BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN  LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN TỪ RUỘT TÔM SÚ VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CAO CHIẾT LÁ CỎ MỰC (ECLIPTA ALBA H.) CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS ĐÁI THỊ XUÂN TRANG KHOA: KHOA HỌC TỰ NHIÊN SINH VIÊN THỰC HIỆN TRƯƠNG PHAM THẢO QUỲNH MSSV: 3102677 LỚP: CỬ NHÂN SINH HỌC – K36 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu cán hướng dẫn tôi. Các kết trình bày luận văn trung thực chưa nghiên cứu công trình nghiên cứu luận văn nào. Cán hướng dẫn Tác giả Ts Đái Thị Xuân Trang Trương Phạm Thảo Quỳnh PHẦN KÝ DUYỆT Đề tài: “Phân lập vi khuẩn từ ruột tôm sú bệnh khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao cỏ mực (Eclipta alba H.)” sinh viên Trương Phạm Thảo Quỳnh thực duyệt thông qua hội đồng phản biện luận văn tốt nghiệp đại học. Cần Thơ, ngày….tháng….năm 2013 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TS: Đái Thị Xuân Trang LỜI CẢM TẠ Để đề tài luận văn hoàn thành thuận lợi, bên cạnh cố gắng thân, nhận nhiều động viên, giúp đỡ từ thầy, cô, gia đình, bạn bè anh, chị khóa trên. Tôi chân thành gửi lời tri ân đến: Cô Đái thị Xuân Trang cô Võ Thị Tú Anh tận tâm hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm quý báu suốt thời gian học tập tiến trình làm luận văn tốt nghiệp. Thầy Quách Quang Huy Phạm Kháng Nguyên Huân đồng hành giúp đỡ tận tình suốt năm học qua. Toàn thể Cán môn Sinh học, khoa Khoa học tự nhiên truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho chúng em học tập - nghiên cứu. Gia đình thân yêu bên chăm sóc, cổ vũ động viên. Tập thể lớp Sinh học K36, anh, chị khóa em khóa giúp đỡ, chia nhiều kinh nghiệm suốt trình học tập thực luận văn này. Những người bạn thân thiết gắn bó, chia niềm vui buồn suốt thời gian qua. Trương Phạm Thảo Quỳnh Xin chân thành cảm ơn !!! MỤC LỤC Trang MỤC LỤC . i DANH SÁCH BẢNG . ii DANH SÁCH HÌNH . iii DANH MỤC VIẾT TẮT . iv TÓM LƯỢC . v CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU . CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Sơ lược tôm sú 2.2. Sơ lược hệ vi khuẩn gây bệnh đường ruột tôm . 2.3. Cỏ mực CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP . 3.1. Phương tiện nghiên cứu . 3.2. Phương pháp nghiên cứu . CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 12 4.1. Phân lập vi khuẩn từ ruột tôm sú . 12 4.2. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao cỏ mực 16 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 20 5.1. Kết luận . 20 5.2. Đề nghị . 20 5.3. TÀI LIỆU THAM KHẢO . 21 PHỤ LỤC DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1. Đặc điểm dòng vi khuẩn . 14 Bảng 2. Khả kháng vi khuẩn đường ruột tôm cao cỏ mực 16 DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1. Cây cỏ mực (Eclipta alba) . Hình 2. Vi khuẩn đường ruột tôm môi trường TCBS . 12 Hình 3. Các dạng khuẩn lạc dòng vi khuẩn phân lập . 