TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN THÚ Y  NGUYỄN HUY HÙNG KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA E. COLI SINH MEN β-LACTAMASE PHỔ RỘNG TRÊN GÀ KHỎE TẠI HUYỆN TRẦN ĐỀ, TỈNH SÓC TRĂNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH THÚ Y Cần Thơ, 2014 TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN THÚ Y ----  ---- LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH THÚ Y KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA E. COLI SINH MEN β-LACTAMASE PHỔ RỘNG TRÊN GÀ KHỎE TẠI HUYỆN TRẦN ĐỀ, TỈNH SÓC TRĂNG Người hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS LƢU HỮU MÃNH NGUYỄN HUY HÙNG MSSV: 3102950 LỚP: THÚ Y – K36 Cần Thơ, 2014 TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN THÚ Y  Đề tài: “Khảo sát diện E. coli sinh men beta-lactamase phổ rộng gà khỏe huyện Trần Đề, tỉnh Sóc Trăng”. Do sinh viên: Nguyễn Huy Hùng thực phòng thí nghiệm vi trùng miễn dịch, Bộ môn Thú Y, Khoa Nông nghiệp Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ từ tháng 08/2014 đến tháng 12/2014. Cần thơ, ngày … tháng … năm 2014 Cần thơ, ngày … tháng … năm 2014 Duyệt Giáo viên hƣớng dẫn Duyệt Bộ môn Thú Y PGS.TS LƢU HỮU MÃNH Cần thơ, ngày … tháng … năm 2014 Duyệt Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Cha Mẹ, người nuôi nấng, dạy dỗ đặt niềm tin, hy vọng vào tôi. Tôi xin gửi lời biết ơn chân thành đến Quý Thầy Cô trường Đại học Cần Thơ truyền đạt cho kiến thức suốt thời gian theo học trường. Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Lưu Hữu Mãnh, cô Bùi Lê Minh tận tâm hướng dẫn, bảo cho suốt khóa học, đặc biệt thời gian thực đề tài này. Xin cảm ơn thầy Lê Hoàng Sĩ, cố vấn học tập giúp đỡ, hướng dẫn tận tình, động viên suốt trình học tập trường, khó khăn sống. Xin cảm ơn tất thầy cô Bộ môn Thú Y Bộ môn Chăn Nuôi hết lòng truyền thụ kinh nghiệm kiến thức quý báo cho rèn luyện học tập suốt thời gian học đại học. Cảm ơn anh chị cao học Thú y K19, đặc biệt chị Đỗ Kim Huệ tận tình giúp đỡ, hướng dẫn việc thực đề tài. Cảm ơn tất bạn bè lớp Thú y K36 động viên, giúp đỡ chia sẻ vui buồn với suốt thời gian học đại học. Mai đây, dù nơi đâu, thành công hay thất bại. Tôi giữ ký ức đẹp nơi Giảng đường Đại học – nơi có người dạy dỗ, thương yêu, nâng đỡ để có ngày hôm nay!!! XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN ii TÓM LƢỢC Đề tài: “Khảo sát diện E. coli sinh men β-lactamase phổ rộng gà khỏe huyện Trần Đề, tỉnh Sóc Trăng” thực từ tháng 08/2014 đến tháng 12/2014 nhằm mục tiêu xác định tỉ lệ nhiễm vi khuẩn E. coli ESBL gà khỏe Mẫu dùng để làm thí nghiệm mẫu swab chọn ngẫu nhiên trại gà thịt giai đoạn tuần tuổi, giai đoạn tháng tuổi trại gà đẻ 12 con. Xác định vi khuẩn E. coli ESBL sinh β-lactamase phổ rộng phương pháp đĩa kết hợp môi trường MHA. Tiếp theo xác định đề kháng kháng sinh E. coli ESBL cách lập kháng sinh đồ theo phương pháp Kirbry-Bauer vàkiểm tra tính nhạy cảm vi khuẩn với kháng sinh dựa vào chuẩn đường kính vòng vô trùng (CLSI, 2014) Kết cho thấy tỉ lệ nhiễm ESBL gà khỏe địa bàn cao, giai đoạn thấy xuất vi khuẩn E. coli ESBL. Cụ thể tỉ lệ nhiễm ESBL cao gà tháng tuổi (100%), thấp gà đẻ với 8,8% gà tuần tuổi 66,7%. ESBL đa kháng với loại kháng sinh thí nghiệm, điển hình Ampicilin, Cefuroxime, Cefarlor Streptomycine nhạy cảm với số loại kháng sinh Amikacin, Doxycyline, Fosfomycin Norfloxacin. Kết thí nghiệm phần giúp lựa chọn kháng sinh phù hợp chăn nuôi. Từ khóa: E. coli ESBL, gà đẻ, gà thịt (1 tuần, tháng tuổi), huyện Trần Đề, kháng sinh, tỉnh Trà Vinh. iii MỤC LỤC Trang duyệt i LỜI CẢM ƠN ii TÓM LƢỢC . iii LỜI CAM ĐOAN . iv MỤC LỤC . v DANH SÁCH BẢNG vii DANH SÁCH HÌNH viii DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT . ix CHƢƠNG 1. ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 2. CƠ SỞ LÝ LUẬN 2.1 Giới thiệu E. coli 2.1.1 Đặc điểm hình thái 2.1.2 Đặc điểm nuôi cấy . 2.1.3 Đặc điểm sinh hóa . 2.1.4 Cấu trúc kháng nguyên 2.1.5 Tính gây bệnh sức đề kháng . 2.1.6 Độc tố 2.2 Giới thiệu β-lactamase β-lactamase phổ rộng 2.2.1 Các phương pháp xác định vi khuẩn E. coli sinh ESBL . 2.2.1.1 ChromID ESBL agar 2.2.1.2 Phương pháp đĩa đôi 2.2.1.3 Phương pháp đĩa kết hợp 2.2.1.4 Băng giấy E-test ESBL . 10 2.2.1.5 Phương pháp sinh học phân tử RCR 10 2.2.2 Tổng quan kháng sinh đề kháng kháng sinh 10 2.2.2.1 Tổng quan kháng sinh 10 2.2.2.2 Đề kháng kháng sinh 11 2.2.3 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn e. coli ESBL nước . 12 2.2.3.1 Tình hình nghiên cứu giới . 12 2.2.3.2 Tình hình nghiên cứu nước . 14 CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 3.1 Phƣơng tiện nghiên cứu . 15 3.1.1 Thời gian, địa điểm đối tượng nghiên cứu . 15 3.1.2 Dụng cụ hóa chất 15 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu . 16 3.2.1 Phương pháp thu thập mẫu 16 3.2.2 Phân lập E. coli ESBL . 16 3.3 Phƣơng pháp lập kháng sinh đồ 19 3.4 Thống kê xử lí số liệu . 21 iv CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 4.1 Kết khảo sát ESBL gà . 22 4.1.1 Kết khảo sát ESBL gà thịt khỏe . 22 4.1.2 Kết khảo sát ESBL gà thịt gà đẻ khỏe 23 4.2 Tính nhạy cảm vi khuẩn với kháng sinh . 24 4.2.1 Kiểm tra kháng sinh đồ gà tuần tuổi . 24 4.2.2 Kiểm tra kháng sinh đồ gà tháng tuổi . 26 4.2.3 Kiểm tra kháng sinh đồ gà đẻ . 27 CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 30 5.1 Kết Luận 30 5.2 Đề nghị . 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 31 PHỤ LỤC . 34 v DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT Nghĩa tiếng việt Viết tắt Nguyên chữ Ak Amikacin Am Ampicillin Canh thang EE Enteric enrichement broth Canh thang LST Lauryl sulphate tryptose broth Cu Cefuroxime Cr Cefaclor DAEC Diffusely adherent E. coli E. coli bám dính phân tán DEC Dierrheagenic E. coli tiêu chảy Dx Doxyciline EAEC Enteroaggregative E. coli E. coli Escherichia coli EHEC Enterohaemorrhagic E. coli E. coli gây xuất huyết ruột EIEC Enteroinvasive E. coli E. coli xâm nhập ruột EMB Eosin methyl blue EPEC Enteropathogenic E. coli E. coli gây bệnh đường ruột ESBL Extended Spectrum ß-lactamase men beta-lactamase phổ rộng ETEC Enterotoxigenic E. coli E. coli sinh độc tố ruột ExPEC extraintestinal pathogenic E. coli gây bệnh đường ruột Fos Fosfomycin Ge Gentamycin IMViC indole- methyl red- Voges proskauer- Citrate Kn KL L-EMB Kanamycin MAEC Meningitidis-associated E. coli MC Mac conkey agar MPN Most Probable Number MR Methyl red E. coli ngưng tập ruột Khuẩn lạc Levine’s methylene blue agar vi E. coli gây bệnh viêm màng não NA Nutrient agar Nr Norfloxacin Of Oflorxacin PCR polymerase Chain Reaction Sm Streptomycin Te Tetramycin Bt Trimethoprim TSA Trypticase soy agar UPEC Uropathogenic E. coli VP Voges- porskauer E. coli gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu vii DANH SÁCH BẢNG Bảng Tên bảng Trang 3.1 Dung lượng mẫu cần lấy 16 3.2 Mức độ nhạy cảm E. coli ESBL theo tiêu chuẩn CLSI 2014 21 4.1 Kết khảo sát ESBL gà thịt tuần tháng tuổi 22 4.2 Kết khảo sát ESBL gà thịt gà đẻ khỏe 22 4.3 Kiểm tra kháng sinh đồ gà tuần tuổi 23 4.4 Kiểm tra tính đa kháng E. coli ESBL gà tuần tuổi 24 4.5 Kiểm tra kháng sinh đồ gà tháng tuổi 25 4.6 Kiểm tra tính đa kháng E. coli ESBL gà tháng tuổi 26 4.7 Kiểm tra kháng sinh đồ gà đẻ 26 4.8 Kiểm tra tính đa kháng E. coli ESBL gà đẻ 27 viii Hình 3.2 Phản ứng IMViC định danh vi khuẩn E. coli Ghi chú: ống nghiêm 1: thử nghiệm citrate âm tính ống nghiệm 2: thử nghiệm VP âm tính ống nghiệm 3: thử nghiệm MR dương tính ống nghiệm 4: thử nghiệm indol dương tính 3.3 Phƣơng pháp lập kháng sinh đồ Lập kháng sinh đồ phương pháp khuếch tán thạch theo KirbryBauer. Đề tài thử nghiệm 13 loại kháng sinh xác định loại kháng sinh nhạy, trung bình kháng dựa vào chuẩn đường kính vòng vô trùng (mm) theo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) 2014 trình bày bảng 3.2. Chuẩn bị canh khuẩn: vi khuẩn E. coli ESBL pha thành huyển dịch vi