BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRẦN NGỌC YẾN CHI SÀNG LỌC CÁC CÂY THUỐC CÓ TIỀM NĂNG ĐIỀU TRỊ BỆNH GÚT THÔNG QUA ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. T.S. Nguyễn Thùy Dương 2. T.S. Phương Thiện Thương Nơi thực hiện: Bộ môn Dược lực HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khoá luận này, tôi đã nhận đƣợc sự giúp đỡ rất nhiều của thầy cô, bạn bè và ngƣời thân. Trƣớc tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thuỳ Dương và TS. Phương Thiện Thương, những ngƣời thầy đã luôn quan tâm, giúp đỡ, hƣớng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình hoàn thành đề tài này. Xin chân thành cảm ơn các thầy, cô và các anh chị kĩ thuật viên Bộ môn Dƣợc lực đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng đào tạo, các bộ môn, phòng ban khác của trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội. Lời cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè, những ngƣời đã luôn luôn động viên, giúp đỡ và đóng góp ý kiến cho tôi hoàn thành khoá luận này. Hà Nội, tháng 5, năm 2013. Sinh viên Trần Ngọc Yến Chi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Vài nét về bệnh gút & enzym xanthin oxidase 3 1.1.1. Khái niệm và cơ chế bệnh sinh bệnh gút 3 1.1.2. Mối liên quan giữa bệnh gút và enzym xanthin oxidase 4 1.1.3. Enzym xanthin oxidase 5 1.2. Một số thuốc và dƣợc liệu có tác dụng ức chế XO 7 1.2.1. Các thuốc ức chế XO đang đƣợc lƣu hành 7 1.2.2. Các nghiên cứu về phát triển dƣợc liệu có tiềm năng ức chế XO 9 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1. Nguyên liệu nghiên cứu 14 2.2. Phƣơng tiện nghiên cứu 14 2.2.1. Hoá chất, thuốc thử 14 2.2.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 15 2.3. Nội dung nghiên cứu 15 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 16 2.4.1. Phƣơng pháp thu thập mẫu và thông tin các cây thuốc đƣa vào sàng lọc 16 2.4.2. Phƣơng pháp chiết xuất dƣợc liệu 16 2.4.3. Phƣơng pháp đánh giá ảnh hƣởng của các mẫu thử lên hoạt độ XO 17 2.4.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu 19 3.1. Kết quả 20 3.1.1. Kết quả thu thập dữ liệu về các dƣợc liệu đƣa vào sàng lọc 20 3.1.2. Kết quả sàng lọc tác dụng ức chế XO in vitro của các dƣợc liệu 44 3.1.3. Xác định IC 50 của các dƣợc liệu tiềm năng ức chế XO 63 3.2. Bàn luận 63 3.2.1. Về thông tin của các cây thuốc đƣa vào nghiên cứu 63 3.2.2. Về kết quả sàng lọc tác dụng ức chế XO in vitro trên đĩa Costar 96 giếng 64 3.2.3. Về khả năng ức chế XO của cây thuốc tiềm năng 65 KẾT LUẬN 67 1. Kết luận 67 2. Đề xuất 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU XO : Xanthin oxidase XDH : Xanthin dehydrogenase Oxh : Oxy hoá CCTT : Chƣa có thông tin ĐHMD : Điều hoà miễn dich HA : Huyết áp DANH MỤC CÁC BẢNG STT Ký hiệu Tên bảng Trang 1 2.1 Bố trí thí nghiệm trong từng giếng 18 2 3.1 Thông tin về các dƣợc liệu sàng lọc 21 3 3.2 Ảnh hƣởng của các dịch chiết lên hoạt độ XO in vitro tại các nồng độ 100 g/ml, 50 g/ml, 10 g/ml hỗn hợp phản ứng 45 4 3.3 