một số nghiên cứu gần đây cho thấy trong nhiều loài rong câu chi Gracilaria thuộc ngành rong đỏ (Rhodophyta) Việt Nam có chứa hàm lượng cao các axit béo không no đa nối đôi đặc biệt là các axit béo họ eicosanoit, chúng là tiền chất tổng hợp lên protagladin, thromboxan, leukotrien trong cơ thể sống. Đây là các chất điều hòa sinh học có vai trò như các hoocmon. Ngoài ra các axit béo này còn có vai trò trong việc điều trị các bệnh tim mạch, cao huyết áp, viêm mãn tính (hen suyễn, khớp, vảy nến… ), lão hóa, ung thư và liên quan đến sự phát triển của trẻ em từ 112 tuổi…25.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC Vũ Thị Oanh NGHIÊN CỨU THU NHẬN LIPIT GIÀU AXIT BÉO HỌ EICOSANOIT TỪ RONG CÂU CHỈ VÀNG (GRACILARIA TENUISTIPITATA) TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT AGAR Khóa luận tốt nghiệp đại học hệ chính quy Ngành: Công nghệ Sinh học Hà Nội, 2014 V ũ T h ị O a n h * K 5 5 C N S H B 1 * N ă m 2 0 1 4 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC Vũ Thị Oanh NGHIÊN CỨU THU NHẬN LIPIT GIÀU AXIT BÉO HỌ EICOSANOIT TỪ RONG CÂU CHỈ VÀNG (GRACILARIA TENUISTIPITATA) TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT AGAR Khóa luận tốt nghiệp đại học hệ chính quy Ngành: Công nghệ Sinh học Chương trình đào tạo: Chuẩn Cán bộ hướng dẫn: ThS. Lê Tất Thành TS. Lê Hồng Điệp Hà Nội, 2014 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này, ngoài sự nỗ lực phấn đấu không ngừng của bản thân, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Phạm Quốc Long – Viện trưởng Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên đã tạo điều kiện cho em được thực tập tại Viện. Em xin trân trọng cảm ơn ThS Lê Tất Thành, ThS Hoàng Thị Bích – cán bộ Trung tâm nghiên cứu và phát triển các sản phẩm thiên nhiên – Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, các thầy cô đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức quý báu giúp em hoàn thành khóa luận này. Em xin chân thành cảm ơn các anh chị cán bộ Phòng Hóa sinh hữu cơ – Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, đã giúp đỡ và có những đóng góp quý báu cho khóa luận này. Em xin chân thành cảm ơn TS. Lê Hồng Điệp – người thầy đồng hướng dẫn em thực hiện khóa luận này; các thầy cô công tác tại Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập tại Khoa. Cuối cùng em xin bày tỏ lời cảm ơn đến gia đình, người thân, bạn bè đã luôn quan tâm chia sẻ, động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận này. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 27 tháng 5 năm 2014 Sinh viên Vũ Thị Oanh DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AA : Arachidonic acid EPA : Eicosapentaenoic acid DAPA : Diaminopimelic acid DGLA : Dihomo-γ-Linolenic acid PG : Prostaglandin PUFAs : Polyunsaturated fatty acids GC : Gas Chromatography GC-MS : Gas Chromatography - Mass Spectrometry TLC : Thin Layer Chromatography ECL : Equivalent Chain Lengths TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam MỤC LỤC 1 2 LỜI MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1. SƠ LƯỢC VỀ RONG ĐỎ 3 1.1.1. Đặc điểm hình thái và sinh thái học 3 1.1.2. Phân bố 3 1.1.3. Một số thành phần hóa học chính trong rong đỏ 4 1.2. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA RONG CÂU CHỈ VÀNG (GRACILARIA TENUISTIPITATA) 7 1.2.1. Phân loại 7 1.2.2. Hình thái 7 1.2.3. Phân bố 8 1.2.4. Hình thức sinh sản 10 1.3. AGAR (HAY AGAR-AGAR) 10 1.3.1. Cấu trúc 10 1.3.2. Tính chất hóa lý và chất lượng của agar 11 1.4. LIPIT VÀ AXIT BÉO 15 1.4.1. Lipit 15 1.4.2. Các axit béo họ eicosanoit 16 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 21 2.2. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT 21 2.2.1. Dụng cụ 21 2.2.2. Thiết bị nghiên cứu 21 2.2.3. Hóa chất 22 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.3.1. Xác định hàm lượng nước, hàm lượng tro tổng số, các nguyên tố vi lượng và kim loại nặng 22 2.3.2. Xác định hàm lượng lipit tổng có trong rong câu chỉ vàng 23 2.3.3. Xác định thành phần và hàm lượng các axit béo có trong lipit tổng 24 2.3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ và thời gian ngâm kiềm đến chất lượng agar 24 2.3.5. Kiểm tra chất lượng agar 25 CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1. Hàm lượng tro, nước, các nguyên tố vi lượng và kim loại nặng trong rong 27 3.2. Hàm lượng lipit tổng 27 3.3. Thành phần và hàm lượng các axit béo trong dịch chiết lipit tổng 28 3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ và thời gian ngâm kiềm đến chất lượng agar 31 3.5. Kết quả xác định hiệu suất thu agar và một số đặc điểm lý hóa và tồn dư dung môi của sản phẩm agar 32 3.6. Quy trình kép thu nhận lipit chứa các axit béo họ eicosanoit và agar từ nguyên liệu rong câu chỉ vàng Gracilaria tenuistipitata 33 KẾT LUẬN 35 KIẾN NGHỊ 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Sản lượng rong câu nuôi trồng của các tỉnh Việt Nam 9 Bảng 2: Hàm lượng tro, nước và các nguyên tố vi lượng 27 Bảng 3: Thành phần và hàm lượng các axit béo trong dịch chiết lipit tổng 29 Bảng 4. Ảnh hưởng của nồng độ và thời gian ngâm kiềm đến chất lượng agar 31 Bảng 5: Hiệu suất thu agar và đặc tính lý hóa của agar 32 DANH MỤC HÌNH Hình 1: Hình ảnh rong câu chỉ vàng 8 A: Hình thái rong câu chỉ vàng G. tenuistipitata 8 B: Mặt cắt ngang của G. tenuistipitata 8 Hình 2: Sinh sản hữu tính ở rong câu chỉ vàng G. tenuistipitata 10 Hình 3: Cấu trúc phân tử agar: (A) Agarose; (B) Agarosepectin 11 Hình 4: Máy sắc kí khí GC 22 Hình 5: Máy cô quay chân không 22 Hình 6: Máy ly tâm 22 Hình 7: Cân phân tích 22 Hình 8: Phổ GC thành phần hàm lượng các axit béo 28 Hình 9: Tỷ lệ các axit béo trong rong câu chỉ vàng G. tenuistipitata 30 Hình 10: Hàm lượng các axit béo 30 Hình 11: Phổ GC-MS kiểm tra dư lượng dung môi của agar 33 LỜI MỞ ĐẦU Việt Nam có hệ động vật và thực vật vô cùng phong phú, có nhiều nguồn gen quý hiếm đặc trưng cho khí hậu nhiệt đới nóng ẩm. Một trong những điều kiện tạo nên sự phong phú và giàu có ấy chính là vùng biển nhiệt đới rộng và bờ dài hơn 3000 km bao bọc hết phía đông và phía nam đất nước. Một trong những nguồn tài nguyên phong phú và giá trị là nguồn rong biển. Tại biển Việt Nam đã phát hiện được hơn 1000 loài trong đó trên 800 loài đã được định tên thuộc tất cả các bộ của các ngành rong đã được công bố trên thế giới [21]. Trên thế giới, rong biển thuộc vào loại tài nguyên có giá trị về mặt kinh tế và đã được khai thác từ nhiều năm nay để phục vụ cho những mục đích khác nhau của nền kinh tế. Trong những giá trị về mặt kinh