Năm 2011 1 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai MỞ ĐẦU Công nghệ sinh học là một bước tiến mới nhất trong nỗ lực lâu dài chinh phục tự nhiên để nâng cao điều kiện sống của con người. Những thành tựu của chúng đã làm cho cuộc sống con người an toàn hơn, khỏe mạnh hơn, tạo ra các sản phẩm cho năng suất cao hơn, đáp ứng nhu cầu của con người. Tuy ra đời muộn hơn các ngành khoa học khác nhưng công nghệ sinh học đang trên đà phát triển mạnh mẽ và ngày càng có nhiều đóng góp tích cực vào sự tiến bộ chung của nhân loại. Là một bộ phận của công nghệ sinh học nên công nghệ gen cũng nằm trong xu thế phát triển không ngừng đó. Thành công đầu tiên của công nghệ gen thực vật bậc cao là tái sinh được cây trồng chuyển gen (transgenic plant) vào đầu thập niên 1980. Bằng các kỹ thuật khác nhau để đưa một đoạn DNA ngoại lai vào genome của tế bào, đến nay đã có hơn 120 loài thực vật thuộc 35 họ bao gồm các cây trồng rau quả, nông nhiệp, cây cảnh, cây dược liệu và cây cỏ được chuyển gen thành công. Trong đó, chuyển gen vào cây trồng với mục đích tạo ra protein kháng nguyên để sản xuất vaccine dựa vào thực vật phòng bệnh cho người và động vật đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Đây là một lĩnh vực mang nhiều hứa hẹn và ý nghĩa cho những nước đang phát triển, nơi mà việc triển khai tiêm chủng mở rộng bằng các loại vaccine truyền thống còn gặp nhiều khó khăn vì giá thành thành cao, điều kiện bảo quản khắt khe Nghiên cứu chuyển gen kháng độc tố bề mặt của Streptococcus mutans (SpaA) vào cây thuốc lá vào năm 1990 đã đánh dấu sự ra đời của vaccine thực vật. Sau đó là hàng loạt các công bố về chuyển gen vào cây trồng để phát triển loại vaccine này như vaccine phòng bệnh viêm gan B, viêm gan C, bệnh tiêu chảy [19, 22, 31, 40]. Hiện nay, bệnh tiêu chảy có tỷ lệ người mắc và tử vong rất cao. Hàng năm, trên thế giới có hàng tỷ người mắc bệnh và hàng triệu người tử vong do bệnh tiêu chảy. Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới ẩm, dân cư đông đúc, điều kiện vệ sinh kém nên bệnh tiêu chảy khá phổ biến. Ở Việt Nam, bệnh tiêu chảy xếp thứ hai trong 10 bệnh phổ biến nhất sau cúm và xếp thứ tư trong 10 bệnh có tỷ lệ tử vong cao nhất [6]. Bệnh tiêu chảy thực sự là mối đe dọa nguy hiểm cho con người, là gánh nặng cho y tế cộng đồng và gây thiệt hại lớn về kinh tế-xã hội. Vì vậy, nghiên cứu để chuyển gen kháng nguyên vào cây trồng làm cơ sở cho các nghiên cứu chuyên sâu về vaccine dựa vào thực vật là vấn đề đang được quan tâm. Có nhiều phương pháp chuyển gen đươc áp dụng cho thực vật như chuyển gen vào tế bào nhờ Agrobacterium tumefaciens, chuyển gen vào tế bào bằng vi đạn, xung điện, xử lí hóa học bằng PEG… Một trong những phương pháp hữu hiệu hiện đang được sử dụng phổ biến tại các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học trong nước và trên thế giới là chuyển gen trực tiếp bằng vi đạn. Kỹ thuật này có khả năng áp dụng đối với hầu hết các đối tượng động thực vật, vi sinh vật. Đặc biệt, nó còn cho phép chuyển gen ngoại lai vào các cơ quan tử như lục lạp, ty thể…[45]. Rau má (Centella asiatica L.) là loại rau phổ biến trong tự nhiên và thường Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ thuật vi đạn Năm 2011 2 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai mọc ở những nơi ẩm ướt như bờ mương bờ sông, bờ ruộng, từ lâu đã được sử dụng làm thực phẩm, có giới hạn sinh thái rộng, dễ trồng và có khả năng sinh trưởng rất mạnh. Chúng thường được làm rau xanh cho mỗi bữa ăn hay dùng dich chiết thô để chữa một số bệnh như lao, phong, thổ huyết. chữa giãn tĩnh mạch [5]. Xuất phát từ những vấn đề trên chúng tôi chon đề tài “Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ thuật vi đạn” nhằm tạo cơ sở cho các nghiên cứu chuyên sâu về vaccine dựa vào thực vật sau này. Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ thuật vi đạn Năm 2011 3 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Chuyển gen ở thực vật Trong gần hai thế kỷ qua, công nghệ sinh học đã đạt được những thành tựu to lớn đặc biệt trong lĩnh vực công nghệ gen. Một trong những thành tựu nỗi bật là chuyển thành công những gen phân lập từ sinh vật này sang sinh vật khác để tạo ra cơ thể biến đổi gen mang các đặc tính mong muốn. Cây trồng chuyển gen (transgenic crops) hay còn gọi là cây trồng biến đổi gen (genetically modified crops) hiện đang là vấn đề được cả thế giới tranh luận. Song không thể phủ nhận hiệu quả của nó trong sản xuất cùng lợi ích kinh tế rất lớn do nó mang lại. Cây trồng chuyển gen với năng suất và chất lượng cao đã đem lại lợi ích khổng lồ cho những quốc gia có nền công nghệ sinh học tiên tiến. Đồng thời giảm được việc sử dụng thuốc trừ sâu, phân bón hóa học vốn làm suy kiệt tài nguyên thiên nhiên và phá vỡ cân bằng sinh thái, ảnh hưởng nghiêm trọng đến khí hậu toàn cầu [6]. Chuyển gen là kỹ thuật đưa một gen mong muốn vào tế bào, gen này có thể có nguồn gốc từ vi sinh vật, động vật, thực vật hay được tổng hợp nhân tạo. Điểm mấu chốt của thao tác di truyền là việc phân lập một đoạn DNA riêng biệt từ hệ gen, đó là bản chất của tạo dòng gen. Tạo dòng gen là quá trình gồm 4 bước: tạo ra các đoạn DNA, gắn chúng vào vector, đưa cấu trúc tái tổ hợp vào tế bào vật chủ để nhân lên, chọn lọc trình tự quan tâm. Và sau cùng là tiến hành chuyển gen mong muốn đó vào tế bào thực vật [13]. Có nhiều phương pháp chuyển gen, tuy nhiên có 2 phương pháp chính là chuyển gen gián tiếp qua A. tumefaciens và chuyển gen trực tiếp như kỹ thuật xung điện, vi tiêm, vi đạn… Lựa chọn phương pháp nào để đạt được mục đích phụ thuộc nhiều yếu tố như vật chủ cần chuyển gen, mục đích của thí nghiêm và các thiết bị cho quá trình chuyển gen. Đa số kỹ thuật chuyển gen yêu cầu các loại mô có khả năng tái sinh cao và điều này góp phần quyết định sự lựa chọn phương pháp chuyển gen thích hợp [45]. Chuyển gen giáp tiếp thông qua A. tumefaciens được sử dụng phổ biến do có nhiều ưu điểm như kỹ thuật hoàn chỉnh, khả năng chuyển một hay một số ít bản sao, hiệu quả cao, chuyển được đoạn DNA lơn, ổn định, ít bị sắp xếp lại và hạn chế các thể khảm. Tuy nhiên, trở ngoại lớn nhất trong phương pháp này là tính đặc trưng vật chủ của A. tumefaciens và hiệu suất biến nạp phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Thay vào đó, người ta sử dụng kỹ thuật chuyển gen trực tiếp bởi những thuận lợi như kỹ thuật đơn giản, áp dụng đối với hầu hết các đối tượng thực vật, động vật và vi sinh vật. Đặc biệt nó còn cho phép chuyển gen ngoại lai vào các cơ quen tử như lục lạp, ty thể [10, 32, 45]. Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ thuật vi đạn Năm 2011 4 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai 1.2. Chuyển gen bằng kỹ thuật vi đạn 1.2.1. Khái quát chuyển gen bằng kỹ thuật vi đạn Chuyển gen bằng vi đạn là phương pháp hiện đang được sử dụng phổ biến tại các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học thực vật ở trong nước và trên thế giới. Đây là phương pháp thường hay được sử dụng để đưa gen ngoại lai vào cây trồng hay những cơ thể khác. Hàng triệu hạt vi đạn kim loại bọc DNA được bắn vào tế bào đích hay mô đích bằng hệ thống dội bom hay súng bắn gen. DNA sẽ tách khỏi vi đạn và đi vào trong tế bào, một phần DNA có thể hợp nhất trong NST tế bào vật chủ khi DNA ngoại lai vào đến nhân [32]. Thiết bị chuyển gen dùng để đưa DNA vào tế bào và mô nguyên vẹn nhờ dùng đạn có kích thước hiển vi, có gia tốc cao mang DNA hay những vật chất di truyền khác xuyên qua thành và màng tế bào [44]. DNA được phủ lên bề mặt viên đạn có kích thước hiển vi làm bằng vàng hay tungsten bằng cách cho kết tủa với calcium chloride và spermiline. Một khi DNA vào đến nhân tế bào đích, DNA sẽ có khả năng hợp nhất ổn định trong vật chất di truyền của tế bào đích [16, 32]. Thiết bị chuyển gen được sử dụng để đưa thông tin di truyền vào tế bào, được phát triển vào đầu thập niên 1980 do các nhà thực vật học ở Đại học Cornell (New York, USA). Tên chính xác và đầy đủ của thiết bị chuyển gen là hệ thống phân phối hạt biolistics (biolistic particle delivery system) và kỹ thuật này thường được gọi một cách đơn giản là biolistics (sự kết hợp giữa hai thuật ngữ biology (sinh học) và ballistics (sự bắn tung). Mặc dù có nhiều thiết kế kỹ thuật khác nhau nhưng nguyên lý chung của phương pháp này là sử dụng áp lực xung của khí helium để gia tốc các hạt. Thiết bị được sử dụng rỗng rãi nhất hiện nay là Biolistic PDS R -1000/He Particle Delivery Sytem (Biorad). Hệ thống sử dụng khí helium tạo ra áp suất cao ép vào một đĩa chắn khí (rupsture disk). Khí áp lực khi vượt qua giới hạn chịu đựng của đĩa chắn sẽ làm cho đĩa này vỡ ra, đẩy nhanh viên đạn lớn (marcocarrier) mang hàng triệu hạt vi đạn bọc DNA hướng về tế bào đích. Một màng chắn sẽ ngăn viên đạn lớn lại, chỉ cho viên đạn nhỏ xuyên qua đến tầng đich và thâm nhập vào tế bào [51]. Phương pháp chuyển gen bằng vi đạn cho phép chuyển DNA vào hầu hết các loài hay mô. Quá trình tiến hành nhanh, đơn giản và thuận tiện cho chuyển gen trực tiếp vào những mô toàn năng như phấn hoa, phôi, mô phân sinh hay nuôi cấy tế bào phôi thai. Ngoài ra, phương pháp chuyển gen bằng vi đạn còn cho phép chuyển gen vào cơ quan tử như lục lạp, ti thể [2, 51]. John và cs (1988) đã tiến hành biến nạp thành công vào lục lạp tảo lục đơn bào (Chlamyclomonas reinhardtiib) bằng kỹ thuật vi đạn [25]. Phương pháp này không chỉ được ứng dụng với đối tượng là thực vật mà còn thu hiệu quả ở cả vi sinh vật và động vật. Zelnin và cs (1993) đã nghiên cứu chuyển gen thành công vào mô chuột bằng phương pháp dội bom [59]. Tuy nhiên cũng như các phương pháp chuyển gen khác, phương pháp dội bom cũng có những hạn chế như hiệu suất biến nạp thấp hơn so với các phương pháp khác như chuyển gen nhờ A. tumefaciens, đòi hỏi thiết bị đắt tiền, chi phí cho mỗi lần chuyển Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ thuật vi đạn Năm 2011 5 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai gen tốn kém, việc hợp nhất nhiều bản sao của gen ngoại lai cũng như khả năng hợp nhất của nó vào vùng hoạt động của genome vật chủ, có thể làm gen không hoạt động (gene silencing) và sự không ổn định của gen ngoại lai [36, 51, 54]. 1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen bằng vi đạn 1.2.2.1.Mức độ chân không trong buồng bắn Mức độ chân không trong buồng bắn là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến đường đi của vi đạn. Môi trường chân không trong buồng bắn có tác dụng làm giảm lực ma sát trượt khi các hạt vi đạn di chuyển hướng về tế bào đích. Nhờ vậy mà đạn di chuyễn đúng hướng và không bị thay đổi vận tốc. Mức độ chân không trong buồng bắn tối ưu là 28-29 inHg và sẽ thay đổi tùy vào mục đích thí nghiệm như tiến hành dội bom với mẫu da chuột in situ, mức độ chân không yêu cầu thấp hơn khoảng 20 inHg. Nếu mức độ chân không trong buồng bắn không thích hợp thì sẽ gây áp lực lên mô phá hủy tế bào, làm giảm mức độ biểu hiện của tế bào [50]. Có thể làm tăng hiệu quả biến nạp bằng cách bơm khi helium vào buồng bắn trước khi hút chân không. Nhờ vậy, khí helium sẽ thay thế cho không khí. Cách này đặc biệt hiệu quả với vi sinh vật, làm tăng hiệu quả biến nạp ở vi khuẩn lên 5-6 lần, nấm men lên 4 lần. Helium là loại khí có trọng lượng phân tử thấp nhất sẽ là giảm tối thiểu sự giảm tốc của vi đạn khi chúng di chuyển trong dòng khí và giúp giảm lực tác động khi dòng khi va chạm lên tế bào đích [50]. 1.2.2.2. Áp suất khi Helium Áp suất khí helium ảnh hưởng đến vận tốc vi đạn. Áp suất thích hợp cho quá trình dội bom từ 600-2.400 psi. Nhưng với các loại mô khác nhau thì áp suất thích hợp cũng khác nhau. Các tế bào vi khuẩn, động vật, thực vật thường sử dụng áp suất 1100 psi trong khi tế bào nấm và nấm mem thường sử dụng áp suất 1300 psi. Khi áp suất tăng, sẽ làm tăng sự thâm nhập của vi đạn bọc DNA đi sâu vào tế bào, mô đích nhưng lại làm tổn thương đến tế bào và mô đích [50]. 1.2.2.3. Đường kính và loại đạn Việc lựa chọn loại đạn và đường kính đạn cũng ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất biến nạp. Kim loại làm vi đạn phải có khối lượng riêng đủ lớn để có đủ động lượng xuyên qua mô, thành tế bào đích. Các kim loại thường được sử dụng là vàng, tungsten, palladium. rhodium, platinium, và iridium. Chúng phải trơ về mặt hóa học để tránh phản ứng với DNA hay các thành phần trong tế bào. Đồng thời hình dạng, bề mặt của vi đạn phải đầy đủ các tính chất để đảm bảo chúng có thể gắn với DNA hay tách khỏi DNA một cách dễ dàng [50]. Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ thuật vi đạn Năm 2011 6 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai Đạn tungsten có khá nhiều đường kính khác nhau, từ 0,5-2,0 µm, hình dạng không đồng nhất. Ưu điểm của đạn tungsten là không quá đắt, có nhiều loại với đường kính khác nhau để lựa chọn và có khả năng dính bám DNA trên bề mặt khá tốt. Nhược điểm của loại đạn này là có khả năng gây độc cho một số loại tế bào, dễ bị oxy hóa bề mặt gây phá hủy cấu trúc DNA. Trong khi đạn bằng vàng có khá ít kích cỡ, hình dạng nhẵn, đồng đều hơn so với đạn tungsten. Ưu điểm nổi bật của loại đạn này là tính đồng nhất của chúng, cho phép chúng ta có thể tối ưu đường kính đạn để phù hợp với dạng tế bào cần chuyển. Vàng không độc với bất kỳ loại tế bào nào và đã được chứng nhận bởi FDA về tính an toàn khi sử dụng trong quá trình chuyển gen. Tuy nhiên, nhược điểm của đạn vàng là rất đắt, đồng thời nó không ổn định trong hỗn hợp chất lỏng và bị đóng cục khi để lâu. Đây là hai loại đạn hiện nay hay được sử dụng. Ngoài ra, một số kim loại khác cũng đã được sử dụng làm đạn cho quá trình chuyển gen nhu iridium hay platinium, tuy nhiên hiệu suất biến nạp khá thấp [50]. Đường kính đạn cũng ảnh hưởng đến hiệu suất biến nạp, và nó phụ thuộc vào kích thước của tế bào đích. Thường thì đường kính đạn bằng 1/10 đường kính tế bào đích. Tuy nhiên, trong vài trường hợp sử dụng đạn có đường kính lớn hơn như khi chuyển gen vào tế bào biểu bì chuột, đường kính đạn lớn (đường kính 3,9 µm) trong khi tế bào có đường kính 20 µm. Hoặc khi sử dụng đạn có đường kính 1 µm lại có hiệu quả cao trong nuôi cấy tế bào myotube (kích thước 40x100 µm). Còn theo Kikkert (2005) khi sử dụng đạn vàng có đường kính từ 0,7-1 µm thì tỷ lệ biến nạp ổn định cao nhất [32]. 1.2.2.4. Khoảng cách di chuyển của vi đạn Một trong những thông số ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả biến nạp là khoảng cách di chuyển của vi đạn tính từ màng chắn đến vị trí đặt mô đích. Việc thay đổi các vị trí đặt mô đích sẽ làm thay đổi khoảng cách này. Có 4 mức và có thể thay đổi trong buồng bắn: 3, 6, 9 và 12 cm. Việc lựa chọn mức nào phụ thuộc nhiều vào loại mô, tế bào đích [50]. Việc bọc DNA lên bề mặt đạn là một trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hiệu quả của quá trình chuyển gen. Việc kết lắng DNA trên bề mặt diễn ra rất nhanh. Vì vậy rất khó để thu được một hỗn hợp đồng nhất, do vi đạn bằng vàng hay tungsten rất khó giữ ở dạng huyền phù [50]. Để bọc DNA quanh vi đạn hiệu quả, spermidine và calcium chloride được dùng phối hợp để tăng khả năng ổn định của đạn. Harwood và cs (2000) đã nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình bọc DNA lên bề mặt đạn trong thí nghiệm chuyển gen vào cây lúa mạch. Thay đổi các thông số về lượng đạn, lượng DNA và thể tích sử dụng cho một lần chuyển gen thu nhận các kết quả khác nhau [26]. Các nghiên cứu của Lacorte và cs (1997) cũng cho kết luận tương tự khi quan sát sự biểu hiện của gen gus ở các mô hạt đậu phộng (Arachis hypogaea L.) chuyển gen. Sử dụng lượng đạn nhiều sẽ làm giảm khả năng sống của mô đích dẫn đến làm giảm hiệu suất biến nạp [33]. Thường hay dùng Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ thuật vi đạn Năm 2011 7 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai spermidine hay calcium chloride hay dùng kết hợp cả hai để bọc DNA. Tuy nhiên, trong nghiên cứu của Elumalai và cs (2009) khi sử dụng protamine thay vì spermidine để bọc DNA thì thu hiệu quả biến nạp cao hơn [23]. Cấu hình của vector được dùng trong chuyển DNA ngoại lai vào thực vật ảnh hưởng đến cả sự tiếp hợp lẫn sự biểu hiện của các gen. Sự biến nạp sẽ hiệu quả hơn khi dùng DNA mạch thẳng so với DNA mạch vòng. Hơn nữa các plasmid có kích thước lớn (>10 kb) có thể bị phân đoạn trong quá trình bắn và do đó mức biểu hiện gen ngoại lai thấp. Tuy nhiên, các đoạn DNA lớn có thể được đưa vào cây bằng nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm mem (YAC) [2]. Bản chất của DNA ngoại lai cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình biến nạp. Người ta thường sử dụng DNA sợi đơn, sợi đôi, DNA mạch vòng như plasmid do tính ổn định, bền vững về mặt cấu trúc của nó [32]. Để tối ưu hóa quá trình chuyển gen bằng kỹ thuật vi đạn, các nghiên cứu thường thăm dò các thông số khác nhau nhằm tăng hiệu suất biến nạp. Tùy vào từng loại tế bào, từng đối tượng nghiên cứu mà các thông số này có thể thay đổi khác nhau. 1.3. Một số nghiên cứu về chuyển gen LTB trong nước và thế giới 1.3.1. Trên thế giới Hiện nay, trên thế giới có rất nhiều nghiên cứu về chuyển gen LTB. Mason và cs (1998) đã thiết kế và xây dựng quá trình tối ưu hóa cho việc tổng hợp gen mã hóa LTB, để có thể sử dụng thực vật chuyển gen như là vaccine đường ăn (có thể ăn được) bảo vệ cơ thể khỏi nội độc tố E. coli. Biểu hiện của gen LTB trong khoai tây được tổng hợp dưới sự kiểm soát của vùng promoter có hiệu quả cao hơn ở củ và lá, và lượng LTB này nhiều hơn khi lấy từ vi khuẩn. Mason và cs chứng minh tính sinh miễn dịch khi so sánh lượng kháng thể kháng LTB IgG trong huyết thanh và IgA trong phân ở chuột được cho ăn củ khoai sống với chuột được gây miễn dịch bởi LTB vi khuẩn. Kết quả chuột được cho ăn 1 lần/tuần/3 tuần với liều 5 g khoai củ chứa 20-25 μg LTB so với 5 μg LTB từ E. coli tái tổ hợp. Một tuần sau liều thứ 3, chuột được miễn dịch với LTB khoai tây có nồng độ huyết thanh, niêm mạc cao hơn. Chuột được thử nghiệm với 25 μg LT và sự bảo vệ được đánh giá bởi tỷ lệ ruột/thịt (gut/carcass mass ratios). Mặc dù không có con chuột nào được miễn dịch hoàn toàn nhưng hiệu lực cao hơn được thấy ở vaccine khoai tây so với vaccine vi khuẩn [40]. Kim và cs (2007) đã phát hiện gen sLTB trong DNA của tế bào lá cây diếp cá chuyển gen bằng phương pháp PCR. Sự tổng hợp và gắn kết sLTB vào phần oligomer của cấu trúc pentamer được quan sát thấy ở chất chiết xuất thực vật chuyển gen bằng phương pháp phân tích Western Blot. Sự gắn kết của các sLTB pentamer vào các receptor glucolipid ở màng tế bào thượng mô ruột được xác nhận bằng phương pháp phân tích hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme G-ganglioside. Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ thuật vi đạn Năm 2011 8 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai Protein sLTB chiếm khoảng 1.0-2.0% lượng protein hòa tan trong mô tế bào lá cây diếp cá. Sự tổng hợp và gắn kết của các sLTB monomer vào các oligomer có hoạt tính sinh học trong mô tế bào lá diếp cá cho thấy rõ tính khả thi của việc sử dụng vaccine đường ăn từ thực vật để tạo miễn dịch niêm mạc [34]. Kang và cs (2005) nghiên cứu quá trình sử dụng phôi soma đã chuyển gen LTB của nhân sâm Siberia để sản xuất ra một lượng lớn vaccine thực vật. Khi phôi soma được nuôi cấy vào máy máy phản ứng sinh học loại khí nén 130 L, chúng được chuyển thành phôi soma trưởng thành thông qua quá trình phát sinh phôi và chứa khoảng 0.36% LTB của tổng số protein hòa tan. Phương pháp ELISA đã xác định có sự gắn đặc hiệu vào G-ganglioside của protein LTB tổng hơp từ phôi soma, có nghĩa LTB đã tạo dạng pentamer hoạt động. Vì thế, việc sử dụng hệ thống máy phản ứng sinh học để tạo LTB protein trong phôi soma cho phép sản xuất lượng lớn vaccine thực vật trong thời gian ngắn [29]. Salimian và cs (2010) đã thiết kế thành công gen tổng hợp được tối ưu hóa từ thực vật, mã hóa cho protein CfaB-LTB. Sau khi chèn vào vector biểu hiện thực vật với promoter đặc hiệu, gen này sẽ được đưa vào cây cải dầu. 10 dòng chuyển gene đã được tái sinh. Sau khi phân tích phân tử, cho chuột balb/c ăn hạt của cây cải dầu chuyển gen. Phân tích huyết thanh để xác định IgG và IgA đặc hiệu của Cfab- LTB và phân tích phân để tìm IgA đặc hiệu của Cfab-LTB. Dựa theo kết quả ELISA, Cfab-LTB protein chiếm xấp xỉ 0.3-0.5% tổng lượng protein hòa tan của hạt cây cải dầu chuyển gene. Quan sát thấy phản ứng kháng thể anti Cfab-LTB có nồng độ cao ở nhóm được cho ăn hạt chuyển gene. Các kết quả trên cho thấy Cfab- LTB lấy từ hạt cây cải dầu chuyển gen có tính sinh miễn dịch và có tính bảo vệ khi được dùng theo đường uống cho chuột [49]. Mendoza và cs (2007) nghiên cứu biểu hiện của gen LTB trong cây cà rốt. Phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua Agrobacterium đã được sử dụng trong nghiên cứu này. Ba mươi dòng chuyển gen độc lập đã tạo phôi soma trong 6 tháng nuôi cấy và được chuyển qua nhà kính. Phương pháp GM1-ELISA được sử dụng để đánh giá hàm lượng protein LTB trong rễ cây trưởng thành. Một số dòng chuyển gen biểu hiện LTB lên đến 0,3% trong tổng số protein hòa tan, cao hơn so với biểu hiện ở gen vi khuẩn ban đầu có trong cây. Phân tích miễn dịch học cho thấy hoạt động của protein LTB tái tổ hợp có thể có chức năng phòng chống bệnh tiêu chảy [41]. Oszvald và cs (2008) đã nghiên cứu biểu hiện LTB ở cây lúa chuyển gen. LTB tổng hợp (sLTB) đã được thay đổi dựa trên việc sử dụng trình tự tối ưu hóa của thực vật, và kết hợp với một tín hiệu dịch mã (các chuỗi Kozak) trước trình tự khởi đầu và tín hiệu chặn ER, SEKDEL, trong c-teminus của gen sLTB. Các sLTB và các gen LTB hoang dại (wLTB) được đặt vào vector biểu hiện thực vật dưới sự kiểm soát của vùng promoter đặc biệt ở lúa mì Bx17 HMW (phân tử lượng cao) chứa các intron đầu tiên của gen actin 1 ở lúa. Cả hai gen đã được đưa vào các tế bào lúa (Oryza sativa L.) bằng phương pháp chuyển gen thông qua bắn phá hạt. Sự tích hợp của LTB gen vào nhiễm sắc thể của cây biến đổi gen đã được xác nhận bởi phương Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ thuật vi đạn Năm 2011 9 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai pháp di truyền DNA khuếch đại PCR. Các phiên mã và dịch mã của gen LTB đã được xác định bằng kỹ thuật PCR đảo ngược (RT-PCR) và phân tích Western blot. Các protein LTB tổng hợp trong các mô giống lúa biến đổi gen cho thấy ái lực liên kết với GM1 ganglioside, LTB tổng hợp từ thực vật có khả năng hình thành pentame hoạt động. Mức độ biểu hiện của sLTB cao hơn wLTB trong cây lúa chuyển gen và lên tới 2,7% trong tổng số protein hòa tan của các mô hạt [44]. Chikwamba và cs (2002) nghiên cứu tổng hợp LTB trong hạt giống ngô biến đổi gen. Phương pháp phân tích ELISA đã chỉ ra bằng việc sử dụng CaMV 35S, lượng LTB tối đa được phát hiện trong mô sẹo là 0,04% trong tổng số protein chiết trong dung dịch (TAEP) và 0,01% trong hạt R1 của cây chuyển gen. Sử dụng promoter zein gamma, LTB tích lũy đạt 0,07% trong hạt R1. Trình tự SEKDEL làm tăng lượng LTB khi kết hợp với các promoter zein gamma. Kết quả được theo dõi qua 3 thế hệ cho thấy hạt R3 của một dòng chuyển gen mang promoter 35S CaMV có tối đa là 0,3% LTB trong TAEP, dòng chuyển gen mang promoter zein gamma lên đến 3,7% LTB trong TAEP. Như vậy hạt giống ngô có thể được sử dụng như một hệ thống tổng hợp các kháng nguyên chức năng [19]. Rezaee và cs (2005) nghiên cứu sự biểu hiện của LTB ở chủng Saccharomyces cerevisiae. Để xây dựng vector biểu hiện nấm men cho các protein LTB, gen eltB mã hóa LTB đã được khuếch đại từ DNA E. coli có nguồn gốc con người bằng PCR. Biểu hiện plasmid pLTB83 được xây dựng bằng cách chèn các gene eltB vào vector pYES2 phía dưới promoter GAL1. Vector tái tổ hợp được chuyển vào S. cerevisiae. Các protein LTB được xác định trong tổng số protein hòa tan của nấm men bằng cách phân tích SDS-PAGE. ELISA định lượng đượclượng tối đa của protein LTB biểu hiện hiện trong nấm men được khoảng 1,9% trong tổng số protein hòa tan. Phân tích sinh miễn dịch cho thấy protein LTB có nguồn gốc từ nấm men không thể phân biệt được với protein LTB vi khuẩn về mặt kháng nguyên. Như vậy, khi toàn bộ nấm men tái tổ hợp được xem như là một công thức vắc-xin mới thì biểu hiện của LTB trong S. cerevisiae có thể là một chiến lược rẻ tiền nhưng hiệu quả để bảo vệ chống lại ETEC [47]. Tacket và cs (2004) nghiên cứu chuyển gen LTB vào cây ngũ cốc. Ngũ cốc chuyển gen có thể dùng để ăn mà vẫn không làm mất đi tính kháng nguyên . Điều đó được thể hiện qua việc 1 mg LTB của E. coli mà không có bộ đệm đã được làm thức ăn cho các tình nguyện viên người lớn với ba liều, mỗi liều chứa 2,1 g nguyên liệu thực vật. Bảy trong chín tình nguyện viên (chiếm 78%) có lượng huyết thanh IgG chống các độc tố không bền nhiệt E. coli (LT) và số lượng tế bào tiết kháng thể tăng lên sau khi chủng ngừa. Bốn trong chín tình nguyện viên (chiếm 44%) có lượng IgA tăng lên [53]. Kang và cs (2004) dùng phương pháp chuyển gen bằng Agrobacterium để biểu hiện gen LTB tổng hợp trong N. tabacum, đồng thời sử dụng gen acetyltransferase Phosphinothricin (bar) như là một điểm đánh dấu lựa chọn. Gen LTB tổng hợp phù hợp với trình tự mã hóa của cây thuốc lá đã được nhân bản với một vector biểu hiện thực vật dưới sự kiểm soát của promoter ubiquitin và chuyển vào thuốc lá chuyển gen thông qua Agrobacterium. Cây chuyển gen được lựa chọn Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ thuật vi đạn Năm 2011 10 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai trong môi trường có bổ sung l mg 5’ Phosphinothricin 1 (PPT). Lượng protein LTB được phát hiện trong thuốc lá chuyển gen xấp xỉ 3,3% tổng lượng protein hòa tan, cao hơn khoảng 300 lần so với lượng tạo ra ở các cây sử dụng các gen LTB ban đầu dưới sự kiểm soát của promoter 35S CaMV. Các cây trồng chuyển gen được đưa vào nhà kính và hạt giống thu được đã chứng minh là có khả năng kháng thuốc diệt cỏ. Do đó, kỹ thuật này có thể là một công cụ hữu ích cho việc chuyển đổi gene ở cây thuốc lá [30]. Moravec Tomas và cs (2006) nghiên cứu việc sản xuất LTB từ hạt đậu nành và tính sinh miễn dịch để sử dụng nó như một vaccine đường ăn. Các tiểu đơn vị B của các độc tố không bền nhiệt của E. coli (LTB) được sử dụng như là một immunogen mới trong quá trình sản xuất hạt đậu tương. Biểu hiện của LTB được chuyển trực tiếp tới mạng lưới nội sinh chất của các tế bào nhu mô.Phức hợp Pentameric LTB tích lũy chiếm đến 2,4% tổng lượng protein trong hạt giống vào ngày cuối cùng và được ổn định trong hạt sấy khô. LTB từ đậu tương, cảm ứng với những con chuột ở cả hai hệ thống IgG và IgA, và phản ứng kháng thể IgA niêm mạc, và đặc biệt hiệu quả khi được sử dụng trong một chiến lược chủng ngừa bằng đường ăn qua sonde. Huyết thanh từ những con chuột được chủng ngừa ngăn chặn sự liên kết phối tử in-vitro và con chuột này cũng có thể chống lại các độc tố không bền nhiệt E. coli (LT) khi được thử nghiệm. Hơn nữa, LTB chiết từ đậu tương kích thích các phản ứng kháng thể chống lại một kháng nguyên gấp đến 500 lần. Những kết quả này chứng minh sự hữu ích của đậu nành như một nguồn sản xuất hiệu quả đối với vaccine đường ăn [43]. 1.3.2 Trong nước Ở Việt Nam, việc nghiên cứu thực vật chuyển gen hiện đang là một hướng mới, tuy nhiên đã có những công trình mở đầu cho bước phát triển công nghệ gen ở nước ta trong tương lai. Loc NH và cs (2010 a) đã tổng hợp được gene mã hóa cho LTB được làm phù hợp với chuỗi mã hóa tối ưu ở thực vật và dung hợp với trình tự SEKDEL để tăng cường mức độ biểu hiện và gắn kết protein ở thực vật. Gen tổng hợp LTB được đặt vào một vector biểu hiện, dưới sự kiểm soát của promoter CaMV 35S và được đưa vào cây rau càng cua bằng phương pháp vi đạn. Sự tích hợp gen LTB vào genome DNA của cây được xác định bởi phương pháp PCR. Sự tổng hợp LTB thực vật được kiểm tra bằng kỹ thuật phân tích Western Blot. Lượng LTB protein được sản xuất từ lá cây rau càng cua là khoảng 0.75% của tổng lượng protein hòa tan. Phương pháp ELISA xác định LTB thực vật đã gắn đặc hiệu vào GM1-ganglioside, là receptor của LTB trên màng tế bào, như vậy LTB đã hình thành dạng có hoạt tính sinh học [37]. Loc NH và cs (2010 b) đã nghiên cứu đưa gen LTB vào vector biểu hiện thực vật dưới sự kiểm soát của promoter CaMV 35S, sau đó vector được đưa vào cây cải xoong bằng phương pháp chuyển gen trung gian qua vi khuẩn Argobacterium. Sự tích hợp của gen LTB tổng hợp vào genome được xác nhận bằng kỹ thuật PCR (khuếch đại chuỗi DNA). Sự tổng hợp protein LTB thực vật được xác định bằng Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ thuật vi đạn [...]... protein LTB biểu hiện trong cây rau má Tối ưu quá trình chuyển gen LTB vào cây rau má bằng kỹ thuật vi đạn để tăng hiệu quả biến nạp Kiểm tra sự biểu hiện gen của các dòng chuyển gen thế hệ sau Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ thuật vi đạn Năm 2011 28 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Vi t 1 Nguyễn Hoàng Bách (2 009), Nghiên cứu chuyển. .. và dài ra (2 -3 cm) và sau 6 tuần thì chồi in vitro đã phát triển thành cây hoàn chỉnh với chiều cao trung bình đạt 5 cm [1] Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ thuật vi đạn Năm 2011 21 A SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai B Hình 3.1 (A) Tái sinh chồi từ cuống lá rau má in vitro (B) Cây rau má in vitro sau 5 tuần nuôi cấy 3.2 Chuyển gen ltb bằng kỹ thuật vi đạn Ảnh hưởng... Lệ (2 008), “Thử nghiệm chuyển gen trên lan hồ điệp (Phalaenopsis amabilis L.) bằng phương pháp bắn gen và Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí Phát triển KH & CN (1 0), tr 109-112 Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ thuật vi đạn Năm 2011 29 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai 15 Phạm Thị Quỳnh Nga (2 010), Nghiên cứu chuyển gen LTB vào cây cải xoong bằng kỹ thuật vi đạn, ... 414 4 bp bp SM 1 2 3 Hình 3.5 Điện di cá sản phẩm PCR từ genomic DNA của các cây chuyển gen ltb trên agarose gel 0,8% SM: thang marker; 1 PC: vector pMY051 mang gen ltb; 2 NC: cây rau má không chuyển gen; 3 Cây rau má chuyển gen Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ thuật vi đạn Năm 2011 27 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai Chương 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận... cm Phạm Thị Quỳnh Nga và cs (2 010) tiến hành chuyển gen LTB vào cây cải xoong ở áp suất khí helium 1100 psi, khoảng Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ thuật vi đạn Năm 2011 25 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai cách bắn 9 cm, sau 8 tuần nuôi cấy, các đoạn thân chuyển gen bắt đầu xuất hiện chồi [18] Watad và cs (1 998) chuyển gen PAT vào cây hoa loa kèn, sử dụng nguyên... của mạch máu Do đó rau má cũng hữu ích trong các chứng tăng áp lực tĩnh mạch ở các chi dưới [5, 7] Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ thuật vi đạn Năm 2011 15 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng và nguyên liệu nghiên cứu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là cây rau má (Centella asiatica L.) thuộc... phút, 95oC/1 phút (3 0 chu kỳ), 55oC/1 phút, 72oC/1 phút và cuối cùng 72oC/10 phút Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên agarose gel 0,8% và nhuộm với ethidium bromide [28] Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ thuật vi đạn Năm 2011 20 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tạo cây rau má in vitro Trong chuyển gen, vi c lựa chọn... LTB tổng hợp Trình tự Kozak (GCCACC), trình tự SEKDEL (TCTGAGAAGATGAGCTA) 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Tạo cây rau má in vitro Cây rau má tự nhiên có đặc tính sạch bệnh, khỏe mạnh được chọn làm đối tượng chuyển gen trong nghiên cứu này Rau má sau khi được thu thập sẽ cắt bỏ rễ và một phần cuống lá để thu chồi đỉnh có kích thước 5-6 cm Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca. .. biểu hiện protein LTB Cây rau má sau khi tái sinh từ mô chuyển gen được đem đi phân tích sự hiện diện của gen ltb bằng phương pháo PCR Kết quả PCR được trình bày ở hình 3.5 cho thấy có sự hiện diện của một band DNA với kích thước khoảng gen ltb trong cây rau má Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ thuật vi đạn Năm 2011 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai 26 56 414 4 bp bp... asiaticoside Đề tài: Khảo sát chuyển gene LTB vào cây rau má ( Centella asiatiaca L.) bằng kỹ thuật vi đạn Năm 2011 14 SVTH: Hồ Thị Quỳnh Mai và các loại vitamins B1, B2, B3, C và K, tùy theo khu vực trồng hoặc mùa thu hoạch tỷ lệ các hoạt động chất có thể sai khác [7] 1.6.2.4 Tác dụng dược lý và công dụng của cây rau má Theo y học cổ truyền, rau má có vị đắng, hơi ngọt, tính bình, vào Can, Tỳ Vị có tác . phòng bệnh cho người và động vật đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Đây là một lĩnh vực mang nhiều hứa hẹn và ý nghĩa cho những nước đang phát triển, nơi mà việc triển. (genetically modified crops) hiện đang là vấn đề được cả thế giới tranh luận. Song không thể phủ nhận hiệu quả của nó trong sản xuất cùng lợi ích kinh tế rất lớn do nó mang lại. Cây trồng chuyển gen. Cambuchia, Indonesia, Mailasia, Srilanka, Ấn độ, Pakistan, Madagascar… [5, 7]. 1.6.2.2. Đặc điểm về hình thái Rau má là một loại cỏ mọc bò, có rễ ở các mấu, thân gầy, nhẵn. Lá hình mắt chim, màu xanh,