Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM TỐNG XUÂN HOA NHÂN GIỐNG CÂY SÂM DÂY (Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên - 2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM TỐNG XUÂN HOA NHÂN GIỐNG CÂY SÂM DÂY (Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.01.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Tâm Thái Nguyên - 2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin cảm ơn TS. Nguyễn Thị Thúy Hường, Trại Thực nghiệm Sinh học thuộc Viện Công nghệ Sinh học đã hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong quá trình tiến hành thí nghiệm. Trong quá trình nghiên cứu, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của kĩ thuật viên Trần Thị Hồng (Phòng thí nghiệm Nuôi cấy mô tế bào thực vật - Khoa Sinh - KTNN - Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên). Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Tôi xin chân thành cảm ơn Bộ môn Di truyền và Sinh học hiện đại - Trường Đại học sư phạm Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện quá trình nghiên cứu. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn đến gia đình cùng bạn bè đã động viên, khuyến khích, giúp đỡ tôi, luôn quan tâm và là chỗ dựa cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Thái nguyên, tháng 8 năm 2014 Tác giả luận văn Tống Xuân Hoa Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố. Thái nguyên, tháng 8 năm 2014 Tác giả luận văn Tống Xuân Hoa Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt iv Danh mục các bảng. v Danh mục các hình vi MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 2 3. Nội dung nghiên cứu 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Giới thiệu chung về cây Sâm dây 3 1.1.1. Đặc điểm phân loại và sinh học của cây Sâm dây 3 1.2. Kỹ thuật nhân giống in vitro trong công nghệ tế bào thực vật 9 1.2.1. Ưu thế và các phương thức nhân giống in vitro 9 1.2.2. Quy trình nhân giống in vitro 12 1.3. Chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin và cytokinin sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật 14 1.3.1. Auxin 15 1.3.2. Cytokinin 16 1.4. Tình hình nhân giống cây dược liệu bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ở trong nước và ngoài nước 17 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1. Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 21 2.1.1. Vật liệu 21 2.1.2. Hoá chất, thiết bị 21 2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 21 2.2. Phương pháp nghiên cứu 21 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv 2.2.1. Phương pháp nuôi cấy in vitro 21 2.2.2. Phương pháp xử lí và tính toán số liệu 24 2.2.3. Điều kiện thí nghiệm 25 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm Cytokinin đến khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi Sâm dây trong ống nghiệm 26 3.1.1. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi cây Sâm dây trong ống nghiệm 26 3.1.2. Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi Sâm dây trong ống nghiệm 29 3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ của chồi Sâm dây trong ống nghiệm 30 3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp giữa các chất thuộc nhóm Cytokinin với IBA đến hiệu quả nhân chồi, sự sinh trưởng của chồi và khả năng tạo rễ cây Sâm dây trong ống nghiệm 32 3.3.1. Ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và IBA đến khả năng nhân chồi, sự sinh trưởng của chồi và khả năng tạo rễ cây Sâm dây trong ống nghiệm 32 3.3.2. Ảnh hưởng kết hợp giữa Kinetin và IBA đến khả năng nhân chồi, sự sinh trưởng của chồi và khả năng tạo rễ cây Sâm dây trong ống nghiệm 33 3.3.3. Ảnh hưởng kết hợp giữa BAP, kinetin và IBA đến khả năng nhân chồi, sự sinh trưởng của chồi và khả năng tạo rễ cây Sâm dây trong ống nghiệm 35 3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống và sự sinh trưởng của cây con trong vườn ươm 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC 44 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT BAP: 6-Benzylaminopurine CS: Cộng sự CT: Công thức ĐC: Đối chứng IBA: Indole-3-acetic acid Kinetin: 6-furfurylaminopurine MS: Murashige và Skoog Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ v DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi Sâm dây (sau 4 tuần và 8 tuần) 27 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi Sâm dây (sau 4 tuần và 8 tuần) 29 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ của chồi Sâm dây (sau 8 tuần) 31 Bảng 3.4. Ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và IBA đến khả năng nhân chồi, sự sinh trưởng của chồi và khả năng tạo rễ cây Sâm dây (sau 8 tuần) 32 Bảng 3.5. Ảnh hưởng kết hợp giữa Kinetin và IBA đến khả năng nhân chồi, sự sinh trưởng của chồi và khả năng tạo rễ cây Sâm dây (sau 8 tuần) 34 Bảng 3.6. Ảnh hưởng kết hợp giữa BAP, kinetin và IBA đến khả năng nhân chồi, sự sinh trưởng của chồi và khả năng tạo rễ cây Sâm dây (sau 8 tuần) 35 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống và sự sinh trưởng của cây Sâm dây in vitro trong vườn ươm (sau 4 tuần) 38 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vi DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Cây Sâm dây 3 Hình 3.1. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi Sâm dây (sau 8 tuần) 27 Hình 3.2. Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi Sâm dây (sau 8 tuần) 30 Hình 3.3. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ của chồi Sâm dây (sau 8 tuần) 31 Hình 3.4. Ảnh hưởng kết hợp của BAP và IBA đến khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng của chồi cây Sâm dây trong ống nghiệm (sau 8 tuần) 33 Hình 3.5. Ảnh hưởng kết hợp của kinetin và IBA khả năng nhân chồi, sự sinh trưởng của chồi cây Sâm dây trong ống nghiệm (sau 8 tuần) 34 Hình 3.6. Ảnh hưởng kết hợp của BAP , kinetin, IBA đến khả năng nhân chồi và sinh trưởng của chồi cây Sâm dây trong ống nghiệm (sau 8 tuần) 36 Hình 3.7. Cây Sâm dây đưa ra môi trường tự nhiên (sau 4 tuần) 38 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những kỹ thuật rất quan trọng của Công nghệ sinh học thực vật. Những thành tựu của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đạt được đã chứng tỏ khả năng ứng dụng hiệu quả trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là nhân nhanh và bảo tồn các loài cây thuốc quý có giá trị kinh tế cao. Mặc dù có nguồn tài nguyên thực vật phong phú, đa dạng và kinh nghiệm sử dụng dược liệu làm thuốc của nhân dân ta đã có từ xa xưa, nhưng nguồn tài nguyên đó đang ngày càng suy giảm nghiêm trọng, đa số các cây thuốc quý hiếm đang có nguy cơ tuyệt chủng. Nguyên nhân là do sự khai thác một cách ồ ạt, không có kế hoạch và chưa chú ý đến việc tái sinh, bảo vệ rừng làm nguồn cây thuốc Việt Nam bị tàn phá nhanh và cạn kiệt. Sâm dây hay còn gọi là Đảng sâm là loại dược liệu quý được đưa vào sách đỏ Việt Nam từ năm 1996. Công dụng của Sâm dây đã được nghiên cứu và được y học dân tộc đưa vào các bài thuốc chữa bệnh. Sâm dây là một vị thuốc có rất nhiều công dụng chữa bệnh và phòng ngừa bệnh, giúp cho cơ thể khỏe mạnh và đề kháng tốt. Đông y coi Sâm dây là nhân sâm của người nghèo vì có mọi công dụng của nhân sâm nhưng lại rẻ tiền hơn. Vì thế việc dùng Sâm dây trở nên phổ biến rộng rãi, đáp ứng được nhu cầu sử dụng gần như không giới hạn trong y học dân tộc. Tuy nhiên, nạn tàn phá rừng làm nương rẫy quá mức trong tự nhiên làm cho vùng phân bố của cây Sâm dây bị thu hẹp nhanh chóng, có nguy cơ cạn kiệt. Vì vậy, việc bảo tồn cây Sâm dây là cần thiết. : “Nhân giống cây Sâm dây (Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật”. [...]... 1.4 Tình hình nhân giống cây dƣợc liệu bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ở trong nƣớc và ngoài nƣớc Ở Việt Nam, công nghệ nuôi cấy mô tế bào phục vụ nhân giống cây trồng đã được triển khai trên 20 năm nay Nhân giống thương mại quy mô lớn đã đạt được ở một số cây trồng như nhân nhanh giống chuối (khoảng 2 triệu cây/ năm), nhân nhanh giống khoai tây sạch bệnh, nhân nhanh các giống mía mới nhập... thống cấy vô trùng Là giai đoạn chuyển mẫu vật từ ngoài vào môi trường nuôi cấy, giai đoạn này được tiến hành theo các bước: ( 1) Khử trùng bề mặt mẫu vật và chuẩn bị các môi trường nuôi cấy ( 2) Cấy mẫu vật đã khử trùng vào ống