. 28 Hình 3.2: Kết điện di sản phẩm SSR-PCR 23 mẫu giống lúa nghiên cứu với đoạn mồi RM21 (M: marker 20bp)  Kết phân tích với mồi RM224 Kết điện di sản phẩm PCR với RM224 thu đƣợc loại băng. Trên tổng số 23 mẫu nghiên cứu cho thấy xuất băng DNA từ khoảng 125bp đến 165bp, có mẫu nghiên cứu xuất alen có tổng số 25 băng DNA. Mồi RM224 có mẫu giống có băng dị hợp NSC60 NSC63. Hình 3.3: Kết điện di sản phẩm SSR-PCR 23 mẫu giống lúa nghiên cứu với đoạn mồi RM224 (M: marker 20bp) 29  Kết phân tích với mồi RM515 Kết điện di sản phẩm PCR 23 mẫu giống nghiên cứu với cặp mồi RM515 thu đƣợc tổng số 24 băng DNA thuộc loại băng có kích thƣớc khác nhau. Các băng DNA dao động từ khoảng 200bp đến 250bp. Với locus RM515 mẫu giống NSC54 xuất alen (mẫu giống NSC54 có kiểu gen dị hợp locus này). Hình 3.4: Kết điện di sản phẩm SSR-PCR 23 mẫu giống lúa nghiên cứu với đoạn mồi RM515 (M: marker 20bp)  Kết phân tích với mồi RM1233 Kết điện di sản phẩm PCR với RM1233 thu đƣợc loại băng. Trên tổng số 23 mẫu giống lúa nghiên cứu cho thấy xuất băng DNA từ khoảng 160bp đến 200bp, mẫu giống nghiên cứu xuất alen thu đƣợc tổng 23 băng DNA, xuất dị hợp tử nhƣ khuyết số liệu. 30 Hình 3.5: Kết điện di sản phẩm SSR-PCR 23 mẫu giống lúa nghiên cứu với đoạn mồi RM1233 (M: marker 20bp)  Kết phân tích mồi RM7102 Kết điện di sản phẩm PCR 23 mẫu giống nghiên cứu với cặp mồi RM7102 thu đƣợc tổng số 25 băng DNA thuộc loại băng có kích thƣớc khác nhau. Các băng DNA dao động từ khoảng 180bp đến 200bp. Với locus RM7102 mẫu giống NSC51 NSC54 xuất alen (mẫu giống NSC51 NSC54 có kiểu gen dị hợp locus này). 31 Hình 3.6: Kết điện di sản phẩm SSR-PCR 23 mẫu giống lúa nghiên cứu với đoạn mồi RM7102 (M: marker 20bp) Số liệu thu đƣợc từ tiêu điện di sản phẩm PCR 26 cặp mồi SSR với 23 mẫu giống lúa nghiên cứu đƣợc thống kê phân tích phần mềm NTSYpc 2.1, từ thiết lập đƣợc bảng hệ số tƣơng đồng di truyền sơ đồ hình (hình 3.7) mối quan hệ di truyền giống lúa nghiên cứu. 32 Bảng 3.3: Hệ số tƣơng đồng di truyền 23 mẫu giống lúa nghiên cứu 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 46 1.00 47 0.28 1.00 48 0.38 0.38 1.00 49 0.66 0.26 0.43 1.00 50 0.50 0.34 0.50 0.61 1.00 51 0.54 0.41 0.32 0.56 0.46 1.00 52 0.38 0.25 0.38 0.43 0.46 0.35 1.00 53 0.54 0.34 0.42 0.56 0.64 0.42 0.54 1.00 54 0.42 0.31 0.32 0.39 0.35 0.54 0.23 0.26 1.00 55 0.42 0.25 0.35 0.51 0.50 0.32 0.50 0.69 0.26 1.00 56 0.38 0.30 0.41 0.38 0.49 0.38 0.28 0.38 0.34 0.41 1.00 57 0.29 0.22 0.23 0.39 0.38 0.38 0.20 0.26 0.26 0.23 0.31 1.00 58 0.59 0.28 0.35 0.77 0.46 0.46 0.46 0.42 0.32 0.38 0.28 0.42 1.00 59 0.38 0.41 0.35 0.43 0.42 0.35 0.26 0.29 0.35 0.32 0.53 0.29 0.42 1.00 60 0.30 0.27 0.33 0.34 0.44 0.33 0.33 0.37 0.30 0.37 0.36 0.47 0.40 0.33 1.00 61 0.32 0.25 0.29 0.39 0.35 0.42 0.32 0.29 0.38 0.35 0.34 0.38 0.38 0.38 0.60 1.00 62 0.38 0.45 0.23 0.39 0.42 0.38 0.23 0.32 0.35 0.35 0.45 0.35 