khuẩn có độ đục tương đương với độ đục khuẩn Macfarland 0.5 (108 CFU/ml, sau pha loãng nước muối sinh lý để huyễn dịch vi khuẩn có độ đục 10 CFU/ml Tiến hành Cấy huyễn dịch vi khuẩn lên thạch MHA cách dùng tampon vô trùng nhúng vào huyễn dịch vi khuẩn (106 CFU/ml), sau chan lên khắp mặt thạch MHA đèn cồn để tránh tạp nhiễm. Chờ cho mặt thạch khô gắp lấy kháng sinh đặt nhẹ lên mặt thạch. Đặt kháng sinh cho hai đĩa kháng sinh cách 2,5-3,5cm cách mép thạch 2-2,5cm, phải đảm bảo đĩa kháng sinh tiếp xúc thẳng với mặt thạch (1 đĩa thạch MHA đặt tối đa loại 19 kháng sinh). Các đĩa lật úp lại sau đặt kháng sinh. Sau đem ủ 370C 24 giờ, đọc kết quả. Huyễn dịch vi khuẩn MHA, đặt đĩa kháng sinh ủ 16-18 giờ/370C Đo đường kính vòng vô khuẩn (mm) Đọc kết kháng sinh nhạy, kháng trung gian dựa vào chuẩn đường kính vòng kháng khuẩn theo CLSI (2014) Hình 3.4 Quy trình lập kháng sinh đồ 20 Bảng 3.2 Tiêu chuẩn đường kính vòng kháng khuẩn số loại kháng sinh CLSI 2014 Đƣờng kính vùng ức chế (mm) Kháng sinh Hàm lƣợng Nhạy Trung gian Kháng Ampicillin 10 µg ≥17 14-16 ≤13 Cefuroxime 30 µg ≥23 15-22 ≤14 Cefaclor 30 µg ≥18 15-17 ≤14 Gentamycin 10 µg ≥15 13-14 ≤12 Streptomycin 10 µg ≥15 12-14 ≤11 Kanamycin 30 µg ≥18 14-17 ≤13 Amikacin 30 µg ≥17 15-16 ≤14 Tetracycline 30 µg ≥15 12-14 ≤11 Doxycycline 30 µg ≥14 11-13 ≤10 Norfloxacin 10 µg ≥17 13-16 ≤12 µg ≥16 13-15 ≤12 50 µg ≥16 13-15 ≤12 Ceftazidime-clavulanic 30/10 µg ≥18 13-15 ≤12 Amoxicillin + acid clavulanic 20/10 µg ≥18 14-17 ≤13 µg ≥16 11-15 ≤10 Ofloxacin Fosfomycin Trimethoprim +Sulfamethoxazol 3.4 Thống kê xử lí số liệu Số liệu so sánh tỉ lệ nhiễm loại gà phương pháp chi bình phương (χ2), sử dụng phần mềm thống kê Minitab 16. 21 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết khảo sát E.coli ESBL gà 4.1.1 Kết khảo sát E.coli ESBL gà thịt khỏe Lấy 12 mẫu phân thu thập từ 12 gà thịt khỏe, gồm gà thịt tuần tuổi gà thịt tháng tuổi, kiểm tra tỉ lệ nhiễm E.coli ESBL phương pháp đĩa kết hợp, kết thể qua bảng 4.1. Bảng 4.1 Tỉ lệ dương tính với E. coli ESBL gà thịt khỏe Loại gà Gà thịt tuần tuổi Gà thịt tháng tuổi Tổng Số mẫu khảo sát 6 12 Số mẫu dương tính 10 Tỉ lệ (%) 66,7a 100a 83,33 Những giá trị cột mang chữ mũ giống sai khác ý nghĩa thống kê. Kết bảng 4.1 cho thấy gà thịt tháng tuổi có tỉ lệ nhiễm E.coli ESBL cao gà thịt tuần tuổi. Sự khác biệt ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Kết phù hợp với kết Nahla M.S et al. (2014) phân lập 128 mẫu E. coli ESBL từ 145 mẫu phân gà thịt tỉnh Sulaimania, Iraq chiếm tỉ lệ 88,3%. Vì sau sinh thời gian ngắn (khoảng 24 giờ) đường tiêu hóa gia súc non xuất E. coli số loại vi sinh vật gây bệnh (Links et al., 2005). Gà tuần tuổi nở thiếu đáp ứng miễn dịch cách đầy đủ nhạy cảm cao với bệnh truyền nhiễm ( Vũ Duy Giảng, 2009) cộng thêm lây nhiễm vi khuẩn từ lò ấp. đó, khả gà tuần tuổi tiếp xúc với vi khuẩn E. coli ESBL có sẵn môi trường từ gà mẹ truyền qua tiếp xúc với trứng cao tạo nên hệ vi khuẩn E. coli ESBL đường ruột. Ngày nay, thuốc kháng sinh sử dụng rộng rãi chất kích thích tăng trưởng điều trị bệnh truyền nhiễm ( Wolfgang 1998). Và thuốc kháng sinh bổ sung vào phần ăn uống gà định kỳ thường xuyên. Do tuổi gà cao tiếp xúc với kháng sinh nhiều. Điều lý giải tỉ lệ nhiễm E. coli ESBL gà thịt tháng tuổi cao so với gà thịt tuần tuổi. 22 4.1.2 Kết khảo sát E. coli ESBL gà thịt gà đẻ khỏe Lấy 24 mẫu phân thu thập từ 24 gà khỏe, gồm 12 gà thịt 12 gà đẻ kiểm tra tỉ lệ nhiễm E.coli ESBL nhóm này. Kết thể qua bảng 4.2. Bảng 4.2 Tỉ lệ dương tính với ESBL gà thịt gà đẻ khỏe Loại gà Gà thịt Gà đẻ Tổng Số mẫu khảo sát 12 12 24 Số mẫu dương tính 10 11 Tỉ lệ (%) 83,33a 8,3b 45,8 Những giá trị cột mang chữ mũ khác sai khác có ý nghĩa thống kê. Tỉ lệ nhiễm ESBL gà theo bảng 4.2 45,8% . Tỉ lệ cao Nigieria Sunday Akidarju Mamza et al. (2010) khảo sát số mẫu swab phân gà 9/89 mẫu đạt tỉ lệ 4,9%. Sự khác biệt tỉ lệ nhiễm gà thịt gà đẻ có ý nghĩa thống kê. Kết cho thấy tỉ lệ nhiễm vi khuẩn E. coli ESBL gà thịt (83,33%) cao gà đẻ (8,3%). Điều mật độ nuôi gà thịt cao gà đẻ. Theo Phạm Kim Đăng et al. (2012) qua điều tra tình hình sử dụng kháng sinh chăn nuôi gà loại mô hình chăn nuôi (nông hộ, gia trại trang trại), kết cho thấy tính theo hướng sản xuất tỉ lệ sử dụng kháng sinh để phòng trị bệnh cho gà thịt cao gà đẻ. Ngoài theo Johann D. Pitout et al (2005) gen mã hóa sinh ESBL nằm plasmid, có khả lan truyền ngang, loài vi khuẩn truyền cho gen sinh ESBL cách nhanh chóng dù qua hệ, làm cho chủng loại số lượng vi khuẩn lan rộng nhanh chóng. 23 4.2 Kết tính nhạy cảm vi khuẩn E. coli ESBL với kháng sinh 4.2.1 Kết tính nhạy cảm E. coli ESBL kháng sinh gà tuần tuổi Bảng 4.3 Tỉ lệ kháng kháng sinh gà tuần tuổi Kháng Số KL Tên kháng sinh kiểm Số Tỉ lệ tra KL (%) Ampicillin 12 12 100 Cefuroxime 12 11 92 Cefaclor 12 12 100 Gentamycine 12 12 100 Streptomycine 12 12 100 Kanamycine 12 67 Amikacin 12 0 Tetracyline 12 41,7 Doxycyline 12 0 Norfloxacin 12 33,33 Fosfomycin 12 0 Trimethoprim 12 11 92 +Sulfamethoxazole Ofloxacin 12 67 Trung gian Số Tỉ lệ KL (%) 0 0 0 0 0 33,33 33,33 0 Số KL 0 0 12 11 12 Nhạy Tỉ lệ (%) 0 0 25 100 25 92 33,33 100 25 Từ kết kháng sinh đồ thực gà tuần tuổi theo bảng 4.3 cho thấy ESBL kháng với kháng sinh ampicillins, cefaclor, gentamycine, streptomycine với tỉ lệ cao 100%. Hai loại kháng sinh trung gian tetracyline norfloxacin với tỉ lệ 33,33%, ta dễ dàng thấy ESBL nhạy với amikacin fosfomycin với tỉ lệ 100%, doxycyline có tỉ lệ nhạy cao (92%). Kết kháng sinh đồ bảng 4.3 so sánh với số tác giả nghiên cứu độ nhạy cảm kháng sinh E. coli ESBL gà có số điểm tương đồng, nhiên có số khác biệt cụ thể sau: Kết nghiên cứu bảng 4.3 cho thấy nhóm kháng sinh tetracycline nhạy cảm tương E. coli ESBL ( 41.7%). Tuy nhiên có nhiều kết nghiên cứu khác cho thấy vi khuẩn E. coli đề kháng cao với tetracycline 100% kết nghiên cứu Đỗ Võ Anh Khoa Lưu Hữu Mãnh (2012) Mohammad Tabatabaei (2010), đồng thời đề kháng cao nghiên cứu M.J. Islam (2008) 96,6% Olufemi (2012) 76,9%. 24 Kết bảng 4.3 cho thấy E. coli ESBL đề kháng mạnh nhóm beta-lactam gồm có kháng sinh ampicillin (100%), cefuroxime (92%), cefalor (100%). Đồng thời đề kháng với kháng sinh nhóm aminoglycoside gentamycin (100%) streptomycine (100%). Đối với kháng sinh Trimethoprim + sulfamethoxazole:trong nghiên cứu bảng 4.3 kết cho thấy vi khuẩn E. coli ESBL đề kháng cao với tỉ lệ 92% tương đồng với nghiên cứu Tanvir Bashar et al (2011) 100%. Tuy nhiên, nghiên cứu cao so với nghiên cứu Robab Azadeh (2003) 50%, Rezvan Moniri Kamran Dastehgoli (2005) 70,7% Zainabu Hamisi et al (2012) 53,25%. Đối với kháng sinh có khả nhạy cảm với vi khuẩn E. coli ESBL: kết 4.3 cho thấy nhạy cảm tốt với số kháng sinh thuộc nhóm kháng sinh aminoquinolons, doxycyline fosfomycin amikacin (100%), doxycycline (92%) fosfomycin (100%). Điều tương đồng với nghiên cứu Lê Văn Đồng đàn vịt chạy đồng tỉnh Trà Vinh năm 2011 cho thấy vi khuẩn E. coli nhạy cảm mạnh với kháng sinh amikacin (97,92%), fosfomycin (85,42%). Bảng 4.4. Kiểm tra tính đa kháng E. coli ESBL gà tuần tuổi Số loại kháng sinh đề kháng Số khuẩn lạc kiểm tra (n = 12) Kiểu hình đa kháng Số đa kháng Tỉ lệ (%) Tỉ lệ chung (%) Am+Cr+Ge+Sm+Nr+Of Am+Cu+Cr+Ge+Sm+Bt 1 8,33 8,33 16,66 Am+Cu+Cr+Ge+Sm+Kn+Bt 16,67 16,67 Am+Cu+Cr+Ge+Sm+Kn+Bt+Of Am+Cu+Cr+Ge+Sm+Kn+Te+Bt 16,67 8,33 25 Am+Cu+Cr+Ge+Sm+Kn+Te+Bt+Of Am+Cu+Cr+Ge+Sm+Kn+Nr+Bt+Of Am+Cu+Cr+Ge+Sm+Te+Nr+Bt+Of 2 16,67 8,33 16,67 41,67 Dựa vào bảng 4.4 số lại kháng sinh đề kháng gà tuần tuổi từ 6-9 loại chủ yếu kháng sinh ampicillin, cefuroxime, cefaclor, gentamycine, streptomycine, kanamycine, tetracyline, norfloxacin, trimethoprim, ofloxcin 25 Kết cho ta thấy số loại đa kháng gà tuần tuổi chiếm tỉ lệ cao loại (41,6%). Từ nói vi khuẩn E. coli ESBL kháng nhiều loại kháng sinh, làm cho công tác tìm kháng sinh điều trị gặp nhiều khó khăn hơn. 4.2.2 Kết tính nhạy cảm E. coli ESBL kháng sinh gà tháng tuổi Bảng 4.5 Tỉ lệ kháng kháng sinh gà tháng tuổi Tên kháng sinh Ampicillin Cefuroxime Cefaclor Gentamycine Streptomycine Kanamycine Amikacin Tetracyline Doxycyline Norfloxacin Fosfomycin Trimethoprim +Sulfamethoxazole Ofloxacin Số KL kiểm tra 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 Số KL 18 18 18 17 18 0 Kháng Tỉ lệ (%) 100 100 100 94 100 22 0 50 Trung gian Số Tỉ lệ KL (%) 0 0 0 0 14 78 18 100 16 89 17 94 22 15 83 18 18 100 18 13 72 Số KL 0 0 0 Nhạy Tỉ lệ (%) 0 0 0 11 28 17 22 Ở gà tháng tuổi có .coli ESBL kháng với kháng sinh tươn tự gà tuần tuổi (ampicillin, cefuroxime, cefaclor, streptomycine), chúng kháng trimethopim + sulfamethoxazole với tỉ lệ 100%. Kết so sánh với bảng 4.3 tỉ lệ kháng kháng sinh gà tuần tuổi cho ta thấy gà tuần tuổi nhạy cảm với amikacin (100%), doxycylin(92%) fosfomycin (100%) gà tháng tuổi nhạy cảm với kháng sinh chuyển sang trung gian đề kháng với mức độ trung gian khác loại kháng sinh amikacin, doxycyline fosfomycin 100%, 94%, 83%. 26 Bảng 4.6 kiểm tra tính đa kháng E. coli ESBL gà tháng tuổi Số loại khág sinh đề kháng Số khuẩn lạc kiểm tra (n = 18) Kiểu hình đa kháng Số đa kháng Tỉ lệ (%) Tỉ lệ chung (%) Am+Cu+Cr+Ge+Sm+Bt 11,11 11,11 Am+Cu+Cr+Ge+Sm+Bt+Of Am+Cu+Cr+Sm+Nr+Bt+Of Am+Cu+Cr+Ge+Sm+Kn+Bt 22,22 5,56 16,66 44,44 Am+Cu+Cr+Ge+Sm+Nr+Bt+Of 38,89 38,89 Am+Cu+Cr+Ge+Sm+Kn+Nr+Bt+Of 11,11 5,56 Dựa vào bảng 4.6 ta thấy có kiều đa kháng vi khuẩn E. coli ESBL gà tháng tuổi. Trong đó, kiểu đa kháng với loại kháng sinh chiếm tỷ lệ cao 44,44%. Ở gà tháng tuổi có số loại đa kháng có tỉ lệ cao 8, chủ yếu kháng sinh như: ampicillin, cefuroxime, cefaclor, gentamycine, streptomycine, norfloxacin, trimethoprim, ofloxcin. 4.2.3 Kết tính nhạy cảm E. coli ESBL kháng sinh gà đẻ Bảng 4.7 Tỉ lệ kháng kháng sinh gà đẻ Kháng Số KL Tên kháng sinh kiểm Số Tỉ lệ tra KL (%) Ampicillin 3 100 Cefuroxime 3 100 Cefaclor 3 100 Gentamycine 66,67 Streptomycine 66,67 Kanamycine 3 100 Amikacin 0 Tetreacyline 0 Doxycyline 0 Norfloxacin 33,33 Fosfomycin 0 Trimethoprim 3 100 +Sulfamethoxazole Ofloxacin 33,33 27 Trung gian Số Tỉ lệ KL (%) 0 0 0 0 0 0 0 33,33 0 0 0 Số KL 0 1 3 Nhạy Tỉ lệ (%) 0 33,33 33,33 100 66,67 100 66,67 100 66,67 Qua bảng 4.7 cho thấy vi khuẩn E. coli ESBL phân lập gà đẻ nhạy cảm cao với amikacin (100%), doxycycline (100%), fosfomycin (100%) nhạy cảm tương tetracycline, norloxacin, ofloxacin với tỉ lệ 66,67%. Đồng thời E. coli ESBL đề kháng hoàn toàn với ampicillin, cefuroxime, cefaclor, kanamycine, trimethoprim +sulfamethoxazole với tỉ lệ 100%. Đối với kháng sinh ampicillin, kết nghiên cứu bảng 4.7 phù hợp với nghiên cứu Mohammad tabatabaei (2010) Tanvir Bashar et al (2011) vi khuẩn E. coli đề kháng tuyệt đối 100% với ampicillin. Đối với kháng sinh Trimethoprim +Sulfamethoxazole nghiên cứu bảng 4.7 kết cho thấy vi khuẩn E. coli đề kháng hoàn toàn với tỉ lệ 100% phù hợp với nghiên cứu Tanvir Bashar et al (2011) 100%. 28 Bảng 4.8 Kiểm tra tính đa kháng E. coli ESBL gà đẻ Số loại kháng sinh đề kháng Số khuẩn lạc kiểm tra (n = 18) Số đa kháng Kiểu hình đa kháng Tỉ lệ (%) Tỉ lệ chung (%) Am+Cu+Cr+Sm+Kn+Bt 33,33 33,33 Am+Cu+Cr+Ge+Sm+Kn+Bt 33,33 33,33 Am+Cu+Cr+Ge+Kn+Nr+Bt+Of 33,33 33,33 Dựa vào bảng 4.8 ta thấy tỉ lệ số loại đa kháng gà đẻ tương đương (33,33%). Kết so sánh với bảng 4.4 bảng 4.6 cho thấy khác với gà thịt tuần tháng tuổi, gà đẻ có kiểu hình đa kháng . Số loại kháng sinh đề kháng gà đẻ từ 6-8 loại Chủ yếu kháng sinh ampicillin, cefuroxime, cefaclor, kanamycine trimethoprim + Sulfamethoxazole. 