Nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số dẫn chất 1,4 bis(1h benzodimidazol 2 yl thio) butan

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của phân tử 1H - benzimidazol 2 Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của phân tử vitamin B12 2 Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của phân tử 2-mercaptobenzimidazol 3 Hình 1.4

1,4-BIS(1H-BUTAN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2013

Bộ mô Cô i p Dược

Trườ ại ọc Dược Hà ội

HÀ NỘI - 2013

cô giáo, gia đình cùng bạn bè, tôi đã hoàn thành khóa luận tốt nghiệp “Nghiên cứu

tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số dẫn chất

1,4-bis(1H-benzo[d]imidazol-2-yl-thio)butan”

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến thầy giáo

PGS TS Nguyễn Đình Luyện đã trực tiếp hướng dẫn và tạo mọi điều kiện để giúp

đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này Đồng thời, tôi cũng

xin chân thành cám ơn DS Nguyễn Văn Giang, DS Phạm Thị Hiền và DS Nguyễn

Thị Phương của phân môn Tổng hợp Hóa dược - Bộ môn Công Nghiệp Dược đã rất

nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận

Tôi cũng xin được gửi lời cám ơn đến các thầy cô, anh chị thuộc Bộ môn

Công nghiệp Dược, cũng như các thầy cô trong trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo

mọi điều kiện thuận lợi cho tôi học tập suốt 5 năm qua

Cuối cùng, tôi cũng xin gửi lời cám ơn đến gia đình và bạn bè đã luôn giúp

đỡ, động viên, quan tâm và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học

tập và hoàn thành khóa luận này

Tôi xin chân thành cám ơn!

Hà Nội, ngày 21 tháng 5 năm 2013

Sinh viên

SAR VUTHY

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, HÌNH ẢNH

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 K HÁI QUÁT CHUNG VỀ KHUNG BENZIMIDAZOL 2

1.1.1 Cấu trúc hóa học 2

1.1.2 Tính chất hóa học 2

1.2 K HÁI QUÁT CHUNG VỀ 2- MERCAPTOBENZIMIDAZOL VÀ DẪN CHẤT 3

1.2.1 Công thức cấu tạo của 2-mercaptobenzimidazol 3

1.2.2 Tính chất hóa lý học của 2-mercaptobenzimidazol 3

1.3 T ÁC DỤNG SINH HỌC CỦA DẪN CHẤT 2- MERCAPTOBENZIMIDAZOL 3

1.3.1 Tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm 3

1.3.2 Tác dụng giảm cholesterol máu và chống xơ cứng động mạch 7

1.3.3 Tác dụng chống ung thư 8

1.3.4 Tác dụng chống co giật 10

1.3.5 Tác dụng chống bài tiết acid dịch vị, ức chế bơm proton H+/K+-ATPase và chống viêm loét dạ dày 11

1.3.6 Các tác dụng khác của dẫn chất 2-mercaptobenzimidazol 13

1.4 C ÁC PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP DẪN CHẤT 1,4- BIS (1H- BENZO [ D ] IMIDAZOL -2-YL - THIO ) BUTAN 13

1.4.1 Phản ứng đóng vòng tạo nhân 2-mercaptobenzimidazol từ o-phenylendiamin hoặc dẫn chất o-phenylendiamin 14

1.4.2 Phản ứng tạo bis(1H-benzo[d]imidazol-2-yl-thio) và dẫn chất 15

1.4.3 Phản ứng thế vào vị trí N1 và N1’ trên nhân benzimidazol 16

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 18

2.1 N GUYÊN LIỆU , THIẾT BỊ 18

2.1.1 Hóa chất 18

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 19

2.2 N ỘI DUNG NGHIÊN CỨU 20

2.3 P HƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.3.1 Tổng hợp hóa học 20

2.3.2 Xác định cấu trúc 21

2.3.3 Thử tác dụng sinh học 21

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22

3.1 T ỔNG HỢP HÓA HỌC 22

3.1.1 Tổng hợp 2-mercaptobenzimidazol 22

3.1.2 Tổng hợp 1,4-bis(1H-benzo[d]imidazol-2-yl-thio)butan 24

3.1.2.1 Tổng hợp tác nhân 1,4-dibromobutan 24

3.1.2.2 Tổng hợp 1,4-bis(1H-benzo[d]imidazol-2-yl-thio)butan 25

3.1.3 Tổng hợp một số dẫn chất thế ở vị trí N1 và N1’ của 1,4-bis(1H-benzo[d]imidazol-2-yl-thio)butan 26

3.1.3.1 Tổng hợp 1,4-bis(1-benzyl-1H-benzo[d]imidazol-2-yl-thio)butan 26

3.1.3.2 Tổng hợp 1,4-bis(1-methoxycarbonylmethyl-1H-benzo[d]imidazol-2-yl-thio)butan 28

3.1.3.3 Tổng hợp 1,4-bis(1-ethoxycarbonylmethyl-1H-benzo[d]imidazol-2-yl-thio)butan 30

3.2 K IỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT CỦA CÁC DẪN CHẤT TỔNG HỢP ĐƯỢC 32

3.3 X ÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA CÁC CHẤT TỔNG HỢP ĐƯỢC 33

3.3.1 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR) 33

3.3.2 Kết quả phân tích phổ khối lượng (MS) 35

3.4.2 Cách tiến hành 38

3.5 B ÀN LUẬN 42

3.5.1 Về tổng hợp hóa học 42

3.5.2 Về thử tác dụng sinh học 47

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

K ẾT LUẬN 48

K IẾN NGHỊ 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

ATCC : American Type Culture Collection

ECA : Ethyl cloroacetat

HIV : Virus suy giảm miễm dịch ở người (Human

Immunodeficiency Virus)

1H – NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

(Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)

IR : Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy)