13 Hình 4. Hình dạng vi khuẩn kính hiển vi quang học nhuộm Gram 14 Hình 5. Vòng vô khuẩn cao Cỏ Mực lên số dòng vi khuẩn .15 Hình 6. Biểu đồ thể đường kính vòng vô khuẩn nồng độ cao chiết khác dòng vi khuẩn khác . 17 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TCBS Thiosulphate citrate bile-salts sucrose ĐBSCL . Đồng sông Cửu Long NA nutrition agar TÓM LƯỢC Mười hai dòng vi khuẩn phân lập từ ruột tôm sú huyện Trần Văn Thời, tỉnh Cà Mau môi trường thạch TCBS. Các dòng vi khuẩn có dạng tròn không đều, bìa nguyên cưa, số dòng vi khuẩn tạo bao nhày xung quanh khuẩn lạc, đường kính khuẩn lạc biến thiên từ 0,5 – mm. Tất 12 dòng vi khuẩn vi khuẩn Gram âm có khả di động môi trường TCBS bán lỏng. Trong 12 dòng vi khuẩn phân lập có 10 dòng vi khuẩn bị ức chế cao chiết cỏ mực. đó, dòng vi khuẩn G2, G3, G4, G7, Y8, Y9 bị ức chế cao cỏ mực nồng độ µg/mL, dòng vi khuẩn Y4 bị ức chế cao từ nồng độ µg/mL, dòng vi khuẩn Y6 bị ức chế cao từ nồng độ 16 µg/mL, dòng vi khuẩn G1 Y6 bị ức chế cao từ nồng độ 32 µg/mL. Hai dòng vi khuẩn Y2 Y5 không bị ức chế cao chiết cỏ mực tất nồng độ khảo sát. Trong đó, dòng bị ức chế mạnh cao chiết cỏ mực đáng kể đến dòng vi khuẩn G7 (đường kính vòng vô khuẩn 30,3 mm nồng độ µg/mL), G3 (đường kính vòng vô khuẩn 59,6 mm nồng độ 128 µg/mL) G4 (đường kính vòng vô khuẩn 57,3 mm nồng độ 128 µg/mL). Từ khóa: Tính kháng khuẩn, vi khuẩn đường ruột tôm, bệnh tôm sú, cỏ mực, Eclipta alba H. Chương 1: GIỚI THIỆU Đồng sông Cửu Long biết đến vùng cung cấp thuỷ sản lớn nước, đa dạng hình thức nuôi có 1.200.000 nuôi thuỷ sản chiếm khoảng 60% tổng diện tích nuôi nước [1]. Trong đó, tôm sú (Penaeus monodon) đối tượng nuôi truyền thống có giá trị kinh tế cao. Trước đây, tôm sú (Penaeus monodon) nuôi vùng nước lợ, mặn tôm sú nuôi kết hợp với trồng lúa, nghề nuôi tôm phát triển kinh tế mà góp phần cải thiện đời sống người dân. Tuy nhiên, việc quản lý môi trường nuôi thủy sản chưa thật chặc chẽ hợp lý. Nhiều vùng nuôi tôm thâm canh hoá với mật độ cao, không theo qui hoạch, gia tăng diện tích nuôi, đa dạng hóa đối tượng nuôi, sử dụng giống sinh sản nhân tạo mật độ cao, thức ăn công nghiệp, di nhập tôm giống tôm bố mẹ,…các nguyên nhân dẫn đến tình trạng dịch bệnh bùng phát thường xuyên xảy nhiều khu vực nuôi, xuất lây lan nhiều bệnh nguy hiểm, đặc biệt bệnh virus vi khuẩn gây ra. Nhiều nhóm vi khuẩn gây dịch bệnh tôm Leucothrix spp., Vibrio spp., Photobacterium, Aeromonas Propionigenium (phylum Fusobacteria) [2] trở thành mối lo ngại người dân. Vibrio spp. gây bệnh dịch tả người, độc tố vi khuẩn gây tiêu chảy nặng nước, có khả bùng phát thành đại dịch thời gian ngắn phạm vi rộng. Người dân thường sử dụng số loài thảo dược cỏ mực, sài đất, hoàng kỳ, tỏi, xuyên tâm liên, xoan, thầu dầu tía . để trị bệnh tôm cá. Tuy nhiên, việc sử dụng dừng lại mức kinh nghiệm thường chưa có sở khoa học liều lượng cụ thể. Trong năm gần đây, hoạt tính kháng khuẩn loài thảo dược nghiên cứu nhiều đối tượng tràm, húng chanh, sống đời, diệp hạ châu . Trong tương lai, việc sử dụng thảo dược để điều trị bệnh động vật thủy sản xem tối ưu có tính an toàn cho người, môi trường không để lại tồn dư, phù hợp với quy định an toàn thực phẩm. 10 khuẩn lạc phát mắt thường, bỏ qua khuẩn lạc li ti mép mà phát kính hiển vi. 20 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Phân lập vi khuẩn từ ruột tôm sú Mười hai dòng vi khuẩn phân lập từ 30 mẫu ruột tôm sú bệnh môi trường TCBS có tế bào dạng hình que (dài ngắn), di động. Các dòng vi khuẩn kí hiệu sau: kí hiệu đầu Y (yellow) G (green) thể màu sắc khuẩn lạc môi trường TCBS. Chữ số cuối kí hiệu cho số dòng vi khuẩn phân lập được. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc tế bào vi khuẩn Trên môi trường TCBS, khuẩn lạc dòng vi khuẩn có màu vàng màu xanh (đậm nhạt). Màu sắc khuẩn lạc định màu môi trường nuôi cấy. Đối với khuẩn lạc có màu vàng, môi trường đĩa nuôi cấy chuyển từ xanh sang vàng. Đối với khuẩn lạc xanh, màu sắc môi trường thay đổi không đáng kể, màu xanh nhạt không. Kết chuyển màu trình phát triển vi khuẩn, vi khuẩn có khả sử dụng đường sucrose có khuẩn lạc màu vàng vi khuẩn khả sử dụng đường sucrose khuẩn lạc có màu xanh [16]. A B Hình 2: Vi khuẩn đường ruột tôm môi trường TCBS A: Khuẩn lạc vàng; B: Khuẩn lạc xanh Hình thái khuẩn lạc dòng vi khuẩn phân lập có dạng hình tròn tròn không đều, bìa nguyên gợn sóng, có tâm tâm khuẩn lạc, độ từ lài đến mô. Kết so với nghiên cứu dòng vi 21 khuẩn gây bệnh tôm sú Bùi Quang Tề [5] Đặng Thị Hoàng Oanh [4] phù hợp. Y2 G1 G2 Y5 G5 G4 Hình 3: Các dạng khuẩn lạc dòng vi khuẩn phân lập Y2: khuẩn lạc vàng, tròn không đều, không bóng G1: khuẩn lạc xanh, tròn, bóng G2: khuẩn lạc xanh, tròn, không bóng, có bao Y5: khuẩn lạc vàng, tròn, bóng 22 Trong 12 dòng vi khuẩn phân lập được, có dòng vi khuẩn có khuẩn lạc màu vàng, dòng màu xanh dòng màu xanh nhạt. Một số dòng vi khuẩn tạo bao nhày xung quanh khuẩn lạc G2, G4, G1, Y7. Sự hình thành bao nhày (biofilm) dòng vi khuẩn giúp chúng hấp thu chất dinh dưỡng, kháng thuốc kháng sinh liên kết với tế bào khác với vật chủ [13]. Đường kính khuẩn lạc biến thiên từ 0,5-4 mm. (Bảng 1) Hình dạng tế bào vi khuẩn 12 dòng vi khuẩn phân lập có hình que cong, bắt màu hồng sarafine nhuộm Gram chứng tỏ dòng vi khuẩn Gram âm. Kết phù hợp với nghiên cứu Bùi Quang Tể [5] Đặng Thị Hoàng Oanh [4]. (Hình 4) Bảng 1: Đặc điểm hình thái dòng vi khuẩn Dòng STT vi Màu sắc Hình dạng Tâm Dạng bìa khuẩn Độ Kích thước (mm) G1 Xanh Tròn + Nguyên Nổi 2-2,2 G2 Xanh Tròn - Nguyên Lài 1-1,5 G3 Xanh Tròn - Nguyên Nổi 1,2-1,7 G4 Xanh nhạt Tròn + Nguyên Lài 3-3,5 G5 Xanh Tròn + Nguyên Nổi 3,5-4 Y1 Vàng Tròn - Nguyên Nổi 0,5-1 Y2 Vàng Tròn - Răng cưa Lài 2,2-3 Y3 Vàng Tròn + Nguyên Nổi 2,2-3 Y4 Vàng Tròn + Răng cưa Lài 1,2-1,7 10 Y5 Vàng Không + Nguyên Nổi 2-2,5 11 Y6 Vàng Không - Răng cưa Lài 3,5-4 12 Y7 Vàng Tròn + Nguyên Nổi 2-2,5 Chú thích: “+“ có tâm, “-” tâm. 23 Hình 4: Hình dạng vi khuẩn kính hiển vi quang học nhuộm Gram 4.2. Khảo