nội chuyển hóa ester bằng enzyme

Cơ chế phản ứng Phản ứng nội chuyển hóa ester bằng enzyme lipase cần sự tham gia của phân tử nước trong suốt quá trình phản ứng và những phân tử TAG mới luôn được tạo thành cùng với một

Trang 1

Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 1 – Giới thiệu

PHẦN 1

Giới thiệu phương pháp Nội chuyển hóa ester bằng enzyme

1.1 GIỚI THIỆU VÀ PHÂN LOẠI CÁC PHƯƠNG PHÁP

CHUYỂN HÓA ESTER

1.1.1 Giới thiệu

Chất béo là một trong những thành phần không thể thiếu trong khẩu phần ăn hằng ngày của chúng ta Không những mang lại giá trị dinh dưỡng cao, chất béo còn góp phần tạo nên mùi vị, cấu trúc và tăng giá trị cảm quan cho sản phẩm thực phẩm mà chúng ta tiêu thụ Tuy nhiên, đối với dầu và mỡ tự nhiên thì tính chất chức năng và dinh dưỡng của chất béo không thể đạt được một cách toàn diện Do đó, việc phát triển các phương pháp cải thiện tính chất chức năng và dinh dưỡng của dầu mỡ là điều mà các nhà sản xuất thực phẩm luôn quan tâm

Chúng ta biết rằng khối lượng phân tử (hay chiều dài mạch), mức độ không bão hòa và vị trí của các acid béo trên mạch glycerol là những yếu tố quan trọng quyết định đến tính chất vật lý của triacylglycerol (TAG) như nhiệt độ nóng chảy, chỉ số chất béo rắn, cấu trúc và tính ổn định Vì vậy để sản xuất được loại chất béo có tính chất theo yêu cầu thì phải thay đổi các yếu tố quyết định trên Và cho đến hiện nay, có ba kỹ thuật giúp điều chỉnh tính chất vật lý của chất béo đó là kỹ thuật tách phân đoạn, kỹ thuật hydro hóa và kỹ thuật nội chuyển hóa ester (S Ramamurthi và A.R McCurdy, 1995)

Đối với kỹ thuật tách phân đoạn, đây hoàn toàn là một phương pháp vật lý dựa vào đặc tính kết tinh của những TAG khác nhau để thu nhận một hoặc một số phân đoạn béo có giá trị dinh dưỡng hoặc tính chất cảm quan phù hợp hơn so với nguyên liệu ban đầu Ngược lại, kỹ thuật hydro hóa là một phương pháp hóa học làm thay đổi mức độ không bão hòa của hỗn hợp TAG Và cuối cùng là kỹ thuật nội chuyển hóa ester, một trong những phương pháp chuyển hóa ester, làm thay đổi vị trí của acid béo trên những phân tử TAG trong hỗn hợp nguyên liệu ban đầu (F.D Gunstone, 2006)

Trang 2

1.1.2 Phân loại các phương pháp chuyển hóa ester

Chuyển hóa ester là phản ứng hóa học làm thay đổi liên kết ester trong phân tử TAG Dựa vào cơ chất tác dụng mà ta phân loại thành các phương pháp chuyển hóa sau (W Willis và A Marangoni, 2002):

1.1.2.1 Acidolysis

Acidolysis là phản ứng hóa học giúp chuyển đổi gốc acyl giữa một acid và một ester Và đây cũng là một phương pháp giúp gắn kết những acid béo tự do vào phân tử TAG Phương pháp này được dùng để cải thiện giá trị dinh dưỡng của dầu mỡ Ví dụ như các aicd béo tự do hoặc ethyl ester của acid eicosapentaenoic (EPA) và acid docosahexaenoic (DHA) được gắn và thay thế các gốc acyl trên phân tử dầu thực vật hoặc dầu cá Theo Yamane và cộng sự (1993), ông có thể tăng hàm lượng EPA trong dầu gan cá từ 8,6% lên 25% và hàm lượng DHA từ 12,7% đến 40% khi ông tiến hành phản ứng acidolysis với việc sử dụng enzyme lipase cố định từ loài Mucor miehei Trong suốt quá trình phản ứng này, hàm lượng các acid béo không bão hòa đa (PUFA) trong dầu cá tăng khi nhiệt độ trong khoảng âm từ 10oC đến

20oC vì sự kết tinh và tách ra khỏi hỗn hợp của những acid béo bão hòa Ngoài ra, Oba và Witholt (1994) còn sử dụng phản ứng acidolysis để gắn các phân tử acid oleic lên chất béo có trong sữa Do đó hàm lượng các acid béo không bão hòa trong bơ tăng mà không làm thay đổi hương vị của bơ

Ngoài ra, phương pháp acidolysis còn được dùng để tổng hợp chất béo có cấu trúc Đây là những chất béo được tạo thành từ các acid béo mạch dài hay trung bình Các loại acid béo này có chức năng dinh dưỡng đối với bệnh nhân ăn kiêng, bởi vì khi được hấp thu vào cơ thể, các acid béo như acid capric và caproic dễ dàng bị oxy hóa để tạo ra năng lượng thay vì được dự trữ như những loại acid béo khác (J Kennedy, 1991) Còn đối với các loại acid béo mạch dài mà đặc biệt là PUFA, việc sử dụng chúng sẽ làm giảm đi nguy cơ mắc những bệnh về tim mạch (C Akoh, 1995) Tóm lại, chất béo cấu trúc có dạng MUM với acid béo mạch trung bình (M-medium chain fatty acid)) nằm ở vị trí sn-1,3 và acid béo không bão hòa (U-unsaturated fatty acid) nằm ở vị trí sn-2 thì được xem là nguồn cung cấp năng lượng lý tưởng Việc tổng hợp nên loại chất béo có cấu trúc xác định này đã được nghiên cứu rất nhiều với việc sử dụng enzyme lipase (Xu, 2000)

Trang 3

Một trong những chất béo cấu trúc xác định có giá trị kinh tế cao là sản phẩm thay thế

bơ ca cao (CBE – Cocoa Butter Equivalent) cũng được sản xuất theo phương pháp acidolysis Nguồn cơ chất sử dụng là phân đoạn giữa của dầu cọ (1,3-dipalmitoyl-oleoyl-glycerol) và acid stearic (Chong và cộng sự, 1992)

1.1.2.2 Alcoholysis

Alcoholysis là phản ứng chuyển hóa ester xảy ra giữa rượu và ester Phản ứng này được dùng để tổng hợp methyl ester (biodiesel) với nồng độ có thể lên đến 53% (D Briand, 1994) Ngoài ra, sản phẩm của phản ứng còn có thể là những hợp chất trao đổi gốc acyl (acyl donor) được sử dụng trong sản xuất chất béo có cấu trúc xác định, như ethyl ester của acid béo (Xu, 2000) Nếu phản ứng xảy ra giữa TAG và một glycerol thì được gọi là glycerolysis Phản ứng này được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất mono- và diacylglycerol

Hiện nay, việc tổng hợp monoacylglycerol (MAG) sử dụng xúc tác enzyme lipase được thực hiện bằng quá trình kết tinh điều khiển nhiệt độ để tách các tinh thể MAG không bão hòa ra khỏi hỗn hợp phản ứng (G McNeill, 1992) Enzyme lipase sử dụng là của loài vi khuẩn Pseudomonas fluorescens và Chromobacterium vicosum vì nó thể hiện hoạt tính cao đối với phản ứng glycerolysis (G McNeill, 1991) Tc là nhiệt độ tới hạn mà nếu thấp hơn nhiệt độ này thì MAG sẽ kết tinh và tách ra khỏi dung dịch Lúc này cân bằng của phản ứng sẽ dịch chuyển về chiều tạo thành MAG Kết quả là hàm lượng MAG sẽ được tổng hợp nhiều hơn (từ 30% đến 90%) Nhiệt độ tới hạn của dầu thực vật (5 – 10oC) sẽ thấp hơn nhiệt độ tới hạn của mỡ động vật (30 – 46oC) Hàm lượng ẩm cũng có ảnh hưởng đến phản ứng Mcneill và cộng sự nhận thấy rằng nếu lượng ẩm tăng từ 0,5 đến 5,7% thì sẽ tăng sự tổng hợp MAG, nếu vượt quá mức thì sẽ không ảnh hưởng đến tốc độ của phản ứng Tuy nhiên, thời gian thực hiện phản ứng khá dài, từ 4 đến 5 ngày

Trang 4

1.1.2.3 Nội chuyển hóa ester

Đây là một trong những phương pháp chuyển hóa ester mà được sử dụng nhiều nhất trong công nghiệp thực phẩm Phương pháp này sẽ thay đổi vị trí các acid béo của phân tử TAG Phản ứng được thực hiện qua nhiều bước Đầu tiên, các liên kết ester của glycerol sẽ bị cắt đứt, giải phóng một số phân tử acid béo vào trong dung dịch phản ứng Sau đó, những acid béo tự do này hoặc những acid béo đã có sẵn trong dung dịch sẽ kết hợp ngẫu nhiên với glycerol tạo nên liên kết ester mới Liên kết này có thể được hình thành trên phân tử glycerol cũ (intraesterification) hoặc phân tử glycerol hoàn toàn mới (interesterification) Tuy nhiên tốc độ phản ứng intraesterification sẽ nhanh hơn so với interesterification (B Sreenivasan, 1978) Cuối cùng, khi phản ứng đạt cân bằng, ta sẽ thu được một hỗn hợp TAG Sự ảnh hưởng của phương pháp này đến tính chất của chất béo phụ thuộc rất nhiều vào thành phần của nguyên liệu ban đầu Nếu ta chỉ sử dụng một loại nguyên liệu thì hiệu quả phản ứng sẽ không cao so với một hỗn hợp nguyên liệu (D Rousseau, 1996)

