BỘYTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI • • • • NGUYỄN DANH HIỆU NGHIÊN CỨU PHÂN BIỆT "HOÀI SƠN" CHẾBtẾN TỪ CÁC LOÀI DIOSCOREA KHÁC NHAU KHỐA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sl KHÓA 2003 - 2007 Người hướng dẫn : DS. Hồ Trung ChiênN-i— Nơi thực hiện : Bộ môn dược liệu Trường Đại học Dược Hà Nội Thời gian thực hiện : Từ 02/2007 - 05/2007 Ha IVỘi -0S/S007 m LỜI CẢM ƠN Khoá luận này được thực hiện tại bộ môn Dược Liệu trường đại học Dược Hà Nội. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm 0fn thầy: H ồ T run g C hiến đã tận tình hướng dẫn giúp đỡ Em trong suốt quá trình học tập và thực hiện khoá luận. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên trong trường, đặc biệt là các thầy cô giáo và anh chị kỹ thuật viên bộ môn Dược Liệu Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi để Em hoàn thành khoá luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và những người thân đã khuyên khích, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp. Hà Nội, tháng 5 năm 2007 Sinh viên Nguyễn Danh Hiệu MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN 1 CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT 3 ĐẶT VẨN ĐỂ 4 Phần 1. Tổng quan 5 1 .1 . Đặc điểm về hình thái cơ bản của họ Củ Nâu (Dioscoreaceae). 5 1 .2 . Đặc điểm về hình thái của một số cây thuộc chi Dioscorea L 7 1.2.2. Cây Củ md 9 1 2 3 . Cây Củ Cọc 10 1.2.4. Cây Củ mài thân sùi 11 1.2.5. Cây Củ Dại 12 Phần 2. Thực nghiệm và kết quả nghiên cứu 13 2.1. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 13 2.1.1 Nguyên liệu 13 2.1.2 phương pháp nghiên cứu 13 2.2. Thực nghiệm và kết quả 16 2.2.1. Kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái và đặcđiểm vỉ học: 16 2.2.2. Kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học 18 2.2.3. Nghiên cứu một số mẫu Hoài sơn trên thị trường 36 Phần 3. Kết luận và đề xuất 37 1. Kết luận 37 2. Đề xuất 37 TÀI LIÊU THAM KHẢO 38 CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT SKĨM ; Sắc ký lớp mỏng. SKĐ : Sắc ký đồ. p.ư ; Phản ứng. Uv 254nm : Ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm. Uv 366nm : Ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm. ĐẶT VẤN ĐỂ Họ Củ nâu (Dioscoreaceae) phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đói và cận nhiệt đới thuộc Đông và Đông Nam châu Á. ở Việt Nam, nhiều loài thuộc chi Dioscorea có hình thái thực vật tương đối giống nhau, nên dễ gây nhầm lẫn. Thân rễ một số loài sau khi chế biến thành vị thuốc có hình dáng, thể chất rất giống nhau, nên khó phân biệt. Dược điển Việt Nam n i qui định: củ mài (Rhizoma Dioscoreae persimỉlis) là thân rễ đã chế biến khô của cây củ mài còn gọi là Hoài sơn (Rhizoma D .persimilis Prain et Burkill), họ Củ nâu (Dioscoreaceae). Lâu nay, trên thị trường người ta sử dụng các vị thuốc mang tên Hoài som chế biến từ nhiều loại củ khác nhau thuộc chi Dioscorea L. như củ mài, Củ cọc, Củ mỡ .v.v tác dụng của những vị thuốc này so vái Hoài sơn chưa có tài liệu nào công bố một cách đầy đủ. Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu phân biệt “Hoài sơn” chế biến từ các loài Dioscorea khác nhau, với mục đích xây dựng cơ sở dữ liệu góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn kiểm nghiệm vị thuốc Hoài sơn. Đề tài gồm các nội dung sau: • Nghiên cứu hình thái thực vật các loài thuộc chi Dioscorea dùng chế biến Hoài scfn trên thị trường. • Nghiên cứu thành phần hoá học trong các vị thuốc, Tìm ra đặc điểm để phân biệt các vị thuốc mang tên Hoài sơn trên thị trường. PHẦN 1. TỔNG QUAN 1.1. Đặc điểm về hình thái cơ bản của họ củ Nâu (Dioscoreaceae) Theo hệ thống phân loại Takhajan 1987, họ củ Nâu (Dioscoreaceae) thuộc bộ củ Nâu (Dioscoreales), Phân lớp Hành (Liliidae), Lớp Hành {Liliopsidae), Ngành Ngọc Lan {Magnoliophyta)[\%\[2QĨ\ Các cây họ củ Nâu là cây có củ hay thân rễ, thuộc dạng thảo, mọc leo, có khi mọc đứng hay toả ra. Lá thưòfng mọc so le, hay mọc đối, thường đơn, có hình dạng thay đổi, dạng tim hay có góc. Cụm hoa thành chùm hay bông ở nách lá. hoa nhỏ màu lục, trắng trắng hay vàng vàng, đều, đơn tính; hoa đực hình chuông, hình bánh xe hay hình ống; hoa cái có bao hoa tồn tại. Quả nang, có 3 cạnh, 3 cánh; hạt có nhiều hay ít. Một số loài tạo ra hành con. [21] Họ củ Nâu trên thế giới có 9 chi và trên 650 loài, phân bố ở vùng Nhiệt đới và Á Nhiệt đói, nhiều chi sống ở vùng trung sinh, một vài chi trong họ như chi Stenomesis (2 loài) phân bố ở Đông Nam Châu Á. [23] ở nước ta, họ củ Nâu chỉ có 1 chi với 51 loài (Ploregenéralede 1- Indochine tập VI). Chi Dioscorea L. gồm các loài cây phân bố rất rộng rãi ở nước ta, từ Bắc vào Nam, đa số là cây mọc dại trong rừng thứ sinh ẩm ướt, từ vùng đồi thấp đến vùng núi đá vôi. Nhiều loài cho củ ăn được và làm thuốc nên được gây trồng rất phổ biến ở nông thôn. Có loài củ lấy Tanin rất tốt hoặc dùng lấy chất Diosgenin để bán tổng hợp hormone Steroid. [23]. Củ Mài là cây quen thuộc, ngoài ra còn nhiều cây đã và đang được dùng rộng rãi trong nhân dân như: + Dioscorea cirrhosa Lour. (Cây Củ Nâu). + Dioscorea alata L (Củ Cái, Khoai vác). + Dioscoreatokoro Makico ( Tỳ giải). + D ioscoreabulbifera L.( Củ Dại, Củ Mỡ). + D ioscorea esculenta Burk. ( Củ từ). + D ioscorea kratica Prain et Burk. (khoai Mỡ). + D ioscorea pentaphylla L. (Cây Sú vằn, Củ trâu, Từ năm lá). + D ioscorea brevipetiolata Prain et Burkill (khoai mài) + Dioscorea glabra Rox B. (Khoai rạng, Củ cọc). + Dioscorea collettỉi Hook. F.(Nần nghệ, Ty giải). + D ioscorea hem sleyi Prain et Burk. (Chiêm sơn dược). + Dioscorea poilanei Prain et Burk. ( Củ từ Poilane). + D ioscorea chingii Prain et Burk (Sơn cát thự, Từ chinh). + D ioscorea deltoiea wall ex Kunth. ( c ủ nêm, Từ tam giác). +Dioscorea hispida Dennest. (Dioscorea triphylỉa var reticulate Praỉn et Burk.)ị Củ nần,Củ nê ) + D ioscorea zingiberensis C.H W right ( Củ Mài gừng ) [7] Trên thực tế có một số loài thuộc chi Dioscorea L. được dùng thay củ Mài làm Hoài sơn như: + D ioscorea alata L. + D ioscorea glabra Roxb. + Dioscorea hemsleyỉ Prain et Burk. + Dioscorea bulbifera L. [7] Có một số loài khác cho củ ăn được như củ Mài song không chế biến thành Hoài sơn nhưng về hình thái dễ nhầm lẫn: + Dioscorea pyrifolia Kunth + Dioscorea decipiens Hook. + Dioscorea intempetiva var chevalierỉi. Prain et Burkill. + Dioscorea intempetiva Prain et Burkill. + D ioscorea ham iltoni Hook. + D ioscorea brevipetiolata Prain et Burkill. + D ioscorea kratica Prain et Burkill. [7]. Trong phần tổng quan chúng tôi chỉ trình bày đặc điểm về hình thái của một số cây thuộc chi Dioscorea L. mà theo chúng tôi đó là những dược liệu thường chế biến thành vị thuốc “Hoài sơn” trên thị trường hiện nay. 1.2. Đặc điểm về hình thái của một sô cây thuộc chi Dioscorea L. 1.2.1. Cây Củ mài Cây Củ mài có tên khoa học là Dioscorea persimilis Prain et Burk, thuộc họ Củ nâu (Dioscoreaceae). Thân rễ cây Củ mài cạo vỏ, sơ bộ chế biến rồi sấy khô ta được vị thuốc Hoài sơn hay còn gọi là Sơn dược.[5],[6],[7],[19]. Cây Củ mài có đặc điểm hình thái là dây leo, có 1- 2 rễ củ mập hình trụ hơi dẹt, thuôn dần về phía đầu như hình quả bầu, dài 30 - 50 cm có thể đến 1 m, ăn sâu xuống đất [7], vỏ ngoài có màu nâu xám, thịt mềm màu trắng [21]. Thân nhẵn, hơi có cạnh, đôi khi có màu đỏ, thường mang những củ ngắn, nhỏ ở kẽ lá gọi là dái mài ( thiên hoài). Lá mọc so le hay moc đối, hình tim dài, đầu nhọn, nhẵn, dài 8-10 cm, rộng 6 - 8 cm, gân lá 5 - 7, toả ra từ gốc, cuống lá dài 1,5 - 3,5 cm. Cụm hoa mọc thành chùm ở kẽ lá gồm nhiều hoa nhỏ, màu vàng, hoa đực và hoa cái khác gốc; bao hoa có 6 phiến dài bằng nhau; nhị 6 ; cụm hoa đực dài 40 cm, cum hoa cái cong, dài 20 cm. Quả nang có 3 cánh; khi quả khô, cây không còn lá; hạt có cánh mỏng màu nâu xỉn. [24],[7],[9]. Cây Củ mài ra hoa vào tháng 6-7; mùa quả: tháng 8 - 10. [7]. Cây Củ mài Phân bố ở Trung Quốc , Việt Nam, Lào, Campuchia. ở nước ta gặp nhiều ở các tỉnh phía Bắc vào tới Thừa Thiên - Huế. [18]. Nhiều nhất tại các tỉnh Hà Bắc, Lào Cai, Yên Bái, Thanh Hoá, Nghệ An và Quảng Ninh. Hiện nay, nhiều nơi bắt đầu trồng củ Mài để chế biến Hoài Sơn [9]. Thân rễ cây Củ mài ( Rhizoma Dioscoreae persỉmilis) sau khi thu hái, rửa sạch, cạo sạch vỏ rồi cho vào lò sấy diêm sinh trong khoảng 2 ngày 2 đêm hoặc đến khi thật mềm, lấy ra phơi, sấy khô ta được vị thuốc Hoài sơn [9]. - Đặc điểm bột Hoài sơn là màu trắng, mịn, vị hơi chua, Soi bột trên kính hiển vi thấy có nhiều hạt tinh bột hình trứng hay hình thận, rốn hạt dài, có vân đồng tâm. Kích thước dài trung bình 0,03 mm đến 0,06 mm rộng 0,02 mn đến 0,04 mm. Tinh thể calci oxalat hình kim. Mảnh mô mềm gồm các tế bào thành mỏng, chứa tinh bột. Mảnh mạch mạng [1],[17],[16]. (Ảnh 1) - Vị thuốc Hoài sơn đã được Dược điển Việt Nam III tiêu chuẩn hoá bằng phương pháp định tính. * Dưới ánh sáng tử ngoại bột dược liệu phát quang màu trắng. * Phương pháp sắc ký lófp mỏng. + Bản mỏng Silicagen G. + Dung môi khai triển: Cloroform - Methanol (9:1). + Dung dịch thử: Lấy 5 gam bột dược liệu thêm 5 ml hỗn hợp Cloroform - Methanol (4:1) đun sôi dưới ống sinh hàn hồi lưu khoảng 10 phút, Lọc, cô còn khoảng 1 ml. + Cách tiến hành: Chấm lên bản mỏng 15 Microlit - 30 Microlit dung dịch thử, sau khi triển khai sắc ký, phun dung dịch Vanilin 1% trong hỗn hợp Acid Photphoric đậm đặc xuất hiện các vết màu tím Rf khoảng 0,84; 0,56; 0,38; 0,20; 0,13; 0,08; 0,04 [5],[6 ], - Thành phần hoá học vị thuốc Hoài sơn chủ yếu chứa tinh bột. Ngoài ra, Củ mài còn có mucin là loại protein nhớt, allantonin, các acid amin arginin, cholin và men maltase, saponin nhân sterol.[7], Diosgenin, ß- sitosterol và dioscin.[19]. về tỷ lệ các chất trong củ mài Theo tài liệu “ Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam”, Củ mài chứa 63,25% tinh bột, 0,45% chất béo, 6,75% chất đạm, Theo tài liệu Trung quốc, Hoài sơn có chất bột 16%, chất nhầy, cholin, 16 acid amin, các men oxy hoá, vitaminC, trong chất nhầy có acid phytic. Trong củ, chứa nhiều nguyên tố vi lượng mà số lượng tuỳ theo địa điểm mọc khác nhau. Ngoài ra, còn có d - abscicin và dopamin [7],[9]. - Hoài sơn có vị ngọt, tính bình, vào các kinh phế, tỳ, vị, thận. Có tác dụng bổ tỳ, dưỡng vị, sinh tân, ích phế, bổ thận, chỉ khát. [9]. Trong y học cổ truyền hoài sơn được coi là vị thuốc bổ, chữa tỳ, vị hư nhược, ăn uống kém tiêu, chóng mặt hoa mắt, viêm ruột kinh niên, tiêu chảy lâu ngày không khỏi, phế hư ho hen, bệnh tiểu đường, di tinh, di niệu, bạch đới, ra mồ hôi trộm. Hoài sơn phối hợp với Ý dĩ chữa trẻ em cam sài, gầy yếu, bụng ỏng đít beo kém ăn nôn trớ [6 ][7]. Giải độc, trị bệnh sưng vú đau đófn; có thể dùng củ Mài tươi giã nát đắp lên chỗ sưng đau. [3]. Hoài sơn được dùng dưới dạng thuốc bột hoặc dạng thuốc sắc với liều uống từ 10 gam - 20 gam. Thường phối hợp vói các vị thuốc khác.[6 ][7] [9] Trung Quốc, Nhật Bản, Sơn dược tức Hoài sơn được chế biến từ D. oposita Thunb và vị Dã sơn dược chế biến từ D. japónica Thunb cũng được dùng như Sơn dược [1],[9]. 1.2.2. Cây Củ mỡ. Cây Củ mỡ có một số tên khác như: Khoai vạc, Củ cái, Củ cẩm, Củ đỏ, Củ tía, Khoai tía, ỈQioai ngà, Khoai long, Khoai mỡ, Khoai trút, Khoai ngọt. Củ mỡ có tên khoa học là Dioscorea alataL. thuộc họ Củ Nâu (Dioscoreaceae) [19],[21],[23],[24]. Cây Củ mỡ có đặc điểm hình thái là thân thảo leo dài, củ to, thường đơn độc, có khi xếp 2 - 4 củ tuỳ thứ, hình dạng củ rất thay đổi, hoặc hình tròn, hoặc hình trụ, dạng con thoi, gần hình cầu nguyên hay xẻ ngón, mọc sâu hay lộ thiên, có vỏ tím hay nâu xám, có lông; ruột màu trắng, màu ngà, hay có khi màu tía; chất bột hơi dính. Thân nhẵn, có hình bốn cạnh, có cánh ở các cạnh. Lá đơn, hình tim to, mọc đối, nhẵn, dài tới 15 cm, rộng 14 cm, có 5 [...]... NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u 2.1 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1.1 Nguyên liệu Nguyên liệu nghiên cứu là thân rễ lấy từ các loài Dioscorea thưcmg dùng chế biến Hoài sơn: 1.CâyC ủm ài 2.Cây 7 Cù cọc _ ị , ẻủ - _ ^ 3 Cây Củ mỡ 4 M ột số mẫu H oài sơn trên thị trường 2.12 phương pháp nghiên cứu Quan sát đặc điểm hình thái thực vật, đặc điểm vi học các mẫu cây, mẫu dược liệu thu được từ đó xác định... trưng của từng dược liệu 2.1.2.4 Nghiên cứu thành phần hoá học *Mục đích: Nghiên cứu thành phần hoá học có trong một số vị thuốc mang tên Hoài sơn, tạo dữ liệu làm cơ sở cho quá trình kiểm nghiệm, tìm ra sự khác biệt của các vị thuốc này * Tiến hành - Định tính sơ bộ các nhóm chất hữu cơ trong từng dược liệu được thực hiện theo các tài liệu [ 1 ],[2 ] - Sử dụng Sắc ký lớp mỏng kết hợp với các phần mềm... thuốc Nghiên cứu thành phần hoá học của từng vỊ thuốc, tìm ra sự khác biệt các vỊ thuốc mang tên “ Hoài Sơn Với mỗi dược liệu tiến hành theo các bước sau: 2.1.2.1 Thu mẫu và bảo quản: * Mẫu dược liệu tươi thu hái về rửa sạch, cạo sạch vỏ, xông diêm sinh đến khi mềm, phơi sấy khô, cho vào túi PE đóng kín, để nơi khô ráo * Mẫu dược liệu khô, cho vào túi PE đóng kín, để nơi khô ráo 2.1.22 Quan sát các. .. dụng Sắc ký lớp mỏng kết hợp với các phần mềm chuyên dụng, tìm những điểm khác biệt giữa các sắc đồ của dịch chiết dược liệu ở các bước sóng khác nhau Các bước tiến hành : • Chuẩn bị dịch chấm sắc ký: Cân khoảng 5g dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml, thêm 50 ml Methanol Đun cách thủy 10 phút, lọc nóng Dịch lọc đem cô cách thủy thu được khoảng 1 ml dịch chiết đậm đặc để chấm sắc ký • Bán mỏng:... thể phân biệt Củ mài vói Củ cọc và Củ mỡ nhưng độ chính xác chưa cao - Chúng tôi nghiên cứu thành phần hoá học của dược liệu để đưa thêm dữ liệu phân biệt các dược liệu này 2.2.2 Kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học 2.22.1 định tính sơ bộ các nhóm chất hữu cơ có trong dược liệu Định tính Alcaloid Tiến hành vói tất cả các bột Củ mài, Củ cọc, củ mỡ Mỗi loại bột dược liệu cân khoảng 3g cho vào bình... kúih 16mm, cho vào các ống nghiệm 1,2,3- 10 ml dịch chiết, thêm nước cất vào mỗi ống cho đủ 10 ml Bịt miệng các ống nghiệm rồi lắc trong 15 giây, mỗi giây lắc 2 lần Để yên 15 phút đo chiều cao các cột bọt * Kết quả: Tất cả các cột bọt đều trong các ống nghiệm đều nhỏ hơn 1 cm Vậy các bột dược liệu Củ mài, Củ cọc, Củ mỡ có chỉ số tạo bọt nhỏ hơn 100 Nhận xét: Không có sự khác biệt giữa các dược liệu -... c ó R f 2 4 gần bằng nhau - Các sắc ký đồ dịch chiết củ mài, Củ cọc à bước sóng 366 nm đều có 2 vết đậm, phản quang, có Rf gần bằng nhau - Sắc ký đồ dịch chiết Củ mài ở ánh sáng trắng sau khi phun thuốc thử Valinin/H2S0 4 đậm đặc có 2 vết màu đỏ khác biệt hoàn toàn với các sắc ký đồ dịch chiết Củ cọc và củ mỡ - Sắc ký đồ dịch chiết củ mỡ ở bước sóng 366 nm có 1 vết khác biệt vói các Sắc ký đồ dịch chiết... TT.Bouchardat Kết quả: Tất cả các phản ứng trên đều không có thay đổi gì Nhận xét: Tất cả các dược liệu trên đều không có phản ứng dương tính với các thuốc thử chung của Alcaloid Giữa các dược liệu không có sự khác biệt Định tính Flavonoid Tiến hành với tất cả các bột Củ mài, củ cọc, củ mỡ Mỗi loại bột dược liệu cân khoảng 5g cho vào bình nón, thêm 50 ml cồn 90°, đun cách thuỷ 10 phút Lọc nóng, dùng... Phản ứng với Chì acetat: Ống 3: thêm 2-3 giọt dd chì acetate 10% thấy: không thay đổi Kết luận: Củ cọc, Củ mài, Củ mỡ không có phản ứng vói các thuốc thử của nhóm Tanin Không có sự khác biệt giữa các dược liệu Bảns 2: Kết quả định tính các nhóm chất trong nghiên cứu STT Nhóm chất Phản ứng nhận xét Kết quả Củ mài — — — — +++ — + — + Ỷ +++ ++ ++ + Pư với FeCl3 5 % +++ +++ +++ Ỷ — — — Pư với NH3 +++ +... điểm vi học của mẫu nghiên cứu phù hợp với đặc điểm của cây Củ cọc (Dioscorea glabra Roxb) Kết luận: - Căn cứ vào đặc điểm hình thái thực vật chúng ta có thể dễ dàng phân biệt Củ mài với Củ cọc và Củ mỡ Trên thực tế, các dược liệu được trồng và thu hái trong khoa học 1 năm, cây không thể có hoa, quả được nên khó xác định lên - Căn cứ vào đặc điểm vi học chúng ta có thể phân biệt Củ mài vói Củ cọc và . tài: Nghiên cứu phân biệt Hoài sơn chế biến từ các loài Dioscorea khác nhau, với mục đích xây dựng cơ sở dữ liệu góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn kiểm nghiệm vị thuốc Hoài sơn. Đề tài gồm các. sau: • Nghiên cứu hình thái thực vật các loài thuộc chi Dioscorea dùng chế biến Hoài scfn trên thị trường. • Nghiên cứu thành phần hoá học trong các vị thuốc, Tìm ra đặc điểm để phân biệt các. BỘYTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI • • • • NGUYỄN DANH HIỆU NGHIÊN CỨU PHÂN BIỆT "HOÀI SƠN" CHẾBtẾN TỪ CÁC LOÀI DIOSCOREA KHÁC NHAU KHỐA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sl KHÓA 2003 - 2007 Người