MS : Phổ khối lượng phân tử (Mass spectrometry)

Rf : Hệ số lưu giữ (retention factor)

Bảng 2.1 Các hóa chất, dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm 18

Bảng 2.2 Các máy móc, dụng cụ sử dụng trong quá trình thực nghiệm 19

Bảng 3.1 Tóm tắt kết quả tổng hợp hóa học 32

Bảng 3.2 Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy của các chất tổng hợp được 33

Bảng 3.3 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của 5 chất đã tổng hợp được 34

Bảng 3.4 Kết quả phân tích phổ khối lượng của 5 chất đã tổng hợp được 35

Bảng 3.5 Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của 5

Bảng 3.6 Các môi trường trong thử nghiệm kháng khuẩn và kháng nấm 39

Bảng 3.7 Kết quả thử tác dụng kháng khuẩn 41

Bảng 3.8 Kết quả thử tác dụng kháng nấm 42

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của phân tử 1H - benzimidazol 2

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của phân tử vitamin B12 2

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của phân tử 2-mercaptobenzimidazol 3

Hình 1.4 CTCT chung của dẫn chất 2-mercaptobenzimidazol theo

Hình 1.5 CTCT chung của dẫn chất

bis(1H-benzo[d]imidazol-2-yl-thio) theo nghiên cứu của G Srikanth năm 2010 5

Hình 1.6 CTCT của bis ở vị trí N1 và N1’ trong nghiên cứu của G Srikanth năm 2010 5

Hình 1.7 CTCT chung của dithiobis(1H-benzimidazol) trong nghiên

Hình 1.8 CTCT chung của dẫn chất

bis(1H-benzo[d]imidazol-2-yl-thio) theo nghiên cứu của K Aoki và K Aikawa năm 1999 7

Hình 1.9 Công thức cấu tạo của Hoechst 33258 và Hoechst 33342 9

Hình 1.10 CTCT của dẫn chất 2-(4-methoxyphenyl)-1H-benzimidazol 9

Hình 1.11 CTCT của dẫn chất

Hình 1.12 CTCT chung của dẫn chất 2-mercaptobenzimidazol theo

nghiên cứu của K Anandarajagopal và cộng sự 10

Hình 1.13 CTCT chung của dẫn chất benzimidazol theo nghiên cứu của

Hình 1.14 CTCT chung của dẫn chất benzimidazol theo nghiên cứu của

Sơ đồ 1 Sơ đồ tổng hợp 1,4-bis(1H-benzo[d]imidazol-2-yl-thio)butan và dẫn chất 13

Sơ đồ 2 Phản ứng tạo khung 2-mercaptobenzimidazol theo Maw-Ling

Sơ đồ 3 Phản ứng tạo khung 2-mercaptobenzimidazol của Van Allan và

Sơ đồ 4 Phản ứng tạo khung 2-mercaptobenzimidazol từ o-nitroamin 15

Sơ đồ 5 Phản ứng tạo bis(1H-benzo[d]imidazol-2-yl-thio) và dẫn chất 15

Sơ đồ 6 Phản ứng alkyl hóa thế vào vị trí N1 và N1’ trên nhân

Sơ đồ 7 Phản ứng acyl hóa thế vào vị trí N1 và N1’ trên nhân benzimidazol 17

Sơ đồ 8 Sơ đồ các dẫn chất

Sơ đồ 9 Sơ đồ tổng hợp 2-mercaptobenzimidazol 22

Sơ đồ 10 Sơ đồ tổng hợp 1,4-dibromobutan 24

Sơ đồ 11 Sơ đồ tổng hợp 1,4-bis(1H-benzo[d]imidazol-2-yl-thio)butan 25

Sơ đồ 12 Sơ đồ tổng hợp 1,4-bis(1-benzyl-1H-benzo[d]imidazol-2-yl-thio)butan 26

Sơ đồ 13 Sơ đồ tổng hợp

Sơ đồ 14 Sơ đồ tổng hơp

Sơ đồ 15 Cơ chế phản ứng đóng vòng 2-mercaptobenzimidazol 43

Sơ đồ 16 Vai trò của KOH trong phản ứng tạo chất II-a 43

Sơ đồ 17 Cơ chế thế ái nhân lưỡng phân tử (SN 2) của phản ứng tạo chất

Sơ đồ 18 Cơ chế phản ứng alkyl hóa của nhân benzimidazol 45

Sơ đồ 19 Phản ứng tạo muối amino bậc 4 46

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, khi xã hội ngày càng phát triển thì mô hình bệnh tật của con người ngày càng phức tạp, xuất hiện nhiều căn bệnh mới Do đó, việc tìm ra những loại thuốc mới để đáp ứng nhu cầu điều trị là việc làm hết sức thiết thực

Để tìm được các hoạt chất có hiệu quả điều trị cao, ít độc và có thể ứng dụng trong điều trị, các nhà khoa học thường dựa vào cấu trúc của các chất đang được dùng làm thuốc hoặc các chất có tác dụng sinh học triển vọng để tạo ra nhiều thuốc mới Việc tạo ra thuốc mới là một quá trình lâu dài và được thực hiện bằng nhiều con đường khác nhau, trong đó đáng quan tâm là con đường tổng hợp hóa dược Ngày nay, những thuốc có nguồn gốc tổng hợp hóa dược chiếm một tỷ lệ lớn nhất trong điều trị

Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy dẫn chất benzimidazol là nhóm chất dị vòng có tác dụng sinh học rất đa dạng như: kháng khuẩn, kháng nấm, chống viêm, giảm đau, trị giun sán, chống co giật, ức chế virus, chống ung thư Trong đó dẫn chất 2-mercaptobenzimidazol được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu trong thời gian gần đây

Để góp phần làm phong phú thêm các nghiên cứu về tổng hợp và thử tác

dụng sinh học của các dẫn chất benzimidazol, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng sinh học một số dẫn chất 1,4-bis(1H-

benzo[d]imidazol-2-yl-thio)butan” với 2 mục tiêu chính:

1 Tổng hợp một số dẫn chất 1,4-bis(1H-benzo[d]imidazol-2-yl-thio)butan

2 Thử hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của một số dẫn chất đã tổng hợp được

H

2

3 4

7

1

5 6

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của phân tử 1H-benzimidazol

Trong tự nhiên đã có sự tồn tại của dẫn chất benzimidazol, trong đó nổi bật nhất là N-ribosyl-dimethylbenzimidazol là một thành phần quan trọng trong cấu trúc hóa học của phân tử vitamin B12 [26,31]

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của phân tử vitamin B 12

1.1.2 Tính chất hóa học

Nhìn chung, khung benzimidazol là một base yếu, có thể hòa tan trong acid

vô cơ loãng Tính base của benzimidazol yếu hơn imidazol Benzimidazol cũng có đầy đủ tính chất của một acid, tan tốt trong dung dịch kiềm [19]

1.2 Khái quát chung về 2-mercaptobenzimidazol và dẫn chất

1.2.1 Công thức cấu tạo của 2-mercaptobenzimidazol

Tên khoa học và cấu trúc:

N

H N SH

1H-Benzo[d]imidazol-2-thiol

1 2 3 4

5 6 7

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của phân tử 2-mercaptobenzimidazol

Công thức phân tử : C7H6N2S

Khối lượng phân tử : 150,2 g/mol

1.2.2 Tính chất hóa lý học của 2-mercaptobenzimidazol

Độ tan: Tan được trong dung môi hữu cơ như: methanol, ethyl acetat, aceton; tan rất tốt trong ethanol; rất ít tan trong nước

Độ hòa tan trong nước < 0,1g/100ml ở 23,5ºC

Nhiệt độ nóng chảy: 300-305ºC

Đặc điểm tinh thể: Tinh thể hình phiến mỏng, có màu vàng nhạt hoặc màu trắng

1.3 Tác dụng sinh học của dẫn chất 2-mercaptobenzimidazol

Trong nhiều thập kỷ vừa qua, các dẫn chất 2-mercaptobenzimidazol đã thu hút được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học do tác dụng sinh học phong phú như: tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn, chống ung thư, chống viêm, giảm đau, trị giun sán, chống co giật, ức chế virus, chống sự tăng lipid máu, chống xơ cứng động mạch, chống viêm loét, ức chế bơm proton H+/K+-ATPase, kháng acid dịch vị

Nhiều chất trong số đó đã được ứng dụng trong lâm sàng [8,26,27]

1.3.1 Tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm

Năm 2010, Gigani Yaseen và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng kháng khuẩn của dẫn chất 2-mercaptobenzimidazol có công thức tổng quát như sau:

H N S

H2

C HN R

(1)

Hình 1.4 Công thức cấu tạo chung của dẫn chất 2-mercaptobenzimidazol theo

nghiên cứu của Gigani Yaseen năm 2010

Bảng 1.1 Các dẫn chất của công thức (1) cho bởi bảng sau:

Tiến hành thử tác dụng kháng khuẩn của những dẫn chất trên bằng phương

pháp khuếch tán trên thạch Các thử nghiệm với Escherichia coli ATCC 3750 và

Bacillus subtilis ATCC 6633, ở nồng độ khác nhau là 50µg/ml, 100µg/ml và

200µg/ml (sử dụng chất đối chiếu là Ciprofloxacin) Kết quả cho thấy chất tất cả

các chất 1a, 1b, 1c, 1d, 1e và 1f đều có tác dụng ức chế với 2 vi khuẩn trên Trong

đó chất 1f có tác dụng rất kém đối với E subtilis, 1a và 1d không có tác dụng chống

E coli ở nồng độ thấp hơn 50µg/ml, 1c và 1e thể hiện tác dụng mạnh nhất [34]

Năm 2010, G Srikanth và cộng sự đã nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số dẫn chất bis(1H-benzo[d]imidazol-2-yl-thio) Trong đó điển hình là nhóm các dẫn chất sau:

H N

S (CH 2 ) n S

N H N

(n = 2, 3)

R

R'

(2)

Hình 1.5 Công thức cấu tạo chung của dẫn chất

bis(1H-benzo[d]imidazol-2-yl-thio) theo nghiên cứu của G Srikanth năm 2010

Bảng 1.2 Các dẫn chất của công thức (2) cho bởi bảng sau:

H N

S N

N H

S

R 3

R 3 '

(4)

Hình 1.7 Công thức cấu tạo chung của dithiobis(1H-benzimidazol) trong nghiên

cứu của G Srikanth năm 2010

Bảng 1.4 Các dẫn chất của công thức (4) cho bởi bảng sau:

Bằng phương pháp chọn Candida albicans là nấm đại diện để thử tác dụng

và ketoconazol là chất kháng nấm đối chiếu, kết quả là tất cả các dẫn chất tạo bis

của 2-mercaptobenzimidazol đều có tác dụng kháng Candida albicans

Trong đó có chất 2b, 3b, 4b, 5b, 6b và 6c có tác dụng ức chế mạnh Candida

albicans tại nồng độ 250μg/ml và 500μg/ml Tuy nhiên, tác dụng ức chế này vẫn

còn kém hơn chất đối chiếu ketoconazol [26,27]

Tác dụng kháng khuẩn

Người ta sử dụng Staphylococus aureus là đại diện cho vi khuẩn Gram(+) và

Escherichia coli đại diện cho vi khuẩn Gram(-) để thử nghiệm tác dụng kháng

khuẩn của các dẫn chất trên với chất đối chiếu là ampicillin

Tại nồng độ 50μg/ml thì hoạt tính kháng E coli và S aureus của các dẫn

chất 2a, 3a, 4a, 5a và 6a là thấp, nhưng ở liều cao hơn tức là ở nồng độ 100μg/ml

thì các dẫn chất này lại có tác dụng kháng khuẩn trung bình

Các dẫn chất 2b, 3b, 4b, 5b và 6b đều có tác dụng trung bình kháng E coli

và S aureus tại nồng độ 50µg/ml, tác dụng này rất tốt khi ở nồng độ 100µg/ml

Còn lại, đối với các dẫn chất 2c, 3c, 4c, 5c và 6c có tác dụng ức chế trung

bình trên E coli và S aureus ở nồng độ 100µg/ml [26,27]

1.3.2 Tác dụng giảm cholesterol máu và chống xơ cứng động mạch

Trong năm 1999, Kozo Aoki và Kazuhiro Aikawa đã tiến hành nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng chống tăng lipid máu và xơ cứng động mạch của một số dẫn chất bis(1H-benzo[d]imidazol-2-yl-thio) có công thức cấu tạo chung như sau:

2

3 4

5 6 7

1' 2'

3' 4'

5'

6' 7'

(5)

Hình 1.8 Công thức cấu tạo chung của dẫn chất

bis(1H-benzo[d]imidazol-2-yl-thio) theo nghiên cứu của Kozo Aoki và Kazuhiro Aikawa năm 1999

Bảng 1.5 Các dẫn chất của công thức (5) cho bởi bảng sau:

Đến năm 1984, Tewey và cộng sự đã nghiên cứu và công nhận vai trò của ADN topoisomerase như là mục tiêu phân tử của các thuốc chống ung thư Hiện nay, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng kháng tế bào ung thư của dẫn

chất benzimidazol được công bố Hoechst 33258 và Hoechst 33342 là các dẫn chất

benzimidazol đầu tiên có tác dụng trên ADN topoisomerase I [5]

Hoechst 33342

(14)

Hoechst 33258 (15)

Hình 1.9 Công thức cấu tạo của Hoechst 33258 và Hoechst 33342

Năm 1996, Jung Sun Kim và các cộng sự đã tổng hợp một loạt dẫn chất

2-(4-methoxyphenyl)-1H-benzimidazol và thử hoạt động kháng tế bào ung thư của các

dẫn chất đó [20]

N N

H

OCH3

O2N

X N

OCH3

O2N

(16)

N H

Hình 1.10 Công thức cấu tạo của dẫn chất 2-(4-methoxyphenyl)-1H-benzimidazol

Kết quả là chất 5-nitro-2-(4-methoxyphenyl)-1H-benzimidazol (16) thể hiện

tác dụng ức chế topoisomerase I lớn nhất Sự hiện diện của nhóm nitro (nhóm thế có khả năng hoạt động như chất nhận liên kết hydro) ở vị trí 5 trên khung benzimidazol gây ức chế topoisomerase I tốt hơn các các dẫn chất thế ở vị trí 4 hay 6

Đến năm 2008, Armand Gellis và cộng sự tiếp tục công bố chất

2-cloromethyl-1,5,6-trimethyl-1H-benzimidazol-4,7-dion (19) và các dẫn chất của nó

có tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư vú, ung thư ruột kết và ung thư phổi [9]

N N O

Cl

CH3

O O

N N Cl

R7

Hình 1.12 Công thức cấu tạo chung của dẫn chất 2-mercaptobenzimidazol theo

nghiên cứu của K Anandarajagopal và cộng sự

Bảng 1.6 Các dẫn chất của công thức (22) có tác dụng chống co giật:

22g

N H3C

42,76 %

N Ph Ph

68,81 %

Phenytoin 86,84 % Các dẫn chất 22a-22j trong bảng 1.6 đã được nghiên cứu và cho thấy tác

dụng chống co giật khi tiến hành thử nghiệm trên chuột (20-30g) tại nhiệt độ phòng

25 ± 3oC với chất đối chiếu là phenytoin (với hiệu quả 86,84%) [6,7]

1.3.5 Tác dụng chống bài tiết acid dịch vị, ức chế bơm proton H + /K + -ATPase

và chống viêm loét dạ dày

Năm 2001, Sung Yun Cho và cộng sự đã nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng chống bài tiết acid dịch vị, ức chế bơm proton H+/K+-ATPase và chống viêm loét dạ dày của dẫn chất benzimidazol có công thức cấu tạo chung như sau:

H N

N X N

O A

(23)

Hình 1.13 Công thức cấu tạo chung của dẫn chất benzimidazol theo nghiên cứu

của Sung Yun Cho và cộng sự

Bảng 1.7 Các dẫn chất của công thức (23) cho bởi bảng sau:

S hoặc SO

OC(CH3)2CH=CH-

H 4-OCH35-OCH35-Cl

OC(CH3)2CH2CH2-

H 4-OCH35-OCH3

4-OCH3Các dẫn chất trong bảng 1.7 đều có tác dụng ức chế H+/K+-ATPase ở dạ dày Một số chất cũng có tác dụng chống bài tiết dịch vị ở môn vị dạ dày chuột (Sử dụng Omeprazol là chất đối chiếu) [14,26,30]

Năm 2000, B Bhushan Lohray và cộng sự đã tiến hành tổng hợp và thử tác dụng chống viêm loét và chống bài tiết dịch vị dạ dày của dẫn chất benzimidazol có công thức chung cấu tạo như sau:

N H

N S

Hình 1.14 Công thức cấu tạo chung của dẫn chất benzimidazol theo nghiên cứu

của B Bhushan Lohray và cộng sự

Bảng 1.8 Các dẫn chất của công thức (24) cho bởi bảng sau:

R 9 H F -OCH3 -OCH2CH3 -CH2SO2

R 11 H F -OCH2CF3 -OCH2(CH2)2 -OCH2CCl3

Tất cả các dẫn chất trong bảng 1.8 đều có tác dụng chống loét, chống bài tiết

dịch vị Hơn nữa, phần lớn các dẫn chất này đều có tác dụng chống bài tiết dịch vị

mạnh hơn omeprazol và có hiệu lực cao trong việc chống viêm loét dạ dày, đặc biệt

là bảo vệ niêm mạc dạ dày không bị tổn thương do ethanol gây ra [22,26,30]

1.3.6 Các tác dụng khác của dẫn chất 2-mercaptobenzimidazol

Còn có rất nhiều nghiên cứu cho thấy các dẫn chất 2-mercaaptobenzimidazol

cũng có tác dụng khác bao gồm: Trong điều trị bệnh rối loạn hệ thần kinh trung

ương (trầm cảm) [4], chống viêm [21,23], giảm đau [7,23], chống virus HIV [11],

điều trị giun sán [17,29], kháng histamin [24], chống dị ứng [18,25], chống oxy hóa

[10,13], chống khuẩn lao [16], dinh dưỡng thần kinh [12]…

1.4 Các phương pháp tổng hợp dẫn chất

1,4-bis(1H-benzo[d]imidazol-2-yl-thio)butan

Hầu hết các phương pháp tổng hợp

1,4-bis(1H-benzo[d]imidazol-2-yl-thio)butan đều đi từ nguyên liệu ban đầu là o-phenylendiamin và dẫn chất trong sự

có mặt của CS2, KOH, ehanol và nước để tạo thành khung 2-mercaptobenzimidazol

Sau đó cho 2-mercaptobenzimidazol phản ứng tiếp với dẫn chất 1,4-dibromobutan

để tạo thành 1,4-bis(1H-benzo[d]imidazol-2-yl-thio)butan Thông qua các tài liệu

tham khảo [8,26,27], chúng tôi đưa ra sơ đồ chung như sau:

N

N

S (CH2)4 S

N N

1.4.1 Phản ứng đóng vòng tạo nhân 2-mercaptobenzimidazol từ

o-phenylendiamin hoặc dẫn chất o-o-phenylendiamin

Theo nghiên cứu của Maw-Ling Wang và Biing-Lang Liu (năm 1995) khung 2-mercaptobenzimidazol được tổng hợp bởi nguyên liệu là o-phenylendiamin và carbon disulfid trong ethanol hoặc methanol và nước dưới xúc tác của các amin bậc

3 (R3N) [32,33] Phản ứng xảy ra theo từng bước như sau:

EtOCS 2 K EtOH, H 2 O,

N

H N SK

N

H N SH

2 AcOH, H 2 O

CH3CH2OH + CS2 + KOH CH3CH2OCS2K + H2O



Sơ đồ 3: Phản ứng tạo khung 2-mercaptobenzimidazol của Van Allan và Deacon

Ngoài ra còn có rất nhiều phương pháp để tổng hợp dẫn chất mercaptobenzimidazol cũng đi từ nguyên liệu ban đầu là o-phenylendiamin trong cùng dung môi EtOH/nước Ví dụ như: o-phenylendiamin phản ứng với thiourea

2-SC(NH2)2 dùng xúc tác là acid polyphosphoric (PPA), hoặc o-phenylendiamin phản ứng với lưu huỳnh (S8) dùng xúc tác là Bu4NOH [28]

Nhân 2-mercaptobenzimidazol cũng có thể tạo ra từ o-nitroamin bằng cách alkyl hóa nhóm -NH2 trước và khử hóa nhóm -NO2 sau, sau đó là phản ứng tạo 2-mercaptobenzimidazol [8] Sơ đồ của phản ứng như sau:

NO2

NH2

NO 2

N H

N SH

bis(1H-benzo[d]imidazol-2-độ với sự vắng mặt của bất kỳ những xúc tác nào đó ở trên Nhiệt bis(1H-benzo[d]imidazol-2-độ để thực hiện phản ứng này tùy thuộc vào bản chất của chất và dung môi, thông thường là từ 0-

N

N

S (CH2)n

K2CO3Ethanol

t o R

R R

R = H

= -OCH3 = -OCHF2

và n = 2, 3, 4,

Sơ đồ 5: Phản ứng tạo bis(1H-benzo[d]imidazol-2-yl-thio) và dẫn chất

1.4.3 Phản ứng thế vào vị trí N1 và N1’ trên nhân benzimidazol

1.4.3.1 Phản ứng alkyl hóa

Các dẫn chất bis(1H-benzo[d]imidazol-2-yl-thio) thường được thế với tác nhân R-X (X=Br, Cl) tạo ra các nhóm thế khác nhau ở vị trí N1 và N1’ trên nhân benzimidazol Phản ứng thường được thực hiện trong các dung môi như: aceton, acetonitril, ethyl acetat, THF, DMF, methanol, ethanol…với sự có mặt của các xúc tác base như : NaH, NaOH, K2CO3 khan, C2H5ONa, triethylamin,…và thông thường dùng nhiệt độ từ 0-100oC, nhưng tốt nhất là từ 20-60o

[3,8]

N

H N

S (CH2)n S

N H N

R

R = -CH2C6H5 = -CH2COOC2H5 = -CH2COOCH3 = -CH2CH2Cl = -CH2CH2OH

bis(1H-ở nhiệt độ từ 30-150oC, nhưng nhiệt độ tốt nhất là từ 50-100o

C [3,8]

H N

S (CH2)4

N

N H S

N

N

S (CH2)4

N N S COR

COR

RCOX (RCO)2O

Sơ đồ 7: Phản ứng acyl hóa thế vào vị trí N1 và N1’ trên nhân benzimidazol

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, thiết bị

Thực hiện khóa luận này chúng tôi đã sử dụng một số hóa chất, dung môi và thiết bị của phòng thí nghiệm Tổng hợp hóa dược- Bộ môn Công nghiệp Dược, bao gồm:

2.1.1 Hóa chất

Các hóa chất và dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm đã được thống kê trong bảng 2.1 sau:

Bảng 2.1 Các hóa chất, dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm:

TT Tên hóa chất, dung môi Xuất xứ

15 Nước cất Việt Nam

Bảng 2.2 Các máy móc, dụng cụ sử dụng trong quá trình thực nghiệm:

2 Bình cầu 25ml, 50ml, 100ml, 250ml, 500ml Đức

15 Máy đo phổ khối lượng LTQ Orbitrap XL tại Phòng Hóa

vật liệu - Khoa Hóa - Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại Mỹ

học Quốc gia Hà Nội

16

Máy đo phổ khối lượng LC/MSD Trap - SL và

LC/MS/MS - Xevo TQ tại Phòng Phân tích cấu trúc phân

tử - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công

nghệ Việt Nam

Mỹ

17

Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Brucker

AV-500MHz tại Phòng Phân tích cấu trúc phân tử - Viện Hóa

học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Mỹ

18

Máy đo phổ hồng ngoại GX-Perkin Elmer tại Phòng

Phân tích cấu trúc phân tử - Viện Hóa học - Viện Hàn

lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Mỹ

2 Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp được

3 Thử hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của một số dẫn chất

Xác định độ tinh khiết của các sản phẩm tổng hợp được bằng phương pháp SKLM và đo nhiệt độ nóng chảy

2.3.2 Xác định cấu trúc

Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được dựa trên kết quả phân tích phổ

hồng ngoại (IR), Phổ khối lượng phân tử (MS), Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H - NMR)

Phổ hồng ngoại (IR):

Được ghi tại Phòng Phân tích cấu trúc phân tử - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, trên máy Perkin Elmer với kỹ thuật viên nén KBr trong vùng 4000-400cm-1 Mẫu rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ khoảng 1: 200 rồi ép dưới dạng viên nén dưới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm

Phổ khối lượng phân tử (MS):

Được ghi theo phương pháp ESI trên máyLTQ Orbitrap XL tại Phòng Hóa vật liệu - Khoa Hóa - Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, còn tại Phòng Phân tích phổ - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam được ghi trên máy LC/MSD Trap - SL và máy LC/MS/MS-Xevo TQ

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H - NMR):

Được ghi trên máy Brucker AV-500MHz tại Phòng Phân tích phổ - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.3.3 Thử tác dụng sinh học

Thử tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm tiến hành theo phương pháp khuếch tán trên thạch, thực hiện tại bộ môn Vi sinh - Sinh học của Trường Đại học Dược Hà Nội

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Tổng hợp hóa học

Qua tham khảo các tài liệu và dựa vào điều kiện của phòng thí nghiệm, các hóa chất cho phép, chúng tôi đã tiến hành tổng hợp một số dẫn chất của 1,4-bis(1H-benzo[d]imidazol-2-yl-thio)butan theo sơ đồ như sau:

NH2

NH2N

H SH

N

H N

S (CH2)4

N N S

N

N

S (CH2)4

N N S

N

N

S (CH2)4

N N S

N

N

S (CH2)4

N N S

N

H N

SH + H2S + H2O

Sơ đồ 9: Sơ đồ tổng hợp 2-mercaptobenzimidazol

Tiến hành: Chuẩn bị dụng cụ bao gồm: một bình cầu 250ml, ống đong

100ml, nồi áo, quả bóp, đá bọt, hệ thống sinh hàn hồi lưu Cố định bình cầu và hệ thống sinh hàn lên giá đỡ Đầu tiên, cho vào bình cầu hỗn hợp gồm có: 7,03g (0,065 mol) o-phenylendiamin và 3,642g (0,065mol) KOH, 70ml ethanol tuyệt đối, 12ml nước cất, sau đó thêm từ từ 3,93ml (0,065 mol) carbon disulfid (CS2) và thêm vài viên đá bọt (để làm hỗn hợp phản ứng sôi đều) Lắp bình cầu vào bếp ôm với hệ thống sinh hàn thích hợp Tiến hành hồi lưu trong 3 giờ

Theo dõi tiến triển phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi là dicloromethan: methanol (20: 1) và hiện màu bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm Dưới đây là hình ảnh SKLM minh họa (với 1 là nguyên liệu ban đầu và 2 là hỗn hợp phản ứng):

(Phản ứng đang diễn ra) (Phản ứng kết thúc)

Hình 3.1 Hình ảnh theo dõi phản ứng bằng SKLM của phản ứng tạo chất II-a

Xử lý hỗn hợp phản ứng: Sau khi phản ứng kết thúc, thêm vào hỗn hợp

phản ứng 0,7g than hoạt, tiếp tục đun trong vòng 10 phút, sau đó lọc nóng bằng phễu Buchner và rửa 2-3 lần bằng ít ethanol (bỏ than hoạt và đá bọt) Dịch thu được thêm 70ml nước nóng (60-70o

C), acid hóa đến pH khoảng 5-6, tiếp tục khuấy khoảng 1 giờ Lọc lấy tủa (rửa bằng nước cất) và sấy khô dưới đèn hồng ngoại, thu được sản phẩm thô Tinh chế bằng cách kết tinh lại trong cồn 50%, thu được 9,154g sản phẩm

Kết quả:

Cảm quan : Tinh thể hình phiến mỏng, màu trắng bạc

Độ tan : Tan tốt trong ethanol, aceton, DMF, DMSO; tan trong

methanol, dicloromethan; không tan trong nước

Sơ đồ 10: Sơ đồ tổng hợp 1,4-dibromobutan

Tiến hành: Chuẩn bị dụng cụ bao gồm: Một bình cầu 250ml, 3 pipet 10ml,

găng tay, quả bóp, nồi áo, đá bọt, hệ thống sinh hàn thích hợp Cố định bình cầu và

hệ thống sinh hàn lên giá đỡ Đầu tiên, cho vào bình cầu 34ml acid hydrobromic (HBr) 40%; tiếp theo nhỏ từ từ 8,2ml acid sulfuric đặc; cuối cùng là thêm 4,1ml tetrahydrofuran và vài viên đá bọt Sau đó lắc nhẹ và lắp bình cầu vào bếp ôm với

hệ thống sinh hàn thích hợp Tiến hành hồi lưu trong 3 giờ

Chú ý: Trong thao tác pha hỗn hợp phản ứng nền: đeo kính, găng tay, khẩu

trang để an toàn và phải tiến hành trong tủ hút

Xử lý hỗn hợp phản ứng: Phản ứng kết thúc sau thời gian 3 tiếng đun hồi

lưu Để lạnh, đổ tất cả hỗn hợp phản ứng sang bình chiết 125ml, gạn lấy lớp dưới vào cốc có mỏ, rửa 2 lần với khoảng 50ml nước cất Sau đó rửa 2 lần tiếp với 50ml natri carbonat bão hòa, rửa tiếp với khoảng 50ml nước cất đến pH khoảng 7 Gạn lấy pha hữu cơ vào bình nón 50ml, sau đó cho Na2SO4 vào để làm khan và đậy nắp kín Bảo quản trong tủ hút

Kết quả:

- Thu được 1,4-dibromobutan ở dạng lỏng, không màu

t o = 90 o C / 14h

S

(III-a)

Sơ đồ 11: Sơ đồ tổng hợp 1,4-bis(1H-benzo[d]imidazol-2-yl-thio)butan

Tiến hành: Chuẩn bị dụng cụ bao gồm: một bình cầu 2 cổ 250ml có nút mài,

một pipet chia vạch 10ml, 1 pipet chia vạch 1ml, quả bóp, máy khuấy từ có gia nhiệt, con khuấy từ, nhiệt kế, cân kỹ thuật và hệ thống sinh hàn thích hợp Cố định bình cầu chứa con khuấy từ và hệ thống sinh hàn lên giá đỡ Đầu tiên, hòa tan 3,51g (23,4mmol) 2-mercaptobenzimidazol trong 70ml ethanol tuyệt đối Sau đó nhỏ từ từ 1,39ml (11,7mmol) 1,4-dibromobutan vào dung dịch trên Tiến hành hồi lưu trong

14 giờ

Theo dõi tiến triển phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi là dicloromethan: methanol (20: 1) và hiện màu bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm Dưới đây là hinh ảnh SKLM minh họa (với 1 là nguyên liệu ban đầu và 2 là hỗn hợp phản ứng):

(Phản ứng đang diễn ra) (Phản ứng kết thúc)

Hình 3.2 Hình ảnh theo dõi phản ứng bằng SKLM của phản ứng tạo chất III-a

Xử lý hỗn hợp phản ứng: Sau khi phản ứng kết thúc, bình cầu được để

nguội về nhiệt độ phòng, thêm khoảng 50ml nước cất vào trong bình cầu và khuấy, kiềm hóa bằng cách vừa khuấy vừa nhỏ từ từ dung dịch NaOH 2N vào đến pH khoảng 12-13, sau đó tiến hành lọc lấy tủa bằng phễu Buchner có nối sẵn với bộ phận hút chân không, rửa tủa bằng ethanol và acetonitril Sấy khô dưới đèn hồng ngoại và đem cân, thu được 3,83g sản phẩm

Độ tinh khiết : Kiểm tra bằng SKLM với hệ dung môi khai

triển là dicloromethan: methanol (20: 1) thì cho một vết gọn, rõ, Rf = 0,42

S (CH2)4 S

N N H

(III-b)

Cl

Sơ đồ 12: Sơ đồ tổng hợp 1,4-bis(1-benzyl-1H-benzo[d]imidazol-2-yl-thio)butan

Tiến hành: Chuẩn bị dụng cụ như sau: một bình cầu 2 cổ 250ml có nút mài,

pipet 10ml, pipet chia vạch 1ml, quả bóp, máy khuấy từ có gia nhiệt, nhiệt kế, con khuấy từ, cân kỹ thuật, hóa chất, bộ dụng cụ làm khan và hệ thống sinh hàn thích hợp Cố định bình cầu chứa con khuấy từ và hệ thống sinh hàn có nối dụng cụ làm khan lên giá đỡ Đầu tiên, hòa tan 0,42g (1,19mmol) 1,4-bis(1H-benzo[d]imidazol-2-yl-thio)butan trong 13ml DMF khan, sau đó thêm 0,45g K2CO3 khan và tiến hành khuấy hoạt hóa ở nhiệt độ phòng trong vòng 1 giờ, tiếp theo là nhỏ từ từ 0,28ml (2,37mmol) benzyl clorid vào hỗn hợp phản ứng Tiến hành khuấy ở 100oC, sau 1 giờ chấm sắc ký xem thì thấy có phản ứng chạy, tiếp tục đun hồi lưu ở 100oC trong

10 giờ nữa thì kết thúc phản ứng

Theo dõi tiến triển phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi là dicloromethan: methanol (20: 1) và hiện màu bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm Dưới đây là hinh ảnh SKLM minh họa (với 1 là nguyên liệu ban đầu và 2 là hỗn hợp phản ứng):

(Phản ứng đang diễn ra) (Phản ứng kết thúc)

Hình 3.3 Hình ảnh theo dõi phản ứng bằng SKLM của phản ứng tạo chất III-b

Xử lý hỗn hợp phản ứng: Sau khi phản ứng kết thúc, bình cầu được để

nguội về nhiệt độ phòng Chuẩn bị một cốc có mỏ 250ml khác có chứa khoảng 200ml nước cất và 1 con khuấy, vừa khuấy vừa đổ từ từ hỗn hợp phản ứng trong bình cầu vào cốc có mỏ trên, rửa bình cầu bằng ít nước cất Tiếp tục khuấy trong khoảng 2 giờ (để tách sản phẩm khỏi dung môi và hòa tan hết K2CO3 trong nước) Sau đó tiến hành lọc lấy tủa qua phễu Buchner có nối sẵn hệ thống hút chân không

(rửa tủa bằng nước cất) Sấy khô dưới đèn hồng ngoại và đem cân, thu được 0,5g sản phẩm

Kết quả:

- Cảm quan : Bột màu trắng hơi vàng

- Độ tan : Không tan trong nước, tan trong ethanol nóng,

DMF, DMSO

- Nhiệt độ nóng chảy : 166oC – 168oC

- Độ tinh khiết : Kiểm tra bằng SKLM với hệ dung môi khai triển là

dicloromethan: methanol (20: 1), thì cho một vết gọn,

rõ, Rf = 0,64

3.1.3.2 Tổng hợp thio)butan

1,4-bis(1-methoxycarbonylmethyl-1H-benzo[d]imidazol-2-yl-Phương trình phản ứng như sau:

N

H N

S (CH2)4 S

N N H

DMF khan ClCH2COOCH3

Tiến hành: Chuẩn bị dụng cụ như sau: một bình cầu 2 cổ 250ml có nút mài,

pipet 10ml, pipet chia vạch 1ml, quả bóp, máy khuấy từ có gia nhiệt, nhiệt kế, con khuấy từ, cân kỹ thuật, hóa chất, bộ dụng cụ làm khan và hệ thống sinh hàn thích hợp Cố định bình cầu chứa con khuấy từ và hệ thống sinh hàn có nối dụng cụ làm khan lên giá đỡ Đầu tiên, hòa tan 0,41g (1,16mmol) 1,4-bis(1H-benzo[d]imidazol-2-yl-thio)butan trong 13ml DMF khan, sau đó thêm 0,48g K2CO3 và tiến hành

khuấy hoạt hóa ở nhiệt độ phòng trong vòng 1 giờ, nhỏ từ từ 0,21ml (2,32mmol) methyl cloroacetat vào Tiến hành khuấy ở nhiệt độ phòng trong 3 giờ 30 phút

Theo dõi tiến triển phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi là dicloromethan: methanol (20: 1) và hiện màu bằng đèn tử ngoại ở bước sóng

254nm Dưới đây là hình ảnh SKLM minh họa (với 1 là nguyên liệu ban đầu, 2 là

hỗn hợp phản ứng):

(Phản ứng đang diễn ra) (Phản ứng kết thúc)

Hình 3.4 Hình ảnh theo dõi phản ứng bằng SKLM của phản ứng tạo chất III-c

Xử lý hỗn hợp phản ứng: Sau khi phản ứng kết thúc, lấy bình cầu hỗn hợp

phản ứng ra Chuẩn bị một cốc có mỏ 250ml khác có chứa khoảng 200ml nước cất

và 1 con khuấy, vừa khuấy vừa đổ từ từ hỗn hợp phản ứng trong bình cầu vào cốc

có mỏ trên, rửa bình cầu bằng ít nước cất Tiếp tục khuấy trong khoảng 2 giờ (để tách sản phẩm khỏi dung môi và hòa tan hết K2CO3 trong nước) Sau đó tiến hành lọc lấy tủa qua phễu Buchner có nối sẵn hệ thống hút chân không (rửa tủa bằng nước cất) Sấy khô dưới đèn hồng ngoại và đem cân, thu được 0,37g sản phẩm

- Độ tinh khiết : Kiểm tra bằng SKLM với hệ dung môi khai triển là

dicloromethan: methanol (20: 1), thì cho một vết gọn,

rõ, Rf = 0,46

3.1.3.3 Tổng hợp thio)butan

1,4-bis(1-ethoxycarbonylmethyl-1H-benzo[d]imidazol-2-yl-Phương trình phản ứng như sau:

N

H N

S (CH2)4 S

N H

Tiến hành: Chuẩn bị dụng cụ như sau: một bình cầu 2 cổ 250ml có nút mài,

pipet 10ml, pipet chia vạch 1ml, quả bóp, máy khuấy từ có gia nhiệt, nhiệt kế, con khuấy từ, cân kỹ thuật, hóa chất, bộ dụng cụ làm khan và hệ thống sinh hàn thích hợp Cố định bình cầu chứa con khuấy từ và hệ thống sinh hàn có nối dụng cụ làm khan lên giá đỡ Đầu tiên, hòa tan 0,51g (1,44mmol) 1,4-bis(1H-benzo[d]imidazol-2-yl-thio)butan trong 13ml DMF khan, sau đó thêm 0,55g K2CO3 và tiến hành khuấy hoạt hóa ở nhiệt độ phòng trong vòng 1 tiếng, nhỏ từ từ 0,31ml (2,88mmol) ethyl cloroacetat vào Tiến hành đun hồi lưu ở nhiệt độ 90oC trong 2 giờ

Theo dõi tiến triển phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi là dicloromethan: methanol (20: 1) và hiện màu bằng đèn tử ngoại ở bước sóng

254nm Dưới đây là hình ảnh SKLM minh họa (với 1 là nguyên liệu ban đầu, 2 là

hỗn hợp phản ứng):