0.38 0.64 0.40 0.46 1.00 63 0.41 0.31 0.29 0.39 0.53 0.35 0.32 0.35 0.35 0.35 0.37 0.35 0.41 0.49 0.43 0.35 0.49 1.00 64 0.34 0.33 0.34 0.38 0.41 0.31 0.31 0.34 0.34 0.38 0.30 0.41 0.41 0.49 0.46 0.31 0.38 0.55 1.00 65 0.50 0.28 0.35 0.47 0.50 0.35 0.29 0.32 0.35 0.35 0.41 0.46 0.50 0.59 0.47 0.46 0.59 0.61 0.57 1.00 66 0.38 0.31 0.23 0.29 0.38 0.26 0.26 0.26 0.23 0.26 0.38 0.42 0.32 0.46 0.40 0.38 0.54 0.53 0.41 0.59 1.00 67 0.12 0.27 0.10 0.23 0.20 0.28 0.22 0.17 0.31 0.17 0.17 0.25 0.22 0.17 0.14 0.15 0.25 0.23 0.24 0.17 0.17 1.00 68 0.30 0.30 0.17 0.31 0.27 0.44 0.33 0.22 0.40 0.17 0.21 0.30 0.30 0.30 0.23 0.30 0.33 0.28 0.27 0.33 0.24 0.43 33 68 1.00 Hình 3.7: Sơ đồ hình mối quan hệ di truyền mẫu giống lúa nghiên cứu Qua bảng hệ số tƣơng đồng sơ đồ mối quan hệ di truyền mẫu giống lúa nghiên cứu cho thấy: Hệ số tƣơng đồng di truyền 23 mẫu giống 34 lúa ƣu tú nghiên cứu dao động khoảng từ 0,1 (NSC48 NSC67) đến 0,77 (NSC49 NSC58). Dựa vào sơ đồ phát sinh chủng loại, mức tƣơng đồng di truyền 0,36 (36%), 23 giống lúa nghiên cứu đƣợc chia thành nhóm cách biệt di truyền. Nhóm I: Gồm 11 mẫu giống đƣợc chia thành phân nhóm phụ Phân nhóm phụ 1.1: Có giống lúa (NSC46, NSC49, NSC58, NSC50, NSC53, NSC55, NSC52), giống có hệ số tƣơng đồng di truyền từ 0,38 (NSC46 NSC52); (NSC55 NSC58) đến 0,77 (NSC49 NSC58). Phân nhóm phụ 1.2: Có giống lúa (NSC48 NSC56). Nhóm có hệ số tƣơng đồng di truyền 0,41. Phân nhóm phụ 1.3: Có giống lúa (NSC51 NSC54). Nhóm có hệ số tƣơng đồng di truyền 0,54. Nhóm II: Gồm mẫu giống đƣợc chia làm phân nhóm phụ Phân nhóm phụ 2.1: Có giống lúa (NSC57, NSC60 NSC61). Nhóm có hệ số tƣơng đồng di truyền từ 0,38 (NSC57 NSC61) đến 0,6 (NSC60 NSC61). Phân nhóm phụ 2.2: Có giống lúa (NSC59, NSC62, NSC63, NSC65, NSC64 NSC66). Nhóm có hệ số tƣơng đồng di truyền từ 0,38 (NSC62 NSC64) đến 0,64 (NSC59 NSC62). Nhóm III:Gồm giống lúa NSC47 có hệ số tƣơng đồng với giống lại dao động từ 0,22 (NSC47 NSC57) đến 0,45 (NSC47 NSC62). Nhóm IV: Có giống lúa (NSC67 NSC68), nhóm có hệ số tƣơng đồng di truyền 0,43. 35 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Tập đoàn dòng/giống lúa ƣu tú nghiên cứu đa dạng thành phần alen. Kết phân tích 26 cặp mồi SSR với 23 mẫu giống lúa ƣu tú thu đƣợc băng DNA thuộc 74 loại alen khác nhau, trung bình 2,85 alen/locus. Hệ số PIC dao động từ 0,08 đến 0,76 trung bình 0,45.Các giống lúa có độ đa dạng di truyền tỉ lệ dị hợp tử mẫu nghiên cứu dao động từ 0% đến 15,4%. Hệ số tƣơng đồng di truyền dao động khoảng từ 0,1 đến 0,77. Dựa vào sơ đồ phát sinh chủng loại, mức tƣơng đồng di truyền 36%, 23 giống lúa ƣu tú nghiên cứu đƣợc chia thành nhóm cách biệt di truyền. 4.2. Kiến nghị Cần tiếp tục nghiên cứu xác định alen đặc trƣng, alen để nhận dạng xác nguồn gen ƣu tú phục vụ nghiên cứu chọn, lai tạo giống định hƣớng phát triển giống lúa suất chất lƣợng cao. 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt 1. Trần Văn Đạt, 2005. Sản xuất lúa gạo giới: Hiện trạng khuynh hƣớng phát triển kỷ 21. 2. Vũ Thị Hiền, Phạm Văn Cƣờng (2012). Phân tích đa dạng di truyền mẫu giống lúa canh tác nƣớc trời thị phân tử SSR. Tạp chí Khoa học Phát triển. Tập 10, số 1, tr.15 – 24. 3. Trần Thị Hòa, Triest (1999). Sử dụng kỹ thuật PCR – RAPD nghiên cứu đa hình di truyền thực vật. Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc. tr 1305 1312. 4. Trần Thị Lƣơng, Lƣu Minh Cúc, Nguyễn Đức Thành (2013). Phân tích quan hệ di truyền số giống lúa đặc sản, chất lƣợng, trồng phổ biến Việt Nam thị phân tử SSR. Tạp chí sinh học. Tập 35, số 3, tr. 348-356. 5. Trần Danh Sửu, Đỗ Đức Tuyến, Lƣu Ngọc Trình, Nguyễn Thị Ngọc Huệ (2004). Nghiên cứu đa dạng di truyền giống lúa nông dân đặt tên (Oryza sativa) sở phân tích đẳng men, bảo tồn nội vi tài nguyên trồng phát triển bền vững. NXB Nông nghiệp Hà Nội, Tr. 54-60. 6. Trần Danh Sửu, Nguyễn Thị Lan Hoa, Hà Minh Loan, Ngô Kim Hoài, Nguyễn Thị Vân Anh, Vũ Mạnh Hải (2011). Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa nếp địa phƣơng tỉnh đồng bắc thị SSR. Tạp chí Công nghệ sinh học năm 2011, số 3, tr. 230-290. Tr 17-29. 7. Nguyễn Đức Thành (2004). Nghiên cứu đa dạng di truyền số dòng lúa chọn làm cặp lai tạo giống suất cao. Tạp chí công nghệ sinh học. Tập 2, số 1, tr. 101-108. 8. Lƣu Ngọc Trình (2007). Báo cáo kết thực đề tài "Bảo tồn tài nguyên di truyền thực vật phục vụ cho mục tiêu lương thực nông nghiệp" năm 2006. Hà Nội. Tr 40-50. 37 9. Khuất Hữu Trung, Nguyễn Thị Phƣơng Đoài (2010). Nghiên cứu đa dạng di truyền nhận dạng số giống tập đoàn lúa Tám đặc sản Việt Nam thị phân tử SSR (microsatellite). TC Nông nghiệp PTNT, số 149, tr. 3-8. Tiếng Anh 10.Akagi H., Yokozeki Y., Inagaki A., Fujimura T. (1996). Microsatellite DNA markers for rice chromosomes. Theor Appl Genet, 93, pp. 1071. 11. Chang TT. (1985). Crop history and gentic conservation. Rice, A case study. In: Iwova state. Journal of research, 4, pp. 59. 12. Harsh B., Ravindra K., Vivek and Sanjay (2013). Analysis of diversity in rice (Oryza sativa L.) using random amplified polymorphic DNA (RAPD) and simple sequence repeats (SSR) markers. Vol. 12(35), pp.5404-5412. 13.Kibria K., NurF., BegumS.N., IslamM.M., PaulS.K.,RahmanK.S., and Azam S.M.M. (2009). Molecular marker based genetic diversity analysis in aromatic tice genotypes using SSR and RAPD marker. Int. J. Sustain. Crop Prod, 4, pp. 23-34. 14.Jacob HJ., Lindpaintner K., Lincoln S., Kusumi E., Bunker K., Mao RK., Yi P., Ganten D., Dzau VJ and Lander ES. (1991). Genetic mapping of a gene causing hypertensive rat. Cell, 67, pp. 213-224. 15.Olufowote. J.O., XU Y., Chen X., Park W.D., Beachell H. M., Dilday R.H., Goto M., and McCouch S.R. (1997). Comparative evaluation of within-cultivar variation of rice (Oryza sativa L.) using microsatellite and RFLP markers, Genome, 38, pp. 1170-1176. 16.Raj KJ. and Lambodar B. (2006). Identification and differentiation of indigenous non-Basmati aromatic rice genotypes of India using microsatellite markers, African Journal of Biotechnology, 6, pp. 348-354. 17. Rohlf FJ. (2000). NTSYS-pc: Numerical taxonomy and multivariate analysis system. Version 2.1. Exeter Publication, New York, USA. 38 18.Shahid M.S., Shahzad AN. and Muhamad A. (2013). Genetic diversity in basmati and non-basmati rice varieties based on microsatellite markers.Pak. J. Bot., 45(S1): 423-431 19.Singh B., Singh S.P., Kumar J. (2011). Assessment of genetic diversity of aromatic rices (Oryza sativa L.) using morphological, physiochemical and SSR markers. 20.http://www.biodivn.com/2014/05/phuong-phap-tieu-chi-danh-giadddt.htmlphƣơng pháp tiêu chí đánh giá đa dạng di truyền 21.http://voer.edu.vn/m/vi-tri-cua-lua-gao-trong-nen-kinh-te-the-gioi-va-vietnam/9ffdcd78 39 [...]... lạp[6] 16 Năm 2012, Vũ Thị Thu Hiền và Phạm Văn Cƣờng đã phân tích đa dạng di truyền của 64 dòng /giống lúa đang canh tác trong điều kiện nhờ nƣớc trời thông qua sự có mặt và mức độ đa hình của các chỉ thị phân tử SSR Bằng việc sử dụng 34 chỉ thị phân tử SSR, có 8 chỉ thị không cho xuất hiện vạch ở tất cả các dòng /giống; 2 chỉ thị xuất hiện vạch đơn hình; 24 chỉ thị còn lại xuất hiện đa hình với tổng số... nghiên cứu biến động di truyền trong giống của 71 giống lúa bằng cả hai loại chỉ thị SSR và RFLP Kết quả cho thấy các giống lúa địa phƣơng có mức độ đa dạng, hỗn tạp và dị hợp tử cao hơn các giống lúa cải tiến Cả hai phƣơng pháp đều cho thấy số lƣợng các alen ở các giống lúa địa phƣơng cao hơn hẳn các giống lúa cải tiến Chỉ thị SSR có khả năng phân biệt các cá thể có quan hệ di truyền gần gũi, đồng... lớn bao gồm nhiều loài có quan hệ di truyền xa nhau Trong nghiên cứu này chúng tôi chọn chỉ thị SSR cho nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền của giống lúa ƣu tú để lựa chọn và tạo ra giống có năng suất cao, phẩm chất tốt nhất phục vụ cho chọn giống 1.5 Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền lúa trên thế giới và ở Việt Nam 1.5.1 Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền lúa trên thế giới Tác giả Olufowote... đồng, 40 giống lúa đƣợc chia thành 3nhóm khác biệt Kết quả này đƣợc sử dụng hữu ích cho việc theo dõi, xác định kiểu gen và bảo vệ giống lúa[ 18] Harsh Bansal (2013), sử dụng chỉ thị phân tử đánh giá đa dạng di truyền của 20 giống lúa (đƣợc thu thập từ phòng di truyền học, Viện nghiên cứu Nông nghiệp Ấn Độ) bằng chỉ thị RAPD và chỉ thị SSR Sử dụng 20 mồi RAPD thu đƣợc 116 băng trong đó có 114 băng đa hình... học của 1.819 giống, đánh giá 40 - 50 tính trạng của 1.385 giống và từ 20 - 30 tính trạng của 2.066 giống[ 8] Năm 2010, tác giả Khuất Hữu Trung và Nguyễn Thị Phƣơng Đoài đã sử dụng chỉ thị SSR để nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn nguồn gen lúa Tám đặc sản bản địa của Việt Nam Kết quả nghiên cứu đã cho thấy tập đoàn lúa Tám nghiên cứu khá đa dạng: phân tích 36 cặp mồi SSR trên 26 giống lúa Tám thu... marker phân tử đánh giá đa dạng di truyền của 40 giống lúa thơm và không thơm bằng chỉ thị SSR, 40 giống 13 lúa này đƣợc đánh giá bởi 24 mồi Kết quả cho thấy có tổng cộng 66 alen và hệ số alen dao động từ 2-4, trung bình là 2,75 alen/marker, hệ số PIC dao động từ 0,4250 (RM252) đến 0,9750 (RM315) Hệ số PIC trung bình của 24 cặp mồi nghiên cứu trên 40 giống lúa là 0,6472 Kết quả phân tích đa dạng di truyền. .. vậy, cả 23 giống lúa ƣu tú đều có ý nghĩa phân tích thống kê để đánh giá đa dạng di truyền Tỷ lệ dị hợp tử (H) cao nhất ở mẫu giống lúa NSC63 là 15,4%; tiếp đến là mẫu giống lúa NSC54 có tỉ lệ dị hợp tử là 11,5%; hai giống lúa NSC60 và NSC68 có tỷ lệ dị hợp tử là 7,69%; hai mẫu giống NSC49, NSC51 có tỷ lệ dị hợp tử là 4%; ba giống lúa NSC47, NSC64 và NSC67 có tỷ lệ dị hợp tử là 3,85% Các giống còn lại... I gồm có 22 giống (15 giống lúa thơmBasmati và 5 giống không thơm, hai giống lúa Japonica) Nhóm II bao gồm 19 giống lúa không thơm Kết quả nghiên cứu này cũng cho thấy rằng các marker SSR có thể đƣợc sử dụng để phân tích đa dạng di truyền và chỉ ra sự khác biệt giữa giống lúa Basmati thơm và giống lúa Basmati không thơm Hơn nữa, việc xác định giống lúa Basmati truyền thống dựa vào marker SSR có thể... thể rất nhỏ (2bp) Chỉ thị SSR dùng để đánh giá đa dạng di truyền, xác lập quan hệ di truyền của cây trồng, chọn lọc tính kháng bệnh, một số tính trạng có quan hệ chặt chẽ với năng suất ở cây lúa, lập bản đồ, nghiên cứu locus tính trạng số lƣợng (DTL) Ưu điểm và hạn chế của chỉ thị SSR Thuận lợi to lớn của việc phân tích chỉ thị SSR là phƣơng pháp này biểu hiện số lƣợng lớn sự đa hình SSR là marker đồng... băng đa hình Kết quả phân tích SSR cho thấy khoảng cách di truyền cao nhất giữa các giống lúa thơm là 2,306 và khoảng cách di truyền cao nhất khi dùng các marker RAPD là 0,7634 Kết quả của nghiên cứu này sẽ là công cụ hữu ích để chọn dòng bố mẹ cho việc phát triển công tác chọn giống[ 13] Tác giả Malik Ashiq (2010), đã tiến hành đánh giá đa dạng di truyền giữa các giống lúa truyền thống và giống lúa . nghiên cứu: Đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn giống lúa ưu tú (NSC46 – NSC68) bằng chỉ thị phân tử SSR . 2. Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu đa dạng di truyền giữa các giống lúa nghiên cứu,xác. KHƢƠNG THỊ BÍCH ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN TẬP ĐOÀN GIỐNG LÚA ƢU TÚ (NSC46 – NSC68) BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Di truyền phân tử Ngƣời. cứu Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn giống lúa ƣu tú NSC46 – NSC68 bằng chỉ thị phân tử SSR. - Thu mẫu lúa NSC - Xử lí mẫu, tách chiết DNA - Phản ứng PCR - Điện di sản phẩm PCR