IC 50 của các dƣợc liệu tiềm năng ức chế XO 63 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Ký hiệu Tên hình Trang 1 1.1 Quá trình chuyển hoá purin trong cơ thể 4 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Từ lâu, các sản phẩm tự nhiên đã đóng vai trò quan trọng trong điều trị bệnh. Trong hai thập kỉ qua đã có 30,2 % các loại thuốc mới đƣợc phê duyệt có nguồn gốc từ tự nhiên [72]. Cùng với sự đổi mới trong các phƣơng pháp điều trị bằng các sản phẩm tự nhiên, cây thuốc và các chế phẩm chiết xuất từ thực vật đã đƣợc quan tâm nhiều hơn bởi những ƣu điểm so với hoá dƣợc [114]. Các thuốc theo y học hiện đại thƣờng có tác dụng nhanh, hiệu quả tƣơng đối tốt. Tuy nhiên, khi dùng tân dƣợc để điều trị các bệnh mạn tính lại bộc lộ nhƣợc điểm nhiều tác dụng không mong muốn và giá thành cao khi dùng lâu dài. Gút là bệnh rối loạn chuyển hoá mạn tính. Ngƣời bị bệnh gút phải đối mặt với việc sẽ phải sử dụng thuốc trong thời gian dài và có thể gặp nhiều vấn đề mà các thuốc tân dƣợc mang lại. Do đó, nhiều nghiên cứu về thuốc có nguồn gốc từ dƣợc liệu đã đƣợc đƣa ra để khắc phục các nhƣợc điểm nêu trên. Bệnh gút gắn liền với tăng acid uric máu và mục tiêu chính trong điều trị là làm giảm lƣợng acid uric trong máu. Acid uric huyết thanh là sản phẩm cuối cùng của quá trình chuyển hoá purin qua trung gian là xanthin oxidase (XO), một loại enzym oxy hoá hypoxanthin thành xanthin và xanthin thành acid uric. Việc sử dụng các chất ức chế enzym XO để cản trở hình thành acid uric trong cơ thể là một mục tiêu mà các nghiên cứu đã và đang hƣớng tới. Với truyền thống lâu đời về y học cổ truyền, với những kinh nghiệm dân gian về sử dụng cây cỏ làm thuốc từ các dân tộc khác nhau trong nƣớc, Việt Nam có một nguồn dƣợc liệu phong phú và còn chƣa đƣợc khai thác nhiều. Từ thực tế đó, để góp phần sàng lọc nhằm tìm kiếm các dƣợc liệu có khả năng ức chế XO, bƣớc đầu trong quá trình xác định dƣợc liệu tiềm năng điều trị gút, đề tài: “Sàng lọc các cây thuốc có tiềm năng điều trị bệnh gút thông qua ức chế xanthin oxidase in vitro” đƣợc thực hiện với ba mục tiêu sau: 1. Thu thập đƣợc thông tin của một số cây thuốc Việt Nam có tiềm năng khai thác. 2 2. Sàng lọc đƣợc các cây thuốc có tiềm năng điều trị gút thông qua con đƣờng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa 96 giếng. 3. Xác định IC 50 của các cây thuốc có tiềm năng ức chế XO. 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Vài nét về bệnh gút & enzym xanthin oxidase 1.1.1. Khái niệm và cơ chế bệnh sinh bệnh gút 1.1.1.1. Khái niệm Gút là bệnh rối loạn chuyển hoá các nhân purin, có đặc điểm chính là tăng acid uric máu. Tình trạng viêm khớp trong bệnh gút là do sự lắng đọng các tinh thể monosolium urat trong dịch khớp hoặc mô [9]. 1.1.1.2. Cơ chế bệnh sinh bệnh gút Bệnh gút xuất hiện khi cơ thể tích luỹ acid uric quá mức (gấp vài lần bình thƣờng). Nguyên nhân là do sản xuất acid uric quá mức hoặc giảm thải trừ acid uric. Tăng acid uric quá mức có thể do sự bất thƣờng của một số hệ enzym tác động vào quá trình chuyển hoá purin nhƣ tăng hoạt tính phosphoribosyl pyrophosphat (PRPP) synthetase dẫn đến tăng nồng độ PRPP - chất quan trọng trong quá trình tổng hợp purin hay thiếu hụt hypoxanthin-guanin phosphoribosyl transferase (HGPRT) - enzym chịu trách nhiệm chuyển guanin thành guanylic acid và chuyển hypoxanthin thành inosinic acid. Hiện tƣợng giảm thải trừ acid uric ở thận với hầu hết các bệnh nhân gút (80- 90%) đều không rõ nguyên nhân (tăng acid uric máu tự phát). Thông thƣờng, nếu sản xuất acid uric cân bằng với thải trừ thì acid uric không bị tích lũy. Tuy nhiên, ở bệnh nhân gút lƣợng thải trừ ít hơn nhiều so với lƣợng acid uric sinh ra dẫn đến tăng lƣợng tinh thể natri urat hòa tan trong máu [36]. Khi nồng độ acid uric tăng cao sẽ gây lắng đọng các tinh thể urat tại mô tạo nên các hạt tophi. Khi các hạt tophi tại sụn khớp bị vỡ sẽ khởi phát cơn gút cấp, sự lắng đọng vi tinh thể cạnh khớp, màng hoạt dịch, trong mô sụn và mô xƣơng sẽ dẫn đến bệnh xƣơng khớp mạn tính do gút. Sự có mặt vi tinh thể urat tại mô mềm, bao gân tạo nên hạt tophi; viêm thận kẽ là do tinh thể urat lắng đọng tại tổ chức kẽ của thận; acid uric niệu tăng và sự toan hoá nƣớc tiểu dẫn đến sỏi tiết niệu [9]. [...]... liệu có khả năng ức chế XO Chuẩn bị mẫu thử in vitro Đánh giá khả năng ức chế của các mẫu thử ở 3 nồng độ 100 µg/ml, 50 µg/ml và 10 µg/ml  Thực hiện mục tiêu 3: Xác định đƣợc IC50 của các cây thuốc có tiềm năng ức chế XO Khảo sát khả năng ức chế của các mẫu thử tiềm năng ở các nồng độ khác nhau để xác định IC50 16 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp thu thập mẫu và thông tin các cây thuốc. .. Nucleic acid Guanin + Điều hòa ngƣợc ức chế Glutamin Điều hòa ngƣợc ức chế Inosinic acid Nucleic acid Adenylic acid HGPRTase PRPP Guanylic acid HGPR Tase PRPP Hypoxanthin Xanthin + PRPP Xanthin oxidase Acid uric Hình1.1 Chuyển hoá purin trong cơ thể 5 Bệnh gút có mối quan hệ chặt chẽ với nồng độ acid uric máu Khi nồng độ acid uric máu tăng cao sẽ làm tăng nguy cơ mắc bệnh Bên cạnh đó, enzym XO có vai trò... trung sàng lọc các loài thuộc các họ khác nhau dựa trên kinh nghiệm dân gian hoặc nền y học cổ truyền ở các nƣớc để từ đó tìm ra các cây thuốc có tiềm năng nhất Năm 1998, tác dụng ức chế XO đã đƣợc khảo sát trên 26 loài thuộc 18 họ theo truyền thống đƣợc sử dụng để điều trị bệnh gút và các triệu chứng liên quan của ngƣời dân bản địa của vùng đông bắc Bắc Mỹ Khoảng 88% các cây đã đƣợc tìm thấy có hoạt... có tác dụng ức chế XO hiện đang đƣợc sử dụng trong điều trị 1.2.1.1 Allopurinol Allopurinol là chất đầu tiên đƣợc xác định có khả năng ức chế XO và bây giờ vẫn là thuốc điều trị tăng acid uric máu thƣờng đƣợc sử dụng - Tác dụng và cơ chế tác dụng Tác dụng [3], [24]: Thuốc ức chế XO, ngăn chặn sự tổng hợp urat từ hypoxanthin và xanthin do đó làm giảm lƣợng acid uric trong máu Khi không dùng allopurinol,... mối liên quan cấu trúc-tác dụng sinh học của các hợp chất flavonoid nhƣ apigenin, quercetin, myricetin, isovitexin, genistein và naringenin cũng đã đƣợc thực hiện Kết quả cho thấy, apigenin là chất ức chế mạnh nhất, tƣơng tác thuận lợi nhất với trung tâm hoạt động enzym Tiếp theo đó là quercetin, myricetin, genistein và isovitexin Naringenin không cho thấy sự ức chế với IC50 > 50 M [75] 1.2.2.2 Các nghiên... (Dây chiều) có khả năng ức chế XO mạnh với IC50 < 20 g/ml Dịch chiết methanol từ hoa Chrysanthemum sinense có khả năng ức chế mạnh nhất với giá trị IC50 = 5,1 g/ml [86] Từ cơ sở sàng lọc đó, các cây đã đƣợc nghiên cứu sâu hơn Từ ruột gỗ của cây Caesalpinia sappanphân lập đƣợc 17 hợp chất tự nhiên trong đó có 9 hợp chất có tác dụng ức chế XO với IC50 dao động từ 3,9 đến 93,2 M Hợp chất có tác dụng mạnh... thuốc mới, kinh nghiệm sử dụng chƣa nhiều Vì vậy, các tƣơng tác thuốc cũng nhƣ các tác dụng không mong muốn của thuốc cần phải tiếp tục đƣợc nghiên cứu [107] 1.2.2 Các nghiên cứu về phát triển dược liệu có tiềm năng ức chế XO Allopurinol và febuxostat là 2 thuốc tân dƣợc điển hình trong điều trị gút mạn Hiệu quả điều trị tốt là những ƣu điểm nổi bật của hai thuốc trên Tuy nhiên, chúng có nhiều tác... ngại Vì vậy, các dƣợc liệu điều trị gút theo cơ chế ức chế XO vẫn đang đƣợc tiếp tục phát triển để khắc phục nhƣợc điểm trên 1.2.2.1 Các hƣớng nghiên cứu trên thế giới Nghiên cứu sàng lọc in vitro là bƣớc đầu để từ đó có thể nghiên cứu theo định hƣớng tác dụng sinh học và đánh giá sâu hơn khẳng định tác dụng trên mô hình gây bệnh trên động vật thực nghiệm của các dƣợc liệu có khả năng ức chế XO mạnh... đưa vào sàng lọc Thu hái đƣợc 202 mẫu cây tại Việt Nam theo dự án “Bảo tồn nguồn cây thuốc cổ truyền” của Viện Dƣợc liệu Thông tin về tên địa phƣơng, tên khoa học, họ, bộ phận dùng và tác dụng dƣợc lý đƣợc thể hiện trong bảng 3.1 Nhận xét: 202 mẫu cây thuộc 74 họ và 187 loài, trong đó: - 27 mẫu cây chƣa có thông tin về họ - 81 mẫu cây chƣa có thông tin về tác dụng - 13 mẫu cây chƣa có thông tin về bộ... đó ức chế hoạt động của enzym [47] 9 - Ƣu điểm: So với allopurinol, febuxostat ít gây dị ứng hơn, hiệu lực mạnh hơn khi lựa chọn cho bệnh nhân không uống đƣợc allopurinol hoặc các thuốc điều trị bệnh gút khác Thuốc hữu ích với 5-10% ngƣời đã có hiện tƣợng quá mẫn với allopurinol cũng nhƣ những ngƣời suy thận không thể dùng đủ liều allopurinol [107] Febuxostat không có purin trong cấu trúc Tuy ức chế . thuốc có tiềm năng điều trị gút thông qua con đƣờng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa 96 giếng. 3. Xác định IC 50 của các cây thuốc có tiềm năng ức chế XO. 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN. phần sàng lọc nhằm tìm kiếm các dƣợc liệu có khả năng ức chế XO, bƣớc đầu trong quá trình xác định dƣợc liệu tiềm năng điều trị gút, đề tài: Sàng lọc các cây thuốc có tiềm năng điều trị bệnh gút. TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRẦN NGỌC YẾN CHI SÀNG LỌC CÁC CÂY THUỐC CÓ TIỀM NĂNG ĐIỀU TRỊ BỆNH GÚT THÔNG QUA ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng