TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG  VÕ QUỐC HOÀNG DÂN XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP ĐỂ NUÔI CẤY TẾ BÀO THẬN VÀ GAN PHÔI VỊT TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO VÀ THỬ NGHIỆM GÂY NHIỄM VIRUS VIÊM GAN VỊT TYPE LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGÀNH THÚ Y Cần Thơ, 2013 i TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN THÚ Y  LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP ĐỂ NUÔI CẤY TẾ BÀO THẬN VÀ GAN PHÔI VỊT TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO VÀ THỬ NGHIỆM GÂY NHIỄM VIRUS VIÊM GAN VỊT TYPE GVHD: PGS.TS HỒ THỊ VIỆT THU Sinh viện thực hiện: VÕ QUỐC HOÀNG DÂN MSSV: 3092656 LỚP: THÚ Y – K 35 Cần Thơ, 2013 i TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN THÚ Y  Đề tài: “Xác định số điều kiện thích hợp cho nuôi cấy tế bào thận gan phôi vịt điều kiện in vitro nuôi cấy thử nghiệm virus viêm gan vịt type 1” sinh viên: Võ Quốc Hoàng Dân thực phòng Chẩn đoán xét nghiệm, Khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ, từ 08/2013 đến 12/2013. Cần Thơ, Ngày tháng năm 2013 Cần Thơ, Ngày Duyệt Bộ Môn tháng năm 2013 Duyệt Giáo viên hướng dẫn PGS. TS. HỒ THỊ VIỆT THU Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 Duyệt Khoa Nông Nghiệp & SHƯD ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu thân. Các số liệu, kết trình bày luận văn trung thực chưa công bố công trình luận văn trước đây. ` Tác giả luận văn Võ Quốc Hoàng Dân iii LỜI CẢM TẠ Với tất kính trọng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối Bố mẹ người sinh thành, nuôi dạy khôn lớn bên cạnh ủng hộ, động viên gặp khó khăn, vấp ngã sống. Tôi xin chân thành cảm ơn: Cô Hồ Thị Việt Thu dành thời gian quý báu tận tình hướng dẫn, giúp đỡ suốt thời gian l àm luận văn tốt nghiệp. Cảm ơn anh Lê Trần Hoài Khanh tận tình hướng dẫn thao tác phòng thí nghiệm. Cảm ơn tất anh chị phòng Chẩn đoán xét nghiệm, bạn lớp Thú Y Khóa 35 chia buồn vui trình học tập hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ suốt thời gian thực đề t ài. Xin kính gởi đến quý thầy, cô, người than, anh, chị, bạn bè lời chúc sức khỏe thành công xin nhận nơi lòng biết ơn sâu sắc. Cuối xin cảm ơn đến Hội Đồng Giám Khảo dành thời gian đọc, xem xét đóng góp ý kiến quí báu cho đề tài tốt nghiệp tôi. Võ Quốc Hoàng Dân iv TÓM LƯỢC Mục tiêu: Tạo môi trường tế bào thận phôi gan phôi vịt lớp đơn phục vụ nghiên cứu tế bào học virus học. Để đáp ứng mục tiêu trên, thực đề tài: “Xác định số điều kiện thích hợp cho nuôi cấy tế bào thận gan phôi vịt điều kiện in vitro nuôi cấy thử nghiệm virus viêm gan vịt type 1”. Từ tháng 08/2013 đến tháng 12/2013, thực phòng chẩn đoán xét nghiệm, Bộ môn Thú Y, Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng, Đại học Cần Thơ. Nội dung: - Xác định số điều kiện thích hợp để tạo môi trường tế bào gan phôi vịt thận phôi vịt lớp qua nồng độ nuôi cấy ban đầu nồng độ huyết bổ sung vào môi trường nuôi cấy. - Thử nghiệm gây nhiễm virus viêm gan vịt type loại môi trường tế bào thận phôi vịt gan phôi vịt lớp đơn. Các kết thu được: - Về nồng độ nuôi cấy ban đầu loại tế bào: nồng độ nuôi cấy ban đầu tế bào thận phôi vịt tạo lớp nhanh tế bào gan phôi vịt; Nồng độ thích hợp để tạo môi trường tế bào 5x105 tb/ml. Về nồng độ huyết thích hợp bổ sung vào môi trường