m Bộ y tê TRƯỜNG ĐẠI HỌC D ợ c HÀ NỘI = = === oOo = = === NGUYỄN ĐỨC DŨNG GÓP PHẦN NGHIÊN c ứ u LÊN MEN SINH TổNG HỢP KHÁNG SINH Từ CHỦNG XẠ KHUẨN STREPTOMYCES 19.2.11 (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 1999 - 2004) Người hướng dẫn : TS. CAO VĂN THƯ Nơi thực : Bộ môn Công nghiệp Dược Thời gian thực : 15/01/2004-^0/05/2004 Hà Nội tháng - 2004 MỜa&ÀALƠnt Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, em xin bày tỏ lòng cảm ơn tới: Thầy giáo, Tiến sĩ Cao Văn Thu. Người tận tình bảo giành nhiều thời gian giúp đỡ em suốt trình thực khoá luận. Nhân dịp em xin chân thành cảm Ơ1Í tới tất thầy, cô giáo, cán kỹ thuật viên thuộc Bộ môn Công nghiệp Dược toàn thể phòng ban, ban giám hiệu Trường Đại Học Dược Hà Nội, gia đình bạn bè tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành luận văn ỉ Hà Nội, ngày 19 tháng 05 năm 2004 Sinh viên Nguyễn Đức Dũng MỤC LỤC Tiêu đề Trang Đặt vấn đ ề Phần 1: Tổng quan 1.1. Vài nét kháng sinh 1.1.1. Định nghĩa: 1.1.2.Tính kháng kháng sinh: 1.2. Đặc điểm chung Streptomyces 1.2.1. Một số đặc điểm hình thái chi Streptomyces: 1.2.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá Streptomyces 1.2.3. Một số kháng sinh Streptomyces sinh tổng hợp . 1.3. Cải tạo giống vi sinh yật . 1.3.2. Đột biến nhân tạo . 1.4. Lên m en: .8 1.4.1. Lên men bề mặt 1.4.2. Lên men chìm 1.5. Chiết tách tinh chế: 10 1.5.1. Phương pháp chia cắt pha: 11 1.5.2. Phương pháp chuyển pha: 11 1.6. Mốt số thành tựu nghiên cứu sản xuất kháng sinh ứng dụng kháng sinh y học 15 1.6.1. Thành tựu nghiên cứu, sản xuất kháng sinh 15 1.6.2. ứng dụng kháng sinh y học 17 Phần :Thực nghiệm kết 19 2.1. Nguyên liệu phương pháp thực nghiệm 19 2.1.1.Nguyên vật liệu 19 2.1.2. Các phương pháp thực nghiệm . 24 2.2. Kết thực nghiệm nhận xét: .30 2.2.1 Khả sinh tổng hợp kháng sinh chủng Streptomyces 19.2.11 môi trường phân lập M T3 30 2.2.2. Lựa chọn môi trường nuôi cấy v s v kiểm định Streptomyces 19.2.11 31 2.2.3. Kết chọn lọc ngẫu nhiên: .32 2.2.4. Kết đột biến cải tạo giống: .33 2.2.5 Kết lựa chọn môi trường lên men chìm .34 2.2.6. Các kết lên men chìm 35 2.2.7 Ảnh hưởng pH đến độ bền vữngcủa kháng sinh 36 2.2.8. m en Lựa chọn dung môi chiết thích hợp kháng sinh từ dịch lên 37 2.2.9 Kết phân loại theo ISP .38 2.2.10. Kết sắc ký lớp mỏng : 38 2.2.11. Kết thử hoạt tính kháng sinh sinh khối: 39 Phần 3. Kết luận đề xuất . 40 3.1. Kết luận 40 3.2 Đề xuất .40 Phụ lục . Tài liệu tham khảo CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid Deoxyribonucleic As Aspergillus niger DIPIC 109 Be Bacillus cereus ATCC 9946 Bp Bacillus pumilus A T cc 10241 Bs Bacillus subtilis ATCC 6633 D (mm) Đường kính vòng vô khuẩn trung bình EC Escherichia coli ATCC 25922. Gy Grey - xám Hairy - tóc rối ISP International Streptomyces Project- Chương trình Streptomyces quốc tế. MT Môi trường MTdd Môi trường dung dịch Pro Proteus mirabilis BV 108 Pseu Pseudomonas aeruginosa VM 201 RA Rectinaculiaperti - móc câu, vòng xoắn đơn RAS Rectinaculiapertispirales - móc câu, vòng xoắn đơn, lò xo. s Độ lệch thực nghiệm chuẩn hiệu chỉnh. Sal Salmonella typhi DT 220. Shi Shigella flexneri DT 112 SI Sarcina lutea ATTC 9341 sm Smooth - nhẩn sp Spiny - gai Sta Staphylococcus aureus ATTC 1228 VK Vi khuẩn vsv Vi sinh vật Wa Sần sùi da CÓC y Yellow-V àng ĐẶT VÂN ĐỂ Năm 1928 Alexander Fleming lần phát Penicillin đến nhà khoa học tìm khoảng 20 họ kháng sinh khác với hàng ngàn sản phẩm bào chế dạng khác phục vụ cho công tác phòng chữa bệnh. Và người ta đánh giá kháng sinh số thuốc chữa bệnh cứu sống người hiệu nhất. Hiện mô hình bệnh tật Việt Nam giới diễn biến phức tạp bệnh nhiễm trùng tình hình vi sinh vật kháng thuốc ngày nhiều .Vì việc tìm kháng sinh đưa vào điều trị cần thiết. Kháng sinh tìm nhiều đường khác tổng hợp, bán tổng hợp. Trong tổng hợp kháng sinh công nghệ sinh học đóng vai trò quan trong. Trong số 8000 kháng sinh tìm có tới 60% lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ xạ khuẩn. Hơn điều kiện khí hậu Việt Nam tạo nên hệ sinh thái xạ khuẩn phát triển đa dạng phong phú chủng loại.Tại môn công nghiệp Dược trường đại học Dược Hà Nội khảo sát cho thấy chủng Streptomyces 19.2.11 chủng xạ khuẩn có khả sinh tổng hợp kháng sinh tốt có triển vọng ứng dụng thực tiễn. Chính chọn khoá luận với tiêu đề ”Góp phần nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ chủng xạ khuẩn Streptomyces 19.2.11” thực YỚi mục tiêu: 1. Chọn giống sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhờ chọn lọc ngẫu nhiên đột biến cải tạo giống. 2. Nghiên cứu môi trường điều kiện lên men tối ưu. 3. Nghiên cứu đặc điểm hình thái sinh lỷ nhằm phân loại xác định tên khoa học chủng Streptomyces 19.2.11. 4. Nghiên cứu quy trình chiết tách tinh chế sản phẩm. PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1. VÀI NÉT VỂ KHÁNG SINH 1.1.1. Định nghĩa [2],[3],[5],[11]: Kháng sinh (Antibiotic) sản phẩm đặc biệt nhận từ vi sinh vật, hay nguồn tự nhiên khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm tiêu diệt cách chọn lọc lên nhóm vi sinh vật xác định (vi khuẩn, nấm, nguyên sinh động v ậ t .) hay tế bào ung thư nồng độ thấp. 1.1.2.Tính kháng kháng sinh [2],[3],[5],[11]: Các nghiên cứu chứng tỏ vi khuẩn kháng kháng sinh vấn đề toàn cầu, bệnh nhiễm khuẩn nguyên nhân hàng đầu gây tử vong. Hiện người tìm thuốc để thay loại thuốc hiệu quả. Trong chạy đua để dành ưu vi khuẩn người, vi khuẩn vượt lên trước. Khả vi khuẩn biến đổi trở thành kháng thuốc khả người kiểm soát vi khuẩn cách xa nhau. 1.2. ĐẶC ĐIỂM CHUNG VỂ STREPTOMYCES[3] 1.2.1. Một Số đặc điểm hình thái chi Streptomyces: Streptomyces chi thuộc lớp phụ Actinomycetales phân bố rộng rãi tự nhiên nhiều nơi: đất, bùn ao hồ, cát, nước . Trung bình gam đất nói chung có triêu xạ khuẩn. Mật độ xạ khuẩn mẫu đất khác khác nhau, phụ thuộc nhiều điều kiện: môi trường độ ẩm, nhiệt độ, dinh dưỡng, pH . Streptomyces tạo khuẩn ty khí sinh khuẩn ty chất, khuẩn lạc hình thành sau vài ngày nuôi cấy thường có mầu sắc phong phú, hay gặp màu trắng, màu xám, màu tím . Khuẩn lạc thường có dạng thô ráp, dạng phấn, không suốt, có nếp toả hình phóng xạ. Khuẩn ty chất sinh trưởng có tính chất xốp, bề mặt nhẩn hoăc xù xì có xu hướng dính chặt vào môi trường. Khuẩn ty khí sinh có đường kính từ 0,5 - 1,4 |LIIĨ1 từ hình thành nên chuỗi bào tử. Đây sở sinh sản đặc trưng, chuỗi bào tử có cấu tạo gồm sợi trục, chức sinh sản, đoạn phân nhánh cuối có khả sinh bào tử. Trên nhánh có từ 10 - 100 bào tử. Bào tử hình cầu, elip . Đường kính bào tử có kính thước tương ứng với đường kính khuẩn ty. 1.2.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá Streptomyces. Streptomyces phát triển nhiệt độ từ 20 - 40 °c. Nhưng điều kiện phát triển tối thích 30 ± 2°c pH:7,0 ± 0,2. Một số đặc điểm Streptomyces tạo sắc tố hoà tan, khuẩn lạc có màu sắc khác môi trường nuôi cấy khác nhau, sở để giúp phân loại định tên loài cho chủng Streptomyces. Hầu hết loài Streptomyces vi khuẩn gram dương, hiếu khí, sống hoại sinh đất nước. Chúng có khả phân huỷ mạnh glucid, có thành tế bào kiểu I chứa DAP (diaminopimelat) glycin. 1.2.3. Một số kháng sinh streptomyces sinh tổng hợp Nhiều loài Streptomyces có khả sinh tổng hợp tạo nhiều loại thuộc nhiều nhóm kháng sinh khác như: aminoglycosid, phenicol, macrolidỉincosamid, tetracylin . > Nhóm aminosid + Streptomycin S.griseus (Waskman 1943) + Kanamycin S.kanamycetiusịUmezawa 1957) + Torbramycin S.tenebreus + Neomycin s.ýradie +Paromomycin s.rimosus formaparomomycinus + Spectimomycin S.pectabilis 'r Nhóm phenicol. + Cloramphenicol > Nhóm tetracyclin + Tetracylin S.aureofaciens + Oxytetracylin S.rimosus + Clotetracylin S.aureofaciens > Nhóm macrolid: + Erythromycin S.erythreus + Oleandomycin S.antibioticus + Spiramycin s.ambofaciens y Nhóm lincosamid + Lincomycin S.lincolnensis r Kháng sinh chống nấm + Nystatin S.noursei + Amphotericin B s. nodosus 1.3. CẢI TẠO GIỐNG VI SINH VẬT [1],[4],[7],[8],[11] Hầu hết vi sinh vật sinh kháng sinh phân lập từ chất thiên nhiên thường có hoạt tính thấp, không đáp ứng yêu cầu sản xuất. Do đó, để thu chủng có hoạt tính cao, ổn định đưa vào sản xuất cần phải tiến hành cải tạo giống biện pháp khác nhau. 1.3.1. Chọn lọc ngẫu nhiên[7],[ll] Các vi sinh vật biến dị tự nhiên theo tần sô khác có cá thể tăng hoạt tính kháng sinh so YỚi cá thể khác. Ta cần chọn lấy cá thể có hoạt tính cao để nghiên cứu tiếp. Trên thực tế tần suất xuất biến chủng dương tính thấp việc chọn lọc tự nhiên cá thể có hoạt tính kháng sinh cao để nghiên cứu ban đầu có giá trị áp dụng vào sản xuất, để thu chủng có khả sinh tổng hợp kháng sinh cao ta phải cải tạo giống. 1.3.2. Đột biến nhân tạo [4]: Đột biến trình làm thay đổi trình tự xếp bazơ thay đổi thân bazơ ADN. Các yếu tố gây đột biến tác nhân gây đột biến làm thay đổi vài nhược điểm giống. Đột biến nhân tạo đột biến tạo tác nhân đột biến với mục đích nhằm nâng cao tần suất xuất đột biến. Ngày nay, với phát triển mạnh mẽ di truyền học đại việc tìm chất gen, hiểu chất đột biến trình phát sinh đột biến. Người ta có khả tạo đột biến mạnh để tăng hiệu trình nghiên cứu sản xuất. > Các tác nhân đột biến: + Tác nhân vật lý: Tia X, ánh sáng u v , tia Ỵ . + Tác nhân hoá học: N - mustar, ethylenimin, HN02 . + Tác nhân sinh học: Đột biến tượng thiếu bazơ, nitơ hay tác động gen gây đột biến. Trong khoá luận nghiên cứu cải tạo giống cách gây đột biến ánh sáng tử ngoại. Tia u v có khả đâm thấu tới nhân với tế bào vi sinh vật nên sử dụng rộng rãi công việc cải tạo giống. > Cơ chê gây đột biến tia UV: - Xác định sắc tố melanin: Nuôi cấy xạ khuẩn môi trường ISP6, ISP7 hấp tiệt trùng, quan sát ngày thứ ,thứ 4, Nếu có ký hiệu 1, ngược lại ký hiệu 0. - Khả tiêu thụ nguồn carbon: Nuôi cấy xạ khuẩn môi trường chứa nguồn carbonhydrat khác ( ISP9) đánh giá ngày thứ 10-16. Nếu xạ khuẩn phát triển đánh dấu (+), không đánh dấu (-), không rõ ràng đánh dấu (±), phát triển mạnh so với glucose đánh dấu (++). 2.2. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT: 2.2.1 Khả sinh tổng hợp kháng sinh chủng Streptomyces 19.2.11 môi trường phân lập MT3 Chủng Streptomyces 19.2.11 cấy MT3 sau ngày thử khả sinh tổng hợp kháng sinh môi trường thạch thường có chứa v s v kiểm định. Kết giới thiệu ỏ bảng 2. Bảng 2: Hoạt tính kháng sinh chủng Streptomyces 19.2.11 số v s v kiểm định vsv kiểm định Bc Bp Bs 5/ sta EC Pro Pseu 12,60 13,00 13,50 14,00 15,40 14,90 15,00 13,21 Shi Sai Đường kính vòng vô 14,34 12,57 khuẩn(mm) Rhận xét: Sau đánh giá kết thử nhiều chủng Streptomyces (số liệu không công bố), định chọn chủng Streptomyces 19.2.11 để tiến hành nghiên cứu tiếp theo. 28 2.2.2. Lựa chọn môi trường nuôi cấy v s v kiểm định Streptomyces 19.2.11 Streptomyces 19.2.11 nuôi cấy môi trường từ MT1-Ĩ-MT7. Sau ngày tiến hành thử khả sinh tổng hợp kháng sinh. Kết khảo sát giới thiệu bảng 3. Bảng 3: Kết thử hoạt tính kháng sinh chủng Streptomyces 19.2.11 môi trường khác \ MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 D (mm) D (mm) D (mm) D (mm) D (mm) Bc 11,93 14,16 15,76 12,23 12,33 Bs 13,56 16,96 18,46 13,90 13,83 Pro 11,13 13,06 14,96 11,53 11,33 Bp 12,16 14,13 15,26 11,06 14,63 Sal 12,83 15,16 15,36 12,83 12,90 EC 12,13 14,13 16,13 11,84 13,12 SỊ 14,66 16,56 19,76 16,50 17,20 Shi 12,56 15,40 15,93 12,43 12,96 sta 12,83 14,56 16,20 12,70 12,20 Pseu 11,73 13,16 15,50 13,76 12,36 MT vsv\ Rhận x é t: + Trên MT6 MT7 Streptomyces 19.2.11 không phát triển (nên không đưa vào bảng kết quả). + Từ bảng ta xác định môi trường ( MT3 ) môi trường thích hợp để nuôi cấy xạ khuẩn cho hoạt tính kháng sinh tốt nhất. + Hai loại v s v kiểm định tiêu biểu Bs EC. 29 2.2.3. Kết chọn lọc ngẫu nhiên: Giống xạ khuẩn Streptomyces 19.2.11 đủ ngày tuổi sàng lọc ngẫu nhiên để nhận chủng có hoạt tính sinh tổng hợp kháng sinh cao nhất. Kết giới thiệu bảng 4. Bảng : Kết sàng lọc ngẫu nhiên Steptomycesl9.2.11 Bs EC Biến ch ủ n g ^'\^ D (mm) s D (mm) s 13,28 0,99 12,88 0,78 13,63 0,71 13,86 0,95 13,75 0,60 13,68 0,58 13,53 0,12 13,64 0,11 13,97 0,53 13,65 0,82 14,95 0,42 14,55 0,91 15,05 0,78 13,98 0,90 14,22 0,26 13,30 0,50 14,53 0,59 13,65 0,17 10 14,60 0,83 12,59 0,45 ĩ S - s — — — m — 13,19 0,51 ■ H ■ 0,89 13,59 0,86 14,57 0,59 14,10 0,80 15,54 0,86 14,23 0,65 M U ■ M U ■ 19 14,29 0,55 14,22 0,67 20 14,21 0,82 14,17 0,56 21 14,05 0,84 14,23 0,64 22 14,25 0,34 14,19 0,55 23 15,08 0,74 13,85 0,24 24 15,01 1,09 13,79 0,23 13 15,15 Mi 181! 15 15,28 16 17 0,73 30 25 14,54 0,14 13,63 0,46 26 14,36 0,74 14,37 0,14 27 14,29 0,32 14,41 0,05 28 14,15 0,27 13,02 0,48 Wầ ¡S i ■ ■ H 30 13,78 0,42 13,52 liB B 0,50 31 13,58 0,36 14,01 0,52 32 13,86 0,41 13,85 0,31 B lil Rhận xét: Sau sàng lọc ta chọn biến chủng có hoạt tính kháng sinh cao biến chủng 11, 12, 14, 18 29. Các biến chủng sử dụng nghiên cứu tiếp theo. 2.2.4. Kết đột biến cải tạo giống: Tiến hành đột biến bào tử Streptomyces 19.2.11 ánh sáng u v ( X = 254 nm ), khoảng cách 40 cm, thời gian phút. Tỷ lệ sống sót sau đột biến 0,32%. Kết thử hoạt tính kháng sinh biến chủng giới thiệu bảng 5. Bảng 5:Kết thử hoạt tính kháng sinh sau đột biến Biến chủng B.subtilis E.Coli Kết s D (mm) % biến đổi hoạt tính s D (mm) % biến đổi hoạt tính 12.1 15,43 0,06 125,96 16,10 0,31 120,78 12.2 14,43 1,07 117,80 17,07 0,01 128,06 12.3 15,53 1,31 126,78 16,67 0,42 125,06 12.4 