sát hoạt tính cao cỏ mực Trong thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao cỏ mực, dung môi methanol dùng để pha loãng cao chiết. Kết thí nghiệm ảnh hưởng dung môi phát triển vi khuẩn không đáng kể, dung môi không tạo vòng vô khuẩn tất dòng vi khuẩn. Như vậy, việc sử dụng methanol làm dung môi để pha loãng cao chiết thích hợp. Ở nồng độ cao chiết khác nhau, dòng vi khuẩn khác tạo vòng vô khuẩn với kích thước khác nhau. Bảng 2: Khả kháng vi khuẩn đường ruột tôm cao Cỏ Mực khảo sát nồng độ Đường kính vòng vô khuẩn (mm) STT nồng độ cao chiết khác Dòng VK 16 32 µg/mL µg/mL 64 MIC 128 (µg/mL) µg/mL µg/mL µg/mL G1 0c 0f 8,3a 14,3e 24,6c 32 G2 15ab 28bc 21,6ab 36,3cd 40,3b 8 G3 14,3b 18,6de 33,6b 29b 59,6a 8 G4 ab a 23,6 a G5 30,3 Y1 11,6b 25,3 26,3 ab 28bc 45 bc 34,6 37 bc bc 32d 24 40 a 36,3bcd 57,3 a 41,3 b 40,6b 8 8 8 Y2 0c 0f 0e 0f 0e - Y3 0c 11,3e 24,3bc 30,6d 35b 16 Y4 19b 25,6cd 30bc 33d 37,3b 8 10 Y5 0c 0f 0e 0f 0e - 11 Y6 0c 0f 3,3c 12,6e 10,3d 32 12 Y7 23,6ab 25,3cd 29,3d 35,6bcd 41,3b 8 Cácchữ theo sau giá trị cột giống không khác biệt có ý nghĩa P[...]... đề tài Phân lập vi khuẩn từ ruột tôm sú bệnh và Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết cây cỏ mực (Eclipta alba H.) là cần thiết Đề tài đóng góp cơ sở khoa học cho vi c ứng dụng thảo dược trong điều trị bệnh trên thủy sản Mục tiêu của đề tài là đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn được phân lập từ ruột tôm sú (Penaeus monodon) bệnh của cao chiết cây cỏ mực (Eclipta alba) 11 Chương 2 LƯỢC KHẢO TÀI... cây cỏ mực có hoạt tính kháng khuẩn với nhiều loài vi khuẩn và thể hiện hoạt tính kháng khuẩn cao đối với các dòng vi khuẩn đã phân lập được (MIC= 8 – 64 µg/ml) Đây là tiền đề cho vi c ứng dụng cây cỏ mực để điều trị bệnh trên tôm nếu xác định được các nhóm vi khuẩn đã phân lập được là các loài vi khuẩn gây bệnh 27 A B G5 ĐC G1 Y7 G4 Hình 6: Vòng vô khuẩn của cao lá Cỏ Mực lên một số dòng vi khuẩn A,... Trong 12 dòng vi khuẩn phân lập được có 10 dòng vi khuẩn bị ức chế bởi cao chiết lá cây cỏ mực Trong đó, dòng vi khuẩn G2, G3, G4, G7, Y8, và Y4 bị ức chế bởi cao lá cây cỏ mực ở nồng độ 6 µg/mL, dòng vi khuẩn Y9 bị ức chế bởi cao từ nồng độ 8 µg/mL, dòng vi khuẩn Y6 bị ức chế bởi cao từ nồng độ 16 µg/mL, dòng vi khuẩn G1 và Y6 bị ức chế bởi cao từ nồng độ 32 µg/mL Hai dòng vi khuẩn Y2 và Y5 không bị... thấy cao lá cây cỏ mực có khả năng ức chế sự phát triển của các dòng vi khuẩn đã phân lập tương đối cao Đối với các dòng vi khuẩn G2, G3, G4, G5, Y1 và Y7, cao chiết lá cỏ mực thể hiện tính kháng ngay ở nồng độ 8 µg/mL với đường kính vòng vô khuẩn lớn hơn 10 mm Do đó, đối với các dòng vi khuẩn này, cần giảm nồng độ cao chiết để tìm được nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết đối với sự phát triển của vi. .. Trong một nghiên cứu về vị trí phân loại và khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn Vibrio phát sáng phân lập từ hậu ấu trùng tôm sú (Penaeus monodon) ở