BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI TRẦN THÙY DUYÊN NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG VÀ KHẢ NĂNG SINH CELLULASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN Ở XUÂN HÒA, PHÚC YÊN, VĨNH PHÚC LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC HÀ NỘI, 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI TRẦN THÙY DUYÊN NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG VÀ KHẢ NĂNG SINH CELLULASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN Ở XUÂN HÒA, PHÚC YÊN, VĨNH PHÚC Chuyên ngành: Sinh thái học Mã số: 60 42 01 20 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. ĐINH THỊ KIM NHUNG HÀ NỘI, 2014 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung thầy cô phòng Vi sinh, phòng sau đại học, khoa Sinh KTNN tận tình giúp đỡ em thời gian qua. Em xin chân thành cảm ơn thầy giáo, cô giáo khoa Sinh KTNN, thầy cô giáo giảng dạy hướng dẫn tạo điều kiện cho em thực hoàn thành luận văn. Cảm ơn tất bạn học viên giúp đỡ để hoàn thành khóa luận cách tốt đẹp. Xin cảm ơn gia đình, bạn bè người thân giúp đỡ, động viên để em vững tin hoàn thành luận văn. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Học viên Trần Thùy Duyên LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài: “Nghiên cứu đa dạng khả sinh cellulase số chủng xạ khuẩn Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc”, thực trùng lặp với tác giả khác. Tôi xin cam đoan viết luận văn thật. Đây kết nghiên cứu riêng tôi. Tất số liệu thu thập từ thực nghiệm, qua xử lý thống kê, số liệu chép hay bịa đặt, không trùng với kết công bố. Trong tài liệu có sử dụng tài liệu số tác giả, xin phép tác giả để bổ sung cho luận văn mình. Nếu sai xin hoàn toàn chịu trách nhiệm. Hà Nội, ngày tháng Học viên Trần Thùy Duyên năm 2014 MỤC LỤC Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Ký hiệu viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình MỞ ĐẦU 1. Lý chọn đề tài 2. Mục đích nghiên cứu 3. Nội dung nghiên cứu 4. Đối tượng phạm vi nghiên cứu 5. Phương pháp nghiên cứu .2 6. Ý nghĩa khoa học thực tiễn 7. Đóng góp đề tài Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đặc điểm phân loại xạ khuẩn .4 1.1.1. Đặc điểm sinh học xạ khuẩn .4 1.1.3. Vai trò xạ khuẩn 13 1.2. Nhu cầu dinh dưỡng xạ khuẩn 14 1.2.1. Nhu cầu cacbon 14 1.2.2. Nhu cầu nitơ .15 1.3. Cellulose Cellulase .15 1.3.1. Cellulose .15 1.3.2. Cellulase .17 1.4. Triển vọng ứng dụng cellulase 20 1.4.1. Trên giới .21 1.4.2. Ở Việt Nam .22 Chương 24 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1. Vật liệu thiết bị nghiên cứu 24 2.1.1. Vật liệu .24 2.1.2. Hóa chất - Thiết bị .24 2.2. Môi trường 24 2.2.1. Môi trường phân lập xạ khuẩn .24 2.2.2. Môi trường bảo quản giữ giống 25 2.2.3. Môi trường thử hoạt tính enzyme .25 2.3. Phương pháp nghiên cứu .26 2.3.1. Phương pháp lấy mẫu 26 2.3.2. Phương pháp phân lập xạ khuẩn từ mẫu .27 2.3.3. Phương pháp bảo quản chủng giống .27 2.3.4. Phương pháp quan sát hình thái xạ khuẩn 27 2.3.5. Phương pháp xác định hoạt tính Cellulase xạ khuẩn .28 2.3.6. Phương pháp thống kê xử lý số liệu 29 Chương 31 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 31 3.1. Phân lập, tuyển chọn số chủng xạ khuẩn cỏ khô ủ đốt khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 31 3.2. Đánh giá mức độ đa dạng sinh học chủng xạ khuẩn nghiên cứu .34 3.3. Nghiên cứu khả sinh cellulase chủng xạ khuẩn 38 3.4. Nghiên cứu đặc điểm hình thái, tính chất nuôi cấy chủng xạ khuẩn X3 43 3.4.1. Đặc điểm hình thái .43 3.4.2. Tính chất nuôi cấy 45 3.5. Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố môi trường điều kiện nuôi cấy đến hoạt tính sinh cellulose chủng xạ khuẩn X3 47 3.5.1. Ảnh hưởng nguồn cacbon .47 3.5.2. Ảnh hưởng nguồn nitơ .49 3.5.3. Ảnh hưởng pH .50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .52 TÀI LIỆU THAM KHẢO .53 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BG : Bột giấy C1 : Exoglucanse Cx : Endoglucanse CMC : Cacboxyl methyl cellulose CS : Cộng HSCC : Hệ sợi chất HSKS : Hệ sợi khí sinh ADN : Deoxyribonucelic acid ISP : International Streptomyces project MT : Môi trường ARN : Ribonucleic acid VSV : Vi sinh vật DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Các chủng xạ khuẩn phân lập từ cỏ khô ủ đốt 34 Bảng 3.2. Phân nhóm xạ khuẩn dựa theo đặc điểm chuỗi bào tử 37 Bảng 3.3. Kết thử hoạt tính cellulase môi trường chứa 1% CMC 40 Bảng 3.4. Kết thử hoạt tính cellulase môi trường chứa 1% BG . 41 Bảng 3.5. Hoạt tính cellulase chủng xạ khuẩn phân lập . 42 Bảng 3.6 . Khả đồng hóa nguồn cacbon chủng xạ khuẩn X3 47 Bảng 3.7. Khả sinh enzyme ngoại bào chủng xạ khuẩn X3 . 47 Bảng 3.8. Ảnh hưởng nguồn cacbon tự nhiên đến hoạt tính cellulase chủng xạ khuẩn X3 . 50 Bảng 3.9. Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh trưởng hoạt tính cellulase chủng xạ khuẩn X3 50 Bảng 3.10. Ảnh hưởng pH đến hoạt tính cellulase chủng xạ khuẩn X3 . 52 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Công thức hóa học cellulose . 16 Hình 1.2. Tác dụng enzyme cellulase 18 Hình 1.3. Sơ đồ trình thủy phân cellulose theo Erickson, 1973 19 Hình 3.1. Khuẩn lạc xạ khuẩn phân lập môi trường Gause I độ pha loãng 10-5 .33 Hình 3.2. Xạ khuẩn thạch nghiêng 33 Hình 3.3. Xạ khuẩn đĩa petri 34 Hình 3.4. Hình ảnh chuỗi bào tử số xạ khuẩn . 36 Hình 3.5. Hoạt tính cellulase chủng xạ khuẩn X3 . 43 Hình 3.6. Hoạt tính cellulase số chủng xạ khuẩn . 43 Hình 3.7. Khuẩn lạc chủng X3 . 44 Hình 3.8. Màu sắc hệ sợi chủng X3 45 Hình 3.9. Cuống sinh bào tử bào tử chủng X3 46 Hình 3.10. Khả sinh enzyme ngoại bào chủng xạ khuẩn X3 48 Hình 3.11. Môi trường chứa nguồn cacbon tự nhiên . 49 40 Bảng 3.4. Kết thử hoạt tính cellulase môi trường chứa 1% BG STT Chủng xạ khuẩn Đường kính lỗ khoan d (mm) X1 10 Kích thước vòng phân giải D (mm) 18 ÷ 21 X2 10 19 ÷ 21 ÷ 11 X3 10 26 ÷ 28 16 ÷ 18 X4 10 - - X5 10 - - X6 10 15 ÷ 16 5÷6 X7 10 19 ÷ 21,5 ÷ 11,5 X8 10 - - X9 10 21 ÷ 22 11 ÷ 12 10 X10 10 15 11 X11 10 16 ÷ 17 6÷7 12 X12 10 18 ÷ 20,5 ÷ 10,5 13 X13 10 20 10 14 X14 10 19 15 X15 10 16 16 X16 10 19 ÷ 20 ÷ 10 17 X17 10 - - 18 X18 10 - - 19 X19 10 - - Hoạt tính D – d (mm) ÷ 11 41 Bảng 3.5. Hoạt tính cellulase chủng xạ khuẩn phân lập Hoạt tính Mạnh CMC BG CMC Số chủng Số lượng chủng Tỷ lệ (%) Rất mạnh 5,26 Trung bình Yếu BG CMC BG CMC BG 5,26 5,26 5,26 15,79 26,32 42,11 31,58 Mức độ hoạt tính: Rất mạnh: D – d ≥ 15mm Mạnh: 10mm ≤ D – d [...]... dạng của các chủng xạ khuẩn và khả năng sinh cellulase của chúng tại khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 3 Nội dung nghiên cứu 3.1 Phân lập, tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có trong cỏ khô ủ đốt tại khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 3.2 Đánh giá mức độ đa dạng sinh học của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu 3.3 Nghiên cứu khả năng sinh cellulase của các chủng xạ khuẩn 3.4 Nghiên cứu đặc điểm hình... vực Xuân Hòa, như Hà Thị Thu Hằng (2013), Nguyễn Thị Minh Nguyêt (2013) [3], [4] Tuy nhiên việc khảo sát sự đa dạng của các chủng xạ khuẩn ở đây chưa được thực hiện Xuất phát từ những lý do trên, tôi đã chọn đề tài Nghiên cứu sự đa dạng và khả năng sinh cellulase của một số chủng xạ khuẩn ở Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc" 2 Mục đích nghiên cứu Phân lập, tuyển chọn, đánh giá mức độ đa dạng của các chủng. .. tính chất nuôi cấy của chủng xạ khuẩn X3 3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường và điều kiện nuôi cấy đến hoạt tính sinh cellulase của chủng xạ khuẩn X3 4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 4.1 Đối tượng nghiên cứu Một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose có trong cỏ khô ủ đốt 4.2 Phạm vi nghiên cứu Tại khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 5 Phương pháp nghiên cứu 5.1 Phương pháp... vi sinh vật tạo ra kháng sinh chủ yếu (tới 80 % chất kháng sinh) vì thế trong đất có nhiều xạ khuẩn cây trồng ít bị bệnh hơn [7] Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc là khu vực có hệ sinh thái đa dạng với dạng địa hình đồng bằng xen lẫn đồi núi và hồ vực là cơ sở cho đa dạng về thành phần và số lượng các loài sinh vật, trong đó có xạ khuẩn Đã có một số 2 tác giả nghiên cứu nhóm xạ khuẩn trong đất có khả năng. .. cho xạ khuẩn phát triển Xác định được mức độ đa dạng sinh học của nhóm xạ khuẩn, vai trò của chúng với hệ sinh thái khu vực, Tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính enzyme cellulase cao Kết quả nghiên cứu này là cơ đưa ra biện pháp giảm thiểu và khắc phục ô nhiễm môi trường 6.2 Ý nghĩa thực tiễn Góp phần đem lại cho con người những hiểu biết về đời sống tự nhiên của vi sinh vật nói chung và xạ khuẩn. .. mức độ đa dạng sinh học của chúng tại khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 4 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm và phân loại xạ khuẩn 1.1.1 Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn 1.1.1.1 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn * Khuẩn lạc Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh và không có vách ngăn (chỉ trừ cuống sinh bào tử) Hệ thống sợi xạ khuẩn mảnh hơn của nấm mốc với đường kính... (2011) “Tuyển chọn và nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số chủng xạ khuẩn phân lập ở Núi Pháo, Đại Từ, Thái Nguyên” kết quả đã phân lập và thuần khiết 70 chủng xạ khuẩn, trong đó tuyển chọn được 3 chủng có hoạt tính cao là HT12.2, HT19.1 và HT17.8 [4] Một số công trình gần đây của Hà Thị Thu Hằng (2013)[3], Nguyễn Minh Nguyệt (2013)[11], đã tuyển chọn được 2 chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose... phát triển là 25 - 300C Đa số xạ khuẩn phát triển tốt trong môi trường có pH là 6,8 - 7, một số ít có khả năng phát triển tốt trong môi trường kiềm [1] Một trong những đặc điểm đáng lưu ý của xạ khuẩn là chúng không bền vững về mặt di truyền và thường xảy ra sự sắp xếp lại trong phân tử ADN Điều này gây ra tính đa dạng của hình thái, tính chất sinh lý, sinh hóa 8 của xạ khuẩn (khả năng đồng hóa nguồn cacbon,... tới một vài cm [10], [15] Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường rắn chắc, xù xì, có thể có dạng da, dạng phấn, dạng nhung, dạng vôi phụ thuộc vào kích thước của bào tử Trường hợp không có HSKS khuẩn lạc thường có dạng màng dẻo Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng… tùy thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh Kích thước và hình dạng khuẩn lạc có thể thay đổi tùy loài và điều... đất tại khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc Và còn rất nhiều các nghiên cứu hoạt tính sinh học của xạ khuẩn trong cả nước Tuy nhiên, ở Việt Nam việc ứng dụng các chủng xạ khuẩn sinh enzyme cellulase vào thực tế sản xuất vẫn còn hạn chế Vì vậy, chế phẩm enzyme vẫn thường phải nhập khẩu với giá thành cao 1.4.3 Định hướng ứng dụng Hiện nay, việc sử dụng các enzyme như cellulase trong một số ngành công . tài Nghiên cứu sự đa dạng và khả năng sinh cellulase của một số chủng xạ khuẩn ở Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc& quot;. 2. Mục đích nghiên cứu Phân lập, tuyển chọn, đánh giá mức độ đa dạng của. vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc. 3.2. Đánh giá mức độ đa dạng sinh học của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu. 3.3. Nghiên cứu khả năng sinh cellulase của các chủng xạ khuẩn. 3.4. Nghiên cứu. độ đa dạng sinh học của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu 34 3.3. Nghiên cứu khả năng sinh cellulase của các chủng xạ khuẩn 38 3.4. Nghiên cứu đặc điểm hình thái, tính chất nuôi cấy của chủng xạ