15,36 0,80 125,39 16,57 0,82 124,31 - . . ■ 31 — 12.8 15,00 0,89 122,45 16,63 0,75 124,76 12.9 15,03 1,05 122,69 16,89 0,52 126,71 U M ■ ■ ■ ■R R 12.11 15,16 1,18 123,76 17,30 0,95 129,78 12.12 14,33 0,51 116,98 17,00 0,20 127,53 12.13 15,68 0,99 128,00 16,10 0,96 120,78 12.14 14,60 0,78 119,18 15,23 0,26 114,25 12.15 14,00 0,85 114,29 14,05 0,45 105,40 12.16 15,10 0,17 123,27 15,45 0,47 115,90 12.17 13,65 0,75 111,43 14,87 0,62 111,55 Chứng 12,25 0,06 13,33 0,56 ¡§ ¡¡¡¡¡1 | Rhận xét: Như sau đột biến ta thu biến chủng có hoạt tính kháng sinh tăng rõ rệt là: 12.5, 12.6, 12.7, 12.10. Nhất biến chủng 12.6 có % biến đổi hoạt tính chủng cao E.Coli B.subtilis. 2.2.5 Kết lựa chọn môi trường lên men chìm. Tiến hành lên men chìm biến chủng 12 sau sàng lọc ngẫu nhiên máy lắc để lựa chọn môi trường lên men tốt nhất, kết giới thiệu bảng 6. Bảng6: Kết thử hoạt tính kháng sinh lên men chìm. B.subtilis E.Coli Môi trường Lên men D (mm) s D (mm) s MT2dd 13,46 0,19 14,78 0,05 MT3dd 10,18 0,45 10,03 0,20 MT4dd 10,11 0,26 10,42 0,51 32 Như nhìn vào bảng ta thấy môi trường MT2dd môi trường tốt để lên men chìm. Chủng Streptomyces 19.2.11 có khả sinh tổng hợp kháng sinh tốt lên men bề mặt MT3 lên men chìm MT2dd sở tốt nghiên cứu tiếp theo. 2.2.6. Các kết lên men chìm. Đã tiến hành lên men chìm máy lắc với biến chủng Streptomyces 19.2.11, kết giới thiệu bảng bảng 8. Bảng 7.Kết lên men chìm biến chủng sau sàng lọc tự nhiên \ ỵ s v kiểm định Biến chủng B.subtilis E.Coli D (mm) s D (mm) s 19.2.11.12 14,44 0,34 15,37 0,78 19.2.11.18 6,21 0,02 8,12 0,26 19.2.11.29 8,89 0,56 10,26 0,25 33 Bảng 8. Kết lên men chìm đối vói biến chủng sau đột biến ĩlhận x é t : Như sau cải tạo giống lần dịch lọc dịch lên men biến chủng dau đột biến có hoạt tính kháng sinh cao lần 1, chứng tỏ biến chủng sau cải tạo lần có đặc tính tốt lần 1. Nhất biến chủng 12.7 ta giữ lại dịch lọc để làm thí nghiệm tiếp theo. 2.2.7 Ảnh hưởng pH đến độ bền vững kháng sinh. Đã tiến hành khảo sát thay đổi hoạt tính kháng sinh pH khác sau ngày ngày phương pháp giếng thạch. Kết trình bày bảng 9. Bảng 9.Ảnh hưởng pH đến độ bền vững kháng sinh Đường kính vòng vô khuẩn(mm) pH Sau ngày EC Sau ngày Bs EC Bs 13,57 10,96 13,67 13,77 13,44 13,13 9,56 10,74 16,53 17,63 15,89 16,99 15,97 14,29 15,37 15,32 11 14,83 15,84 14,59 14,52 34 Rhận xét: + Từ bảng ta thấy kháng sinh ổn định giữ hoạt tính pH 7-11. + Tại pH =7 hoạt tính không sinh bền ổn định nhất. + PH = 3-5 hoạt tính kháng sinh giảm dần, giảm mạnh pH = 5. 2.2.8. Lựa chọn dung môi chiết thích hợp kháng sinh từ dịch lên men Đã sử dụng dung môi chiết khác để chiết kháng sinh. Tiến hành chiết pH 3, 5, 7, 9, 11. Đánh giá hoạt tính kháng sinh pha dung môi hữu ( dmhc ), pha dịch lọc ( N ). Kết thể bảng lOa, lOb. Bảng 10a:Hoạt tính kháng sinh sau chiết dung môi hữu đối vói E.Coli PH 11 Chloroform N dmhc 8,37 16,35 0,00 9,99 19,81 0,00 14,56 0,00 13,78 0,00 Đuừng kính vòng vô khuẩn (mm) n-Butanol Butyl acetat N N dmhc dmhc 14,64 0,00 8,48 0,00 7,88 0,00 7,30 0,00 15,72 0,00 10,15 0,00 11,22 0,00 8,51 0,00 0,00 6,80 0,00 8,84 Bảng lOb: Hoạt tính kháng sinh sau chiết dung môi hữu B.subtilỉs PH 11 Chloroform N dmhc 16,12 6,33 9,02 0,00 22,17 0,00 0,00 17,82 15,92 0,00 Đu'ờng kính vòng vô khuẩn (mm) Butyl acetat n-Butanol N dmhc N dmhc 10,42 8,88 0,00 0,00 7,02 8,75 0,00 0,00 16,26 0,00 16,38 0,00 10,58 0,00 0,00 11,34 8,98 9,86 0,00 0,00 35 Rhận xét: Từ bảng 10a, lOb ta thấy: + Butylacetat, n-Butanol không chiết kháng sinh từ dịch lọc tất pH. + Chloroform dung môi có khả chiết kháng sinh tốt hoàn toàn chiết lần pH = 7. + Chloroform dung môi sử dụng cho nghiên cứu chiết tách phòng thí nghiệm. 2.2.9 Kết phân loại theo ISP Chủng Streptomyces 19.2.11 nuôi cấy môi trường ISP. Kết giới thiệu bảng 11. Bảngll: Kết phân loại Streptomyces 19.2.11 Các đặc điểm phân loại Màu khuẩn ty khí sinh Sắc tố melanin Màu khuẩn ty chất Sắc tố hoà tan Chuỗi bào tử Bề măt bào tử Arabinose Xylose Inositol Manitol Fructose Rhamnose Saccarose Raffinose Glucose Streptomyces 19.2.11 Gy s wa + + + + + + + + + Streptomyces. sp Rhận xét: Qua trình tra cứu khoá phân loại theo ISP không tìm loài Streptomyces có đầy đủ tất đặc điểm chủng Streptomyces 19.2.11 loài chi Streptomyces tìm thấy. 36 2.2.10. Kết sắc ký lớp mỏng : Dịch chiết kháng sinh dung môi Chloroform sử dụng để chấm sắc ký. Với 25 hệ dung môi, chọn hệ dung môi độc lập tách tốt. Kết giới thiệu bảng 12. Bảngl2.Kết sắc ký lớp mỏng Rf Hệ dung môi uv vsv 0,73 Hê Hê 0,61 0,73 0,61 Hê3 0,68 0,68 + Hệl: n-butyl acetat : methanol: aceton (8:1:1) + Hệ2: Chloroform : ethanol : nước ( : : ) + Hệ3: Ethyl acetat: n-butanol: a.acetic ( : : ) Rhận xét: Kết sắc ký soi đèn tử ngoại u v phương pháp vi sinh vật cho phép ta kết luận dịch chiết có thành phần kháng sinh. 2.2.11. Kết thử hoạt tính kháng sinh sinh khối: Sinh khối sau sấy khô, nghiền lg sinh khối ngâm 5ml Chloroform. Đánh giá hoạt tính kháng sinh phương pháp khoanh giấy lọc. Kết cho thấy dịch chiết kháng sinh từ sinh khối hoạt tính. Như sơ kết luận chủng Streptomyces 19.2.11 có khả sinh tổng hợp kháng sinh ngoại bào, không giữ lại kháng sinh nội bào. 37 PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUÂT 3.1. KẾT LUẬN Qua trình nghiên cứu từ kết thực nghiệm hoàn thành mục tiêu đề có kết luận sau: > Sau cải tạo giống phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên đột biến nhân lạo chọn biến chủng có hoạt tính kháng sinh tăng rõ lệt, hiệu xuất sinh tổng hợp kháng sinh tăng mạnh. r Đã chọn môi trường MT2 môi trường lên men tối thích. r Dung môi Chloroform có khả chiết kháng sinh tốt pH=7. > Đã xác định đặc điểm hình thái sinh lý chủng Streptomyces 19.2.11. > Đã chọn ba hệ dung môi độc lập chạy sắc ký tốt. Kết cho vết kháng sinh phát ánh sáng uv trùng với vết khány; sinh hình v s v . Kết luận kháng sinh Streptomyces 19.2.11 đơn thành phần. 3.2 ĐỂ XUẤT r Tiếp tục nghiên cứu độ ổn định kháng sinh dung mồi Chloroform. r Nghiên cứu điều kiện tối ưu hoá lên men kháng sinh từ chủng Streptomyces 19.2.11. r Nghiên cứu trình chiết tách, tinh chế xác định cấu trúc hoá học kháng sinh này. r Tiếp tục nghiên cứu xác định tên khoa học Streptomyces 19.2.11. 