ĐBSCL cho thấy vị trí phân loại của 27 chủng vi khuẩn phát sáng phân lập từ tôm sú giống và nước tại trại ương được xác định bằng phương pháp phân tích cụm so sánh với 26 chủng vi khuẩn chuẩn và chủng tham khảo dựa vào khoảng cách Euclid-UPGMA Kết... cao lá cỏ mực Trong thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao lá cỏ mực, dung môi methanol được dùng để pha loãng cao chiết Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của dung môi đối với sự phát triển của vi khuẩn là không đáng kể, dung môi không tạo được vòng vô khuẩn đối với tất cả các dòng vi khuẩn Như vậy, vi c sử dụng methanol làm dung môi để pha loãng cao chiết là thích hợp Ở các nồng độ cao chiết. .. chế bởi cao chiết cây cỏ mực ở tất cả các nồng độ khảo sát Các dòng bị ức chế mạnh nhất bởi cao chiết lá cây cỏ mực đáng kể đến là dòng vi khuẩn G7 (đường kính vòng vô khuẩn 30,3 mm ở nồng độ 8 µg/mL), G3 (đường kính vòng vô khuẩn 59,6 mm ở nồng độ 128 µg/mL) và G4 (đường kính vòng vô khuẩn 57,3 mm ở nồng độ 128 µg/mL) 5.2 Kiến nghị  Khảo sát khả năng kháng khuẩn cao cây và cao rễ của cây cỏ mực lên... đặc tính thuần chủng và hoạt tính kháng khuẩn của lá Tràm Tạp chí khoa học, 19a, 2011 Đại học Cần Thơ 8 Huỳnh Kim Diệu và Lê Thị Loan Em Sự thuần chủng và hoạt tính kháng khuẩn của cây sống đời và cây rau mương Tạp chí khoa học, 17b, 2011 Đại học Cần Thơ 9 Nguyễn Thị Bích Thuyền, Nguyễn Thị Diệu Thúy và Châu Thị Thúy Hằng Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu lá húng... hiển vi 20 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Phân lập vi khuẩn từ ruột tôm sú Mười hai dòng vi khuẩn phân lập được từ 30 mẫu ruột tôm sú bệnh trên môi trường TCBS đều có tế bào dạng hình que (dài hoặc ngắn), di động Các dòng vi khuẩn này được kí hiệu như sau: kí hiệu đầu là Y (yellow) hoặc G (green) thể hiện màu sắc khuẩn lạc trên môi trường TCBS Chữ số cuối là kí hiệu cho số dòng vi khuẩn phân lập. .. chuyển màu này là do trong quá trình phát triển của vi khuẩn, các vi khuẩn có khả năng sử dụng đường sucrose thì có khuẩn lạc màu vàng còn vi khuẩn không có khả năng sử dụng đường sucrose thì khuẩn lạc sẽ có màu xanh [16] A B Hình 2: Vi khuẩn đường ruột tôm trên môi trường TCBS A: Khuẩn lạc vàng; B: Khuẩn lạc xanh Hình thái khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được có dạng hình tròn hoặc tròn không . tài: Phân lập vi khuẩn từ ruột tôm sú bệnh và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao cây cỏ mực (Eclipta alba H. ) do sinh vi n Trương Phạm Thảo Quỳnh thực hiện đã được duyệt thông qua h i đồng. kích thước, h nh dạng). H nh dạng, kích thước và tính ròng của vi khuẩn được xác định bằng phương pháp nhuộm Gram [13]. ● Thí nghiệm 2: Khảo sát hoạt tính của cao chiết cây cỏ mực Cỏ mực. hoạt tính kháng vi khuẩn được phân lập từ ruột tôm sú (Penaeus monodon) bệnh của cao chiết cây cỏ mực (Eclipta alba) . 12 Chương 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về tôm sú Khoá phân loại tôm