29 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Sự diện E. coli ESBL gà nuôi công nghiệp huyện Trần Đề, tỉnh Sóc Trăng 45,8%. Tỉ lệ nhiễm ESBL gà tuần tuổi, tháng tuổi gà đẻ 66,7%, 100%, 8,8%. E.coli ESBL nhạy cảm với Amikacin, Doxycyline, Fosfomycin Norfloxacin. Ngoài ra, E. coli ESBL đề kháng với Ampicilin, Cefuroxime, Cefarlor Streptomycine. Vi khuẩn E. coli ESBL phân lập có 14 kiểu hình đa kháng. Số loại kháng sinh đề kháng từ 6-9 loại. 5.2 Đề nghị Nghiên cứu tỉ lệ nhiễm ESBL loài gia cầm khác nghiên cứu tình hình nhiễm theo loại gà khác. Nhà chăn nuôi phải thực tốt công tác phòng trị bệnh. Cần trọng đến việc chăm sóc nuôi dưỡng vệ sinh môi trường khu vực chăn nuôi. Việc sử dụng kháng sinh chăn nuôi cần hiểu rõ tính kháng sinh để tránh tốn mà không đạt hiệu quả. Có thể sử dụng loại kháng sinh nhạy cảm (Amikacin, Doxycyline Fosfomycin) công tác điều trị 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Abhilash K. P., Veeraraghavan B. and Abraham O. C., 2010. Epidemiology and outcome of bacteremia caused by extended spectrum beta-lactamase (ESBL)-producing Escherichia coli and Klebsiella spp. in a tertiary care teaching hospital in south India. The Journal of the Association of Physicians of India, 58: 13-17. 2. Bradford P. A., 2001. Extended-Spectrum β-Lactamases in the 21st Century: Characterization, Epidemiology, and Detection of This Important Resistance Threat. Clinical Microbiology Reviews, 14(4): 933-951. 3. Byarugaba D. K., 2010. Mechanism of antimicrobial resistence. In Antimicrobial resistence on developing countries (Eds. A. J. Sosa, D. K. Byarugaba, C. F. Amabile-Cuevas, P. R. Hsuch, S. Kariuki, and I. N. Okeke). Springer, 15-25. 4. Coque T.M., Baquero F., Canton R., 2008. Increasing prevalence of ESBL-producing Enterobacteriaceae in Europe. Euro Surveill, 13(47):pii=19044. 5. De Rosa FG, Pagani N, Fossati L, Raviolo S, Cometto C, Cavallerio P, Parlato C, Guglielmi E, Serra R and Di Perri G, 2011. The effect of inappropriate therapy on bacteremia by ESBL-producing bacteria. Infection, 39(6): 555-561. 6. Deniela costa, Laura Vinue, Patricia Poeta, Ana Claudia Cocho, Manuela Matos, Yolanda Saenz, Sergio Somalo, Myria Zarazaga, Jorge Rorge Rodrigues and Carmen Torres, 2009. Prevalence of Extended- spectrum beta-lactamase – producing Eschirichia coli isolate in faecal samples of broilers. Veterinary Microbiology, 138. 7. Duru Carissa, Nwanegbo Edward, Adikwu Michael, Ejikeugwu Chika and Esimone Charles, 2013. Extended-spectrum beta-lactamase-producing Eschirichia coli strains of poultry origin in Owerri, Nigieria. World Journal of Medical Sciences, 8. 8. Elisabete Machado, Teresa M. Coque, Rafael Canton, Joao C. Sousa and Luisa Peixe, 2008. Antibiotic resistance integrons and extended-spectrum β-lactamases among Enterobacteriaceae isolates recovered from chickens and swine in Portugal. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 62 (2): 296-302. 9. Escudero. E., 2010. Resitance mechainisms and farm level distribution of fecal Eschirichia coli isolates resistant to extended- sprectrum cephalosporins in pigs in Spain. Research in Veterinary Science, 88. 31 10. Guardabbasi L., and Couvalin P., 2006. Modes of antimicrobial action and mechanisms of bacterial resistance. In Antimicrobial resistance in bacteria of animal origin (Ed. F. M. Aarestrup). American Society for Microbiology, Washington, 1-18. 11. Hawser S. P., Bouchillon S. K., Hoban D. J., Badal R. E., Hsueh PR. and Paterson D. L., 2009. Emergence of High Levels of Extended-Spectrum-βLactamase-Producing Gram-Negative Bacilli in the Asia-Pacific Region: Data from the Study for Monitoring Antimicrobial Resistance Trends (SMART) Program, 2007. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 53(8): 3280-3284. 12. Jam Kashif, Rehana Buriro, Javed Memon, Muhammad Yaqoob, Jamila Soomro, Diao Dongxue, Huang Jinhu and Wang Liping, 2013. Detection of Class and Integrons, β-Lactamase Genes and Molecular Characterization of Sulfonamide Resistance in Escherichia coli Isolates Recovered from Poultry in China. Pakistan Veterinary Journal. 13. Li Yuan, Jian-Hua Liu, Gong-Zheng, Yu-Shan Pan, Zhi-Minh Liu, Juan and Yong-Jun Wei, 2009. Molecular characterization of extendedspectrum beta-lactamase-producing Escherichia coli isolates from chickens in Henan Province, China. Journal of Medical Microbiology, 58(Pt 11) : 1449-1453. 