38 PHỤ LỤC Hình 2. Bề mặt bào tử (độ phóng đại 20000 lần) Hình 3. Kết thử hoạt tính kháng sinh sau đột biến ánh sáng u v Hình 4. Kết thử hoạt tính kháng sinh dịch lên men B.subtiỉis TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Kiều Hữu Ảnh (1999), Giáo trình v s v học công nghiệp, NXB khoa học kỹ thuật. [2]. Bộ y tế (2002), Dược điển Việt Nam III, NXB Y học. [3]. Nguyễn Lân Dũng (1975), Vi sinh vật học, NXB Đại học trung học chuyên nghiệp. [4]. Kiều Khắc Đôn (chủ biên) (1999), Vi sinh vật học, Trường Đại học Dược Hà Nội. [5]. Đỗ Thu Hà (2002), "Định loại chủng xạ khuẩn Streptomyces ĐN-05 sinh chất kháng sinh có hoạt phổ rộng phân lập từ đất tỉnh Quảng Nam", Tạp chí sinh học, tập 24, số 1, trang 59-63. [6]. Phạm Gia Huệ,Trần Tử An (1998), Hoá phân tích II, Trường Đại học Dược Hà Nội. [7]. Từ Minh Koóng (chủ biên) (2001), Kỹ thuật sản xuất dược phẩml, Trường Đại học Dược Hà Nội. [8]. Lương Đức Phẩm (1998), Công nghệ v s v , NXB nông nghiệp. [9]. Hồ Viết Quý ( 2000), Chiết tách, phân chia, xác định chất dung môi hữu cơ, tập 1, NXB khoa học kỹ thuật. [10]. Trần Thị Thanh (2001), Công nghệ vi sinh, NXB khoa học kỹ thuật. [11]. Cao Văn Thu (1998), Bài giảng kháng sinh vừamin, Hà Nội. [12]. André A. Neves, Luis M. Vieira and José' C.Menezes (2001), "Effect of Preculture Variability on Clavulanic Acid Fermentation",Biotechnology and Bioengineering, Vol.72, No.6, P.628632. [13]. Chang Joon Kim, Yong Keun Chang, Gie-Taek Chun, Yeon Ho Jeong and Sang Jong Lee (2001), "Continuous Culture of Immobilized Streptomyces Cell for Kasugamycin Production", Biotechnology Progress, Vol.l7,No.3, P.453-461. [14]. E. B Shirling & D. Gottlieb (1966), "Methods for characterozation of Streptomyces Species", IntJ.Syst.Bacteriol, Vol.16, No.3, P.313-340. [15]. E. B Shirling & D. Gottlieb (1968), "Cooperative description of type culture of Streptomyces", IntJ.Syst.Bateriol, Vol.18, No.2, P.69-189. [16]. Johanes A. Roubos, Preben Kraben, Wim, T.A.M. Delaat, Robert Babuska and Joseph J.Heijnen (2002). "Clavulanic Acid Degradation in Streptomyces clavuligerus Fed-Batch Cultivations", Biotechnology Pregress, Vol. 18, No.3, P.451-457. [...]... tính kháng sinh của chủng Streptomyces 19. 2. 11 trên các môi trường khác nhau MT1 MT3 MT4 MT5 D (mm) D (mm) D (mm) D (mm) D (mm) Bc 11, 93 14,16 15,76 12, 23 12, 33 Bs 13,56 16,96 18,46 13,90 13,83 Pro 11, 13 13,06 14,96 11, 53 11, 33 Bp 12, 16 14,13 15 ,26 11, 06 14,63 Sal 12, 83 15,16 15,36 12, 83 12, 90 EC 12, 13 14,13 16,13 11, 84 13, 12 SỊ 14,66 16,56 19, 76 16,50 17 ,20 Shi 12, 56 15,40 15,93 12, 43 12, 96 sta 12, 83... đánh giá kết quả thử trên nhiều chủng Streptomyces (số liệu không công bố), chúng tôi quyết định chọn chủng Streptomyces 19. 2. 11 để tiến hành nghiên cứu tiếp theo 28 2. 2 .2 Lựa chọn môi trường nuôi cấy và các v s v kiểm định đối với Streptomyces 19. 2. 11 Streptomyces 19. 2. 11 được nuôi cấy trên 7 môi trường từ MT1-Ĩ-MT7 Sau 6 ngày tiến hành thử khả năng sinh tổng hợp kháng sinh Kết quả khảo sát được giới... 1.4 LÊN MEN [1],[7],[8],[10], [11] : Lên men là quá trình nuôi cấy vi sinh vật trong điều kiện tối ưu để sản xuất các sản phẩm trao đổi chất nhờ các vi sinh vật ấy hoặc các thành phần tế bào của chúng Hầu hết các kháng sinh hiện có đều là sản phẩm của quá trình lên men hoặc bán tổng hợp rất ít kháng sinh có thể tổng hợp toàn phần như cloramphenicol Có 2 kiểu lên men chính: + Lên men bề mặt, + Lên men. .. 8 14 ,22 0 ,26 13,30 0,50 9 14,53 0,59 13,65 0,17 10 14,60 0,83 12, 59 0,45 ĩ S - s — 5 — — m — 13 ,19 0,51 ■ H ■ 0,89 13,59 0,86 14,57 0,59 14,10 0,80 15,54 0,86 14 ,23 0,65 M U ■ M U ■ 19 14 ,29 0,55 14 ,22 0,67 20 14 ,21 0, 82 14,17 0,56 21 14,05 0,84 14 ,23 0,64 22 14 ,25 0,34 14 ,19 0,55 23 15,08 0,74 13,85 0 ,24 24 15,01 1,09 13,79 0 ,23 13 15,15 Mi 181! 15 15 ,28 16 17 0,73 30 25 14,54 0,14 13,63 0,46 26 14,36... 0,14 27 14 ,29 0, 32 14,41 0,05 28 14,15 0 ,27 13, 02 0,48 W ầ ¡S i ■ ■ H 30 13,78 0, 42 13, 52 liB B 0,50 31 13,58 0,36 14,01 0, 52 32 13,86 0,41 13,85 0,31 B lil Rhận xét: Sau khi sàng lọc ta chọn được 5 biến chủng có hoạt tính kháng sinh cao nhất là biến chủng 11, 12, 14, 18 và 29 Các biến chủng này được sử dụng ở nghiên cứu tiếp theo 2. 2.4 Kết quả đột biến cải tạo giống: Tiến hành đột biến bào tử Streptomyces. .. 16 ,20 12, 70 12, 20 Pseu \ MT2 11, 73 13,16 15,50 13,76 12, 36 MT vsv\ Rhận x é t: + Trên MT6 và MT7 Streptomyces 19. 2. 11 không phát triển (nên không đưa vào bảng kết quả) + Từ bảng trên ta xác định được môi trường ( MT3 ) là môi trường thích hợp nhất để nuôi cấy xạ khuẩn cho hoạt tính kháng sinh tốt nhất + Hai loại v s v kiểm định tiêu biểu là Bs và EC 29 2. 2.3 Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên: Giống xạ khuẩn. .. Streptomyces 19. 2. 11 được cấy trên MT3 sau 6 ngày được thử khả năng sinh tổng hợp kháng sinh trên môi trường thạch thường có chứa v s v kiểm định Kết quả được giới thiệu ỏ bảng 2 Bảng 2: Hoạt tính kháng sinh của chủng Streptomyces 19. 2. 11 trên một số v s v kiểm định vsv kiểm định Bc Bp Bs 5/ sta EC Pro Pseu 12, 60 13,00 13,50 14,00 15,40 14,90 15,00 13 ,21 Shi Sai Đường kính vòng vô 14,34 12, 57 khuẩn( mm)... ATCC 9341 (Sl) • Vi khuẩn Gram (-): Escherichia Coli ATCC 25 922 (EC) Proteus mirabilis BV Shigella flexneri DT 1 12 (Shi) Salmonella typhi DT 22 0 (Sal) 20 1 (Pseu) Pseudomonas aeruginosa VM 108 (Pro) 'r Các mồi trường sử dụng được giới thiệu ở bảng 1 17 Bdng ỉ : Thành phần các môi trường sử dụng (g/lOOml) Thành phần MT1 MTldd MT2 MT2dd Tinh bôt 2 2 2 lactose MT4 2, 4 1 MT7 MT7 dd 2 2 3 3 2 Glucose 0,5 Cao... cấy xạ khuẩn trong các môi trường chứa các nguồn carbonhydrat khác nhau ( ISP9) đánh giá ở ngày thứ 10-16 Nếu xạ khuẩn phát triển đánh dấu (+), nếu không đánh dấu (-), nếu không rõ ràng đánh dấu (±), nếu phát triển rất mạnh so với glucose đánh dấu (++) 2. 2 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT: 2. 2.1 Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng Streptomyces 19. 2. 11 trên môi trường phân lập MT3 Chủng Streptomyces. .. DỤNG KHÁNG SINH NGOÀI Y HỌC 1.6.1 Thành tựu trong nghiên cứu, sản xuất kháng sinh [ 12] ,[13],[16]: * Ảnh hưởng của giai đoạn tiền lên men trong lên men acid Clavulanic [ 12] Acid Clavulanic là một kháng sinh thuộc nhóm p - lactam, được tạo thành từ chủng Streptomyces clavuligerus Trong công trình này André A Neves và cộng sự đã tiến hành lên men trong hai nhóm A& B: - Nhóm A: Tỷ lệ giống cấy vào bình lên . tiêu đề Góp phần nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ chủng xạ khuẩn Streptomyces 19. 2. 11 được thực hiện YỚi 4 mục tiêu: 1. Chọn giống sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất nhờ chọn lọc. = = == = NGUYỄN ĐỨC DŨNG m GÓP PHẦN NGHIÊN c ứ u LÊN MEN SINH TổNG HỢP KHÁNG SINH Từ CHỦNG XẠ KHUẨN STREPTOMYCES 19. 2. 11 (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 199 9 - 20 04) Người hướng dẫn Nơi. quá trình lên men hoặc bán tổng hợp rất ít kháng sinh có thể tổng hợp toàn phần như cloramphenicol. Có 2 kiểu lên men chính: + Lên men bề mặt, + Lên men chìm. 1.4.1. Lên men bề mặt. Vi sinh vật