Hình 1.1 – Sự hình thành triacylglycerol trong phản ứng nội chuyển hóa ester: S, stearoyl;

O, oleoyl; L, linoleoyl

Trang 5

1.2 PHƯƠNG PHÁP NỘI CHUYỂN HÓA ESTER BẰNG ENZYME

Phản ứng nội chuyển hóa ester xảy ra giữa hai TAG, hoặc giữa một TAG và một ethyl ester Phản ứng này được xúc tác bởi hợp chất hóa học hoặc bằng enzyme Tuy nhiên, hỗn hợp sản phẩm sẽ rất khác nhau khi sử dụng hai loại xúc tác trên vì enzyme lipase có tính đặc hiệu về vị trí (Hình 1.2) Phản ứng này được ứng dụng để sản xuất margarine, shortening và một số chất béo có cấu trúc và chức năng xác định (Zhang và cộng sự, 2004) Hiện nay, loại

bơ có thành phần acid béo là PUFA cũng được nghiên cứu sản xuất theo phương pháp nội chuyển hóa ester bằng enzyme

Hình 1.2 – Phản ứng nội chuyển hóa ester có sử dụng xúc tác hóa học và enzyme giữa hai triacylglycerol ACA và BBB Những phân tử được gạch dưới là nguyên liệu ban đầu; dấu sao (*) thể hiện những phân tử có thể được tổng hợp trong phản ứng sử dụng enzyme Triacylglycerol có dạng UPU (U, acid béo không bão hòa; P, acid palmitic) được xem là chất béo rất tốt cho trẻ sơ sinh bởi vì tính dễ hấp thụ của nó Loders – Croklaan đã sản xuất thành công sản phẩm thay thế chất béo có trong sữa mẹ với nguyên liệu là tripalmitin, dầu thực vật giàu acid oleic và sử dụng enzyme lipase đặc hiệu vị trí sn-1,3 (Kavanagh, 1997)

Còn đối với phản ứng xảy ra giữa một TAG và một ethyl ester (EE) của acid béo thì phản ứng này được xem như phản ứng acidolysis, được dùng để sản xuất chất béo có thành phần acid béo xác định Vì vậy, khi tổng hợp chất béo thay thế cho chất béo trong sữa mẹ bằng phản ứng này thì ta sử dụng nguyên liệu là PPP và U-EE Hỗn hợp sau phản ứng đem đi chưng cất để tách P-EE ra khỏi sản phẩm là hỗn hợp PPU và UPU

Trang 6

1.2.1 Mục đích và ứng dụng

Vào những năm 1990, những acid béo dạng trans (TFA-trans fatty acid) đã gây nên những cuộc tranh cãi về việc sử dụng có thể dẫn đến nguy cơ mắc bệnh về tim mạch Vì vậy trong tất cả các sản phẩm thực phẩm người ta luôn lưu ý đến hàm lượng acid béo này Nguyên nhân dẫn đến xuất hiện TFA là do sự hydro hóa không hoàn toàn hỗn hợp dầu béo

Vì vậy để tránh sự tạo thành TFA, phương pháp nội chuyển hóa ester đã được ứng dụng để tạo thành những sản phẩm hoàn toàn không chứa TFA

Phương pháp nội chuyển hóa ester bằng enzyme hiện nay được nghiên cứu và ứng dụng rất nhiều, tuy nhiên đây không phải là một công nghệ mới Unilever đã sử dụng phương pháp này vào năm 1977 để sắp xếp các acid béo của hỗn hợp dầu mỡ, tạo thành sản phẩm có độ mềm dẻo cao Đột phá cộng nghệ này đã bị trì hoãn bởi vì chi phí cho enzyme lipase cố định sử dụng trong phản ứng quá đắt tiền Vì vậy chỉ những chất béo có giá trị cao mới được tổng hợp bằng phương pháp nội chuyển hóa ester như bơ ca cao (Chang và cộng sự, 1990), chất béo trong sữa mẹ (BetapolTM), dầu cá giàu PUFA (Shimada và cộng sự, 1997; Haralddsson và Kristinsson, 1998), và các chất béo có cấu trúc khác (Soumanou và cộng sự, 1998; Xu và cộng sự, 1999) Tuy nhiên những năm gần đây, phương pháp này đã được mở ra một cơ hội mới với sự phát triển của công nghệ enzyme Đó là việc ứng dụng Lipozyme TL

IM (Thermomyces lanuginosus lipase được cố định trên những hạt silicagen) vào trong phương pháp nội chuyển ester bằng enzyme

1.2.2 Cơ chế phản ứng

Phản ứng nội chuyển hóa ester bằng enzyme lipase cần sự tham gia của phân tử nước trong suốt quá trình phản ứng và những phân tử TAG mới luôn được tạo thành cùng với một vài diacylglycerol (DAG) và acid béo tự do (FFA-free fatty acid) được xem là những sản phẩm phụ trong dung dịch (Wong, 1995)

Cơ chế phản ứng được minh họa bởi một số phản ứng sau đây: (E là enzyme)

Trang 7

Phản ứng sẽ tiếp tục xảy ra cho đến khi đạt trạng thái cân bằng giữa các sản phẩm tạo thành và nguyên liệu ban đầu Nếu hàm lượng nước trong phản ứng tăng thì lượng acid béo tự do sẽ tăng, trong khi đó FFA1.E hoặc FFA2.E sẽ giảm Điều này dẫn đến hàm lượng các DAG cũng tăng theo Vì vậy tổng hàm lượng TAG sẽ giảm Kiểm soát lượng nước tự do trong phản ứng là điều cần thiết để hạn chế FFA và DAG trong sản phẩm

Khi sử dụng enzyme lipase đặc hiệu vị trí sn-1,3, phản ứng nội chuyển hóa ester sẽ tạo thành các hợp chất trung gian như 1,2(2,3)-DAG và FFA.E Các gốc acyl trên những phân tử DAG sẽ chuyển vị khi có sự xúc tác của acid, base hoặc do trao đổi ion trên chất mang (resin) Điều này gây cản trở cho sự gắn kết các gốc acyl lên mạch glycerol không còn đặc hiệu nữa Nhiệt độ cao và thời gian thực hiện phản ứng là hai yếu tố ảnh hưởng đến sự chuyển vị của gốc acyl (Bloomer và cộng sự, 1991; Xu và cộng sự, 1998) Do đó để hạn chế sự không đặc hiệu của enzyme, thông số nhiệt độ và thời gian phản ứng cần được kiểm soát

Trang 8

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng hoạt tính enzyme lipase

1.2.3.1 pH

Enzyme lipase chỉ thể hiện hoạt tính ở những giá trị pH nhất định Giá trị pH này phụ thuộc vào nguồn gốc thu nhận enzyme và tình trạng ion hóa của trung tâm hoạt động Mặc dù enzyme lipase có thể hoạt động trong dải pH khá rộng từ 4 đến 10, nhưng pH tối ưu chỉ nằm trong khoảng từ 7 đến 9 (F.X Malcata và cộng sự, 1992; T Yamane, 1987) Ví dụ như enzyme lipase từ các loài Pseudomonas có giá trị pH tối ưu nằm trong khoảng 8,5 nhưng từ Aspergillus niger và Rhizopus delemar enzyme lipase có pH tối ưu dưới 7 (M Iwai và Y Tsujisaka, 1974)

Ngoài ra, việc cố định enzyme cũng có ảnh hưởng đến giá trị pH tối ưu Sự ảnh hưởng này phụ thuộc vào mức độ khuếch tán ion giữa pha liên tục và môi trường vi mô xung quanh chất mang Trong trường hợp enzyme được cố định bằng chất mang polyanion (polymer tích điện âm), khi đó chất mang sẽ tác động mạnh với cơ chất tích điện dương, chẳng hạn như các proton H+ , thì các ion này sẽ tập trung xung quanh polymer chất mang Lúc đó mật độ của nó ở khoảng không gian gần enzyme cao , mặc dù nồng độ trung bình của nó trong cả hệ thấp Từ đó, pH ở môi trường vi mô xung quanh enzyme thấp hơn so với pH trong toàn hệ Kết quả là pH tối ưu của enzyme liên kết đồng hóa trị với chất mang có điện tích âm sẽ chuyển dịch sang phía pH kiềm so với enzyme hòa tan Ví dụ đối với enzyme lipase tự do có giá trị pH tối ưu là 8,0 , khi được cố định trên chất mang có điện tích âm trong dung dịch cũng có pH bằng 8,0 thì pH ở vùng xung quanh enzyme có thể chỉ bằng 7,0 Do đó enzyme lipase hoạt động ở điều kiện pH thấp hơn giá trị tối ưu của nó Dung dịch cần tăng giá trị pH lên 9,0 để làm cho vùng xung quanh enzyme có giá trị pH là 8,0 đạt điều kiện tối ưu Hiện tượng này chỉ xảy ra đối với chất mang có điện tích và lực ion thấp (M.D Trevan, 1980) Nếu proton H+ được sinh ra trong quá trình phản ứng thì pH ở vùng xung quanh enzyme sẽ giảm xuống cho đến khi enzyme bị mất hoạt tính hoàn toàn

1.2.3.2 Nhiệt độ

Nhìn chung khi tăng nhiệt độ thì tốc độ của phản ứng sẽ tăng , nhưng nếu nhiệt độ quá cao thì sẽ làm biến tính không thuận nghịch enzyme dẫn đến làm giảm tốc độ phản ứng Lipase thu nhận từ động vật và thực vật thường có khả năng chịu nhiệt kém hơn từ vi sinh vật (T Yamane, 1987) Trong dung dịch phản ứng không sử dụng dung môi hữu cơ để hòa tan cơ chất, nhiệt độ phản ứng phải đủ cao để giữ cho cơ chất ở trạng thái lỏng (A.P Ison và cộng sự, 1994; P Forssel và cộng sự, 1992) Tuy nhiên, trong ngành công nghiệp thực

Trang 9

phẩm, khi không có sử dụng dung môi thì nhiệt độ phản ứng vẫn cao và tăng đến giá trị

60oC để hóa lỏng cơ chất Nhiệt độ cao như thế sẽ làm giảm sự ổn định và tuổi thọ của enzyme mặc dù enzyme đã được cố định trên chất mang Việc cố định enzyme sẽ làm cho nó có hình dạng nhất định, giảm tính nhạy cảm với nhiệt độ và chống lại sự biến tính bởi nhiệt Vì vậy khoảng nhiệt độ tối ưu cho enzyme cố định là từ 30 đến 62oC, cao hơn so với enzyme tự do

1.2.3.3 Hàm lượng và hoạt độ nước

Sự ảnh hưởng của hàm lượng nước đến hoạt tính enzyme lipase phụ thuộc vào nguồn thu nhận enzyme Lipase thu nhận từ nấm mốc có khả năng chịu được hoạt độ nước thấp hơn từ vi sinh vật Hàm lượng nước tối ưu cho phản ứng nội chuyển hóa ester đối với các loại lipase khác nhau nằm trong khoảng 0,04 – 11% (w/v), mặc dù hầu hết các phản ứng cần hàm lượng nước ít hơn 1% để đạt hiệu quả chuyển hóa ester (S Bornaz, 1994; F.X Malcata, 1992) Hàm lượng nước là yếu tố quyết định để xảy ra phản ứng thủy phân hay phản ứng tạo thành liên kết ester Hoạt độ nước thấp thì phản ứng tạo thành liên kết ester sẽ xảy ra một cách thuận lợi Tuy nhiên, trong điều kiện đó hoạt tính của enzyme lipase sẽ bị hạn chế (D Briand, 1994; I Svesson, 1994)

Khi được cố định trên chất mang kị nước, hoạt tính của enzyme lipase sẽ ổn định hơn Khi tiếp xúc với hệ nhũ tương dầu trong nước, pha dầu có xu hướng hấp phụ trên bề mặt và khuếch tán vào bên trong chất mang Do đó, môi trường xung quanh enzyme và chất mang sẽ bị ngăn cách với pha nước bởi lớp dầu bao phủ Nhưng để phản ứng có thể xảy ra thì các phân tử nước phải tiếp xúc với enzyme Vì vậy để đảm bảo sự khuếch tán những phân tử nước vào bên trong chất mang thì pha dầu phải được bão hòa nước (F.X Malcata, 1992) Hàm lượng nước quá nhiều có thể kìm hãm phản ứng nội chuyển hoá ester bởi vì nó sẽ ngăn cản sự tiếp xúc giữa cơ chất và enzyme Theo Abraham và cộng sự (1998), phản ứng thủy phân sẽ chiếm ưu thế khi tỉ lệ giữa nước và enzyme lipase là 0,9

Trong phản ứng tạo thành liên kết ester, cân bằng của phản ứng sẽ bị ảnh hưởng bởi những phân tử nước được giải phóng khi tạo thành liên kết Sự tích tụ những phân tử nước này sẽ ngăn cản phản ứng xảy ra theo chiều tạo thành liên kết ester Vì vậy, hoạt độ nước cần phải được giữ ổn định bằng cách loại bỏ liên tục những phân tử nước trong suốt quá trình phản ứng Một cách thực hiện rất đơn giản là ta tiến hành phản ứng trong điều kiện chân không Khi đó, những phân tử nước được tạo thành sẽ bốc hơi mà vẫn giữ được hoạt tính của enzyme lipase

Trang 10

1.2.3.4 Thành phần cơ chất và sự cản trở không gian

Thành phần cơ chất sẽ ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng thủy phân và nội chuyển hóa ester bằng enzyme lipase Sự có mặt của nhóm hydroxyl (-OH) ở vị trí sn-2 sẽ làm tăng dần tốc độ phản ứng thủy phân từ MAG, DAG đến TAG (P Desnuelle, 1972) Bên cạnh đó, cấu hình không gian của cơ chất sẽ ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng Điều đó thể hiện ở sự cản trở bởi cấu hình không gian sẽ làm giảm tốc độ phản ứng nhiều hơn mặc dù tính ái nhân (nucleophilicity) của cơ chất sẽ làm tăng tốc độ phản ứng

Cấu trúc phân tử cơ chất cũng có ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng bởi vì nó ảnh hưởng đến sự tiếp xúc có hiệu quả giữa cơ chất và trung tâm hoạt động của enzyme Enzyme lipase có vùng trung tâm hoạt động bị che phủ bởi đoạn peptide có tính kỵ nước Vì vậy phân tử cơ chất có tính ưa béo hoặc có cấu trúc vòng thơm sẽ được hấp phụ dễ dàng hơn so với phân tử

cơ chất có mạch nhánh Ví dụ khi ta sử dụng acid carboxylic có độ dài mạch khác nhau thì việc tăng độ dài mạch lên 7 carbon sẽ làm tăng tốc độ phản ứng đối với enzyme lipase từ loài Mucor miehei (Miller và cộng sự, 1988)

Sự oxy hóa cơ chất, mà đặc biệt là PUFA , sẽ làm giảm hoạt tính của enzyme lipase do tạo thành những gốc tự do Do đó, trước khi tiến hành phản ứng nội chuyển hóa ester, đặc biệt là thực hiện trong thiết bị liên tục có sử dụng chất đệm (fixed bed reactor), dầu chứa hàm lượng PUFA cao cần được tinh luyện thật sạch

1.2.3.5 Chất hoạt động bề mặt

Việc sử dụng chất hoạt động bề mặt khi cố định enzyme lipase sẽ làm tăng hoạt tính của enzyme trong phản ứng nội chuyển hóa ester Tuy nhiên, nếu sử dụng chất hoạt động bề mặt để tạo thành hệ nhũ tương thì nó sẽ ngăn cản sự tiếp xúc giữa cơ chất và enzyme Ngoài

ra, sự có mặt của protein sẽ làm giảm sự hấp phụ của enzyme lipase lên trên bề mặt cơ chất đã được nhũ hóa

Thành phần phospholipid trong dầu (0,1 – 3,2%) cũng có ảnh hưởng không tốt đến hoạt tính của enzyme Tốc độ của phản ứng sẽ giảm bởi vì phospholipid sẽ cạnh tranh tiếp xúc enzyme với cơ chất Trong đó, phosphatidylethanolamine có tác động ức chế enzyme lipase nhiều nhất vì có chứa nhóm amine Do đó, hàm lượng phospholipid trong dầu cần phải được kiểm soát để đảm bảo hoạt tính enzyme lipase được ổn định, thường nhỏ hơn 500ppm đối với enzyme lipase cố định

Trang 11

Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 2 – Enzyme Lipase

Những tiến bộ quan trọng gần đây đã nghiên cứu về cấu trúc của tinh thể lipase để giúp chúng ta tìm hiểu sâu hơn về cơ chế xúc tác, hoạt tính bề mặt, tính đặc hiệu và bản chất của trung tâm hoạt động Do đó việc ứng dụng enzyme lipase ngày càng trở nên đa dạng và đầy tiềm năng Trong phần 2 này, tổng quan về lipase và tính chất của enzyme sẽ được trình bày, đặc biệt là về cấu trúc của lipase, hoạt tính bề mặt, tính chọn lọc và ứng dụng

2.2 NGUỒN THU NHẬN ENZYME LIPASE

2.2.1 Lipase từ động vật

Enzyme lipase thu nhận từ những cơ quan, mô của một số loài động vật hữu nhũ đã được nghiên cứu rất nhiều, nhưng toàn diện hơn cả là lipase có nguồn gốc từ con người và một số lipase từ tuyến tụy Những enzyme tuyến tụy này được tiết ra ở tá tràng xúc tác cho sự thủy phân triacylglycerol Lipase tuyến tụy có thể thủy phân hoàn toàn triacylglycerol thành acid béo và glycerol Bản chất của chúng là những glycoprotein, phân tử lượng 50kDa, không có hoặc ít hoạt tính đối với phospholipid và được hoạt hóa ở bề mặt phân chia pha dầu

Trang 12

nước, nhưng lại bị ức chế bởi muối mật Tuy nhiên, lipase tuyến tụy từ một số động vật lại có thêm hoạt tính của phospholipase A (Hjorth và cộng sự, 1993)

Enzyme lipase của động vật hữu nhũ bền ở pH thấp, được hoạt hóa bởi muối mật và đặc hiệu tại vị trí sn-3 của cơ chất (J.D Weete, 2002) Lipoprotein lipase người có chức năng thủy phân triacylglycerol trong chylomicron Để có hoạt tính thì enzyme này kết hợp với apolipoprotein C-II để tạo thành dimer thay vì kết hợp với colipase và được hoạt hóa bởi heparin (Dugi và cộng sự, 1992) Tuy nhiên, enzyme lipase trong gan thực hiện chức năng chuyển hóa lipoprotein nhưng không liên kết với apoC-II (Clark và cộng sự, 1991) Lipase có trong sữa mẹ được hoạt hóa bởi muối mật để giúp trẻ sơ sinh tiêu hóa chất béo có trong sữa (Baba và cộng sự, 1991)

2.2.2 Lipase từ thực vật

Lipase từ thực vật không được chú ý nhiều so với những nguồn thu nhận khác, nhưng gần đây đã được nghiên cứu bởi hai nhà khoa học Mukherjee và Mills (1994) Trong đó, lipase từ những hạt có dầu là được quan tâm nhất Những enzyme này nếu khác nhau từ nguồn nguyên liệu thu nhận thì tính đặc hiệu về cơ chất, pH tối ưu, khả năng phản ứng với sulfuhydryl, tính kỵ nước cũng khác nhau Những enzym này có quan hệ mật thiết với triacylglycerol có trong bản thân hạt dầu đó và chỉ được tổng hợp trong quá trình nảy mầm của hạt

2.2.3 Lipase từ vi sinh vật

Đây là nguồn enzyme được quan tâm và sản xuất nhiều nhất theo qui mô công nghiệp Khác với thực vật và động vật, vi sinh vật được cấu tạo từ một tế bào, chính vì vậy mà nó có những ưu điểm hơn hẳn động vật và thực vật Vi sinh vật có khả năng tổng hợp một lượng enzyme rất lớn trong một khoảng thời gian ngắn; hoạt tính của enzyme cao hơn hoạt tính của enzyme được tổng hợp từ động vật và thực vật; và ta hoàn toàn có thể điều khiển tốc độ sinh tổng hợp enzyme trong khi sản xuất

Lipase được thu nhận từ vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm men và nấm mốc là những enzyme ngoại bào có tính chất gần giống lipase tuyến tụy Các loài nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp lipase như: Aspergillus spp., Mucor spp., Rhizopus spp., Penicillium spp., Geotrichum spp Đối với nấm men gồm những loài: Torulopsis spp., Candida spp Và vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp lipase bao gồm: Pseudomonas spp., Achromobacter spp., Staphylococcus spp Tính chất của một số enzyme lipase vi sinh vật được tổng hợp và trình bày trong bảng 2.1

Trang 13

Vì enzyme lipase từ vi sinh vật có những ưu điểm hơn hẳn so với từ động vật và thực vật nên những phần tiếp theo sẽ trình bày chi tiết về cấu trúc và các tính chất của những enzyme này

Bảng 2.1 – Tính chất một số enzyme lipase từ vi sinh vật

2.3 PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN VÀ TINH SẠCH LIPASE

2.3.1 Sinh tổng hợp lipase từ vi sinh vật

Giống như sự tổng hợp protein, enzyme lipase sẽ được hình thành khi trải qua các quá trình phiên mã, dịch mã và sau dịch mã diễn ra trong tế bào chất của vi sinh vật Đã có rất nhiều tài liệu nghiên cứu về các quá trình trên, vì thế trong phần này sẽ trình bày các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất sinh tổng hợp lipase của vi sinh vật

Đầu tiên là sự phiên mã Quá trình chỉ xảy ra khi đoạn gen tổng hợp nên enzyme lipase phải được hoạt hóa trước bằng chất cảm ứng Chất này sẽ giúp giải phóng enzyme RNA polymerase thoát khỏi sự kìm hãm của chất ức chế bằng cách kết hợp với chính chất ức chế đó Bản chất của chất cảm ứng chính là cơ chất chịu sự xúc tác của loại enzyme lipase này

Trang 14

Kết thúc quá trình phiên mã diễn ra trong nhân tế bào sản phẩm sẽ là phân tử mRNA, nhưng phân tử này rất dễ bị thủy phân trong môi trường tế bào chất Bên cạnh đó, những kết quả nghiên cứu gần đây (Scherer và Rossi, 2003) cho thấy phân tử siRNA (short interference RNA) được hình thành trong quá trình phiên mã có tác động kìm hãm sự dịch mã hoặc thúc đẩy sự phân hủy những phân tử mRNA Vì vậy số lượng enzyme được tổng hợp sẽ giảm đi đáng kể

Tiếp theo, quá trình dịch mã sẽ sử dụng tài liệu mã chứa trong phân tử mRNA để tạo thành mạch protein có thứ tự acid amin chính xác Tuy nhiên, chuỗi polypeptide này rất dễ

bị thủy phân bởi enzyme peptidase (Enfors, 1992) Quá trình này cần một loại protein

“chuyển giao” để tái sử dụng các acid amin của protein có cấu trúc gấp khúc (folded protein) mà không còn sử dụng được nữa (Wickner và cộng sự, 1999; Henge và Buckau, 2003)

Khi những chuỗi polypeptide enzyme đã được tổng hợp khá nhiều thì những polypeptide

ở gần nhau sẽ tương tác với nhau tạo thành cấu trúc gấp khúc làm cho khối enzyme trở nên không tan Điều này đã làm cho enzyme mất đi hoạt tính sinh học (Mitraki và cộng sự, 1991) Quá trình này được điều khiển bởi chaperone, là một đoạn polypeptide có chức năng làm gấp khúc các enzyme nội bào trước khi những enzyme này được vận chuyển qua màng membrane Đối với pre-pro-enzyme ngoại bào thì cấu trúc phân tử không được gấp khúc trong suốt quá trình vận chuyển qua màng membrane Do đó, một số protein khác đã hỗ trợ enzyme ngoại bào chống lại sự gấp khúc trong tế bào chất để không hình thành khối protein không tan và chống lại sự thủy phân nội bào

Hoạt tính của enzyme còn phụ thuộc vào cofactor là những ion kim loại Sự cung cấp không đủ những ion này trong tế bào chất sẽ làm giảm đi hoạt tính của enzyme Vì vậy phải đảm bảo nồng độ bão hòa các ion đối với enzyme phải thấp hơn nồng độ các ion đó trong tế bào chất (Jones và cộng sự, 2002)

Đối với pre-pro-enzyme, khi không đủ cofactor để đảm bảo hoạt tính cũng như sự vận chuyển qua màng membrane thì một lượng enzyme này bị giữ lại trong tế bào chất làm ảnh hưởng hiệu suất sinh tổng hợp enzyme

Sau khi được vận chuyển qua màng membrane, enzyme ngoại bào vẫn có thể bị phân hủy bởi enzyme peptidase trong không gian chu chất Trong giai đoạn này pro-enzyme vẫn tiếp tục hoàn thiện cấu trúc của nó nhờ những phản ứng thủy phân

Trang 15

2.3.2 Phương pháp thu nhận enzyme

Để thu nhận được lipase, ta phải thực hiện quá trình lên men tổng hợp enzyme từ vi sinh vật Quá trình này phụ thuộc vào ba yếu tố rất quan trọng, đó là giống vi sinh vật, môi trường và điều kiện nuôi cấy Đối với mỗi loài vi sinh vật khác nhau thì điều kiện tối ưu cho tổng hợp lipase cũng sẽ khác nhau Môi trường nuôi cấy vi sinh vật có thể là rắn hoặc lỏng Chất cảm ứng được sử dụng để thu nhận enzyme này thường là dầu olive hoặc dầu đậu nành, nhưng acid béo cũng có thể cảm ứng cho sự sinh tổng hợp lipase

2.3.3 Phương pháp tách và tinh sạch enzyme

Tùy theo môi trường và phương pháp nuôi cấy mà ta áp dụng kỹ thuật tách và tinh sạch enzyme một cách hợp lý Song, cần phải lưu ý một số tính chất của enzyme có ảnh hưởng đến những phương pháp này:

− Khối lượng phân tử

− Điểm đẳng điện

− Cofactor bị tổn thất sẽ làm mất hoạt tính enzyme

− Khoảng pH đảm bảo sự ổn định cho enzyme

Các phương pháp tách enzyme bao gồm hai phương pháp cơ bản sau:

− Phương pháp ly tâm

− Phương pháp lọc

Các phương pháp phá vỡ tế bào:

− Phương pháp cơ học: đồng hóa áp lực cao, nghiền ẩm

− Phương pháp vật lý: shock nhiệt hay shock thẩm thấu

− Phương pháp sinh học: tự phân và sử dụng enzyme để thủy phân

Các phương pháp tinh sạch enzyme:

− Phương pháp kết tinh

− Phương pháp điện di

− Phương pháp sắc ký

Trang 16

2.4 TÍNH CHẤT VÀ PHẢN ỨNG CỦA ENZYME

2.4.1 Cấu trúc phân tử

Enzyme lipase thu nhận từ vi sinh vật là nguồn enzyme đầy tiềm năng và được nghiên cứu một cách sâu rộng Nhìn chung, enzyme lipase có cấu trúc α/β với vị trí trung tâm là lưới hỗn hợp β chứa bộ ba xúc tác và có cấu trúc xoắn ngăn cản cơ chất tiếp xúc trung tâm hoạt động (Dominic W.S Wong, 2003)

Rhizomucor miehei (Mucor miehei) sản xuất enzyme lipase ngoại bào có khả năng thủy phân rất nhiều cơ chất lipid khác nhau Trong quá trình sinh tổng hợp, cấu trúc phân tử của enzyme được gắn thêm một đoạn peptide tín hiệu (signal peptide) và một đoạn propeptide bên cạnh mạch enzyme chính bao gồm 269 amino acid có phân tử lượng là 29.472 Dalton Có hai dạng đồng phân của enzyme là dạng A (pI=3,9) và dạng B (pI=4,3) phụ thuộc mức độ deglycosylation trong quá trình sau dịch mã Cấu trúc của lipase Rhizomucor miehei là cấu trúc dạng α/β gồm vùng lưới β trung tâm có tám dải β liên kết song song cuộn lên trên vùng xoắn lưỡng cực (N-terminal) Tất cả các cấu trúc xoắn đều nằm một bên lưới β Ba liên kết disulfide trong phân tử lipase, Cys29-Cys268; Cys40-Cys43 và Cys235-Cys244 có tác dụng làm cho toàn bộ cấu trúc của enzyme được ổn định Vùng trung tâm hoạt động của enzyme có chứa bộ ba xúc tác Ser144, His257 và Asp203 nhưng lại bị che phủ bởi phần không phân cực của cấu trúc xoắn lưỡng cực “lid” “Lid” là một đoạn oligopeptide kỵ nước mà enzyme esterase không có Chính vì điều này đã giúp enzyme lipase hấp phụ được trên bề mặt phân chia pha dầu-nước và sau đó diễn ra sự tái sắp xếp cấu trúc enzyme, đoạn phân tử “lid” sẽ cuộn vào trong để lộ vùng trung tâm hoạt động xúc tác thủy phân cơ chất Vì thế,

ta có thể nhận thấy rằng hoạt tính bề mặt của enzyme lipase chính là việc tạo thành cấu trúc bền vững trên bề mặt phân chia giữa hai pha dầu và nước