nuôi cấy: tế bào thận phôi vịt 5-10%, tế bào gan phôi vịt 10%. - Virus viêm gan vịt type gây bệnh lý tế bào đặc trưng loại tế bào (co tròn, hoại tử). Virus viêm gan vịt type tăng sinh môi trường tế bào gan phôi vịt nhanh môi trường tế bào thận phôi vịt. v MỤC LỤC Trang phụ bìa . i Trang duyệt . ii LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM TẠ iv TÓM LƯỢC . v MỤC LỤC . vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT . viii DANH MỤC HÌNH x DANH MỤC BẢNG . xi CHƯƠNG ĐẶT VẤN ĐỀ . CHƯƠNG LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Lịch sử nghiên cứu phát triển kỹ thuật nuôi cấy tế bào. 2.2 Đặc điểm tế bào động vật nuôi cấy 2.3 Tổng quan nuôi cấy tế bào động vật 2.4 Các loại tế bào nuôi cấy tế bào động vật . 10 2.5 Những đặc điểm chức tế bào nuôi cấy 10 2.6 Một số điều kiện thích hợp cho nuôi cấy tế b động vật 10 2.7 Một số môi trường nuôi cấy tế bào . 14 2.8 Đánh giá tình trạng tế bào nuôi cấy 14 2.9 Sự tạp nhiễm nuôi cấy tế bào động vật . 15 2.10 Các pha nuôi cấy tế bào . 15 2.11 Bảo quản lạnh tế bào nuôi cấy 15 2.12 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào . 17 2.13 Duck hepatitis virus type (DHV -1) 18 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 20 3.1 thời gian địa điểm . 20 3.2 Vật liệu hóa chất . 20 vi 3.3 Nội dung nghiên cứu . 22 3.4 Phương pháp nghiên cứu . 22 3.4.1 Thí nghiệm 1: Xác định nồng độ tế bào nuôi cấy thích hợp với điều kiện thí nghiệm. . 24 3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ huyết FBS bổ sung vào môi trường tăng trưởng MEM lên hiệu tạo lớp đơn tế bào. 25 3.4.3 Thí nghiệm 3: Nuôi cấy thử nghiệm Duck Hepatitis Viru s type loại môi trường DEK, DEL. . 27 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 29 4.1 Thí nghiệm 1: Xác định nồng độ tế bào nuôi cấy thích hợp với điều kiện thí nghiệm. . 29 4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ huyết FBS bổ sung vào môi trường tăng trưởng MEM lên hiệu tạo lớp đơn tế bào 35 4.3 Thí nghiệm 3: Nuôi cấy thử nghiệm Duck Hepatitis Virus type loại môi trường DEK DEL . 41 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 44 5.1 Kết luận . 44 5.2 Đề nghị 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ CHƯƠNG 49 vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Nguyên chữ Nghĩa tiếng Việt CAM Chorioallantoic membrane Màng nhung niệu CPE Cytopathic Effect Bệnh lý tế bào DEK Duck Embryo Kidney Thận phôi vịt DEL Duck Embryo Liver Gan phôi vịt DHV Duck Hepatitis Virus Virus viêm gan vịt DHV-1 Duck Hepatitis Virus type Virus viêm gan vịt type D’MEM Dulbecco`s modification of Eagle`s medium Môi trường MEM cải tiến Dulbecco DMSO Dimethylsulfoxide (CH3)2CO DNA Deoxyribonucleic acid DPBS Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Solution EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid E’ MEM Eagle's minimal essential medium Môi trường tối thiểu Eagle thiết lập FBS Foetal Bovine Serum Huyết bào thai bò HAT Hypoxanthine Aminopterin Thymidine medium Môi trường nuôi cấy tế bào động vật có vú. HEPES Hydroxy – Ethyl – Piperazine – Ethane – Sulphonic acid Đệm hữu IFN Interferon In Vitro In an artificial environment outside the living organism viii Đệm sinh lý Dulbecco Trong điều kiện thể sống MEM Minimum Essential Medium MTTT Môi trường tối thiểu Môi trường tăng trưởng NGF Nerve Growth Factor