nghiệm hoặc bình nuôi cấy có sẵn môi trường nhân tạo (giai đoạn này còn gọi là cấy mẫu in vitro) Các mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm khuẩn, nấm, virus sẽ được nuôi trong phòng nuôi. .. thức nhân giống in vitro được ứng dụng đó là nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng; tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây và nhân giống qua giai đoạn mô sẹo đã đem lại khả năng nhân giống cây trồng ở quy mô lớn, kể cả các đối tượng khó nhân giống bằng phương pháp thông thường, hệ số nhân giống cao, tiết kiệm vật liệu giống, cho ra sản phẩm đồng nhất về mặt di truyền Nguyên liệu nuôi. .. thành cây con từ phôi vô tính cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro [18] Đối với cây Sâm dây hiện nay các tài liệu nghiên cứu rất hạn chế Việc nghiên cứu, bảo tồn và phát triển các loại dược liệu, nhất là dược liệu hoang dại là một trong những lĩnh vực phát triển mạnh đi cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học thực vật Do đó việc nghiên cứu nhân giống cây Sâm dây bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực. .. (Blume) Hook. f. , tên thường gọi: Đảng sâm, Vú chó, Kim tiền báo, Thổ đảng sâm, Đảng sâm nam, cây Đùi gà, Mằn rầy cấy (Tày), Cang hô (Mèo) Sâm dây thuộc Chi Codonopsis Họ Hoa chuông (Campanulaceae) Bộ Hoa chuông (Campanulales) Lớp Hai lá mầm (Magnoliopsida) Ngành Hạt kín (Magnoliophyta) Giới Thực vật (Plantae) [13], [16] (Nguồn: cơ sở tài nguyên của Viện dược liệu (http://www.vienduoclieu.org.vn /)[ 32]... http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ( 5) Chữa trẻ nhỏ đái dầm: Dùng Sâm dây 20 - 30g, thịt lợn nạc 50 100g, hầm chín ăn (uống nước canh, ăn thịt) ( 6) Chữa trẻ nhỏ cam tích: Dùng Sâm dây 15g, thịt lợn nạc 50 – 70g, cùng hầm chín, chia ra ăn trong ngày [13], [31] 1.2 Kỹ thuật nhân giống in vitro trong công nghệ tế bào thực vật Nhân giống in vitro (vi nhân giống) là một trong những ứng dụng chính của công nghệ tế bào thực vật, sử dụng... nghiên cứu Thí nghiệm được thực hiện tại phòng Công nghệ tế bào - Khoa Sinh Kỹ thuật nông nghiệp - Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phƣơng pháp nuôi cấy in vitro Sử dụng các đoạn thân mang chồi nách của các cây Sâm dây mẫu làm vật liệu cấy trên môi trường nhân nhanh Để tìm ra môi trường nuôi cấy tối ưu cho nhân nhanh và tạo rễ cây Sâm dây, chúng tôi đã bố trí... làm vật liệu của công tác chọn giống ( 2) Duy trì và nhân nhanh các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các loại cây trồng khác nhau như cây lương thực có củ, các loại cây rau, cây cảnh, cây dược liệu… ( 3) Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng cách li tái nhiễm kết hợp với việc làm sạch bệnh virus ( 4) Rút ngắn thời gian đưa các cây lai và các loài cây tự nhiên có đặc điểm tốt vào sản xuất hoặc nhân. .. năng nhân chồi, sự sinh trưởng của chồi và khả năng ra rễ của cây Sâm dây trong ống nghiệm - Nghiên cứu giá thể và các điều kiện thích hợp để đưa cây ra môi trường tự nhiên Số hóa bởi Trung tâm Học liệu 2 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về cây Sâm dây 1.1.1 Đặc điểm phân loại và sinh học của cây Sâm dây Cây Sâm dây có tên khoa học là Codonopsis javanica (Blume). .. các mô sẹo vừa phát sinh, tức là mô sẹo sơ cấp mới thu được cây tái sinh đồng nhất Thông qua giai đoạn mô sẹo có thể thu được những cây sạch virus [14], [21], [26] 1.2.2 Quy trình nhân giống in vitro Theo Đỗ Năng Vịnh (200 5) quy trình nhân giống in vitro gồm các giai đoạn sau [26]: Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc Vì trong nuôi cấy in vitro cây con sẽ mang những đặc tính và tính trạng của cây . cây Sâm dây bị thu hẹp nhanh chóng, có nguy cơ cạn kiệt. Vì vậy, việc bảo tồn cây Sâm dây là cần thiết. : Nhân giống cây Sâm dây (Codonopsis javanica (Blume) Hook. f. ) bằng kỹ thuật nuôi cấy. HỌC SƢ PHẠM TỐNG XUÂN HOA NHÂN GIỐNG CÂY SÂM DÂY (Codonopsis javanica (Blume) Hook. f. ) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.01.21. SƢ PHẠM TỐNG XUÂN HOA NHÂN GIỐNG CÂY SÂM DÂY (Codonopsis javanica (Blume) Hook. f. ) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC