BỘ GIÁO DỤC VÀO ðÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP & PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM HÀ THỊ ANH THƯ NHÂN NHANH KHOAI LANG SỬ DỤNG NUÔI CẤY THOÁNG KHÍ LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI - 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀO ðÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP & PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM HÀ THỊ ANH THƯ NHÂN NHANH KHOAI LANG SỬ DỤNG NUÔI CẤY THOÁNG KHÍ Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã ngành : 60.42.02.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS VŨ ðÌNH HÒA HÀ NỘI - 2015 LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan toàn số liệu kết nghiên cứu luận văn tốt nghiệp trung thực, không trùng lặp, không chép ñề tài, công trình khoa học khác. Tôi xin cam ñoan thông tin trích dẫn luận văn ñều ñược ghi rõ nguồn gốc. Học viên Hà Thị Anh Thư Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i LỜI CẢM ƠN Trong trình thực luận văn, ñã nhận ñược quan tâm, giúp ñỡ nhiều cá nhân quý quan ñơn vị. Nay luận văn ñã hoàn thành, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc tới: PGS. TS. Vũ ðình Hòa, người ñã tận tình hướng dẫn tạo ñiều kiện, giúp ñỡ nghiên cứu thực ñề tài; Các thầy giáo, cô giáo Khoa Công nghệ sinh học, Học viện nông nghiệp Việt Nam ñã nhiệt tình giảng dạy tạo ñiều kiện cho hoàn thành khóa học; Viện Cây lương thực Cây thực phẩm, cán bộ, kỹ thuật viên môn Công nghệ sinh học môn Cây có củ Viện Cây lương thực Cây thực phẩm ñã nhiệt tình cung cấp vật liệu, hướng dẫn, giúp ñỡ tạo ñiều kiện cho thực thí nghiệm nghiên cứu hoàn thành luận văn; Trường ðại học Hải Dương ñã tạo ñiều kiện thuận lợi cho trình học tập nghiên cứu giúp hoàn thành khóa học luận văn mình; Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn người thân gia ñình bạn bè ñã giúp ñỡ ñộng viên suốt trình học tập nghiên cứu. Hà Nội, tháng 12 năm 2014 Học viên Hà Thị Anh Thư Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii MỤC LỤC LỜI CAM ðOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix MỞ ðẦU 1. Tính cấp thiết ñề tài 2. Mục ñích Chương : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung khoai lang 1.1.1. Nguồn gốc phân loại 1.1.2. ðặc ñiểm thực vật học 1.2. Giá trị khoai lang 1.3. Các phương thức nhân giống khoai lang 1.3.1. Tổng quan nuôi cấy in vitro thực vật 1.3.2. Các giai ñoạn nuôi cấy in vitro thực vật 10 1.3.3. Vai trò chất ñiều tiết sinh trưởng 11 1.3.4. Vai trò nhân tố môi trường Carbon 13 1.4. Nuôi cấy in vitro thoáng khí 15 1.5. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy in vitro khoai lang 19 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. 26 Chuẩn bị thực liệu, mẫu cấy, môi trường nuôi cấy ñiều kiện nuôi cấy 26 2.2. Xác ñịnh thời gian khử trùng thích hợp 27 2.3. Ảnh hưởng chất ñiều tiết sinh trưởng ñến khả nhân chồi Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 27 Page iii 2.3.1. Ảnh hưởng nồng ñộ GA3, Kinetin BAP ñến khả nhân chồi 27 2.3.2. Ảnh hưởng tổ hợp BAP IAA ñến khả nhân chồi 28 2.3.3. Ảnh hưởng nước dừa ñến khả nhân chồi sinh trưởng chồi 2.4. 28 Ảnh hưởng α-NAA ñến khả tạo rễ chồi tạo hoàn chỉnh 2.5. 28 Ảnh hưởng ñiều kiện nuôi cấy (thoáng khí không thoáng khí truyền thống) tới tạo chồi sinh trưởng chồi 2.6. 28 Ảnh hưởng ñiều kiện nuôi cấy (thoáng khí không thoáng 29 khí truyền thống) tới khả rễ chồi 2.7. Ảnh hưởng giá thể ñến tỉ lệ sống sót khả sinh trưởng in vitro nuôi thoáng khí nuôi truyền thống kín khí. 29 2.8. Các tiêu ñược theo dõi tính toán 30 2.9. Thu thập xử lý số liệu 31 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. 