Yếu tố tăng trưởng thần kinh OD Optical Density Mật độ quang RNA Ribonucleic acid Tb TCID50 Tế bào Tissue Culture Infective Dose 50 TN Liều gây chết 50% tế bào Thí nghiệm UV Ultraviolet light Ánh sáng cực tím Vero Verda Reno (Africa green kidney monkey) Tế bào thận khỉ xanh Châu Phi ix PHỤ CHƯƠNG Phụ chương 1. MỘT SỐ THAO TÁC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM 1. Sơ đồ quy trình thí nghiệm 1.1 Sơ đồ quy trình nuôi cấy tế bào lớp 49 1.2 Sơ đồ quy trình xác định tỷ lệ sống trung bình tế bào gây nhiễm virus DHV-1 50 2. Thành phần cách pha hóa chất môi trường. 1.1 Đệm DBPS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Solution) - Cân xác 9,6 g DPBS(-) cho vào 1000 ml nước cất, khuấy cho tan hết. - Hấp tiệt trụng 1210C, 1atm 15 phút. Hoặc lọc qua đầu lọc 0,45 μm. - Bảo quản nhiệt độ phòng ngăn mát với 0C, tránh sáng. 1.2 Trypan blue 0,3% Để có 50 ml dung dịch trypan blue 0,3% 2X, tiến h ành: - Đong 49 ml nước cất ống đong. - Cân 0,3 g trypan blue (Wako Pure Chemical Industries, Ltd) cho vào ống dong, cẩn thận rơi vãi. - Thêm ml glacial acetic acid, tr ộn dung dịch micropipette. - Lọc qua giấy lọc (Whatman) cho vào ống falcon 50 ml, trữ nhiệt độ ph òng. Khi sử dụng nhuộm đếm số lượng tế bào, pha loãng 10 ml dung dịch 1X, tỷ lệ: ml Trypan blue 0,3% 2X + ml nước cất, sau lọc lại để nhiệt độ phòng. 1.3 Môi trường nuôi cấy tế bào MEM bổ sung 10% FBS MEM 100 ml FBS 10 ml L-glutamin % ml NaHCO3 % 1,5 ml HEPES 1M ml Kháng sinh (Streptomycin Penicilin) 0,25 ml Amphotericin B 0,5 ml 1.4 Dung dịch kháng sinh (Streptomycin penicillin) Để pha dung dịch Benzylpenicillin (100UI/ml) Steptomycin sulfate (100μg/ml) 50X (stock): - Lấy lọ Benzylpenicillin 106 UI lọ Steptomycin sulfate 1g (106 mg/lọ). Bóc bỏ nắp vỏ kim loại hai lọ để lộ phần cao su b ên trong. - Dùng bơm tiêm hút 10ml đệm DPBS cho vào lọ Benzylpenicillin ml cho lọ Streptomycin sulfate, lắc cho bột bên tan hết. Sau ruát cho vào chai thủy tinh bình tam giác 200ml. Rửa lại lọ với tí đệm. - Làm đầy dụng cụ chứa với đệm DPBS 200ml. 51 - Trữ dung dịch kháng sinh -200C. Khi sử dụng, pha với môi trường với tỷ lệ: 2ml hỗn hợp kháng sinh (stock) cho 100 ml MTTT. 1.5 Kháng nấm FU (fungicide) – Amphotericin B - Dùng kéo lớn bóc vỏ nắp lọ thuốc Amphotericin B solubiliz ed (50mg/lọ) (hãng Sigma). - Hút 10 ml DPBS bơm tiêm cho vào lọ. Đậy nắp, lắc mạnh cho tan hết đều. - Rút thuốc rửa lọ cho vào chai 100 ml. Làm đầy chai với 90 ml đệm DPBS, 100 ml dung dịch kháng nấm (nồng độ 500 μg/ml). Trữ -200C. Pha môi trường theo tỷ lệ 0,5 ml kháng nấm cho v 100 ml MTTT (nồng độ 0,25 μg/ml). Rút để mát 0C trước sử dụng. 1.6 Dung dịch L-Glutamine 3% - Cân g L- Glutamine lọ nhỏ cho vào 100 ml dung dịch DPBS vô trùng (hoặc nước cất). Lắc kỹ, khuấy tan hoàn toàn (khoảng 15 phút). - Đem dung dịch lọc qua đầu lọc 0,22 μm, sau chiết ống falcon lớn 50 ml bảo quản 0C để sử dụng, số lại trữ -200C. 1.7 NaHCO 7% Cân 7g NaHCO cho vào 100 ml nước cất tiệt trùng. Khuấy cho tan, bảo quản nhiệt độ mát 0C. 1.8 Dung dịch Trypsine 0,25% - EDTA 0,2% - Đong 85 ml nước cất cho vào chai thủy tinh 100 ml. - Rút ml trypsine 5% (10X) 10 ml EDTA 2% (10X) cho tiếp vào chai, lắc trộn đều. - Dung dịch lọc vào chai khác đầu lọc 0,22 μm. Sau đem trữ mát C. Trước sử dụng nuôi cấy tế b cần đun nóng 37 0C. 1.9 Pha loãng cồn 960 thành cồn 700 Sử dụng công thức C 1V1=C2V2, đó: C1, C nồng độ cồn trước sau pha loãng. V1, V thể tích cồn 960 thể tích cồn 70 0. 1.10 Thuốc nhuộm Trypan blue Để có 50 ml dung dịch Trypan blue 0,3 – 0,4% (2X) (hãng Wako), tiến hành: 52 - Đong 49 ml nước cất ống đong. - Cân 0,3 – 0,4g Trypan blue cho vào ống đong. - Thêm ml Glacial acetic acid, tr ộn dung dịch micropipette với đầu cone ml. - Lọc cho vào ống falcon 50 ml qua giấy lọc, để nhiệt độ ph òng. Khi sử dụng nhuộm đếm số lượng tế bào, pha loãng 10 ml dung dịch 1X, tỷ lệ: ml Trypan blue 2X cộng ml nước cất, sau lọc qua giấy lọc. 1.11 Formalin 10% - Đong 10 ml dung dịch formalin 37 – 40% cho vào chai 100ml. - Thêm 90 ml đệm DPBS 1X vào chai. Lắc đều, đậy kín, để nhiệt độ phòng. 3. Cách chọn trứng làm thí nghiệm Chọn nguồn trứng Đặt trứng vịt chọn từ đàn vịt khỏe mạnh không tiêm vaccine phòng bệnh. Trứng có kích thước trọng lượng cân đối, không lớn hay nhỏ quá, phân biệt đầu lớn đầu nhỏ. Bề mặt vỏ trơn nhẵn, không xù xì hay méo mó. Sử dụng trứng (trứng đốm canxi bề mặt vỏ. Trứng phải kiểm tra kháng thể (viêm gan vịt) âm tính đem ấp. Tất trứng vệ sinh sát trùng bên vỏ với cồn 70% trước đưa vào máy ấp. Ấp trứng thí nghiệm Giai đoạn ấp trứng quan trọng, có ảnh hưởng đến hình thành phát triển phôi – nguồn vật liệu nuôi cấy tế bào sau này. Trứng đặt đứng khay, nghiêng góc 750, hàng ngày đảo hai lần (sáng – chiều) để tránh tượng “sát phôi” – Hiện tượng phôi phát triển dính vào lớp màng vỏ lụa, ngăn cản hấp thu dưỡng chất từ lòng đỏ trở ngại tuần hoàn, dẫn đến chết phôi. Môi trường bên máy ấp điều chỉnh 37 0C, ẩm độ thích hợp (đặt khay nước đáy máy). Từ 45 ngày ấp, soi (candling) để kiểm tra trứng có phôi, từ loại trứng phôi phôi yếu. Chọn phôi để nuôi cấy tế bào Trứng ấp tùy theo yêu cầu thí nghiệm thu hoạch phôi. Phôi sử dụng cho nuôi cấy tế bào phải đảm bảo yêu cầu: phôi sống, có tính di động mạnh, mạch máu xunh quanh thể rỏ. Tuổi phôi không 18 ngày lâu phôi mọc lông, gây tạp nhiễm tế bào. 53 4. Phương pháp đếm tế bào buồng đếm Neubauer - Trộn 100µl huyễn dịch tế bào 900µl thuốc nhuộm trypan blue 0,22% (tỷ lệ pha 1/10). Trộn kỹ hỗn hợp – phút. - Đưa hỗn hợp thuốc nhuộm tế bào lên buồng đếm cách chạm đầu hút có chứa hỗn hợp vào chỗ tiếp giáp buồng đếm lamelle. - Chỉ đếm tế bào sống (màu vàng nhạt), không đếm tế bào chết (bắt màu xanh). Vùng đếm ô vuông lớn (ký hiệu A, B, C, D). Hình 3.1 Buồng đếm Neubauer (www.pharma.ethz.ch/ ./protocols/Hemato.gif) Cách tính kết quả: Trong đó: C= n.d .10 4 C số tế bào 1ml n số tế bào ô vuông d nông độ pha loãng 54 Phụ chương 2. XỬ LÝ SỐ LIỆU Bảng. Thời gian tạo lớp tế bào giếng với nồng độ nuôi cấy ban đầu Mật độ tế bào ban đầu (tb/ml) Thời gian tạo lớp giếng (giờ) 3x105 84 81 81 81 82 82 5x105 64 61 62 61 63 63 7x105 44 44 45 41 44 44 10x105 39 38 39 37 39 39 3x105 5x105 120 118 119 118 117 120 7x105 109 106 109 108 108 109 10x105 88 85 87 86 86 86 DEK DEL Bảng. giá trị OD 620 giếng thử nghiệm nuôi cấy theo nồng độ tế bào ban đầu Mật độ tế bào ban đầu (tb/ml) Giá trị OD620 giếng 3x105 0.158 0.176 0.177 0.171 0.167 0.167 5x105 0.219 0.245 0.232 0.248 0.217 0.222 7x105 0.266 0.264 0.241 0.291 0.258 0.263 10x105 0.255 0.269 0.256 0.313 0.257 0.258 3x105 0.074 0.105 0.090 0.108 0.103 0.076 5x105 0.118 0.168 0.132 0.173 0.188 0.125 7x105 0.149 0.219 0.161 0.174 0.174 0.151 10x105 0.184 0.239 0.201 0.226 0.223 0.212 DEK DEL 55 Bảng. Thời gian tạo lớp giếng theo nồng độ huyết loại tế bào theo nồng độ nuôi cấy ban đầu (5x105 tb/ml) Nồng độ huyết (%) Thời gian tạo lớp giếng (giờ) 0% 119 118 120 117 119 118 2% 95 94 95 94 95 94 5% 69 67 69 67 69 68 10% 64 62 63 62 62 62 0% 2% 5% 10% 120 118 119 118 118 118 DEK DEL Bảng. Giá trị OD 620 giếng thử nghiệm nuôi cấy tế bào theo nồng độ huyết khác Nồng độ huyết (%) Giá trị OD620 giếng 0% 0.139 0.158 0.127 0.162 0.144 0.154 2% 0.170 0.232 0.171 0.236 0.167 0.233 5% 0.199 0.260 0.204 0.273 0.197 0.232 10% 0.238 0.262 0.250 0.259 0.264 0.263 0% 0.063 0.064 0.066 0.068 0.074 0.068 2% 0.076 0.079 0.077 0.084 0.086 0.092 5% 0.095 0.097 0.095 0.097 0.139 0.108 10% 0.098 0.111 0.123 0.113 0.111 0.122 DEK DEL 56 Bảng. Giá trị OD 620 đo giếng nuôi cấy gây nhiễm virus viêm vịt type tế bào thận phôi vịt. Giá trị OD620 giếng Mẫu thí nghiệm Đối chứng Gây nhiễmDHV-1 0.166 0.190 0.231 0.178 0.168 0.163 0.108 0.071 0.073 0.073 0.088 0.080 0.103 0.106 0.097 0.096 0.086 0.094 0.094 0.089 0.084 0.066 0.124 0.103 0.108 0.074 0.071 0.065 0.103 0.100 0.103 0.110 0.118 0.102 0.109 0.62 0.097 0.072 0.097 0.102 0.099 0.66 0.106 0.082 0.64 0.103 0.151 0.101 Bảng. Giá trị OD 620 đo giếng nuôi cấy gây nhiễm virus viêm gan vịt type tế bào gan phôi vịt. Giá trị OD620 giếng Mẫu thí nghiệm Đối chứng Gây nhiễm DHV-1 0.188 0.284 0.267 0.228 0.224 0.228 0.082 0.117 0.223 0.101 0.128 0.093 0.104 0.079 0.104 0.099 0.108 0.134 0.096 0.105 0.080 0.095 0.104 0.087 0.097 0.103 0.101 0.091 0.118 0.102 0.088 0.124 0.086 0.106 0.131 0.097 0.080 0.103 0.078 0.094 0.109 0.104 0.066 0.099 0.065 0.086 0.081 0.088 57 Xử lý thống kê 1) Hiệu tạo lớp tế bào thận phôi vịt từ nồng độ nuôi cấy ban đầu One-way ANOVA: 3x105, 5x105, 7x105, 10x105 Source Factor Error Total DF 20 23 S = 1.162 Level 3x10 5x10 7x10 10x10 N 6 6 SS 6986.83 27.00 7013.83 MS 2328.94 1.35 R-Sq = 99.62% Mean 81.833 62.333 43.667 38.500 StDev 1.169 1.211 1.366 0.837 F 1725.14 P 0.000 R-Sq(adj) = 99.56% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev ---------+---------+---------+---------+ (*) (*) *) (*) ---------+---------+---------+---------+ 48 60 72 84 Pooled StDev = 1.162 Grouping Information Using Fisher Method N 6 6 3x10 5x10 7x10 10x10 Mean 81.833 62.333 43.667 38.500 Grouping A B C D Means that not share a letter are significantly different. 2) Hiệu tạo lớp tế bào gan phôi vịt từ nồng độ nuôi cấy ban đầu One-way ANOVA: 3x105, 5x105, 7x105, 10x105 Source Factor Error Total DF 20 23 S = 0.9874 Level 3x10 5x10 7x10 10x10 N 6 6 SS 52301.46 19.50 52320.96 MS 17433.82 0.97 R-Sq = 99.96% Mean 0.000 118.667 108.167 86.333 StDev 0.000 1.211 1.169 1.033 F 17880.84 P 0.000 R-Sq(adj) = 99.96% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev +---------+---------+---------+--------* * * (* +---------+---------+---------+--------0 35 70 105 Pooled StDev = 0.987 58 Grouping Information Using Fisher Method 5x10 7x10 10x10 3x10 N 6 6 Mean 118.667 108.167 86.333 0.000 Grouping A B C D Means that not share a letter are significantly different. 