14. Lưu Hữu Mãnh, 2010. Giáo trình vi sinh Thú y. Tủ sách Đại học Cần Thơ. 15. Nahla M.S, Eman T.A and Rana M.A, 2014. Study of Beta-lactamase and Extended Spectrum Beta-lactamase Production by Eschirichia coli is Broiler Farms in Sulaimania Province. App, Sei, Report, 3(1), 2014: 19-24. 16. Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương, 1997. Vi sinh vật thú y, NXB Nông Nghiệp. 17. Nguyễn Thái Sơn, Nguyễn Văn Việt, Lê Thu Hồng, Hà Thị Thu Vân, 2010. Nghiên cứu đặc điểm kháng kháng sinh vi khuẩn ESBL phân lập Bệnh viện 103 giai đoạn 2007-2009. 18. Nguyễn Thanh Bảo, 2006. Vệ sinh-Môi Trường-Dịch tễ. NXB Y Học Hà Nội. 19. Nguyễn Vĩnh Phước, 1977. Vi sinh vật thú y tập 2. NXB Đại học Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội. 20. Paterson D. L. and Bonomo R. A., 2005. Extended-Spectrum βLactamases: a Clinical Update. Clinical Microbiology Reviews, 18(4): 657-686. 21. Tanvir Bashar, Mostafizur Rahman, Fazle Alam Rabbi, Rashed Noor, and M. Majibur Rahman, 2011. Enterotoxin Profiling and Antibiogram of Escherichia coliIsolated from Poultry Feces in Dhaka District of Bangladesh. Stamford Journal of Microbiology, Vol. 1, Issue ISSN: 2074-5346. 32 22. Smet A., Martel A., Persoons D., Dewulf J., Heyndrickx M., Cloeckaert A., Praud K., Haesebrouck L. and Butaye P., 2008. Comparative Analysis of ESBL-Carrying Plasmids from Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae and Salmonella enterica Strains Isolated from Poultry, Pigs and Humans. 23. Sunday A. Mamza, Godwin O. Egwu and Gideon D. Mshelia, 2010. Betalactamase Escherichia coli and Staphylococcus aureus isolated chicken in Nigeria. Veterinaria Italiana, 46(2): 155-165. 24. Võ Thị Chi Mai, Ngô Thị Quỳnh Hoa, Huỳnh Công Lý, Lê Kim Ngọc Giao Hoàng Thị Phương Dung, 2010. Trực khuẩn đường ruột tiết betalactamase phổ rộng (ESBL) gây nhiễm chiếm cư đường ruột phân lập Bệnh viện Chợ Rẫy. Y Học TP. Hồ Chí Minh, 14(2). 25. Võ Thị Trà An, Đào Thị Phương Lan, Lê Hữu Ngọc Nguyễn Ngọc Tuân (2010). Đề kháng kháng sinh E. coli phân lập từ vật nuôi diện beta-lactamase phổ rộng (ESBL). Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y- Tập XVII, số 2: 42-46. 26. Yao J and Moellering R., 2005. Antibacterial agents. IN Manual ò clinical microbiology (Ed. P. Murray). American society for microbiology, Washington, 1474 – 1504. Tài liệu internet 1. http://www.doko.vn/tai-lieu/danh-gia-mot-so-phuong-phap-phat-hien-b-lactamase-phorong-esbl-cua-escherichia-coli-va-klebsiella-pneumoniae-162135 2. http://espacoescolar.com.br/geral/surto-de-superbacteria-deve-inspirar-provas-de-biologia 33 PHỤ LỤC THỐNG KÊ VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU 4.1 Kết khảo sát ESBL gà Bảng 4.1 Kết khảo sát ESBL gà thịt Fisher's exact Dương tính 10 H0 : EPT : exact probability test : Kiểm định xác suất Âm Tính 6 12 PA =PB EPT = 0.227273 Kết quả: NS Bảng 4.2 Kết khảo sát ESBL gà thịt gà đẻ khỏe EPT : exact probability test : Kiểm định xác suất Fisher's exact Dương tính Âm Tính 10 12 11 12 11 13 24 H0 : PA =PB EPT = 0.000317 Kết quả: ** 34 [...]... ruột (ExPEC-extraintestinal pathogenic E coli) Các loại E coli gây bệnh đường ruột đã được biết gồm: - Enteropathogenic E coli (EPEC): E coli gây bệnh đường ruột - Enterotoxigenic E coli (ETEC): E coli sinh độc tố ruột - Enteroinvasive E coli (EIEC): E coli xâm nhập ruột - Enteroaggregative E coli (EAEC): E coli ngưng tập ruột - Diffusely adherent E coli (EAEC): E coli bám dính phân tán - Enterohaemorrhagic... tại huyện Trần Đề, tỉnh Sóc Trăng Mục tiêu đề tài - Khảo sát sự hiện diện E coli sinh men β- lactamase phổ rộng trên gà kh e nuôi công nghiệp huyện Trần Đề, tỉnh Sóc Trăng - Xác định tính nhạy cảm của E coli sinh men β- lactamase phổ rộng đối với một số loại kháng sinh 2 Chƣơng 2 CƠ SỞ LÝ LUẬN 2.1 Giới thiệu về E coli Trực khuẩn ruột già E coli c n có tên là Bacterium coli commune, Bacillus colicommunis... hay không truyền nhiễm, bệnh giun sán E coli thường gây bệnh cho súc vật non từ 2-3 ngày tuổi, có khi từ 4-8 ngày (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977) Những chủng E coli có liên quan đến tiêu chảy thường thuộc các nhóm sau: EPEC (enteropathogenic E coli) , ETEC (enterotoxicgenic E coli) , EIEC (enteroinvasive E coli) , VTEC (verocytotoxin-producing E coli) , EAEC (enteroaggregative) (Nguyễn Thanh Bảo, 2006) Trong phòng... gen mã hóa ESBL: TEM-52 (13,2%), TEM-106 (2%), CTX-M-1 (27,4%), CTX-M-2 (7,8%), CTX-M-14 (5,9%) và CTX-M-15 (2%) (Annemieke smet et al., 2008) Tại Bồ Đào Nha tỉ lệ gà nhiễm E coli sinh men β- lactamase chiếm 10% (Machado et al., 2008) Kết quả nghiên cứu về E coli sinh β- lactamase tại Nigeria cho thấy có 89/805 mẫu E coli dương tính với β- lactamase chiếm 11% và trong 89 mẫu dương tính với β- lactamase. .. quả khảo sát E. coli ESBL trên gà 4.1.1 Kết quả khảo sát E. coli ESBL trên gà thịt kh e Lấy 12 mẫu phân thu thập từ 12 gà thịt kh e, gồm 6 gà thịt 1 tuần tuổi và 6 gà thịt 1 tháng tuổi, kiểm tra tỉ lệ nhiễm E. coli ESBL bằng phương pháp đĩa kết hợp, kết quả được thể hiện qua bảng 4.1 Bảng 4.1 Tỉ lệ dương tính với E coli ESBL gà thịt kh e Loại gà Gà thịt 1 tuần tuổi Gà thịt 1 tháng tuổi Tổng Số mẫu khảo sát. .. 34% năm 2007 (Stephen P Hawser et al., 2009) đến hơn 50% năm 2011 (De Rosa FG., 2011) Trên thế giới hiện nay có rất nhiều nghiên cứu về vi khuẩn E coli sinh men β- lactamase phổ rộng Tuy nhiên, ở Việt Nam chủ yếu được nghiên cứu trên người Theo báo cáo tại bệnh viện Chợ Rẫy năm 1997, trên 222 chủng vi khuẩn Enterobacteriaceae tỉ lệ sinh ESBL là 6,3%, trong đó chưa phát hiện E coli sinh ESBL (Võ Thị Chi... phát hiện chủng Klebsiella ozaenae sinh enzyme β- lactamase phân hủy cefotaxime được đặt tên là SHV-2 đây là trường hợp sinh ESBL đầu tiên được ghi nhận Từ năm 1984 đến năm 1987 đã phát hiện chủng K pneumoniae có gen mã hóa ESBL trên plasmid kháng cefotaxime đặt tên là CTX-1 Cũng vào những năm 1986 ở Nhật Bản Masumato và năm 1989 ở Đức Bauernfein phát hiện E coli sinh ESBL kháng cefotaxime không phải TEM... thịt 1 tháng tuổi cao hơn so với gà thịt 1 tuần tuổi 22 4.1.2 Kết quả khảo sát E coli ESBL trên gà thịt và gà đẻ kh e Lấy 24 mẫu phân thu thập từ 24 con gà kh e, gồm 12 gà thịt và 12 gà đẻ kiểm tra tỉ lệ nhiễm E. coli ESBL giữa 2 nhóm này Kết quả được thể hiện qua bảng 4.2 Bảng 4.2 Tỉ lệ dương tính với ESBL trên gà thịt và gà đẻ kh e Loại gà Gà thịt Gà đẻ Tổng Số mẫu khảo sát 12 12 24 Số mẫu dương tính... khuẩn sinh ESBL bắt đầu gia tăng nhanh chóng, lên đến 33% (58/175 chủng) trong một nghiên cứu ở bệnh viện Nhiệt Đới năm 2002-2004 trên các nhiễm khuẩn bệnh viện Trong đó các vi khuẩn chiếm đa số là E coli và Klebsiella pneumoniae (Võ Thị Chi Mai, 1998) 1 Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “ Khảo sát sự hiện diện của E coli sinh men β- lactamase phổ rộng trên gà kh e tại huyện. .. chế sự phát triển của E coli như chlorine và dẫn xuất của nó, muối mật (Nguyễn Thanh Bảo, 2006) 2.1.3 Đặc điểm sinh hóa E coli E coli lên men có sinh hơi glucose, galactose, lactose, maltose, aribinose, xylose, mannitol, fructose không sinh H2S, hoàn nguyên nitrate thành nitrite, không sử dụng urea, không sử dụng citrate làm nguồn cung cấp carbon Tất cả vi khuẩn E coli đều lên men đường lactose nhanh . rut EIEC Enteroinvasive E. coli E. coli  EMB Eosin methyl blue EPEC Enteropathogenic E. coli E. coli gây bng rut ESBL Extended Spectrum ß -lactamase men beta -lactamase.  Khảo sát sự hiện diện của E. coli sinh men β- lactamase phổ rộng trên gà kh e tại huyện Trần Đề, tỉnh Sóc Trăng . Mục tiêu đề tài - Kho sát s hin din E. coli sinh men  -lactamase ph. coli (ETEC): E. coli c t rut. - Enteroinvasive E. coli (EIEC): E. coli xâm nhp rut. - Enteroaggregative E. coli (EAEC): E. coli p rut. - Diffusely adherent E. coli (EAEC):