Enzyme lipase từ Geotrichum candidum cũng tồn tại dưới hai dạng đồng phân: dạng I (pI=4,56) và dạng II (pI= 4,46) có cùng chiều dài mạch là 544 amino acid, phân tử lượng 59.085 Dalton và có từ hai đến ba vị trí N-glycosylation tương ứng với từng dạng đồng phân Tuy nhiên, lipase I và II được mã hóa bởi hai đoạn gen khác nhau Cấu trúc của enzyme cũng có dạng α/β với lưới hỗn hợp β hình thành bởi 11 dải trong đó có 7 dải song song với nhau Những cấu trúc cuộn xoắn liên kết với các dải đều nằm ở hai bên vùng lưới β Hai liên kết disulfide được tìm thấy là Cys61-Cys105 và Cys276-Cys288 Bộ ba xúc tác là Ser217, His463 và Glu354 nằm trong vùng trung tâm hoạt động bị che khuất bởi hai cấu trúc xoắn α gần như song song với nhau

Trang 17

Một số cấu trúc phân tử của enzyme lipase thu nhận từ Candida rugosa, C antarctica, Rhizopus delmar, Pseudomonas glumae và Ps aeruginosa cũng được nghiên cứu Song, sự khác biệt quan trọng về cấu trúc giữa lipase tuyến tụy và vi sinh vật chính là phần enzyme chứa đầu Carbon (C-terminal domain) được dùng để liên kết với colipase không có trong cấu trúc enzyme của vi sinh vật Một điều cần phải lưu ý là không phải tất cả enzyme lipase đều có hoạt tính bề mặt Ví dụ như lipase từ Pseudomonas aeruginosa thiếu cấu trúc xoắn “lid” bao phủ trung tâm hoạt động, do đó enzyme này không có hoạt tính bề mặt

2.4.2 Hoạt tính bề mặt và phản ứng thủy phân

2.4.2.1 Hoạt tính bề mặt

Nhờ vào kỹ thuật X quang mà cấu trúc tinh thể của một số enzyme lipase đã được xác định Chúng ta biết rằng trong cấu trúc đó có một phân đoạn xoắn α, được gọi là “lid”, đã che lắp trung tâm hoạt động làm cho enzyme không thể có hoạt tính xúc tác trong dung dịch nước hoặc trong dung môi hữu cơ Nhưng nếu trong dung dịch xuất hiện bề mặt phân chia pha giữa dầu và nước thì sự hấp phụ enzyme này lên bề mặt đó sẽ làm thay đổi hình dạng enzyme dẫn đến việc mở rộng cửa rào “lid” tạo điều kiện cho sự tiếp xúc cơ chất với trung tâm hoạt động (Tatsuo Maruyama và cộng sự, 2000)

Hình 2.1 – Hoạt tính bề mặt của enzyme lipase: E, enzyme trong pha nước; Ea, enzyme hấp phụ trên bề mặt; Ea*, enzyme được hoạt hóa; S, cơ chất; Ea*S, phức enzyme cơ chất; Ea*-

Ac, acylenzyme; P1,P2 sản phẩm thủy phân

Trang 18

2.4.2.2 Cơ chế phản ứng thủy phân

Phản ứng thủy phân được thực hiện nhờ bộ ba xúc tác Ser, His, Asp trải qua năm giai đoạn sau:

Hình 2.2 – Cơ chế phản ứng thủy phân enzyme lipase

1 Enzyme kết hợp với cơ chất hình thành phức chất hoạt động

2 Nhóm chức hoạt động –OH của Serine tấn công vào gốc acyl của cơ chất tạo liên kết đồng hóa trị hình thành hợp chất trung gian Giai đoạn này được hỗ trợ bởi hoạt tính xúc tác base của His trong bộ ba xúc tác

3 Tạo thành acyl enzyme và tách khỏi phản ứng oxy của liên kết ester (R1OH)

4 Tách gốc acyl còn lại ra khỏi trung tâm hoạt động bởi nhóm chức hoạt động của His, có sự tham gia của phân tử nước và hình thành hợp chất trung gian có cấu trúc tứ diện

5 Giải phóng acid carboxylic (R2COOH)

2.4.3 Sự hoạt hóa và ức chế enzyme

2.4.3.1 Sự hoạt hóa enzyme

Nguyên tố Ca có thể tăng cường hoạt tính thủy phân của enzyme lipase bằng cách hỗ trợ cho sự thay đổi hình dạng cấu trúc phân tử, tạo điều kiện dễ dàng cho sự hấp phụ enzyme và giảm lượng acid béo tạo thành trên bề mặt phân chia pha mà có thể gây ức chế phản ứng thủy phân

Sự hoạt hóa enzyme lipase ở tuyến tụy của người phụ thuộc rất nhiều vào cơ chất và sự có mặt của muối mật Bên cạnh đó, sự ảnh hưởng Ca đến hoạt tính lipase vi sinh vật phụ

Trang 19

thuộc loại enzyme và điều kiện thí nghiệm Ví dụ, để tăng cường hoạt tính enzyme lipase C rugosa ta có thể bổ sung muối Ca của acid béo tạo thành vào dung dịch đã được nhũ hóa nhưng chỉ đối với cơ chất là dầu olive không phải tributyrin Tuy nhiên, Ca không có tác dụng đối với hệ nhũ tương nước trong dầu và nếu không sử dụng chất nhũ hóa thì Ca cũng không ảnh hưởng đến hoạt tính lipase C rugosa nhưng lại tăng sự ức chế của acid mật

2.4.3.2 Colipase và sự ức chế enzyme

Hoạt tính của enzyme lipase chỉ thể hiện trên bề mặt phân chia pha dầu và nước khi enzyme này được hấp phụ lên trên bề mặt đó Nếu trong dung dịch có sự xuất hiện của muối mật (taurodeoxycholate, glycodeoxycholate hoặc taurocholate) thì những hạt micelle sẽ bị bao phủ một lớp điện tích âm ngăn cản sự hấp phụ enzyme lipase Sự ức chế này không những tác động lên lipase tuyến tụy mà còn đối với lipase vi sinh vật Tuy nhiên, chỉ có hoạt tính của lipase tuyến tụy mới được phục hồi nhờ sự tác động của colipase

Colipase thuộc tuyến tụy lợn là một chuỗi polypeptide đơn bao gồm 96 amino acid, trong phân tử có năm liên kết disulfide, pI=5,0 Đầu tiên colipase được sinh tổng hợp dưới dạng procolipase bao gồm 101 amino acid nhưng sau đó mạch polypeptide bị thủy phân hình thành cấu trúc hoạt động colipase (năm liên kết peptide Val-Pro-Asp-Pro-Arg bị thủy phân từ đầu Nitơ)

Cấu trúc phân tử colipase bao gồm hai vùng: vùng chứa đầu Nitơ (N-terminal region) và vùng có hình dạng như “ba ngón tay” được liên kết với nhau bằng cầu disulfide Vì vậy mà colipase có tính chất lưỡng cực được thể hiện ở vùng chứa đầu Nitơ có tính ưa nước trong khi tính kỵ nước tập trung ở đầu vùng “ba ngón tay” Ngoài ra, hai vùng này còn là hai vị trí liên kết đối với lipase và cơ chất

Sự liên kết giữa colipase và lipase được thực hiện nhờ hai liên kết ion và sáu liên kết hydro ở hai chuỗi xoắn ốc vùng chứa đầu Nitơ của colipase và lưới β vùng chứa đầu Carbon của lipase Mặt khác, colipase liên kết được với cơ chất là nhờ sự tương tác kỵ nước của vùng

“ba ngón tay” Nhưng ở “ngón tay giữa” có chứa ba phân tử Tyrosine (Tyr55, Tyr 58, Tyr59)

bị “giấu” kỹ trong cấu trúc xoắn kỵ nước được xem là vị trí liên kết với cơ chất

Bên cạnh đó, colipase còn liên kết với cấu trúc xoắn “lid” nhờ ba liên kết hydro (Arg38, Leu16, Glu15 của colipase và Val246, Ser343, Asn240 của “lid”) Chính vì liên kết này mà cấu trúc xoắn “lid” sẽ được ổn định trong khi thể hiện hoạt tính của enzyme và diện tích tiếp xúc với cơ chất sẽ được mở rộng hơn nữa

Trang 20

Một điều cần phải lưu ý là natri taurodeoxycholate có khả năng ức chế lipase tuyến tụy khi cơ chất là tributyrin nhưng hoạt tính thủy phân của enzyme lại được tăng cường bởi muối mật khi cơ chất là triolein Mặt khác, khi sử dụng natri taurocholate đối với lipase C rugosa và cơ chất là dầu olive thì khả năng ức chế tăng dần theo nồng độ muối mật Vì vậy

ta phải chọn được nồng độ tối ưu cho từng loại muối mật để đạt được sự ổn định của hệ nhũ, tăng diện tích tiếp xúc với lipase và đồng thời giảm đi sự ức chế của nó

Một số những chất khác có khả năng ức chế enzyme lipase bao gồm chất hoạt động bề mặt mang điện tích âm, một vài protein, ion kim loại, acid boric và hợp chất phospho như diethyl p-nitrophenyl phosphate, phenylmethyl sulfonylfluoride, các hợp chất carbamate, β-lactone và diisopropylfluorophosphate

2.4.4 Tính đặc hiệu của enzyme

Dựa vào tính đặc hiệu, enzyme lipase vi sinh vật có thể được phân thành ba nhóm (Macrae, 1983) Nhóm đầu tiên bao gồm những enzyme không đặc hiệu với vị trí hoặc cấu trúc gốc acyl trên mạch triglyceride, ví dụ như lipase từ Candida cylindracea (Benzonana và Esposito,1971) và Staphylococcus aureus (Vadehra, 1974) Nhóm thứ hai được xem là quan trọng nhất bao gồm những enzyme xúc tác đặc hiệu vị trí 1, 3 trên phân tử triacylglycerol, trong đó thông dụng là lipase từ Aspergillus niger, Rhizopus delemar (Okumura và cộng sự, 1976), Mucor miehei và Pseudomonas fragi (Alford và cộng sự, 1964) Cuối cùng là nhóm thứ ba gồm những enzyme chỉ xúc tác đặc hiệu một số acid béo nhất định, ví dụ lipase từ Geotrichum candidum (Alford và cộng sự, 1964) chỉ thủy phân acid béo mạch dài hoặc acid béo không no dạng cis-9

Trang 21

Bảng 2.2 – Tính đặc hiệu của enzyme lipase ngoại bào từ các chủng

Geotrichum và Mucor miehei

Trang 22

Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Phần 3 – Phương pháp

PHẦN 3

Các phương pháp Nội chuyển hóa ester bằng enzyme Lipase

3.1 NỘI CHUYỂN HÓA ESTER BẰNG ENZYME LIPASE CỐ ĐỊNH

Việc cố định enzyme lipase để ứng dụng trong phản ứng thủy phân cũng như tổng hợp liên kết ester đã trở nên phổ biến Bởi vì enzyme lipase cố định có những ưu điểm hơn hẳn

so với enzyme lipase tự do, ví dụ như khả năng tái sử dụng enzyme, sự kết thúc phản ứng nhanh chóng, việc điều khiển tạo thành sản phẩm và tách enzyme ra khỏi hỗn hợp phản ứng một cách dễ dàng Hơn thế nữa, việc cố định mỗi loại enzyme khác nhau sẽ ảnh hưởng đến tính chất lý và hóa học cũng như tính đặc hiệu của enzyme đó Cố định enzyme còn có thể tăng độ tinh sạch của enzyme Phương pháp cố định enzyme có thể chia làm hai loại, bao gồm: phương pháp vật lý: hấp phụ và gói enzyme trong khuôn gel hay các bao vi thể; phương pháp hóa học: gắn enzyme lên chất mang bằng liên kết đồng hóa trị (Willis và cộng sự, 2002)

3.1.1 Các phương pháp cố định enzyme lipase

3.1.1.1 Phương pháp hấp phụ

Đây là một trong những phương pháp cố định enzyme dễ thực hiện và thông dụng nhất được sử dụng trong phản ứng nội chuyển hóa ester

Nguyên tắc của phương pháp: là hấp phụ enzyme lên các chất mang nhờ lực tương tác yếu giữa chất mang và protein enzyme như: lực van der Waals, liên kết hydro và liên kết kỵ nước Nếu chất mang có chứa điện tích thì liên kết giữa enzyme và chất mang là liên kết ion (bền hơn so với hấp phụ)

Phương pháp thực hiện: cho enzyme và chất mang tiếp xúc nhau (khuấy trộn), sau đó rửa để loại những phân tử bị gắn yếu lên chất mang (Zaborsky, 1973) Một phương pháp cố định khác cũng được sử dụng là dùng dung môi để kết tủa dung dịch enzyme lên chất mang (Mustranta và cộng sự, 1993) Các dung môi được sử dụng là acetone, ethanol, hoặc methanol Và cuối cùng là chất mang sau khi lọc sẽ được đem đi sấy

Trang 23

Một số chất mang thường sử dụng để cố định enzyme bằng hấp phụ hay liên kết ion bao gồm: chất mang hữu cơ (than hoạt tính, cellulose, tinh bột, dextran, collagen, albumin, agarose, chitin), chất mang vô cơ (silic, thủy tinh xốp, oxit kim loại), chất trao đổi ion (amberlit, DEAE-Sephadex, CM-Sephadex, DEAE-Cellulose, CM-Cellulose), và polymer tổng hợp (polyamit, polyacrylamit, polystyrol, polyvinyl, nilon)

Các yếu tố ảnh hưởng: mức độ cố định enzyme bao gồm lượng enzyme được cố định và độ bền của liên kết cố định phụ thuộc vào những yếu tố như pH, nhiệt độ, loại dung môi, lực ion, và nồng độ protein cũng như chất hấp phụ (Đặng Thị Thu, 2003)

pH của môi trường phụ thuộc vào số lượng và bản chất của các nhóm tích điện ở chất mang cũng như protein enzyme Sự thay đổi pH thường ảnh hưởng lớn đến lượng enzyme cố định bằng liên kết ion Đồng thời, sự thay đổi pH đột ngột có thể dẫn đến sự nhả hấp phụ của enzyme

Lực ion môi trường: sự có mặt của các ion muối tích điện trái dấu với chất mang có thể kéo theo sự kết tủa cục bộ enzyme trong dung dịch Tuy nhiên, sự có mặt của muối cũng có thể làm tăng độ hòa tan của enzyme, do đó làm ảnh hưởng xấu đến hiệu quả cố định

Nhiệt độ tăng làm duỗi mạch enzyme, do đó làm tăng liên kết enzyme với chất mang Nhưng hạn chế nhiệt độ cao để tránh làm mất hoạt tính của enzyme

Nồng độ protein enzyme tỷ lệ thuận với lượng enzyme cố định lên chất mang ở một giới hạn nhất định

Việc lựa chọn chất mang phải đảm bảo những yêu cầu về độ bền cơ học, độ bền hóa học, khả năng hấp phụ một lượng lớn enzyme, giá thành, tính chức năng và độ phân cực Nhìn chung, lipase sẽ giữ được hoạt tính khi được cố định trên chất mang kỵ nước (polyethylene, polypropylene, styrene, polyacrylic) vì sự nhả hấp phụ enzyme xảy ra không đáng kể và sự hấp phụ cơ chất kỵ nước lên bề mặt chất mang sẽ làm tăng sự tiếp xúc cơ chất đối với enzyme Sử dụng chất mang ưu nước (Duolite, Celite, silica gel, than hoạt tính, đất sét hoạt tính và Sepharose) có thể làm giảm hoạt tính enzyme vì các nhóm chức ưu nước trên chất mang sẽ biến tính cấu trúc enzyme và ngăn cản enzyme tiếp xúc với cơ chất Bên cạnh đó, nếu cấu trúc chất mang có tính chất lỗ xốp vừa đủ để enzyme chui vào thì sẽ làm giảm sự tiếp xúc cơ chất với enzyme Vì vậy, hoạt tính của enzyme lipase cố định thường nhỏ hơn hoạt tính của

Trang 24

Theo Lee và Akoh (1998), việc cố định enzyme lipase lên các chất mang khác nhau sẽ ảnh hưởng đến hoạt tính cũng như độ bền của enzyme được sử dụng trong phản ứng nội chuyển hóa ester Enzyme lipase thu nhận từ hai loài Pseudomonas spp (Lipase AK và PS) và Candida rugosa (Lipase AY) được hấp phụ trên các chất mang đất sét, Celite 545, DEAE-Sephadex, CM-Sephadex và được sử dụng để tổng hợp chất béo có cấu trúc từ tricaprylin và trilinolein

Các yếu tố cần khảo sát là hàm lượng enzyme hấp phụ trên mỗi loại chất mang, độ ẩm của enzyme cố định, hàm lượng sản phẩm tạo thành (hỗn hợp monocaprinyllinolein và dicaprinyllinolein) và hoạt độ của mỗi loại enzyme cố định trong 24 giờ đầu phản ứng (µmol sản phẩm/phút)

Bảng 3.1 – Các loại enzyme lipase cố định AK, AY, PS lên các chất mang khác nhau

Enzyme lipase AK và AY thể hiện hoạt độ cao nhất khi được hấp phụ trên chất mang Celite 545, trong khi đó thì lipase PS có hoạt độ cao nhất đối với chất mang là CM-Sephadex (Bảng 3.1) Trong số các enzyme, lipase AY có hoạt độ cao nhất (0,35 U), tạo thành 501µmol sản phẩm (monocaprinyllinolein=103 µmol, dicaprinyllinolein=398 µmol) sau 24 giờ phản ứng Bên cạnh đó, ta nhận thấy tất cả các enzyme cố định đều thể hiện tính đặc hiệu cơ chất đối với trilinolein Tuy nhiên, đối với chất mang CM-Sephadex, việc cơ chất trilinolein được thủy phân nhanh hơn tricaprylin không được thể hiện rõ trong suốt thời gian phản ứng Từ đó ta nhận thấy rằng có thể sử dụng các loại chất mang khác nhau để thay đổi tính đặc hiệu của enzyme

Trang 25

Bảng 3.2 – Hàm lượng các sản phẩm sau 24, 48, và 72 giờ phản ứng nội chuyển hóa ester

Trong suốt 72 giờ phản ứng, hàm lượng SL1 (dicaprinyllinolein) được tổng hợp nhiều hơn SL2 (monocaprinyllinolein), và trong một số trường hợp cho thấy không tạo thành SL2 (Bảng 3.2) Một số enzyme lipase cố định, Clay AY, Celite AY, CM PS và DEAE AK được chọn để kiểm tra độ bền hoạt tính khi tái sử dụng các loại enzyme này Kết quả được thể hiện trong Bảng 3.3 Chỉ duy nhất enzyme lipase AK được cố định trên DEAE-Sephadex có thể duy trì được hoạt tính sau 5 lần sử dụng Phương pháp hấp phụ vật lý tương đối dễ thực hiện và đơn giản để không làm biến tính cấu trúc của enzyme Tuy nhiên, lực liên kết enzyme với chất mang là rất yếu khi so sánh với các phương pháp cố định khác Vì vậy, hoạt tính của enzyme cố định bằng phương pháp này sẽ giảm đáng kể sau 5 lần sử dụng ( hoạt tính giảm 97% đối với DEAE AK; Clay AY hoàn toàn mất hoạt tính sau lần sử dụng đầu tiên) Hàm lượng nước là yếu tố quan trọng trong phản ứng nội chuyển hóa ester Nếu lượng nước quá

dư sẽ dẫn đến phản ứng thủy phân thay vì tổng hợp những liên kết ester mới Các enzyme lipase cố định có hàm lượng nước từ 8,9 đến 18,7% khi điều kiện sấy không hiệu quả sẽ ảnh hưởng đến hàm lượng sản phẩm tạo thành do cơ chất bị thủy phân hoàn toàn

Bảng 3.3 – Hàm lượng sản phẩm tạo thành khi tái sử dụng enzyme lipase cố định

Trang 26

3.1.1.2 Phương pháp gắn enzyme lên chất mang bằng liên kết đồng hóa trị

Nguyên tắc: dựa trên sự tương tác đồng hóa trị giữa phân tử enzyme và chất mang Các chất mang phải là những chất không được tan trong nước Phương pháp này được ứng dụng rộng rãi trong quy mô công nghiệp

Các nhóm chức của phân tử protein enzyme có khả năng tạo liên kết đồng hóa trị với chất mang là: nhóm COOH (acid aspartic, acid glutamic), ε-NH2 (lysin), OH (serin), nhân indol (tryptophan), imidazol (histidin)

Các liên kết đồng hóa trị giữa chất mang và enzyme có thể phân loại như sau:

Diazo hóa : chất mang – N=N – enzyme

Tạo cầu amit : chất mang – CO – NH – enzyme

Alkyl hóa và aryl hóa : chất mang – CH2 – NH2 – enzyme

Tạo base Schiff : chất mang –CH=N – enzyme

Trao đổi tidol-disulfua : chất mang – S – S – enzyme

Phương pháp: có hai phương pháp gắn enzyme lên chất mang bằng liên kết đồng hóa trị

Gắn một giai đoạn: quá trình kết hợp enzyme có thể xảy ra qua một giai đoạn nếu chất mang có chứa các nhóm chức có khả năng tham gia trực tiếp với nhóm amin của protein enzyme

Gắn hai giai đoạn: giai đoạn đầu để hoạt hóa chất mang bằng cách đưa vào các nhóm có khả năng phản ứng hơn; giai đoạn hai là giai đoạn kết hợp enzyme

Các chất mang thường sử dụng:

Polymer hữu cơ: polysaccarit dextran (sephadex), agarose (sepharose)

Dẫn xuất cellulose: carboxyl methyl cellulose (CMC), diethylaminoethyl cellulose (DEAE-Cellulose), DEAE-Sephadex, CM-Sephadex

Polymer tổng hợp: polyacrylamit, polystyrol, polyamit, polyvinyl

Chất vô cơ: silicagel, bentonit, nhôm hydroxyt

Các polymer vô cơ bền với các tác nhân lý học (nhiệt, cơ học), hóa học (môi trường acid, kiềm, dung môi hữu cơ), sinh học (vi sinh vật) hơn polymer hữu cơ Đặc biệt không bị biến đổi cấu hình khuôn khi thay đổi môi trường xung quanh

Trang 27

Ưu điểm của phương pháp là tạo độ bền cao cho liên kết protein enzyme và chất mang nên tránh được sự mất mát enzyme trong quá trình phản ứng Do đó phương pháp này rất thích hợp cho thiết bị phản ứng liên tục Tuy nhiên, lượng enzyme cố định thường thấp hơn những phương pháp khác Hoạt tính enzyme có thể bị giảm do sự biến đổi cấu trúc hình thể enzyme trong quá trình cố định và do sự tiếp xúc hạn chế giữa cơ chất và trung tâm hoạt động của enzyme

Lee và cộng sự (2006) đã tập trung nghiên cứu vào việc thực hiện và tối ưu hóa các bước cố định enzyme lipase trên chất mang bằng liên kết đồng hóa trị (cross-linking method) để đạt được hiệu quả cao nhất Enzyme lipase sử dụng để nghiên cứu thuộc loài Rhizopus oryzae và chất mang là silica gel

Quy trình cố định enzyme lipase được thực hiện theo sơ đồ như Hình 3.1

Chuẩn bị enzyme lipase: enzyme lipase được thu nhận từ chủng Rhizopus oryzae KCCM 11970 Toàn bộ canh trường sau khi trích ly enzyme được đem đi ly tâm (10.000 vòng/phút, 15 phút) để tách bã rắn Ta thu được dung dịch enzyme thô, tiếp tục làm dung dịch bão hòa bởi muối ammoni sulfate (NH4)2SO4 đến nồng độ 60% để kết tủa protein enzyme Sau đó ly tâm dung dịch với điều kiện như trên để thu nhận enzyme Hòa tan enzyme trong dung dịch đệm phosphate 0,05M (pH=7) và lọc qua màng membrane siêu lọc để thu nhận dung dịch enzyme tinh khiết Bảo quản ở 4oC

Tiền xử lý chất mang: là hòa trộn silica gel với 15% 3-APTES (3- amino propyltriethoxysilane) trong 20mL acetone và ngâm trong 2 giờ ở 50oC, khuất trộn liên tục Sau đó silica gel được rửa với nước và sấy ở nhiệt độ 60oC trong 2 giờ

Xử lý glutaraldehyde: bằng cách đun sôi hợp chất này trong nước 64oC, 20 phút Mục đích của việc xử lý chất hoạt hóa glutaraldehyde là nhằm giảm bớt chất độc, có hại trong hợp chất

Hoạt hóa silica gel: trong môi trường đệm phosphate 0,05M (pH=7), hòa trộn chất hoạt hóa glutaraldehyde và khuấy đảo liên tục trong 2 giờ ở nhiệt độ 20oC Sau đó, lọc silica gel đã được hoạt hóa, rửa và ngâm trong dung dịch đệm phosphate 0,05M (pH=7)

Cố định enzyme: bằng cách cho 2mL dung dịch enzyme lipase vào trong dung dịch ngâm silica gel đã được hoạt hóa, khuất trộn trong 2 giờ ở 20oC Thu nhận enzyme cố định bằng phương pháp lọc, sau đó rửa bằng nước và bảo quản trong dung dịch đệm

Trang 28

Hình 3.1 – Sơ đồ quy trình cố định enzyme lipase bằng liên kết đồng hóa trị

Phương pháp thí nghiệm:

Xác định hoạt tính enzyme lipase cố định: 10mL dung môi isooctane có chứa 10%(w/v) dầu olive cho vào 10mL dung dịch đệm phosphate 0,05M (pH=7) có 1g enzyme lipase cố định Thực hiện phản ứng trong bồn điều nhiệt (37oC, 150 vòng/phút, 30 phút) Kết thúc phản ứng bằng cách cho vào dung dịch 1mL dung dịch acid HCl 6N và lắc mạnh hỗn hợp trong 30 giây Lấy phần trên của dung dịch (2mL) cho vào ống nghiệm có chứa sẵn đồng acetate-pyridine (0,5mL) Các acid béo tự do sẽ hòa tan trong dung môi isooctane và được đem đi định lượng bằng phương pháp

Trang 29

quang phổ tia UV ở bước sóng 715nm Hoạt độ của enzyme là lượng enzyme cần để thủy phân 1mol acid béo tự do trong 1 phút

Xác định mức độ silan hóa: sử dụng phương pháp ninhyrin

Xác định lượng enzyme gắn kết với silica gel: sử dụng phương pháp Bradford (Kwon và Rhee, JAOCS, 63,1986)

Kết quả thí nghiệm:

Quá trình tiền xử lý silica gel: có ảnh hưởng đến mức độ silan hóa và lượng enzyme liên kết chất mang Mục đích của quá trình này là loại bỏ tạp chất trên bề mặt chất mang, đồng thời hoạt hóa bề mặt silanol (Si – OH) để tăng khả năng phản ứng với chất hoạt hóa Rất nhiều hóa chất được sử dụng đối với mẫu silica gel đã qua tiền xử lý Sử dụng 35% hydrogen peroxide đối với silica gel tiền xử lý cho kết quả tốt nhất (Hình 3.2)

Hình 3.2 – Ảnh hưởng của quá trình tiền xử lý silica gel đối với việc cố định enzyme

() Mức độ silan hóa; (O) Glutaraldehyde (1) không tiền xử lý; (2) sử dụng bồn siêu âm nhiệt độ phòng trong 2 giờ; và kết hợp với (3)

H2SO4:H2O2 (5:1); (4) 5% H2O2; (5) 10% H2O2; (6) 15% H2O2; (7) 20% H2O2; (8) 25% H2O2; (9)

27% H2O2; (10) 30% H2O2; (11) 35% H2O2

Hóa chất sử dụng để hoạt hóa: 3-APTES, 3-APTMS (3-aminopropyltrimethoxy silane), 3-TMSPEDA (3-(trimethoxysilyl)propylethylendiamine) hòa tan trong dung môi acetone để kiểm tra khả năng silan hóa bề mặt chất mang Trong đó, 3-APTES cho kết quả tốt nhất (Hình 3.3) với nồng độ 15% (w/v) (Hình 3.4)

Trang 30

Hình 3.3 – Ảnh hưởng của hóa chất hoạt hóa đối với mức độ silan hóa

() hàm lượng enzyme liên kết; (O) hoạt độ enzyme cố định

Hình 3.4 – Ảnh hưởng nồng độ 3-APTES đối với mức độ silan hóa

() hàm lượng enzyme liên kết; (O) hoạt độ enzyme cố định

Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian phản ứng đối với hoạt độ của enzyme lipase khi được cố định trên silica gel: điều kiện thực hiện phản ứng tại

20oC thì enzyme lipase cố định có hoạt tính cao nhất (8,0 U/g chất mang) sau 120 phút (Hình 3.5)

Trang 31

Hình 3.5 – Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian phản ứng đến hoạt độ enzyme cố định

Sự ảnh hưởng của nhóm chức aldehyde chưa liên kết đối với hoạt độ enzyme lipase cố định: Glutaraldehyde là chất có thể làm giảm hoạt tính enzyme lipase vì những nhóm chức aldehyde sẽ liên kết với các nhóm amin của enzyme Vì vậy sau khi liên kết với chất mang và enzyme, những gốc aldehyde còn tự do phải bị khóa lại bởi những hợp chất phân tử lượng thấp như L-lysine, glycine, và ethanolamine (sau khi cố định enzyme, bổ sung những hợp chất này tiếp tục thực hiện phản ứng tại 20oC trong 2 giờ) Kết quả thí nghiệm cho thấy sử dụng 0,2% (v/v) ethanolamine thì enzyme có hoạt độ cao nhất (Hình 3.6 và Hình 3.7)

Trang 32

Hình 3.7 – Ảnh hưởng của nồng độ ethanolamine đến hoạt độ enzyme cố định

Độ bền của enzyme cố định: sau mỗi lần sử dụng, enzyme lipase cố định được rửa sạch và tái sử dụng 20 lần Kết quả thí nghiệm cho thấy enzyme vẫn giữ được 80% hoạt tính so với ban đầu (Hình 3.8)

Hình 3.8 – Độ bền enzyme lipase cố định sau mỗi lần tái sử dụng

Kết luận: Các bước thực hiện việc cố định enzyme lipase trên chất mang silica gel bằng liên kết đồng hóa trị phải được tối ưu như sau:

Tiền xử lý silica gel với 35% hydrogen peroxide

Silan hóa bề mặt chất mang bằng 15% 3-APTES trong acetone và sử dụng 2% glutaraldehyde đã được xử lý trong dung dịch nước ở 65oC trong 25 phút

Trang 33

Sau khi liên kết với enzyme, những gốc aldehyde tự do sẽ được loại bằng 0,2% (v/v) ethanolamine

Hoạt độ enzyme vẫn giữ được 80% sau 20 lần sử dụng (hoạt hóa lại enzyme cố định sau mỗi lần sử dụng)

3.1.1.3 Phương pháp gói enzyme trong khuôn gel

Nguyên tắc: phân tử enzyme được giữ trong mạng lưới không gian của một polymer không tan trong nước

Gel có thể được điều chế từ các polyacrylamit, hydroxyethyl-2-metacrylat tạo mạng lưới bằng ethylenglycol dimetacrylat, polyurethane, polyvinyl

Yokozeki và cộng sự (1981) đã khảo sát sự ảnh hưởng của các phương pháp cố định đối với hoạt độ enzyme trong phản ứng tổng hợp chất béo thay thế bơ ca cao từ dầu olive và acid stearic, acid palmitic

Enzyme lipase thu nhận từ loài Rhizopus delemar (6000 U/mg)

Hóa chất sử dụng:

Resin ưu nước (hydrophilic photo-crosslinkable resin prepolymer): ENT-1000, 2000,

4000, 6000 (tương ứng với khối lượng phân tử polyethylene glycol)

Resin kỵ nước (hydrophobic photo-crosslinkable resin prepolymer): ENTP-2000

Urethane tiền polymer: PU-3, 6, 9

Bột silic dioxide: Spherosil (XOB 15, QMA, XOB 15 hoạt hóa bằng glutaraldehyde)

Celite (No 535)

Dung môi: n-hexane

Dung dịch đệm: TES (N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid) (pH=6,5)

Trang 34

Phương pháp cố định:

Hấp phụ lipase lên Celite và Spherosil XOB 15: enzyme cố định C-Lipase; Spherosil XOB 15

Gói enzyme trong khuôn gel:

Resin ưu nước: trộn 0,5g chất mang mỗi loại với 5mg benzoin ethyl ether và 100µl dung dịch đệm 0,3M TES (pH=6,5) Đun nóng chảy ở 60oC, sau đó làm mát về nhiệt độ phòng và bổ sung 5mg lipase tự do hòa tan sẵn trong 100µl dung dịch đệm Hỗn hợp dạng gel được chiếu qua tia UV và cắt thành hạt nhỏ (3 x 3 x 3 mm)

Resin kỵ nước: trộn 0,5g chất mang với 5mg benzoin ethyl ether hòa tan trong 400µl dung môi n-hexane bão hòa nước Bổ sung 5mg lipase tự do hòa tan sẵn trong 200µl dung dịch đệm, thêm 40mg Tween 80 hoặc 5mg C-Lipase Hỗn hợp dạng gel được xử lý bằng tia UV trước khi cắt thành hạt nhỏ (3 x 3 x 3 mm)

Tiền polymer urethane: đun nóng chảy 0,5g chất mang mỗi loại ở nhiệt độ 60oC và bổ sung 200µl dung dịch đệm 0,3M TES (pH=6,5) có chứa 5mg enzyme lipase Giữ nhiệt độ hỗn hợp ở 4oC trong vòng 1 giờ Cắt khối gel thành hạt nhỏ (3 x 3 x 3 mm)

Tạo liên kết ion: 1g QMA (–[(CH3)3N]+Cl-) trộn với 10mg lipase hòa tan trong 3mL dung dịch đệm 0.03M TES, pH=6,5 Giữ hỗn hợp ở 4oC trong 1 giờ, khuấy đảo liên tục

Tạo liên kết đồng hóa trị: 1g XOB 15 hoạt hóa bởi glutaraldehyde trộn với 10mg lipase hòa tan trong 3mL dung dịch đệm 0.03M TES, pH=6,5 Giữ hỗn hợp ở 4oC trong 1 giờ, khuấy đảo liên tục

Thí nghiệm: Hỗn hợp phản ứng bao gồm enzyme lipase cố định (tương ứng 5mg enzyme lipase), 0,25g dầu olive và 0,25g acid stearic trong 10mL dung môi n-hexane Nhiệt độ thực hiện phản ứng 40oC, 120 vòng/phút, trong 1 giờ

Trang 35

Ảnh hưởng của chất mang đến hoạt tính enzyme lipase cố định

Bảng 3.4 – Ảnh hưởng của chất mang và phương pháp cố định đến hoạt tính enzyme lipase

Enzyme lipase tự do hoàn toàn không có hoạt tính trong dung môi hữu cơ n-hexane, tuy nhiên lipase hấp phụ trên Celite lại có hoạt tính rất tốt vì nó có khả năng phân tán trong hỗn hợp phản ứng Mặc dù bị nhốt trong khuôn gel, nhưng ENTP-2000 có hoạt tính cao nhất trong số các enzyme cố định khác Nhưng hoạt độ tương đối của enzyme này dao động trong một khoảng giới hạn (29 – 82%) Nguyên nhân là do enzyme lipase tự do không phân tán đều bên trong khuôn gel Tuy nhiên, khi sử dụng C-Lipase để gói trong khuôn gel ENTP-

2000 thì hoạt độ tương đối enzyme rất ổn định (75%) Bên cạnh đó, hoạt tính enzyme giảm khi được cố định trên chất mang ưu nước (ENT) bởi vì cơ chất sẽ bị ngăn cản khuếch tán vào khối gel Các enzyme cố định PU-3,6,9 cũng có hoạt tính thấp nhưng cũng thể hiện khá rõ sự ảnh hưởng của tính kỵ nước chất mang PU-3 không tan trong nước nên có hoạt tính cao hơn các loại PU khác

Độ bền của enzyme cố định: khảo sát độ bền của hai loại enzyme cố định C-Lipase và ENTP-2000 – C-Lipase trong 12 ngày với 12 lần thí nghiệm liên tục, mỗi phản ứng nội chuyển hóa ester trong thí nghiệm được thực hiện trong 24 giờ

Trang 36

Hình 3.9 – Độ bền hoạt độ của enzyme lipase cố định

(o) ENTP-2000-entrapped C-Lipase Sau 5 lần thí nghiệm, hoạt độ C-Lipase giảm gần phân nửa so với hoạt độ ban đầu Nhưng enzyme gói trong khuôn gel có thể duy trì được hơn 90% hoạt độ sau 12 lần thí nghiệm Nguyên nhân là do enzyme gói trong khuôn gel được bảo vệ không bị tổn thất và biến tính cấu trúc bởi dung môi n-hexane

3.2.1.4 Phương pháp Bio – imprinting

Định nghĩa: Bio-imprinting là kỹ thuật hoạt hóa bề mặt enzyme lipase để làm xuất hiện vùng trung tâm hoạt động của enzyme Kỹ thuật này được sử dụng cho phản ứng của enzyme trong dung môi hữu cơ hoặc môi trường khan nước (Mosbach và cộng sự, 1991) Nguyên tắc: làm cho enzyme lipase tiếp xúc với bề mặt phân chia pha; vùng trung tâm hoạt động không còn bị che phủ bởi đoạn peptide cấu trúc xoắn “lid” thì làm khô lạnh (lyophilize) toàn bộ hỗn hợp enzyme để giữ cho cấu trúc hoạt hóa được ổn định

Phương pháp thực hiện:

Để tạo thành bề mặt phân chia pha, ta có thể sử dụng Tween 20, n-octyl-β-D-glucose (n-OG) đến nồng độ bão hòa hoặc cơ chất dầu và gum arabic

Các bước thực hiện (Gonzalez-Navarro & Braco, 1997):

Hòa tan enzyme lipase trong dung dịch đệm

Bổ sung chất nhũ hóa, khuấy trộn và để ở nhiệt độ phòng

Làm khô lạnh dung dịch ở -30oC trong 36 giờ

Thu nhận enzyme hoạt hóa ở dạng muối

Định dạng
Số trang	72
Dung lượng	1,61 MB

nội chuyển hóa ester bằng enzyme

TAØI LIỆU THAM KHẢO