3) Giá trị trung bình OD620 tế bào thận phôi vịt sau 120 nuôi cấy từ nồng độ nuôi cấy ban đầu One-way ANOVA: 3x105, 5x105, 7x105, 10x105 Source Factor Error Total DF 20 23 SS 0.037412 0.005010 0.042422 S = 0.01583 Level 3x10 5x10 7x10 10x10 N 6 6 MS 0.012471 0.000250 R-Sq = 88.19% Mean 0.16933 0.23050 0.26383 0.26800 StDev 0.00700 0.01346 0.01612 0.02263 F 49.79 P 0.000 R-Sq(adj) = 86.42% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -----+---------+---------+---------+---(--*---) (---*---) (--*---) (---*--) -----+---------+---------+---------+---0.175 0.210 0.245 0.280 Pooled StDev = 0.01583 Grouping Information Using Fisher Method 10x10 7x10 5x10 3x10 N 6 6 Mean 0.26800 0.26383 0.23050 0.16933 Grouping A A B C Means that not share a letter are significantly different. 59 4) Giá trị trung bình OD620 tế bào gan phôi vịt sau 120 nuôi cấy từ nồng độ nuôi cấy ban đầu One-way ANOVA: 3x105, 5x105, 7x105, 10x105 Source Factor Error Total DF 20 23 SS 0.045913 0.010623 0.056536 S = 0.02305 Level 3x10 5x10 7x10 10x10 N 6 6 MS 0.015304 0.000531 R-Sq = 81.21% Mean 0.09267 0.15067 0.17133 0.21417 F 28.81 P 0.000 R-Sq(adj) = 78.39% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -----+---------+---------+---------+---(---*--) (---*---) (---*---) (---*---) -----+---------+---------+---------+---0.100 0.150 0.200 0.250 StDev 0.01502 0.02921 0.02571 0.01961 Pooled StDev = 0.02305 Grouping Information Using Fisher Method 10x10 7x10 5x10 3x10 N 6 6 Mean 0.21417 0.17133 0.15067 0.09267 Grouping A B B C Means that not share a letter are significantly different. 5) Thời gian tạo lớp tế bào thận phôi vịt theo nồng độ huyết khác sau 120 nuôi cấy One-way ANOVA: 0%, 2%, 5%, 10% Source Factor Error Total DF 20 23 S = 0.8756 Level 10 N 6 6 SS 11992.50 15.33 12007.83 MS 3997.50 0.77 R-Sq = 99.87% Mean 118.500 94.500 68.167 62.500 StDev 1.049 0.548 0.983 0.837 F 5214.13 P 0.000 R-Sq(adj) = 99.85% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev ---------+---------+---------+---------+ * * *) (* ---------+---------+---------+---------+ 75 90 105 120 Pooled StDev = 0.876 60 Grouping Information Using Fisher Method 10 N 6 6 Mean 118.500 94.500 68.167 62.500 Grouping A B C D Means that not share a letter are significantly different. 6) Thời gian tạo lớp tế bào gan phôi vịt theo nồng độ huyết khác sau 120 nuôi cấy One-way ANOVA: 0%, 2%, 5%, 10% Source Factor Error Total DF 20 23 SS 63190.13 3.50 63193.63 S = 0.4183 Level 10 N 6 6 R-Sq = Mean 0.000 0.000 0.000 118.500 MS 21063.38 0.17 99.99% StDev 0.000 0.000 0.000 0.837 F 120362.14 P 0.000 R-Sq(adj) = 99.99% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev +---------+---------+---------+--------* * * (* +---------+---------+---------+--------0 30 60 90 Pooled StDev = 0.418 Grouping Information Using Fisher Method 10 N 6 6 Mean 118.500 0.000 0.000 0.000 Grouping A B B B Means that not share a letter are significantly different. 7) Giá trị trung bình OD620 tế bào thận phôi vịt sau 120 nuôi cấy ban đầu theo nồng độ huyết khác One-way ANOVA: 0%, 2%, 5%, 10% Source Factor Error Total DF 20 23 S = 0.02555 SS 0.038441 0.013052 0.051494 MS 0.012814 0.000653 R-Sq = 74.65% F 19.63 P 0.000 R-Sq(adj) = 70.85% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev 61 Level 10 N 6 6 Mean 0.14733 0.20150 0.22750 0.25600 StDev 0.01317 0.03529 0.03299 0.01018 ---------+---------+---------+---------+ (-----*----) (----*-----) (-----*----) (----*----) ---------+---------+---------+---------+ 0.160 0.200 0.240 0.280 Pooled StDev = 0.02555 Grouping Information Using Fisher Method 10 N 6 6 Mean 0.25600 0.22750 0.20150 0.14733 Grouping A A B B C Means that not share a letter are significantly different. 