tế mà rong biển mang lại, sản phẩm có giá trị nhất chính là các polysaccharit, fucodan, muối khoáng Từ rong biển có thể tách các polysaccharit như: carrageenan, axit alginic, agar… Trong đó agar là sản phẩm có ý nghĩa quan trọng hàng đầu. Chúng được ứng dụng nhiều trong đời sống do đó việc sản xuất agar đã được nhanh chóng phát triển trên thế giới. So với các polysaccharit khác, agar có giá trị thương mại lớn nhất. Hiện nay, ở nước ta, ngành công nghiệp sản xuất agar còn ở quy mô nhỏ, chưa chủ động trong công nghệ mà chủ yếu dựa theo các quy trình của Trung Quốc nên trong quá trình sản xuất, để tăng chất lượng của agar, người ta thường xử lý rong ở nồng độ kiềm cao (trên 20% ở các cơ sở sản xuất tại Hải Phòng). Tuy nhiên, việc sử dụng nồng độ kiềm cao vừa làm các phân tử polysaccharit mạch dài bị bẻ gẫy và tan vào dung dịch dẫn đến giảm hiệu suất thu hồi agar, vừa làm tăng chi phí sản xuất, vừa ảnh hưởng đến chất lượng agar thành phẩm nếu không xử lý hết toàn bộ và đặc biệt gây ô nhiễm môi trường nước xung quanh khu vực sản xuất. Trong công nghiệp, việc nghiên cứu các điều kiện để giảm lượng hóa chất cần dùng từ đó giảm chi phí sản xuất luôn là vấn đề được quan tâm hàng đầu. Mặt khác một số nghiên cứu gần đây cho thấy trong nhiều loài rong câu chi Gracilaria thuộc ngành rong đỏ (Rhodophyta) Việt Nam có chứa hàm 1 lượng cao các axit béo không no đa nối đôi đặc biệt là các axit béo họ eicosanoit, chúng là tiền chất tổng hợp lên protagladin, thromboxan, leukotrien trong cơ thể sống. Đây là các chất điều hòa sinh học có vai trò như các hoocmon. Ngoài ra các axit béo này còn có vai trò trong việc điều trị các bệnh tim mạch, cao huyết áp, viêm mãn tính (hen suyễn, khớp, vảy nến… ), lão hóa, ung thư và liên quan đến sự phát triển của trẻ em từ 1-12 tuổi…[25]. Tuy nhiên các axit béo này thường bị loại bỏ trong giai đoạn xử lý kiềm của quá trình sản xuất agar, đó là một sự lãng phí lớn. Nghiên cứu phương pháp thu nhận các hoạt chất này và xác định ảnh hưởng của việc thu nhận hoạt chất đến quá trình sản xuất agar theo phương pháp truyền thống, từ đó so sánh chất lượng agar thu được. Thành công của nghiên cứu này giúp gia tăng giá trị của nguyên liệu rong câu trong sản xuất công nghiệp. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu thu nhận lipit giàu axit béo họ eicosanoit từ rong câu chỉ vàng (Gracilaria tenuistipitata) trong quá trình sản xuất agar”. Nội dung của đề tài bao gồm: 1. Xác định một số chỉ tiêu của nguồn nguyên liệu đầu vào cho quá trình sản xuất agar như: xác định hàm ẩm, hàm lượng tro tổng số, thành phần các nguyên tố vi lượng, kim loại nặng. 2. Chiết và thu nhận lipit tổng. 3. Xác định thành phần và hàm lượng các axit béo trong lipit tổng. 4. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ và thời gian ngâm kiềm đến chất lượng agar. 5. Xác định hiệu suất, các chỉ tiêu chất lượng sản phẩm agar, kiểm tra tồn dư của dung môi trong agar thành phẩm. 6. Đưa ra quy trình kép thu nhận lipit giàu các axit béo họ eicosanoit và agar từ rong câu chỉ vàng Gracilaria tennuistipitata. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1. SƠ LƯỢC VỀ RONG ĐỎ 1.1.1. Đặc điểm hình thái và sinh thái học Rong đỏ hay còn được gọi là tảo đỏ Rhodophyta là những sinh vật quang tự dưỡng thuộc một trong mười ngành rong trên thế giới. Chúng có lịch sử phát triển hàng trăm triệu năm trên trái đất, bằng chứng của chúng được tìm thấy trong những vỉa đá trên 500 triệu năm tuổi [16]. Ngành rong đỏ có xấp xỉ 500 chi với hơn 6000 loài khác nhau. Trong đó phải kể đến những chi điển hình như: Porphyta, Gracilaria, Hypnea,… [16]. Hầu hết rong đỏ đều là cơ thể đa bào, sinh sản chủ yếu bằng hai phương thức sinh sản vô tính thực hiện bằng các bào tử và sinh sản hữu tính là các noãn giao, chỉ có ít loài sinh sản sinh dưỡng bằng khúc tản hay các mầm hình thành đầu nhánh [6]. Vách tế bào ở một số ít loài nguyên thủy là bằng cutin, còn hầu hết là xenlulose, nhiều loài phía ngoài vách được phủ lớp keo, một số loài phần gốc tản hoặc toàn bộ tản được phủ hay thấm CaCO 3 hoặc muối của axit silic. Thể màu có hình đĩa, hình sao, hình que hoặc hình sợi. Sắc tố diệp lục a, d, caroten α, β; xantophin – lutein và nhóm sắc tố biliprotein gồm hai sắc tố phicoxian màu xanh lam và phicoerytrin màu đỏ. Màu của tản phụ thuộc vào hàm lượng và tỷ lệ hai sắc tố này, thay đổi từ hồng đến tím thẫm hoặc màu xanh lam. Cũng nhờ hai sắc tố này có khả năng hấp thụ ánh sáng lục và tím, chúng có khả năng thâm nhập xuống lớp nước sâu nên rong đỏ phân bố được khá sâu, có khi vài trăm mét. Sản phẩm đồng hóa là tinh bột tảo đỏ, khác với tinh bột thường là khi tác dụng với iot cho màu đỏ chứ không phải màu xanh. Nhiều loài trong cấu trúc tản có chứa agar là chất có đặc tính quý, dùng làm nguyên liệu chế các bánh kẹo cao cấp, đặc biệt dùng cho môi trường nuôi giữ, phân lập vi sinh vật, công nghiệp thực phẩm [6]. 1.1.2. Phân bố Các loài rong đỏ phần lớn phân bố ở vùng triều thấp ven bờ nước ấm thuộc khu vực nhiệt đới hoặc cận nhiệt đới, có độ muối 10 – 30‰ , chỉ có một số ít sống ở vùng nước lợ hoặc đầm lầy, dọc những vùng nước ven bờ của các con sông [5]. Rong đỏ chứa sắc tố phycoerythrin, giúp chúng quang hợp tốt 3 [...]... số nghiên cứu gần đây đã phát hiện trong một số loài rong câu Việt Nam đã phát hiện có chứa hàm lượng cao axit béo họ eicosanoit, đặc biệt đã phát hiện 3 loài chứa PGE2 trong đó có loài rong câu chỉ vàng Gracilaria tenuistipitata, loài rong có sản lượng cao và là nguyên liệu chính trong công nghiệp sản xuất agar Việt Nam [17] 20 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Rong. .. lượng các axit béo trong dịch chiết lipit tổng Thành phần và hàm lượng các axit béo trong dịch chiết lipit tổng của rong câu chỉ vàng G tenuistipitata được thể hiện trong bảng 3 và hình 9, 10: Hình 8: Phổ GC thành phần hàm lượng các axit béo 28 Bảng 3: Thành phần và hàm lượng các axit béo trong dịch chiết lipit tổng TT Tên của axit béo Tên thông thường Thời gian lưu (phút) Hàm lượng (%) - Tên khoa học 3.65... ta nguồn rong câu có giá trị khai thác nhiều hơn cả là những loài sống trong vùng nước lợ, đồng muối, đầm phá Đầm nước lợ được hình thành do việc đắp đê bào trên các bãi triều với mục đích sản xuất tôm, cá tự 8 nhiên, bán thâm canh, hay thâm canh cải tiến Trong đầm nước lợ có một số loài rong lục, rong đỏ, trong đó rong câu thường gặp là rong câu chỉ vàng và rong câu thắt Trong đầm, rong câu có sinh... giao Hình 2: Sinh sản hữu tính ở rong câu chỉ vàng G tenuistipitata 1.3 AGAR (HAY AGAR- AGAR) 1.3.1 Cấu trúc Agar là một polysaccharit hầu như chỉ có trong rong đỏ Payen (1859) là người đầu tiên nghiên cứu loại polysaccharit này, đã mô tả công thức phân tử của agar là (C6H10O5)n Trong những năm sau đó nhiều nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc agar đã được thực hiện Các kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng cấu trúc... chất gel của agar, ảnh hưởng đến nhiệt độ đông của dung dịch agar Agar và agaroit từ những mẫu rong khác nhau có nhiệt độ đông rất khác nhau Đặc biệt, mức độ metoxyl hóa trong những polyme agar từ rong biển chi Gracilaria cao hơn một cách đáng kể so với agar từ các chi khác và sự khác nhau đó được phản ánh trong nhiệt độ đông của agar Trong thực tế, agar được chiết từ những mẫu rong biển thu c chi Gracilaria... học cao từ rong biển thì lipit được nghiên cứu khá nhiều do trong thành phần của chúng có có chứa nhiều axit 15 béo không no nhiều nối đôi (Polyunsaturate fatty axits- PUFAs), các axit này được xác định như một thành phần đặc trưng của rong biển Chính các axit béo PUFAs này là những chất thể hiện hoạt tính sinh học của lipit, trong đó quan trọng nhất là các axit béo họ omega3 (hay n-3) và họ omega6... được tìm thấy trong một polysaccharit khai thác từ một vài loài Gracilaria sống trong vùng nước lạnh dưới 10oC Trong công nghiệp: agar dùng để hồ tơ lụa, vải sợi, dùng trong kỹ thu t in, làm thu c đánh răng, nghiên cứu hóa các chất dẻo, chất cao điện hóa học, làm giấy chống ẩm, sơn nước thay cho keo xương, dùng trong phim ảnh Trong nông nghiệp agar làm môi trường chế phân vi khuẩn (1kg agar có thể... 5.100 tấn rong khô, chiếm 77% tổng sản lượng cả nước, phần còn lại xuất khẩu sang Trung Quốc ở dạng nguyên liệu thô, nên giá xuất khẩu còn thấp khoảng 6000-6700 đ/kg khô Các cơ sở sản xuất agar ở Việt Nam tập trung phần lớn ở Hải Phòng và Thái Bình, quy trình sản xuất hầu như đều tương tự nhau, chỉ khác nhau ở công cụ sản xuất [3] 1.4 LIPIT VÀ AXIT BÉO 1.4.1 Lipit Tên gọi lipit xuất phát từ tiếng... là axit arachidonic (AA) và axit eicosapentaenoic (EPA)[1,2,9,11] Nhiều nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu các chất có hoạt tính sinh học trong lớp chất của rong biển: Những kết quả thu được về lipit và axit béo của Khotimchenko S V, Svetashev (1991) đã xác định được thành phần các axit béo của một số loài rong đỏ Đáng chú ý là axit eicosapentaenoic (EPA) và axit arachidonic (AA) Khi nghiên cứu. .. từng loại protein khác nhau mà tỷ lệ % các nguyên tố C, H, O, N trong phân tử có sự thay đổi [4,5,14] Các nghiên cứu về hàm lượng protein trong rong biển còn rất ít Theo các công trình nghiên cứu cho thấy hàm lượng protein của rong biển dao động khá lớn, chúng không chỉ phụ thu c vào thành phần loài mà còn phụ thu c vào quá trình phát triển và đặc biệt là điều kiện sống của rong Hàm lượng protein trong . ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC Vũ Thị Oanh NGHIÊN CỨU THU NHẬN LIPIT GIÀU AXIT BÉO HỌ EICOSANOIT TỪ RONG CÂU CHỈ. N ă m 2 0 1 4 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC Vũ Thị Oanh NGHIÊN CỨU THU NHẬN LIPIT GIÀU AXIT BÉO HỌ EICOSANOIT TỪ RONG CÂU CHỈ. này; các thầy cô công tác tại Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập tại Khoa. Cuối cùng em xin bày