Bộ Y TẾ TRƯỜNÍ Ỉ ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI - - HÀ THỊ MINH CHÂƯ s ủ DỤNG LFXTIN CHIẾT TÁCH TỪ MÍT DẠI (ARTO CA R P Ư S M A ST IC A T A M O R A C E A E ) ĐỂ TINH CHẾ VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNí; IgA TRONG DỊCH TÍÊT CỦA BÊNH NHÂN VIÊM cố TỬ CUNG. Giáo viên hướng dẫn : PGS. TS ĐÀO KIM CHI ThS, N(;UYỄN VÃN LỢI Sinh viên thực hiện : HÀ THỊ MĨNH CHÂU Nơi thực hiện : lìộ MỎN HOÁ SINH Thời gian thực hiện : 03/2002 - 05/2002 HÀ NỘI 05 - 2002 jQỜ9^@cẨM(fn aùti hàij, lú Lồttg. hiỀÍ o'tt iãtL ằắe. têưJ)^Ẵ. ^ àũ C K im . & ti im OTírĩ. QtgMitỊhí <ĩ)ăn Mọi, nhữtiạ. tiqưĩỉi ¿tã tậtt Íìttíi itướttg, dẫtt, kíuiỊỊỀii idtíeii ĩtônợ, íùỀti ettt Irtìttợ. ằtiối quả Ịrìtilt ihư& itÀỀtt đễ. tà i nàtj^, <5/11 ae/it ehâtt títàttii eâtn o'fi CTtỹ ^ 0 Qlạạe MÌỀỉt. trưỜỊtạ. ^ ạ ỉ họe 3Cỉttía hoa ÍT h’ ttiùỀti Ịhuôe ^rùòttiỊ ^ ạ i “700e, Q « tfé giíi '3C>à Qỉộl, nạưò'í đã quan tồtn ohỉ ĩmo oà cỉto ettt tthiềtt tị kiỂMi qutị htỉti. ò m eiittíỊ x itt ehíìĩì ỉh à ttỉt etittt o'tt íTrV Q ígttụễư (Xjuătt ^hắng. eùttạ Ufàtt iitỉ eáe. thầíị eô giát), eô ^Ịtạtn ^ítattit ^Mtùơttq oà ũáe. eâ kụ ỉhuật ơiỀtt trong, hô tttôtt '3ỗtìá sinỉt ^rưỉutíị ^ a i íw e ^u'tì'e 3iCrt Qĩ.ôíf íỹ cí. QtạuụễMt '3õạnh - ^riiònq Ịỉỉiồiĩq, £a'Tio Sin ít itơd - <Ĩ)ÌỀMI <ĩ)ị sinit íỉịeh íễ, CKhtìíỉL ^ Itụ Sảtt - ^ ệttií oJệjt ^pitụ Sàti Qlội đă tận ỉínii ạiáụ đ è tạú đỉềií kiện thuận lợi eito £ỉti trtìitạ iuối litòt gỉm t húũ iập, oă kỡàti Ihàttít kltoả luậtt íốt ttạiùỀp,. 'Tôà Qtồif iháttạ. 5 năttt. 2002 Sinh oiỂit 7ôà ^ h ị Mình. & tân MỤC LỤC Trang Lời cảm ƠÍI Các chữ viết tất trong khoá luận ĐẶT VẤN ĐỀ 1 PHẦN 1 : TỔNG Q U A N 3 1.1 Sơ lược về lecitin 3 1.1.1 Lịch sử của lectin 3 1.1.2 Các tính chất của lectin 6 1 1.1.3 Các phưtĩng pháp tinh chế ỉectin 10 1.1.4 ứ ig dụng của lectin 11 1.2 Cấu trúc, chức năng và vai trò của các globulin miễn địch trong hệ thống miễn dịch của cơ thể 12 1.2.1 Một số khái niệm chung 12 1.2.2 Chức năng của các globulin miễn dịch trong hệ thống miễn dịch của cơ thể 13 1.2.3 IgA- Đặc điểm, cấu trúc và mối liên quan với các bệnh lý 14 PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ kẾT QUẢ 17 2.1 Nguyên ỉiệu và phưcíng pháp thực nghiệm 17 2.1.1 Nguyên liệu 17 2.1.2 Hoá chất và thuốc thử 18 2.1.3 Thiết bị và máy móc 18 2.1.4 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2 Kết quả thực nghiệm và nhận xét 25 2.2.1 Nghiên cứu khả năng ngưng kết hồng cầu của lectin trong dịch chiết thô 1(D 1) . 25 2.2.2 Giai đoạn chiết lectin từ hạt mít dại 25 2.2.3 Giai đoạn kết tủa Protein- lectin 26 2.2.4 Giai đoạn tinh chế leclin mít d ạ i 28 2.2.5 Tóm tắt kết quả tách chiết và tinh chế lectin. . . 31 2.2.6 Kết quả điện di lectin mít dại tinh chế trên gel polyacrylamid 32 2.2.7 Kết quả tinh chê IgA bằng cột sắc ký ái lực Sepharose- Jacalin 32 2.2.8 Kiểm tra khả nãng kết hợp của IgA tinh chế và lectin mít dại tinh chế bằng phưcfng pháp ELLA 34 2.2.9 Sử dụng lectin mít tinh chế xác định sự thay đổi hàm lượng IgA trong dịch tiết của bệnh nhân viêm cổ tử cung 35 2.3 Bàn luân 37 PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ X U Ấ l 39 Tài liệu iham khảo CÁC CHỬ VIẾT TẮT TRONG KHOÁ LUẬN AFP : Alpha - Fetoprotein AIDS : Acquired Immunodificiency Syndrom BSA : Bovine serum Albumin C D / : Cluster of Differentiation Con A : Concanavalin A DI : Dịch chiết thô D2 : Dịch chiết hoà tan sau tủa D3 : Dịch thu hồi lectin DEAE: Dimethyl aminoethyl E U SA : Enzyme “ Linked Immuno Sorbent Assay E L L A : Enzyme - Linked Lectino Sorbent Assay HĐR : Hoạt độ riêng H Đ TS; Hoạt độ tổng số HAA : Heamatoagglutinating activity HIV : . Human Immunodeficient Virus Ig : Immuno globulin kDa ; Kilo Dalton PBS : Phosphate buffered saline SDS : Sodium dodecyl sulphate ĐẶT VẤN ĐỂ Nếu như Hormon, enzym, vitamin là những chất có đặc tính sinh học có vai trò quan trọng đối với cơ thể thí lectin cũng là chất có đặc tính sinh học đặc biệt. Mặc dù lectin không có nguồn gốc miễn dịch nhưng nổ vẫn có khả năng kết hợp nhiều loại tế bào theo kiểu đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể, liên kết với đường hoặc những hợp chất chứa đường. Hơn một thế kỷ qua kể từ lần đầu tiên được phát hiện (1888), lectin đã thu hút sự quan tâm chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới bởi mức đô phân bố rộng rãi trong tự nhiên và khả năng ứng dụng đa dạng của nó trong các lĩnh vực của đời sống. Lectin được phân bố nhiều nhất trong giới thực vật, đặc biệt tập trung ở hai họ Fabaceae và Moraceae. Trong số những lectin được phát hiện thì lectin được tinh chế từ chi Artocapus của họ Moraceae có những đặc tính đặc biệt và đã được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực miễn dịch học như; khả năng kết hợp đặc hiệu IgA, được sử dụng để tinh chế IgA và Iheo dõi hàm lượng IgA trong một số bệnh, khả năng kích thích phan chia tế bào lympho, khả năng tưcfng tác với glycoprotein ở bề mặt tế bào lyinpho T của người là phân tử kết hợp đặc hiệu với virus HIV trong pha nhiễm khuẩn đẩu tiên của AIDS. Như vậy, lectin tinh chế từ các loài mít đã thực sự trở thành công cụ hữu ích cho việc chẩn đoán một số căn bệnh hiện nay trên thế giới. ở Việt Nam đã có nhiều cồng trình nghiên cứu về lectin tinh chế từ các loài mít và cũng cho một số ứng dụng khả quan. Kế thừa những thành quả của các công trình trên, chúng tôi thực hiện đề tài này với các mục tiêu và nội dung sau: Chiết tách và tinh chế lectin từ cây Artocơrpus masticata G. Morơceae có hiệu suât và độ tinh sạch cao. Tinh chế IgA từ dịch tiết của bệnh nhân viêm cổ tử cung. Sử dụng lectin tinh chế ứng dụng để xác định hàm lượng IgA trong dịch tiết của bệnh nhân viêm cổ tử cung và người bình thường bằng phương pháp ELLA. PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1 Sơ lược về ỉectin: 1.1.1 Lịch sử của lectỉn: Năm 1888, Stillmark đã tìm ra một chất độc được chiết từ cây thẩu dẩu, có hoạt tính ngưng kết hồng cầu, ông gọi chúng là ricin. Công bố của Stillmark đã được nhiều nhà khoa học quan tâm. Sau ricin , các nhà khoa học khác cũng tách chiết được các chất độc khác có đặc tính tương tự ricin như abrin, crotÌn và còn phát hiện thấy các chất này được phân bố rộng rãi trong cả giới thực vật và động vật. Đầu tiên, các nhà khoa học nhận thấy sự ngưng kết tế bào hồng cầu của các độc tố nói trên mang tính chọn lọc nhóm máu [24, 25]. Vì vậy Boyd (1954) gọi chúng là lectin. Thuật ngữ này xuất phát từ tiếng Latinh là “ lectus”, là thì quá khứ của động từ Legere có nghĩa là chọn lọc. Sau đó, vào những năm cuối thập kỷ 60, khi nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của lectin cho thấy: có khoảng 25% lectin tìm thấy là có khả năng gây ngưng kết đặc hiệu nhóm máu [25]. Ngoài ra người ta còn phát hiện thấy một đặc tính quan trọng nữa của lectin, đó là khả năng tưcmg tác với các loại đường. Vì vậy khái niệm của lectin được bổ xung và định nghĩa như sau: “Lectin là những chất có bản chất là protein hay glycoprotein có khả nãng Wcfng tác vói đường và có đặc tính cơ bản là khả nâng gây ngưng kết tế bào" [25]. Mặc dù các khái niệm của lectin thay đổi nhưng ‘lectin” vẫn được sử dụng như một thuật ngữ khoa học. * Tình hình nghiên cứu trên thế giới: Sau hơn 100 năm kể từ khi Stillmark tìm ra ricin - lectin đầu tiên, quá trình nghiên cứu lectin tiếp theo được chia làm 3 giai đoạn: Cuối tliế kỷ XIX đầu thể kỷ XX: Các nhà khoa học tập trung vào nghiên cứu, điều tra sự phân bố của lectin trong giới sinh vật, rất nhiều công trình nghiên cứu được công bô như của: Stillmark (1888), Helin (1891), Lansteiner (1902), Lansteiner và Raubischeck (1903), Melden (Ỉ909), Korbert(1913), Ludwingvaf Kraus(1902), Kayser(1903), Guyot (1908) đã xác định lectin được phân bố rộng rãi trong thực vật, động vật và cả các vi sinh vật như virus, vi nấm. [25J Từ năm 1950- 1970: Ngoài các công trình về điều tra cơ bản, người ta bắt đầu tập trung vào chiết tách tinh chế để xác định cấu tạo phân tù (cấu tạo bâc ỉ và cấu trúc không gian) của lectin. Phương pháp tinh chế lectin đã trải qua nhiều giai đoạn nghiên cứu từ sắc kỹ cột, đến sắc ký trao đổi ion và cuối cùng dựa trên khả năng tưưiig tác đặc hiệu với đường của lectin, các nhà khoa học đã tinh chế lectin bằng phương pháp sắc ký ái lực. Kỹ thuật này đã được Agrwal và Golsteiner nghiên cứu và sử dụng đầu tiên vào năm 1965 [24J. Đây ỉà phương pháp tinh chế lectin hiệu quả nhất, cho chế phẩm lectin có độ tinh sạch cao và hiện đang được sử dụng tại nhiều nơi trên thế giới. Từ năm 1970 đến nay: Nhờ sự hoàn thiện về kỹ thuật tinh chế lectin, các nghiên cứu tiếp Iheo về lectin được phát triển mạnh sang hướng ứng dụng trong các lĩnh vực của đời sống và đả đạt được những kết quả khả quan; Lectin chiết tách từ các cá thể họ hàng gần gũi có những đặc tính sinh học và có cấu tạo khá giống nhau (Soni-1982), (Wully-1984) được sử dụng làm cơ sở để gián tiếp phân loại thực vật ở mức độ phân tử. Lectin được chiết tách từ đậu thận đỏ {Phaseoỉus vuỉgơris Fahaceae) có khả năng kích thích sự phân chia bạch cầu người. Lectin được chiết suất từ sam biển châu Mỹ {Lỉmulus polyphemus) có khả năng phân tách bạch cầu và tế bào ung thư máu. - Con A được sử dụng trong chẩn đoán một số bệnh ung thư có liên quan đến sự biến đổi hàm lượng AFP dựa trên tương tác đặc hiệu giữa Con A và AFP [23 j. - Lectin của một số loài inít có khả năng kích thích phan chia tế bào lympho T_CD4^ ở người, Lectin từ loài mít mật {ArỉocarỊ?us heteropbyỉỉus Moraceae) còn có khả nâng tương tác với glycoprotein trên bế mặt tế bào T_CD% , đem iại nhiều hy vọng cho một loại thuốc mới hữu hiệu trong chẩn đoán và điều trị căn bệnh thế kỷ AIDS [31J. * Nghiên cứu Lectin ở Việt Nam: Nghiên cứu lectin mới được triển khai ở Việt Nam trong khoảng 20 năm nay (kể từ năm 1983) theo 3 hướng cơ bản: • Điều tra sự phân bố lectin trong giới sinh vật ở Việt Nam. • Tách chiết tinh chế và bước đáu nghiên cứu tính chất và cấu trúc của lectin. • Nghiên cứu ứng dụng của lectin. Mặc dù thời gian nghiên cứu chưa nhiều nhưng cũng đã thu được nhiều kết quả khả quan: • Nhiều công trình điều tra đã khẳng định lectin có sự phân bố rông rãi trong giới sinh vật của Việt Nam [2, 6, 15J. Nhiều công trình đã tách chiết thành công một số lectiii, từ đó tiếp tục nghiên cứu tính chấl và cấu trúc phân tử của chúng 12 |. • Bước đầu nghiên cứu ứng đụng: Đưa lectin vào chẩn đoán thai sớm [2J, tinh chế lgA| và nghiên cứu biểu hiện bệnh lý của chúng ở người [8], sử dụng lectin để chẩn đoán bệnh nhiễm sán máng [9J. Các nghiên cứu trên đây cho thấy một triển vọng tốt đẹp về nghiên cứu lectin ở Việt Nam. Sô' lượng lectin tinh chế ngày càng nhiều và chắc chắn sẽ [...]... T.bỡnh (% ) Kt qu bng 6 cho thy: Qua quỏ trỡnh tinh ch ó thu c 1,21 mg lectin tinh sch vi sch tng 8,63 ln, hiu sut thu hi t 17,65% 2.2.5 Túm tỏt kt qu tỏch chit v tinh ch lectn mớt di: Ton b kt qu ca quỏ trỡnh tỏch chit v tinh ch lectin t ht cõy mớt di (Artocarpus masticta G- Moraceae) vi 3 g nguyờn liu ban u c tng hp bng 7 Bng 7: Túm tt kt qu tỏch chit, tinh ch lectin mớt di (j4 masticata G .) Giai... G .) Giai Nguyờn Protein HTS HR T l on liu (mg) tng s (HAA.IO ') (HAA/ mg) sch thu hi (ln) (% ) (mg) Dch chit DI 3000 Dch chit D2 Sc ký ỏi lc 607 19960,8 32394,8 1 20,23 533,56 25122,13 47094,57 1,45 87,90 94,11 38230,43 406250,53 8,63 17,65 T kt qu trờn ta tớnh c t 100 mg nguyờn liu bt mớt di (A masticata G .), bng phng phỏp sc ký ỏi lc cú th tinh ch c 3,14 mg lectin dng bt, t hiu sut 3,14% so vi nguyờn... cao, thm tớch k loi galactose v NaCL Xỏc nh hot tớnh v hm lng protein ca dch lectin tinh ch D3 Kt qu giai on tinh ch lectin bng ct sc ký ỏi lc c trỡnh by bng 6 Bng 6: Kt qu giai on tinh ch lectin bng ct sc ký ỏi lc Sepharose 4B - Mucin Protein Protein HTS HR T l sch np ct gn ct (HAA.IO ^) (HAA/ mg) thu hi (ln) (mg) (nig) 1 6,94 1,24 499,71 402991,94 17,87 8,56 2 6,87 1,19 483,33 406159,66 17,32 8,62... 4BMUCIN- LECTIN Ra ct bng m PBS pH 7,4 Pro^in khụng gn ct SEPHAROSE 4BMUCIN- LECTIN y ct bng dung dch Galactose 0 ,7 5 M /N aC llM DCH LECTIN THU HI (D 3) ỡ ụng khụ-40'^ BT LECTIN TINH SCH c 1 Hỡnh 3 S quy trỡnh tỏch chit v tinh ch lectin mớt di * Phng phỏp s dng lectin tinh c h trong k thut E LLA : I Gỏn khỏng nguvộn ln bn: Gn lectin lờn bn poớypropylen, bn nhit phũng trong 16h - 18h hoc trong t... 10] Hot lectin (HAA) l giỏ tr nghch o ca pha oóng n nht m ú lectin cũn cú kh nng nguriig kt hng cu Hot tớnh ca lectin c xỏc nh theo hai ch s: + Hot tng s (HTS) c xỏc nh theo cụng thc : HTS= Trong ú : V 2" 50 V : th tớch mu thớ nghim (^ l) n : s ging cũn hot tớnh lectin 50 : s lectin em th 2 HTS c lớnh bng HAA : pha loóng liờn tip HTS HR = mPr Trong ú : mPr ; khi lng protein trong mu thớ... - Mỏy ly tõm lnh Biof'uge I5R (Gennany) - Mỏy o quang ph UV-VIS - Mỏy chy in di Hoffoe Small II (USA) - Mỏy o pH Jenway (England), - Mỏy ụng khụ Jouan LP3 (France) - Mỏy khuy t - Ct sc ký Sepharose 4B- Mucin (1 ,5 X 6cm) - Bn nha lm phn ng ELISA - Mỏy o ELISA LP 200 - Cỏc dng c thu tinh khụ sch 2.1.4 Phng phỏp nghiờn cu: * Phtig phỏp xỏc nh hot tớnh lectin: Hot tớnh ca lectin c xỏc nh bng kh nng ngimg... Acrylamid, Broniuacanogen, Sodium azid, D - (+ ) - Galactose, Amonisulphat (MERCK- Germany) - Amonipersulphat (Kockligh - Japan) - Commasie Brillant Blue R250 (Recinal - Hungary) - Sepharose 4B (Pharmacia biotech AB - Sweden) - Thuc th Folinciocalteur - Thuc th ng kim m Blocking pH 7,65 - Anti- IgA gn OP (Sigma) - C cht OPD (Sigma) - Hng cu ngi nhúm mỏu A, B, o ly ti Vin huyt hc v truyn mỏu trung ng c... lectin: - Kt ta protein bng (NH 4)2 S04 80% bóo ho, n nh kt ta trong 24h Ly tõm ly ta protein (1 0 000 vũng/ phỳt, 4 c , trong 20 phỳt) - Ho tan ta tr li bng m PBS pH 7,4 - Thm tớch loi mui - Xỏc nh hot tớnh v hm lng protein ca dch chit (D 2) Bc 3: Tinh ch lectin bng sc ký ỏi lc: - Np dch chit D2 lờn ct - Ra ct bng m PBS pH 7,4 n khi dch ra khng cũn protein (OD 280nm < 0,0 2) - Phn hp ph lectỡn ra khũi... c tỏch chit t ht mớt di {Artocarpus masticata G Moraceae) khụng phi l loi lectin c hiu nhúm mỏu - Lectin cú hot tớnh ngng kt hng cu trờn nhúm mỏu A l cao nht v n nh nht Vỡ vy chỳng tụi s dng nhúm mỏu A thc hin cỏc Ihớ nghiờm xỏc nh hot ngng kt hng cu (HAA) trong cỏc thớ nghim sau ny 2.2.2 Giai on chit lectin t ht mớt di (Artocarpus masticata G Momceae) - Dung mụi tỏch chit: m PBS pH 7,4/ NaCl IM Thớ... protein - lectin kt ta khụng tng hom nhiu v hot tớnh cng khụng cao hcớn Vỡ vy chỳng tụi ó chn amonisulphat 80% bóo ho kt ta protein- lectin Protein Hot Hot sch T l tng s tng s riờng (ln) thu hi (mg) (HAA.IO ^) (HAA/ mg) 1 555,20 26214,40 47216,14 1,46 91,47 2 530,58 24248,32 45701,53 1,41 87,41 3 514,90 24903,68 48366,05 1,49 84,83 Trung bỡnh 533,56 25122,13 47097,57 1,45 87,90 Mu TN (% ) T kt qu . hợp của IgA tinh chế và lectin mít dại tinh chế bằng phưcfng pháp ELLA 34 2.2.9 Sử dụng lectin mít tinh chế xác định sự thay đổi hàm lượng IgA trong dịch tiết của bệnh nhân viêm cổ tử cung . tiêu và nội dung sau: Chiết tách và tinh chế lectin từ cây Artocơrpus masticata G. Morơceae có hiệu suât và độ tinh sạch cao. Tinh chế IgA từ dịch tiết của bệnh nhân viêm cổ tử cung. Sử dụng lectin. MINH CHÂƯ s ủ DỤNG LFXTIN CHIẾT TÁCH TỪ MÍT DẠI (ARTO CA R P Ư S M A ST IC A T A M O R A C E A E ) ĐỂ TINH CHẾ VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNí; IgA TRONG DỊCH TÍÊT CỦA BÊNH NHÂN VIÊM cố TỬ CUNG. Giáo viên