8) Giá trị trung bình OD 620 tế bào gan phôi vịt sau 120 nuôi cấy ban đầu theo nồng độ huyết khác One-way ANOVA: 0%, 2%, 5%, 10% Source Factor Error Total DF 20 23 SS 0.007947 0.002173 0.010120 S = 0.01042 Level 10 N 6 6 MS 0.002649 0.000109 R-Sq = 78.53% Mean 0.06717 0.08233 0.10517 0.11300 StDev 0.00392 0.00615 0.01728 0.00910 F 24.38 P 0.000 R-Sq(adj) = 75.31% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev ----+---------+---------+---------+----(-----*-----) (----*-----) (-----*----) (-----*----) ----+---------+---------+---------+----0.064 0.080 0.096 0.112 Pooled StDev = 0.01042 Grouping Information Using Fisher Method 10 N 6 6 Mean 0.11300 0.10517 0.08233 0.06717 Grouping A A B C Means that not share a letter are significantly different. 9) Giá trị trung bình OD620 tế bào thận phôi vịt gây nhiễm DHV-1 Two-Sample T-Test and CI: DC, DHV-1 Two-sample T for DC vs DHV-1 62 DC DHV-1 N 42 Mean 0.1827 0.134 StDev 0.0257 0.143 SE Mean 0.010 0.022 Difference = mu (DC) - mu (DHV-1) Estimate for difference: 0.0487 95% CI for difference: (-0.0006, 0.0980) T-Test of difference = (vs not =): T-Value = 1.99 P-Value = 0.053 DF = 43 10) Giá trị trung bình OD 620 tế bào gan phôi vịt gây nhiễm DHV-1 Two-Sample T-Test and CI: DC, DHV-1 Two-sample T for DC vs DHV-1 DC DHV-1 N 42 Mean 0.2365 0.1009 StDev 0.0342 0.0249 SE Mean 0.014 0.0038 Difference = mu (DC) - mu (DHV-1) Estimate for difference: 0.1356 95% CI for difference: (0.0984, 0.1728) T-Test of difference = (vs not =): T-Value = 9.37 63 P-Value = 0.000 DF = Phụ chương 3. MỘT SỐ THIẾT BỊ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI Máy ấp trứng Tủ cấy vô trùng Máy ly tâm lạnh Tủ ấm 370C, 5% CO 64 Máy đo OD Kính hiển vi soi ngược [...]... tài: Xác định một số điều kiện thích hợp cho nuôi cấy tế bào thận và gan phôi vịt trong điều kiện in vitro và nuôi cấy thử nghiệm virus viêm gan vịt type 1 Mục tiêu đề tài Xác định một số điều kiện thích hợp để tạo môi trường tế bào thận phôi và gan phôi tách từ phôi vịt như nồng độ tế bào nuôi cấy, nồng độ huyết thanh bổ sung trong môi trường nuôi cấy Thử nghiệm gây nhiễm virus viêm gan vịt type 1 trên... USA) 21 Peninicillin và Streptomycin (Invitrogen, UK) Kháng nấm Amphotericin-B (Sigma) Glutamine (Waka pure Chemical Industries, Ltd) HEPES 1M NaHCO3 7% Isopropanol (Merck, Germany) 3.3 Nội dung nghiên cứu - Xác định một số điều kiện thích hợp để tạo môi trường thận phôi vịt (DEK) và gan phôi vịt (DEL) một lớp + Xác định nồng độ tế bào nuôi cấy ban đầu thích hợp với điều kiện thí nghiệm + Khảo sát... pháp xét nghiệm định lượng virus Rous sarcoma qua gây nhiễm vào tế bào gà nuôi cấy - Năm19 61, Hayflick và Moorhead thấy rằng tế bào nguyên sợi người (human fibroblast) bị chết sau khi phân chia đến một số lượng giới hạn trong điều kiện nuôi cấy - Năm 19 64, Littlefied đã đưa ra môi trường nuôi cấy HAT dùng để phát triển tế bào sinh dưỡng lai Bao gồm kỹ thuật dung hợp tế bào, để cho các tế bào sinh dưỡng... trong cơ thể sống hay không (ví dụ: tế bào gan tiết albumin) Những dấu hiệu hình thái học hay siêu cấu trúc cũng có thể được xác định (chẳng hạn sự đập của tế bào tim) Thông thường, những đặc điểm này có thể thay đổi hoặc mất đi khi đặt tế bào trong điều kiện nhân tạo 2.6 Một số điều kiện thích hợp cho nuôi cấy tế bào động vật Một điều kiện thích hợp là điều kiện tốt hơn so với điều kiện cho phép tế. .. nhu cầu dinh dưỡng thiết yếu của tế bào nuôi cấy trong điều kiện in vitro và phát hiện rằng tế bào động vật có thể phân chia được trong một hỗn hợp chứa các dinh dưỡng có phân tử lượng nhỏ và có hiện diện của một lượng huyết thanh nhất định - Năm 19 56, Puck nhận thấy yếu tố đột biến cũng kích thích lên sự phát triển của các tế bào Hela trong điều kiện nuôi cấy in vitro - Năm 19 58, Temin và Tubin phát... nuôi cấy qua nhiều thế hệ trong điều kiện in vitro và có thể duy trì khả năng phân bào trong một thời gian dài mà không thay đổi đặc tính Ví dụ: tế bào Hela (tế bào ung thư cổ tử cung người), tế bào Vero (tế bào thận khỉ xanh Châu Phi)… - Dòng tế bào giới hạn: là dòng tế bào chỉ có khả năng sống trong điều kiện nuôi cấy ở một thời gian giới hạn Đây là các dòng tế bào bình thường (không phải tế bào ung... thần kinh hình thành từ tế bào chất của tế bào thần kinh - Năm 19 13, một nghiên cứu có tính chất làm nền tảng cho công nghệ nuôi cấy tế bào động vật do Carrel thực hiện, nghiên cứu đã chứng minh tế bào có thể sống lâu ngày trong điều kiện in vitro nếu được thường xuyên bổ sung chất dinh dưỡng trong điều kiện vô trùng - Năm 19 48, Earle đã thành công khi phân lập được các tế bào đơn từ dòng tế bào và nuôi. .. mới - Năm 19 65, Ham xác định môi trường nuôi cấy tế bào không có huyết thanh cũng có khả năng kích thích sự phát triển của tế bào động vật có vú Cùng thời gian này, Harris và Watkins lần đầu tiên gây được hiện tương dung hợp tế bào người và tế bào chuột bởi tác động của virus trong điều kiện in vitro - Năm 19 75, Kohler và Milstein sản xuất được kháng thể đơn dòng từ tế bào Lympho B với một tế bào ung... Tuy nhiên, việc điều khiển dinh dưỡng tế bào trong nuôi cấy in vitro khác quá trình dinh dưỡng tế bào trong cơ thể Khi nuôi cấy tế bào in vitro, các quá trình trao đổi chất của tế bào hoàn toàn tuân theo các đặc điểm của một tế bào độc lập, không tuân theo quy luật của mô và của cơ thể đa bào Việc nuôi cấy tế bào động vật được thực hiện trên cơ sở điều khiển quá trình tổng hợp enzyme và các hoạt động... dưỡng tổng hợp - Sống ký sinh nội bào bắt buộc - Một số virus ký sinh ở tế bào động vật và thực vật có khả năng tạo tinh thể (ví dụ Tobacco mosai virus) Virus viêm gan vịt type 1 Bệnh viêm gan do virus ở vịt là bệnh truyền nhiễm cấp tính, lây lan nhanh Bệnh chủ yếu xảy ra ở vịt con từ mới nở đến 6 tuần tuổi với các bệnh tích đặc trưng gan sưng, nhạt màu, xuất huyết Trong đó, virus viêm gan type 1 (Duck . DUNG V À PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU 20 3.1 thời gian v à địa điểm 20 3 .2 Vật liệu v à hóa ch ất 20 vii 3.3 Nội dung nghi ên cứu 22 3.4 Phư ơng pháp nghiên c ứu 22 3.4.1 Thí nghi ệm 1: Xác định. ấy 14 2. 9 Sự tạp nhiễm khi nuôi cấy tế b ào động vật 15 2. 10 Các pha trong nuôi c ấy tế bào 15 2. 11 Bảo quản lạnh tế b ào nuôi c ấy 15 2. 12 Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy tế b ào 17 2. 13 Duck. 08 /20 13 đến 12/ 2013 . Cần Thơ, Ngày tháng năm 20 13 Cần Thơ, Ngày tháng năm 20 13 Duyệt Bộ Môn Duyệt Giáo vi ên hướng dẫn PGS. TS. HỒ THỊ VIỆT THU Cần Thơ, ngày tháng năm 20 13