33 Ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% NaClO 2% ñến tỷ lệ sống mẫu cấy 33 3.1.1. Ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% + giọt tween ñến tỉ lệ sống mẫu cấy 33 3.1.2. Ảnh hưởng thời gian khử trùng NaClO 2,0% + giọt tween ñến tỉ lệ sống mẫu cấy 3.2. 34 Ảnh hưởng chất ñiều tiết sinh trưởng (GA3, Kinetin BAP) ñến khả nhân chồi 37 3.2.1. Ảnh hưởng nồng ñộ GA3 ñến khả nhân nhanh chồi 38 3.2.2. Ảnh hưởng nồng ñộ Kinetin ñến khả nhân nhanh chồi 41 3.2.3. Ảnh hưởng nồng ñộ BAP ñến khả nhân nhanh chồi 45 3.3. Ảnh hưởng tổ hợp BAP IAA ñến khả nhân nhanh chồi khoai lang 51 3.4. Ảnh hưởng nước dừa ñến khả nhân nhanh chồi 54 3.5. Ảnh hưởng α-NAA ñến khả tạo rễ chồi khoai lang 57 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv 3.6. Ảnh hưởng phương pháp nuôi cấy (thoáng khí không thoáng khí) ñến khả nhân chồi 60 3.6.1. Ảnh hưởng phương pháp nuôi cấy ñến khả tạo chồi chất lượng chồi. 60 3.6.2. Ảnh hưởng phương pháp nuôi cấy ñến khả rễ chồi khoai lang in vitro. 64 3.6.3. Ảnh hưởng giá thể ñến khả thích nghi ex vitro khoai lang nuôi cấy hai phương pháp khác nhau. 66 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 72 PHỤ LỤC 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO 76 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 2.1. Thời gian khử trùng với HgCl2 0,1% NaClO 2% có bổ sung Tween 20 27 Bảng 3.1. Ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1% ñến tỉ lệ nhiễm, tỉ lệ chết tỉ lệ sống mẫu cấy 33 Bảng 3.2. Ảnh hưởng thời gian khử trùng NaClO 2,0% + giọt tween ñến tỉ lệ nhiễm, tỉ lệ chết tỉ lệ sống mẫu cấy 35 Bảng 3.3. Ảnh hưởng nồng ñộ GA3 ñến số lá, chiều cao chồi hệ số nhân chồi sau tuần nuôi cấy 38 Bảng 3.4. Ảnh hưởng nồng ñộ Kinetin ñến số trung bình, chiều cao trung bình hệ số nhân chồi sau tuần nuôi cấy 42 Bảng 3.5. Ảnh hưởng nồng ñộ BAP ñến số chiều cao trung bình chồi hệ số nhân chồi sau tuần nuôi cấy 45 Bảng 3.6. Ảnh hưởng tổ hợp BAP 1,0mg/l với IAA nồng ñộ khác ñến số lá, chiều cao trung bình chồi hệ số nhân chồi khoai lang 52 Bảng 3.7. Ảnh hưởng nồng ñộ nước dừa ñến số lá, chiều cao trung bình hệ số nhân chồi sau tuần nuôi cấy 55 Bảng 3.8. Ảnh hưởng nồng ñộ α - NAA ñến tỉ lệ rễ, số rễ chiều dài trung bình rễ sau tuần nuôi cấy 57 Bảng 3.9. Ảnh hưởng phương pháp nuôi cấy ñến số lá, chiều cao 61 chồi, hệ số nhân chồi chất lượng chồi sau tuần nuôi cấy Bảng 3.10. Ảnh hưởng phương pháp nuôi cấy ñến tỉ lệ rễ, số rễ chiều dài rễ chồi sau tuần nuôi cấy 64 Bảng 3.11. Ảnh hưởng giá thể ñến số sống, tỉ lệ sống chiều cao có nguồn gốc in vitro Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 67 Page vi DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 3.1: Biểu ñồ biểu thị tỷ lệ mẫu sống tổ hợp khoai lang khử trùng HgCl2 0,1% NaClO 2,0% + giọt tween mức thời gian khác 36 3.2: Mẫu sống thu ñược từ thí nghiệm khử trùng 37 3.3: Ảnh hưởng nồng ñộ chất ñiều tiết sinh trưởng GA3 ñến khả 39 nhân chồi tổ hợp khoai lang 3.4. Ảnh hưởng nồng ñộ chất ñiều tiết sinh trưởng GA3 ñến chất lượng chồi tổ hợp khoai lang 41 3.5. Ảnh hưởng nồng ñộ chất ñiều tiết sinh trưởng KIN ñến khả nhân chồi tổ hợp khoai lang 42 3.6. Ảnh hưởng nồng ñộ chất ñiều tiết sinh trưởng KIN ñến số chiều cao trung bình chồi tổ hợp khoai lang 44 3.7. Ảnh hưởng nồng ñộ chất ñiều tiết sinh trưởng BAP ñến khả nhân chồi tổ hợp khoai lang 46 3.8. Ảnh hưởng nồng ñộ chất ñiều tiết sinh trưởng BAP ñến số chiều cao trung bình chồi tổ hợp khoai lang 47 3.9. Hệ số nhân chồi tổ hợp khoai lang môi trường nuôi cấy bổ sung riêng rẽ nồng ñộ tối ưu GA3, KIN BAP 48 3.10. Cảm ứng tạo chồi MTN bổ sung riêng rẽ GA3, Kinetin BAP 49 3.11. Sự hình thành sinh trưởng chồi MTN bổ sung GA3, KIN BAP 50 3.12. Ảnh hưởng tổ hợp 1,0mg/l BAP IAA với nồng ñộ khác ñến khả nhân chồi khoai lang in vitro 52 3.13. Ảnh hưởng tổ hợp 1,0mg/l BAP IAA với nồng ñộ khác ñến số chiều cao trung bình chồi khoai lang Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 53 Page vii 3.14. Ảnh hưởng nồng ñộ nước dừa ñến khả nhân nhanh chồi 55 khoai lang in vitro 3.15. Ảnh hưởng nồng ñộ nước dừa ñến số chiều cao trung bình chồi khoai lang in vitro 56 3.16. Ảnh hưởng nồng ñộ α – NAA ñến khả tạo rễ chồi khoai lang tổ hợp lai 58 3.17. Ảnh hưởng nồng ñộ α – NAA ñến chiều dài rễ chồi khoai lang in vitro 58 3.18. Ảnh hưởng α – NAA ñến khả rễ chiều dài rễ 59 chồi khoai lang in vitro 3.19. Ảnh hưởng phương pháp nuôi cấy ñến khả tạo chồi tổ hợp khoai lang 61 3.20. Ảnh hưởng phương pháp nuôi cấy ñến số chiều cao trung bình chồi khoai lang in vitro 62 3.21: Sự khác biệt chồi khoai lang in vitro môi trường nhân chồi tối ưu với MTN bổ sung 1,0mg/l BAP 63 3.22. Biểu ñồ ảnh hưởng phương pháp nuôi cấy ñến khả rễ chiều dài rễ chồi khoai lang nuôi cấy 65 3.23. Hình ảnh ảnh hưởng phương pháp nuôi cấy ñến khả 65 rễ chiều dài rễ chồi khoai lang nuôi cấy 3.24. Ảnh hưởng phương pháp nuôi cấy ñến khả thích nghi khoai lang vườn ươm 67 3.25. Ảnh hưởng phương pháp nuôi cấy giá thể ñến sinh trưởng 68 giống khoai lang vườn ươm 3.26. Ảnh hưởng giá thể ñiều kiện nuôi cấy ñến sinh trưởng có nguồn gốc in vitro vườn ươm Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 69 Page viii Quan sát hình 3.21 nhận thấy cụm chồi sinh từ môi trường MTN + 1,0mg/l BAP + 0,5mg/l IAA + 20% ND nuôi cấy thoáng khí có chất lượng tốt hẳn cụm chồi sinh từ môi trường MTN + 1,0mg/l BAP nuôi kín khí truyền thống. Cụm chồi sinh từ môi trường MTN + 1,0mg/l BAP + 0,5mg/l IAA + 20% ND nuôi cấy thoáng khí có nhiề chồi hơn, chồi mập khỏe hơn, to xanh ñậm hơn. Hình thái màu sắc chồi giống với thực tế ngoài ñồng ruộng cụm chồi ñược tạo từ môi trường MTN + 1,0mg/l BAP nuôi kín khí truyền thống. ðiều ñó cho thấy môi trường MTN + 1,0mg/l BAP + 0,5mg/l IAA + 20% ND nuôi cấy thoáng khí ưu việt hơn. 3.6.2. Ảnh hưởng phương pháp nuôi cấy ñến khả rễ chồi khoai lang in vitro. Kết ñánh giá ảnh hưởng phương pháp nuôi cấy ñến khả rễ chồi khoai lang ñược thể bảng 3.10 hình 3.22, 3.23. Bảng 3.10. Ảnh hưởng phương pháp nuôi cấy ñến tỉ lệ rễ, số rễ chiều dài rễ chồi sau tuần nuôi cấy PP nuôi Tỷ lệ chồi rễ (%) Số rễ TB Chiều dài TB rễ (cm) cấy TH1 TH2 TH3 TH1 TH2 TH3 TH1 TH2 TH3 Kín khí 100 100 100 3,06 3,04 3,04 8,71 8,66 8,65 Thoáng khí 100 100 100 4,01 3,94 3,84 10 9,91 9,81 CV% 0,5 0,3 0,3 0,2 0,2 0,2 LSD5% 0,37 0,26 0,26 0,39 0,39 0,49 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 64 Hình 3.22. Biểu ñồ ảnh hưởng phương pháp nuôi cấy ñến khả rễ chiều dài rễ chồi khoai lang nuôi cấy Hình 3.23. Hình ảnh ảnh hưởng phương pháp nuôi cấy ñến khả rễ chiều dài rễ chồi khoai lang nuôi cấy TH3: KLT10 x HL6 – Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 65 Qua bảng số liệu 3.10, hình 3.22, 3.23 cho thấy, chồi mẫu khoai lang nuôi cấy phương pháp thoáng khí cho khả rễ tốt so với phương pháp nuôi cấy truyền thống, số rễ trung bình ñạt 3,84 – 4,01 rễ/chồi (so với 3,04 – 3,06 rễ/chồi phườn pháp truyền thống). Chiều dài rễ phương pháp nuôi cấy thoáng khí cho kết cao nhiều so với kết theo dõi phương pháp nuôi cấy truyền thống. Kết phân tích thống kê với mức ñộ tin cậy 95% cho thấy, công thức khác có sai khác có ý nghĩa số rễ trung bình chiều dài rễ. Tuy nhiên, tổ hợp khoai lang chênh lệch lớn số rễ chiều dài rễ so sánh riêng công thức. Như vậy, nuôi cấy in vitro thoáng khí cho hiệu tốt so với phương pháp truyền thống khả rễ chiều dài rễ tổ hợp khoai lang thí nghiệm. Cây khoai lang tạo phương pháp nuôi cấy thoáng khí có chất lượng tốt so với phương pháp nuôi cấy truyền thống. Tuy nhiên, ñể có ñánh giá xác chất lượng các phương pháp nuôi cấy ñề tài ñã tiến hành thí nghiệm ñánh giá khả thích ứng vườn ươm với nhóm tạo phương pháp nuôi cấy thoáng khí nuôi cấy truyền thống. 3.6.3. Ảnh hưởng giá thể ñến khả thích nghi ex vitro khoai lang nuôi cấy hai phương pháp khác nhau. Ba loại giá thể vườn ươm ñược sử dụng là: cát sạch, trấu hun + cát (tỷ lệ 1:1). Kết theo dõi tiêu ñánh giá sau tuần thí nghiệm ñược trình bày bảng 3.11, hình 3.24, hình 3.25. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 66 Bảng 3.11. Ảnh hưởng giá thể ñến số sống, tỉ lệ sống chiều cao có nguồn gốc in vitro Giá thể Tỷ lệ sống (%) Chiều cao (cm) Chất lượng TH1 TH2 TH3 TH1 TH2 TH3 TH1 TH2 TH3 Cây in vitro nuôi cấy truyền thống Cát Cát + trấu hun Trấu hun 51,86 52,59 71,48 6,00 6,21 6,04 80,37 75,20 77,78 7,62 7,69 7,31 73,70 78,52 73,33 6.74 6,91 6,74 Cây in vitro nuôi cấy thoáng khí Cát 100 100 99,26 10,81 10,45 10,29 Cát + trấu hun 99,63 100 100 12,61 12,45 12,34 Trấu hun 100 100 97,41 11,61 11,54 11,29 CV% 1,1 1,2 1,0 0,40 0,30 0,40 LSD5% 1,68 1,80 1,61 0,63 0,44 0,57 + + + + + + + ++ ++ + ++ ++ + ++ ++ Hình 3.24. Ảnh hưởng phương pháp nuôi cấy ñến khả thích nghi khoai lang vườn ươm Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 67 Hình 3.25. Ảnh hưởng phương pháp nuôi cấy giá thể ñến sinh trưởng giống khoai lang vườn ươm Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 68 Hình 3.26. Ảnh hưởng giá thể ñiều kiện nuôi cấy ñến sinh trưởng có nguồn gốc in vitro vườn ươm TH3: KLT10 x HL6 – Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 69 Qua bảng số liệu 3.11, hình 3.24, 3.25 3.26 cho thấy, tất công thức sử dụng ñược tạo phương pháp nuôi cấy in vitro thoáng khí cho tỷ lệ sống cao nhiều so với công thức sử dụng nuôi cấy truyền thống. Tỷ lệ sống công thức nuôi cấy thoáng khí cho ñạt từ 97,41% - 100% (so với 51,86% - 80,37% phương pháp nuôi cấy truyền thống). Trong ñó, với giá thể cát trộn trấu hun (tỷ lệ 1:1) cho tỷ lệ sống ñạt cao ñối với phương pháp nuôi cấy truyền thống (từ 99,63% 100%) phương pháp nuôi cấy truyền thống (75,20% - 80,37%). Không có chênh lệch lớn tổ hợp khoai lang ñược thử nghiệm. Tiến hành ñánh giá kết theo dõi tiêu chiều cao chất lượng vườn ươm sau tuần thích nghi công thức thí nghiệm cho thấy, nuôi cấy phương pháp thoáng khí vườn ươm ñều sinh trưởng phát triển tốt, dày sậm màu hơn, cho từ gần – mới, cao hơn, ñốt thân dày to mập khỏe nhiều ñặc biệt không bị rụng gốc (lá mô) so với nuôi cấy truyền thống cho từ gần ñến gần lá, ñốt thân thưa, gầy nhỏ rụng gần hết gốc. Như vậy, kết luận: - Cây ñược nuôi phương pháp thoáng khí có khả thích nghi cao hơn, sinh trưởng phát triển sau thích nghi tốt hẳn ñược nuôi phương pháp kín khí truyền thống; - Giá thể phù hợp cho khoai lang in vitro trấu hun + cát trộn theo tỷ lệ 1:1. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 70 SƠ ðỒ TỔNG QUÁT QUY TRÌNH NHÂN NHANH KHOAI LANG Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 71 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ Từ kết nghiên cứu rút số kết luận sau: 1) ðể nhân giống khoai lang ñoạn thân mang mắt ngủ ñiều kiện in vitro sử dụng dung dịch hoá chất HgCl2 0,1% 10 phút ñể khử trùng mẫu thích hợp cho tỷ lệ mẫu sống từ 54,33 – 56,67%; 2) Môi trường phù hợp cho nhân nhanh chồi khoai lang in vitro môi trường MS + 1,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l IAA + 20% nước dừa + 3% Saccarose + 0,8% Agar, pH = 5,8. cho hệ số nhân chồi ñạt 3,96 ñến 4,15 chồi/ mắt ngủ. 3) Môi trường rễ tối ưu cho chồi khoai lang MS + 0,3 mg/l α – NAA + 3% Saccarose + 0,8% Agar, pH = 5,8. ñạt số rễ trung bình 3,04 -3,06 rễ/chồi chiều dài trung bình rễ ñạt 8,66 – 8,07cm; 4) Sinh trưởng, chất lượng chồi chất lượng rễ nuôi cấy ñiều kiện thoáng khí ñạt 8,5 -8,8 lá/chồi, 6,60 – 6,92cm/chồi, 3,84 – 4,01 rễ/chồi, 9,81 -10,00cm/rễ, tỷ lệ sống thích nghi vườn ươm 100% ñạt từ 10,29 – 12,61cm/cây tốt so với ñiều kiện nuôi cấy kín khí truyền thống ñạt 6,8 – 7,0 lá/chồi, 5,01 – 5,22cm/chồi., 3,04 – 3,06 rễ/chồi, 8,65 – 8,71cm/rễ, tỷ lệ sống thích nghi vườn ươm từ 51,86 – 80,37%, ñạt từ 6,00 – 7,69cm/cây; 5) Giá thể phù hợp cho nuôi cấy in vitro trấu hun + cát trộn với tỷ lệ 1:1; Căn vào thực tế nghiên cứu tác giả ñề nghị : Cần tiếp tục hoàn thiện quy trình kỹ thuật nuôi cấy thoáng khí ñối với khoai lang ñoạn thân mang mắt ngủ với môi trường cải tiến rẻ hiệu sử dụng túi nilon thoáng khí, nuôi ánh sáng tự nhiên . Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 72 PHỤ LỤC PHỤ LỤC LỊCH SỬ NUÔI CẤY IN VITRO THỰC VẬT Sự kiện Năm Robert Hooke quan sát thấy tế bào sống kính hiển vi ñưa 1665 khái niệm tế bào. Năm 1838, Matthias Schleiden Theodore Schwann ñã ñề xướng học thuyết sinh học học thuyết tế bào Oscar Hertwing chứng minh quan sát kính hiển vi thụ thai 1875 hợp nhân trứng nhân tinh trùng. Sau ñó, Hermann P., Schneider F.A Butschli O. ñã mô tả xác trình phân chia tế bào 1883 1902 Wilhem Roux lần ñầu tiên lý giải phân bào giảm nhiễm quan sinh dục Haberlandt lần ñầu tiên nuôi cấy mô mầm không thành công Kogl lần ñầu tiên xác ñịnh vai trò IAA, hoomon thực vật 1934 ñầu tiên thuộc nhóm auxin có khả kích thích tăng trưởng phân chia tế bào ba nhà khoa học Gautheret, Nobecourt, White ñã ñồng thời nuôi cấy 1939 mô sẹo thành công thời gian dài từ mô thượng tầng cà rốt thuốc 1941 Overbeek cộng ñã sử dụng nước dừa nuôi cấy phôi non cà Datura Miller cộng ñã phát minh cấu trúc sinh tổng hợp từ chất 1955 kinetin-hoomon có vai trò trình phân bào phân hoá chồi mô nuôi cấy Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 73 Skoog va Millert ñã phát vai trò tỷ lệ nồng ñộ chất auxin cytokinin môi trường nuôi cấy. Năm 1952, Morel 1957 Martin ñã tạo bệnh virus giống khoai tây từ nuôi cấy ñinh sinh trrưởng. Cùng năm ñó hai ông ñã thực vi ghép invitro thành công Morel ñã thực bước ngoặc cách mạng sử dụng kỹ thụât 1960 nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng nhân nhanh giống ñịa lan Cymbidium mở ñầu thành công nghiệp vi nhân giống thực vật 1960 1971 Coking lần ñầu tiên sử dụng enzyme phân giải thành tế bào ñã tạo số lượng tế bào trần lớn Takebe cộng ñã tái sinh ñược từ tế bào trần mô thịt thuốc Carlson cộng lần ñầu tiên thực lai tế bào soma 1972 loài, tạo ñược từ dung hợp tế bào trần từ hai loài thuốc Nicotiana glauca Nicotiana langsdorfii 1978 1964 1959 1977 Melchers ñã tạo ñược lai soma cà chua thuốc lai xa hai tế bào trần hai Guha Maheshwari tạo thành công ñơn bội từ nuôi cấy bao phấn cà chua Datura Tulecke Nickell ñã thử nghiệm thử sinh khối mô thực vật nuôi cấy chìm Noguchi ñã nuôi cấy tế bào thuốc bioreator dung tích 20.000 lít sở quan sát biến dị xảy phổ biến nuôi cấy mô 1981 ñã ñưa khái niệm biến dị soma. Năm 1974, Zaenen cộng ñã phát plasmid Ti ñóng vai trò yếu tố gây khối u trồng 1977 Chilt cộng ñã chuyển thành công T-DNA vào thực vật Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 74 Marton ñã xây dựng quy trình chuyển gen vào tế bào trần nuôi 1979 cấy tế bào trần Agrobacterium.Năm 1982, ñã chuyển thành công DNA vào tế bào trần Fraley cộng ñã thiết kế vertor chuyển gen vào thực vật. Cùng 1985 năm Horsch ñã chuyển gen vào mảnh Agribacterium tumefacienns tái sinh chuyển gen 1994 Thương mại hoá cà chua chuyển gen “Flavr-savr” Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Nguyễn Thị Hoài An (2011). Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường khoáng lên sinh trưởng phát triển khoai lang HL518. 2. Nguyễn Thị Lý Anh cs. (2000). Nghiên cứu làm virus nhân nhanh số dòng, giống khoai lang virus phương pháp nuôi cấy invitro”, Tạp chí Nông nghiệp Công nghiệp thực phẩm (12): 552 554. 3. Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Quang Thạch (2003). Nghiên cứu làm virus nuôi cấy meristem số giống khoai lang Bắc Việt Nam. Báo cáo khoa học hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc, NXB Khoa học kỹ thuật. 4. Ưng ðịnh (1995). Tăng suất khoai lang, Nhà xuất Nông nghiệp. 5. Mai Thạch Hoành, Nguyễn Thị Lan (2003). Kết nghiên cứu số giống khoai lang vùng ñất cát biển Thanh Hóa vụ ñông, vụ xuân 2000 – 2001, Tuyển tập công trình khoa học kỹ thuật nông nghiệp, Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 6. Mai Thạch Hoành (2012). Giống kỹ thuật thâm canh có củ, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 7. Nguyễn Như Khanh (2007). Sinh học phát triển thực vật, NXB Giáo dục. 8. Dương Công Kiên (2003). Nuôi cấy mô thực vật II. Nhà xuất ðại Học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. 9. Nguyễn Thị Lan, Phạm Tiến Dũng (2005). Giáo trình phương pháp thí nghiệm, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 10. Nguyễn Thị Lang (2002). Phương pháp nghiên cứu công nghệ sinh học, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 76 11. Phạm Văn Linh, Nguyễn ðức Anh, Trần Thị Quỳnh Nga cs (2014). Kết nhân nhanh giống khoai lang phương pháp nuôi cấy in vitro, Tạp chí KH-CN Nghệ An, số 7: - 5. 12. ðinh Thế Lộc (1995). Cây khoai lang, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 13. ðinh Thế Lộc cs. (1997). Giáo trình Cây Lương thực, Tập 2, ðHNN I, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 14. Ngô Xuân Mạnh (1996). Nghiên cứu tiêu phẩm chất số biện pháp chế biện nhằm nâng cao hiệu sử dụng khoai lang, Luận án PTS khoa học Nông nghiệp. 15. Trần Văn Minh (2009). Tạo giống trồng chuyên khoa 2, ðH Nông lâm Huế. 16. Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Bá Nam (2009). Ảnh hưởng hệ thống chiếu sáng ñơn sắc lên sinh trưởng phát triển hoa cúc (Chrysanthemum morifolium cv. “nút”) nuôi cấy in vitro. Tạp chí Công nghệ sinh học 7(1): 93 - 100. 17. Dai Peter, Tôn Phan Hữu, Hoàng Mai Thạch cs (2001). Hướng dẫn sử dụng khoai lang trồng khác chăn nuôi lợn miền Bắc, miền Trung Việt Nam, NXB Nông nghiệp. 18. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2005). Giáo trình công nghệ sinh học Nông nghiệp. Nhà xuất Nông nghiệp, ðại học Nông nghiệp Hà Nội. 19. Nguyễn ðức Thành (2000). Nuôi cấy mô tế bào thực vật nghiên cứu ứng dụng, NXB Nông nghiệp Hà Nội. 20. Nguyễn ðình San, Trần Ngọc Khuê (2013). Nhân giống khoai lang nhật beniazuma kỹ thuật nuôi cấy in vitro. 21. Nguyễn Thị Quỳnh cs.(2005). Sự tăng trưởng lan Dendrobium nuôi quang tự dưỡng ñiều kiện ánh sáng tự nhiên. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 77 22. Nguyễn Mỹ Uyên cs. (2006). Khảo sát tăng trưởng in vitro khoai lang Ipomoea batatas L. ñiều kiện chiếu sáng tự nhiên. Tài liệu tiếng Anh: 1. Abab, J.A., Moyer, J.W (1992). Detection and distribution of Sweet potato feathery mottlevirus in sweet-potato by in vitro – transcribed RNA probes (riboprobes), membrane immunobinding assay and direct blootting, Phytopathology 82: 300 – 305Overvoorde, P., Fukaki H., Beeckman T. (2010). Auxin control of root development. Cold Spring Harabor Laboratory Press, 20: 541 – 553. 2. Alam, I., S. A. Sharmin, M. K. Naher, M. J. Alam, M. Anisuzzaman, M. F. Alam (2010). Effect of growth regulators on meristem culture and plantlet establishment in sweet potato [Ipomoea batatas (L.) Lam.], POJ 3(2): 35 – 39. 3. Chun, C., Kozai T (2001) A closed transplant production system, a hybrid of scaled-up micropropagation system and plant factory. J. Plant Biotechnol. 3(2): 59 - 66; 4. Godfrey, J. cs., (2005), Photoautotropic microphropagation of Banksia. 5. Katarzyna Wroblewska, (2013), Benzyladenine effect on rooting and axillary shoot outgrowth of Gaura lindheimeri Engelm. A Gray cuttings, Acta Sci. Pol., Hortorum Cultus 12(3), pp 127 - 136. 6. Kozai, T., Y. Kitaya, C. Kubota, R. Kobayashi, R., S Watanabe (1996). Optimization of photoautotrophic micropropagation conditions for sweetpotato Ipomoea batatas (L). Lam 7. Mervat M.M. EL Far (2007). Optimization of growth conditions during sweetvpotato micro-propagation, African Potato Association Conference Proceedings, Vol. 7: 204 - 211. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 78 8. Mervat M.M.El Far and A. Ashoub (2009), Utility of thermotherapy and meristem tip for freeing sweet potato from viral infection, Australian Journal of basic and applied sciences, 3(1): 153 – 159. 9. Murashige T., Skoog F.(1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Plant Physiol. 15: 473 - 497. 10. Pruski, K,, T. Astatkie, M. Mirza, J. Nowak (2002). Photoautotrophic micropropagtion of Russet Burbank Potato. Plant Cell, Tiss. and Org. cult. 69: 197 - 200. 11. Rahman, M H., A A Alsadon (2007). Photoautotrophic and photomixotrophic micropropagation of three potato cultivars, J. bio-sci. 15: 111 - 116; 12. Ying, D. Q., Z. Ying, T. L. Davenport (2004). Meristem-tip culture boosts yield of sweet potato cv. Picadita in South Florida, Proc. Fla. State Hort. Sci. 117: 70 - 76. 13. Zamora, A. B. (1993). Meristem culture of sweet potato (Ipomoea batatas). FAO/IPBGR Plant genetic resources Newsletter 91/92: 25 - 28. 14. Zobyed, S. M. A, F. Afreen, C. Kubota, T. Kozai (2000). Water control and survival of Ipmoea batatas grown photoautotrophically under forced ventilation and photomixotrophically under natural ventilation, Annals of Botany 86: 603 - 610. 15. Woolfe, J. A. (1992). Sweet potato: an untapped food resource, Cambridge University Press. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 79 [...]... trình t i ưu hóa các ñi u ki n vi nhân t h p quang t dư ng cho khoai lang Beniazuma; Năm 1999, Heo và Kozai công b quy trình nuôi c y quang t dư ng trên cây khoai lang và khoai tây; S M A Zobyed, F Afreen, C Kubota and T Kozai, (2000) nuôi c y khoai lang b ng phương pháp quang t dư ng có ñi u ch nh thoáng gió cho k t qu sau 21 ngày nuôi c y cây con sinh trư ng t t hơn nuôi c y truy n th ng 1,2 l n S... ăn quen thu c như bánh, cháo, chè, m t… Lá khoai lang là lo i rau dân dã v a ngon, v a mát và b C và thân lá khoai lang là v thu c phòng ch a b nh th n, táo bón ñã ñư c dùng t lâu trong dân gian, có nơi g i nó là “Sâm Nam” (Peter và cs., 2001) 1.3 Các phương th c nhân gi ng khoai lang Cây khoai lang có th nhân gi ng b ng các hình th c nhân gi ng h u tính (nhân gi ng t h t, ñây là phương pháp t h p... ng quy trình nhân gi ng cây khoai lang hoàn thi n trong các nghiên c u ti p theo 1.2.2.Yêu c u - Xác ñ nh th i gian kh trùng m u hi u qu , b o ñ m t l s ng cao nhưng nhi m t p th p; - Xác ñ nh n ng ñ ch t ñi u ti t sinh trư ng thích h p ñ nhân nhanh ch i và môi trư ng t o r cho cây khoai lang in vitro hi u qu ; - So sánh nuôi c y in vitro thoáng khí và nuôi c y in vitro truy n th ng kín khí; - Xác ñ... m i qu c t , cây khoai lang lan nhanh ra các vùng nhi t ñ i Ngư i Tây Ban Nha mang khoai lang t Mêhicô vào Philippin, r i t ñó phát tán ra các ñ o khác Ngư i B ðào Nha ñưa cây khoai lang t vùng Caribê và Nam M sang Châu Âu, Châu Phi, ðông Nam Châu Á và n ð (Yen, 1976) Cây khoai lang du nh p vào Vi t Nam t cu i th k 16 có l Phúc Ki n (Trung Qu c) hay ñ o Lu-zôn c a Philippin Khoai lang ñư c tr ng cách... i nhi u công chăm sóc ð c i ti n phương pháp nuôi c y in vitro truy n th ng nh m kh c ph c nh ng h n ch nêu trên nghiên c u nuôi c y in vitro thoáng khí hay còn g i là nuôi c y in vitro quang t dư ng (photoautotrophic micropropagation) Phương pháp nuôi c y in vitro thoáng khí s d ng màng Milliseal (Màng Milliseal có kích thư c l thoáng là 0,5 m giúp không khí có th ñi qua nhưng vi sinh v t và n m m... ch ra r ng k thu t vi nhân gi ng quang t dư ng cung c p CO2 ñã ñư c ti n hành trên gi ng khoai tây Russet Burbank và ñư c ñ xu t trong s n xu t khoai tây gi ng; M H Rahman and A A Alsadon (2007) kh o sát nhân gi ng cây khoai tây in vitro (03 gi ng: Hermes, Rosetta và Asterix) b ng nuôi c y thoáng khí có ñư ng, vitamin và không ñư ng, không vitamin, nuôi c y truy n th ng (kín khí) có ñư ng, có vitamin... (2006) nuôi c y cây dâu tây; Dương T n Nh t, Nguy n Bá Nam (2009) nuôi c y cây hoa cúc; 1.5 Tình hình nghiên c u nuôi c y in vitro cây khoai lang Nhân gi ng in vitro cây khoai lang trên th gi i ñã có nhi u tác gi nghiên c u thành công trong ñó n i b t là các nghiên c u: Yamaguchi và cs (1974) l n ñ u tiên nghiên c u v nhân t h p in vitro khoai lang t mô s o K t qu cho th y s hình thành mô s o t r c trên... T NG QUAN TÀI LI U 1.1 Gi i thi u chung v cây khoai lang 1.1.1 Ngu n g c và phân lo i Khoai lang thu c h bìm bìm, Convolvulaceae, chi Ipomoea Chi Ipomoea có kho ng 500 loài khác nhau, trong ñó khoai lang, Ipomoea batatas, là loài duy nh t có c ăn ñư c Cây khoai lang tr ng hi n nay là cây l c b i (2n=90) trong 13 loài có quan h h hàng v i nhau Cây khoai lang có ngu n g c Tân Th Gi i và ñư c thu n hoá... thích nghi thì t l s ng c a cây nuôi c y thoáng khí H c vi n Nông nghi p Vi t Nam – Lu n văn Th c s Khoa h c Nông nghi p Page 24 g n như ñ t 100% trong khi nuôi c y truy n th ng ch ñ t kho ng 67% Lá cây nuôi c y thoáng khi khi hu n luy n ra nhà lư i không b héo và cây con sinh trư ng phát tri n nhanh hơn nhi u so v i cây con nuôi c y truy n th ng; Hi n nay, cây khoai lang chưa ñư c nghiên c u nhi u... ki n khí h u thích h p cho tr ng khoai lang quanh năm, năng su t ph thu c ch y u vào ch ñ mưa Th i kỳ sau khi c phát tri n yêu c u nhi t ñ cao v a ph i 30 – 320C, chênh l ch ngày ñêm càng l n càng t t - Ánh sáng: Khoai lang có ph n ng ánh sáng ngày ng n Th i gian chi u sáng thích h p trong m t ngày 8 – 10 gi Khoai lang sinh trư ng phát tri n t t trong ñi u ki n có cư ng ñ chi u sáng cao Khoai lang . của ñiều kiện nuôi cấy (thoáng khí và không thoáng khí truyền thống) tới tạo chồi và sinh trưởng của chồi 28 2.6. Ảnh hưởng của ñiều kiện nuôi cấy (thoáng khí và không thoáng khí truyền thống). chồi khoai lang nuôi cấy 65 3.23. Hình ảnh ảnh hưởng của phương pháp nuôi cấy ñến khả năng ra rễ và chiều dài rễ của chồi khoai lang nuôi cấy 65 3.24. Ảnh hưởng của phương pháp nuôi cấy ñến. trưởng thích hợp ñể nhân nhanh chồi và môi trường tạo rễ cho cây khoai lang in vitro hiệu quả; - So sánh nuôi cấy in vitro thoáng khí và nuôi cấy in vitro truyền thống kín khí; - Xác ñịnh giá